KR20050119671A

KR20050119671A - Ａｇ013736을 포함하는 제형

Info

Publication number: KR20050119671A
Application number: KR1020057018606A
Authority: KR
Inventors: 제임스 로렌스 프레도; 다나 휴-로우; 야즈디 케르시 피타발라; 하이디 마리 스타인펠트
Original assignee: 화이자 인코포레이티드
Priority date: 2003-04-03
Filing date: 2004-03-17
Publication date: 2005-12-21
Also published as: TW200423933A; RU2008122358A; WO2004087152A1; EP1613320A1; UY28255A1; US20040224988A1; RU2341263C2; NL1025873A1; AR043822A1; AU2004226586B2; CA2520932A1; BRPI0409230A; PA8599701A1; RU2005128791A; AU2004226586A1; MXPA05009303A; NO20055143D0; NL1025873C2; NO20055143L; JP2006522087A

Abstract

본 발명은 화학식 (1)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 프로드럭의 제형을 제공한다. 본 발명은 추가로 제형을 포유류에게 투여함으로써, 암과 같은, 비정상적 세포 성장을 치료하는 방법을 제공한다.

<화학식 1>

Description

ＡＧ013736을 포함하는 제형{DOSAGE FORMS COMPRISING AG013736}

본 출원은 2003년 4월 3일 출원된 미국 가출원 제60/460,695호와 2003년 7월 31일 출원된 미국 가출원 제60/491,771호의 이익을 주장하며, 그 개시내용은 그 전체로 참조에 의해 본원에 도입된다.

본 발명은 포유류에서 암과 같은 비정상적 세포 성장의 치료에 유용한 VEGFR 저해제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 포유류, 특히 인간에서 비정상적 세포 성장의 치료에 상기 화합물을 사용하는 방법, 및 상기 화합물을 함유하는 제약 조성물에 관한 것이다.

화학식 1에 의해 나타내어지는, 화합물 6-[2-(메틸카바모일)페닐설파닐]-3-E-[2-(피리딘-2-일)에테닐]인다졸은 결장, 흑색종, 유방암 및 폐암의 이종이식 모델에서 광범위한 전임상 활성을 갖는 VEGFR/PDGFR 티로신 키나제의 강력하고 선택적인 저해제이다.

(Hu-Lowe D, Heller, D, Brekken J, Feeley R, Amundson K, Haines M, Troche G, Kim Y, Gonzalez D, Herrman M, Batugo M, Vekich S, Kania R, McTigue M, Gregory S, Bender S, Shalinsky D., Pharmacological Activities of AGO13736, a Small Molecule Inhibitor of VEGF/PDGF Receptor Tyrosine Kinases; Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 2002: abstract #5357). 역동적 조영 증강 MRI(dceMRI)를 이용하여 측정된 전임상 종양 혈관 반응은 종양 성장 지수에 상응하는 것으로 밝혀졌다(Wilmes LJ, Hylton NM, Wang D, Fleming LM Gibbs J, Kim Y, Dillon R, Brasch RC, Park JW, Li K-L, Henry RG, Partridge SC, Shalinsky DR, Hu-Lowe D, McShane TM 및 Pallavicini MG., AG013736, a Novel VEGFR TK Inhibitor, Suppresses Tumor Growth and Vascular Permeability in Human BT474 Breast Cancer Xenografts in Nude Mice"; Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 2003: Abstract #3772).

발명의 요약

본 발명은 6-[2-(메틸카바모일)페닐설파닐]-3-E-[2-(피리딘-2-일)에테닐]인다졸로 계통적으로 명명될 수 있는 화학식 1의 화합물을 이용하는 제형 및 치료방법을 제공한다.

<화학식 1>

일 태양에서, 본 발명은 화학식 1의 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염, 그들의 용매화물 또는 프로드럭 또는 그들의 혼합물을, 포유류에게 투여한 후 4500 ng·hr/㎖ 이하의 화학식 1의 화합물 또는 그의 활성 대사물의 24-시간 AUC 혈장 값을 제공하는데 유효한 양으로 포함하는, 포유류에게 투여하기 위한 제형을 제공한다. 24-시간 AUC 혈장 값은 본원의 상세한 설명에 설명된 바와 같이 결정될 수 있다.

이 태양의 구체적 측면에서, 24-시간 AUC 혈장 값의 상한은 4000 ng·hr/㎖ 이하 또는 3000 ng·hr/㎖ 이하 또는 2500 ng·hr/㎖ 이하 또는 2000 ng·hr/㎖ 이하 또는 1500 ng·hr/㎖ 이하 또는 1000 ng·hr/㎖ 이하 또는 800 ng·hr/㎖ 이하 또는 700 ng·hr/㎖ 이하이다. 바람직하게는, 언급된 상한 중 어느 것과 함께 24-시간 AUC 혈장 값은 10 ng·hr/㎖ 이상 또는 25 ng·hr/㎖ 이상 또는 50 ng·hr/㎖ 이상 또는 75 ng·hr/㎖ 이상 또는 100 ng·hr/㎖ 이상 또는 125 ng·hr/㎖ 이상이다. 24-시간 AUC 혈장 값의 착안된 범위는 언급된 하한 중 어느 것에서부터 언급된 상한 중 어느 것까지의 범위를 포함한다. 바람직한 범위의 구체적, 비제한적 예는 25 내지 4500 ng·hr/㎖, 50 내지 2500 ng·hr/㎖, 75 내지 1000 ng·hr/㎖, 100 내지 800 ng·hr/㎖, 및 125 내지 700 ng·hr/㎖을 포함한다.

다른 태양에서, 본 발명은 위에 정의된 화학식 1의 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 프로드럭, 또는 그들의 혼합물을 30 ㎎ 이하의 양으로 포함하는 제형을 제공한다. 모든 또는 일부의 화합물이 염, 용매화물 또는 프로드럭으로서 제형 중에 존재할 때, 그 양은 몰 질량에 기초하여 당업자에 의해 쉽게 계산되는, 화학식 1의 화합물의 당량임이 이해되어야만 한다.

이 태양의 구체적 측면에서, 양의 상한은 20 ㎎ 이하 또는 15 ㎎ 이하 또는 12 ㎎ 이하 또는 10 ㎎ 이하 또는 8 ㎎ 이하 또는 7 ㎎ 이하이다. 바람직하게는, 언급된 상한 중 어느 것과 함께 양은 0.5 ㎎ 이상 또는 1 ㎎ 이상 또는 1.5 ㎎ 이상 또는 2 ㎎ 이상 또는 2.5 ㎎ 이상 또는 3 ㎎ 이상이다. 착안된 범위는 언급된 하한 중 어느 것에서부터 언급된 상한 중 어느 것까지의 범위를 포함한다. 바람직한 범위의 구체적, 비제한적 예는 0.5 내지 30 ㎎, 1 내지 20 ㎎, 1.5 내지 15 ㎎, 2 내지 10 ㎎, 2.5 내지 8 ㎎, 및 3 내지 7 ㎎을 포함한다.

본 발명은 추가로 위에 정의된 화학식 1의 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 프로드럭, 또는 그들의 혼합물을, 포유류에게 투여한 후 4500 ng·hr/㎖ 이하의 화학식 1의 화합물 또는 그의 활성 대사물의 24-시간 AUC 혈장 값을 제공하는데 유효한 양으로 포유류에게 투여함으로써, 인간을 포함하는 포유류에서 비정상적 세포 성장을 치료하는 방법을 제공한다. 24-시간 AUC 혈장 값은 본원의 상세한 설명에 설명된 바와 같이 결정될 수 있다.

이 태양의 구체적 측면에서, 24-시간 AUC 혈장 값의 상한은 4000 ng·hr/㎖ 이하 또는 3000 ng·hr/㎖ 이하 또는 2500 ng·hr/㎖ 이하 또는 2000 ng·hr/㎖ 또는 1500 ng·hr/㎖ 이하 또는 1000 ng·hr/㎖ 이하 또는 800 ng·hr/㎖ 이하 또는 700 ng·hr/㎖ 이하이다. 바람직하게, 언급된 상한 중 어느 것과 함께 24-시간 AUC 혈장 값은 10 ng·hr/㎖ 이상 또는 25 ng·hr/㎖ 이상 또는 50 ng·hr/㎖ 이상 또는 75 ng·hr/㎖ 이상 또는 100 ng·hr/㎖ 이상 또는 125 ng·hr/㎖ 이상이다. 24-시간 AUC 혈장 값의 착안된 범위는 언급된 하한 중 어느 것에서부터 언급된 상한 중 어느 것까지의 범위를 포함한다. 바람직한 범위의 구체적, 비제한적 예는 25 내지 4500 ng·hr/㎖, 50 내지 2500 ng·hr/㎖, 75 내지 1000 ng·hr/㎖, 100 내지 800 ng·hr/㎖, 및 125 내지 700 ng·hr/㎖을 포함한다.

본 발명은 추가로 위에 정의된 화학식 1의 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 프로드럭, 또는 그들의 혼합물을 투약 당 30 ㎎ 이하의 양으로 포유류에게 투여함으로써, 인간을 포함하는 포유류에서 비정상적 세포 성장을 치료하는 방법을 제공한다. 모든 또는 일부의 화합물이 염, 용매화물 또는 프로드럭으로서 제형 중에 존재할 때, 양은 몰 질량에 기초하여 당업자에 의해 쉽게 계산되는, 화학식 1의 화합물의 당량임이 이해되어야만 한다.

이 태양의 구체적 측면에서, 양의 상한은 20 ㎎ 이하 또는 15 ㎎ 이하 또는 12 ㎎ 이하 또는 10 ㎎ 이하 또는 8 ㎎ 이하 또는 7 ㎎ 이하이다. 바람직하게, 언급된 상한 중 어느 것과 함께 양은 0.5 ㎎ 이상 또는 1 ㎎ 이상 또는 1.5 ㎎ 이상 또는 2 ㎎ 이상 또는 2.5 ㎎ 이상 또는 3 ㎎ 이상이다. 착안된 범위는 언급된 하한 중 어느 것에서부터 언급된 상한 중 어느 것까지의 범위를 포함한다. 바람직한 범위의 구체적, 비제한적 예는 0.5 내지 30 ㎎, 1 내지 20 ㎎, 1.5 내지 15 ㎎, 2 내지 10 ㎎, 2.5 내지 8 ㎎, 및 3 내지 7 ㎎을 포함한다.

본원에 설명된 본 발명의 방법 중 어느 것의 구체적 태양에서, 비정상적 세포 성장은 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 결장암, 유방암, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 외음부암, 호치킨병, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연질 조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구성 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신세포암, 신우암, 중추신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 척수축암, 뇌간신경교종, 뇌하수체 선종, 또는 상기 암의 하나 이상의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 암이다. 상기 방법의 다른 태양에서, 상기 비정상적 세포 성장은 건선, 양성 전립선 비대증 또는 재협착을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 양성 증식성 질환이다.

다른 태양에서, 본 발명은 치료적으로 허용가능한 양의 화학식 1의 화합물을 포유류에게 투여함으로써, 포유류에서 PDGFR BB 매개된 암세포 이동을 저해하는 방법을 제공한다.

다른 태양에서, 본 발명은 치료적으로 허용가능한 양의 화학식 1의 화합물을 포유류에게 투여함으로써, 포유류에서 c-KIT 활성을 저해하는 방법을 제공한다.

본원에 설명된 본 발명의 방법 중 어느 것의 추가의 구체적 태양에서, 방법은 항-종양제, 항-혈관신생제, 신호전달 저해제 및 항증식제로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 상기 비정상적 세포 성장을 치료하는데 함께 유효한 양으로 포유류에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 그러한 물질은 PCT 공개번호 WO 00/38715, WO 00/38716, WO 00/38717, WO 00/38718, WO 00/38719, WO 00/38730, WO 00/38665, WO 00/37107 및 WO 00/38786에 개시된 것들을 포함하며, 그 개시내용은 그 전체로 참조에 의해 본원에 도입된다.

항-종양제의 예는 유사분열 저해제, 예를 들어 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신 및 빈크리스틴과 같은 빈카 알칼로이드 유도체; 콜히친, 알로콜히친, 할리콘드린, N-벤조일트리메틸-메틸 에테르 콜히친산, 돌라스타틴 10, 메이스탄신(maystansine), 리족신, 파클리탁셀(탁솔™), 도세탁셀(탁소티어™), 2'-N-[3-(디메틸아미노)프로필]글루타라메이트(탁솔™ 유도체)와 같은 탁산, 티오콜히친, 트리틸 시스테인, 테니포사이드, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 플루오로우라실, 시토신 아라비노사이드, 2',2'-디플루오로데옥시시티딘(겜시타빈), 아드리아마이신 및 미토마이신; 알킬화제, 예를 들어 시스-플라틴, 카보플라틴, 옥시플라틴, 이프로플라틴, N-아세틸-DL-사르코실-L-류신의 에틸 에스테르(아사레이 또는 아사렉스), 1,4-사이클로헥사디엔-1,4-디카밤산, 2,5-비스(1-아지르디닐)-3,6-디옥소-디에틸 에스테르(디아지쿠온), 1,4-비스(메탄설포닐옥시)부탄(비설판 또는 류코설판), 클로로조토신, 클로메손, 시아노모르폴리노독소루비신, 사이클로디손, 디언하이드로갈락티톨, 플루오로도판, 헵설팜, 미토마이신 C, 하이칸테온미토마이신 C, 미토졸아미드, 1-(2-클로로에틸)-4-(3-클로로프로필)-피페라진 디하이드로클로라이드, 피페라진디온, 피포브로만, 포르피로마이신, 스피로하이단토인 머스타드, 터옥시론, 테트라플라틴, 티오테파, 트리에틸렌멜라민, 우라실 질소 머스타드, 비스(3-메실옥시프로필)아민 하이드로클로라이드, 미토마이신, 사이클로헥실-클로로에틸니트로소우레아, 메틸사이클로헥실-클로로에틸니트로소우레아, 1-(2-클로로에틸)-3-(2,6-디옥소-3-피레피딜)-1-니트로소우레아, 비스(2-클로로에틸)니트로소우레아와 같은 니트로소우레아제, 프로카바진, 다카바진, 질소 머스타드-관련 화합물, 예를 들어 메클로로에타민, 사이클로포스파미드, 이포사미드, 멜팔란, 클로람뷰실, 에스트라무스틴 소듐 포스페이트, 스트렙토조신 및 테모졸아미드; DNA 항-대사물, 예를 들어 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노사이드, 하이드록시우레아, 2-[(3-하이드록시-2-피리노디닐)메틸렌]-하이드라진 카보티오아미드, 데옥시플루오로우리딘, 5-하이드록시-2-포밀피리딘 티오세미카바존, 알파-2'-데옥시-6-티오구아노신, 아피디콜린 글리시네이트, 5-아자데옥시시티딘, 베타-티오구아닌 데옥시리보사이드, 사이클로시티딘, 구아나졸, 이노신 글리코디알데히드, 맥베신 Ⅱ, 피라졸이미다졸, 클라드리빈, 펜토스타틴, 티오구아닌, 머캅토퓨린, 블레오마이신, 2-클로로데옥시아데노신, 랄티트렉세드 및 페메트렉세드 디소듐과 같은 티미딜레이트 신타제의 저해제, 클로파라빈, 플록스우리딘 및 플루다라빈; DNA/RNA 항대사물, 예를 들어, L-알라노신, 5-아자시티딘, 아시비신, 아미노프테린 및 그의 유도체, 예를 들어 N-[2-클로로-5-[[(2,4-디아미노-5-메틸-6-퀴나졸리닐)메틸]아미노]벤조일]-L-아스파르트산, N-[4-[[(2,4-디아미노-5-에틸-6-퀴나졸리닐)메틸]아미노]벤조일]-L-아스파르트산, N-[2-클로로-4-[[(2,4-디아미노프테리디닐)메틸]아미노]벤조일]-L-아스파르트산, 가용성 베이커즈 안티폴, 디클로로알릴 로손, 브레퀴나르, 프토라프, 디하이드로-5-아자시티딘, 메토트렉세이트, N-(포스포노아세틸)-L-아스파르트산 테트라소듐 염, 피라조퓨란, 트리메트렉세이트, 플리카마이신, 악티노마이신 D, 크립토피신, 및 크립토피신-52와 같은 유사체, 또는 예를 들어 N-(5-[N-(3,4-디하이드로-2-메틸-4-옥소퀴나졸린-6-일메틸)-N-메틸아미노]-2-테노일)-L-글루탐산과 같은 유럽특허출원 제239362호에 개시된 바람직한 항-대사물 중의 하나; 성장 인자 저해제; 세포 주기 저해제; 삽입성(intercalating) 항생제, 예를 들어 아드리아마이신 및 블레오마이신; 단백질, 예를 들어 인터페론; 및 항-호르몬, 예를 들어, 놀바덱스(Nolvadex)™(타목시펜)와 같은 항-에스트로겐, 또는 예를 들어 카소덱스(Casodex)™(4'-시아노-3-(4-플루오로페닐설포닐)-2-하이드록시-2-메틸-3'-(트리플루오로메틸)프로피온아닐리드)와 같은 항-안드로겐을 포함한다. 그러한 병용 치료는 개개의 치료 성분의 동시, 순차 또는 분리 투여에 의해 달성될 수 있다.

항-혈관신생제는 MMP-2(기질-금속단백분해효소 2) 저해제, MMP-9(기질-금속단백분해효소 9) 저해제, 및 COX-Ⅱ(사이클로옥시게나제 Ⅱ) 저해제를 포함한다. 유용한 COX-Ⅱ 저해제의 예는 셀레브렉스(CELEBREX)™(알레콕시브), 발데콕시브 및 로페콕시브를 포함한다. 유용한 기질 금속단백분해효소 저해제의 예는 WO 96/33172(1996년 10월 24일 공개), WO 96/27583(1996년 3월 7일 공개), 유럽특허출원 제97304971.1호(1997년 7월 8일 출원), 유럽특허출원 제99308617.2호(1999년 10월 29일 출원), WO 98/07697(1998년 2월 26일 공개), WO 98/03516(1998년 1월 29일 공개), WO 98/34918(1998년 8월 13일 공개), WO 98/34915(1998년 8월 13일 공개), WO 98/33768(1998년 8월 6일 공개), WO 98/30566(1998년 7월 16일 공개), 유럽특허공개 제606,046호(1994년 7월 13일 공개), 유럽특허공개 제931,788호(1999년 7월 28일 공개), WO 90/05719(1990년 5월 31일 공개), WO 99/52910(1999년 10월 21일 공개), WO 99/52889(1999년 10월 21일 공개), WO 99/29667(1999년 6월 17일 공개), PCT 국제출원번호 PCT/IB98/01113(1998년 7월 21일 출원), 유럽특허출원 제99302232.1호(1999년 3월 25일 출원), 영국특허출원 제9912961.1호(1999년 6월 3일 출원), 미국 가출원 제60/148,464호(1999년 8월 12일 출원), 미국특허 제5,863,949호(1999년 1월 26일 등록), 미국특허 제5,861,510호(1999년 1월 19일 등록) 및 유럽특허공개 제780,386호(1997년 6월 25일 공개)를 포함한다(모두 그 전체로 참조에 의해 본원에 도입됨). 바람직한 MMP-2 및 MMP-9 저해제는 MMP-1을 저해하는 활성이 거의 없거나 전혀 없는 것들이다. 더욱 바람직한 것은, 다른 기질-금속단백분해효소(즉, MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 및 MMP-13)에 비해 상대적으로 MMP-2 및(또는) MMP-9을 선택적으로 저해하는 것들이다.

MMP 저해제의 예는 AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830, 및 아래 목록에 언급된 화합물, 및 그의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 및 프로드럭을 포함한다.

3-[[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐]-(1-하이드록시카바모일-사이클로펜틸)-아미노]-프로피온산;

3-엑소-3-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-8-옥사-바이사이클로[3.2.1]옥탄-3-카르복실산 하이드록시아미드;

(2R,3R) 1-[4-(2-클로로-4-플루오로-벤질옥시)-벤젠설포닐]-3-하이드록시-3-메틸-피페리딘-2-카르복실산 하이드록시아미드;

4-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-테트라하이드로-피란-4-카르복실산 하이드록시아미드;

3-[[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐]-(1-하이드록시카바모일-사이클로부틸)-아미노]-프로피온산;

4-[4-(4-클로로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-테트라하이드로-피란-4-카르복실산 하이드록시아미드;

3-[4-(4-클로로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-테트라하이드로-피란-3-카르복실산 하이드록시아미드;

(2R,3R) 1-[4-(4-플루오로-2-메틸-벤질옥시)-벤젠설포닐]-3-하이드록시-3-메틸-피페리딘-2-카르복실산 하이드록시아미드;

3-[[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐]-(1-하이드록시카바모일-1-메틸-에틸)-아미노]-프로피온산;

3-[[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐]-(4-하이드록시카바모일-테트라하이드로-피란-4-일)-아미노]-프로피온산;

3-엑소-3-[4-(4-클로로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-8-옥사-바이사이클로[3.2.1]옥탄-3-카르복실산 하이드록시아미드;

3-엔도-3-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-8-옥사-바이사이클로[3.2.1]옥탄-3-카르복실산 하이드록시아미드; 및

3-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-테트라하이드로-퓨란-3-카르복실산 하이드록시아미드

신호전달 저해제의 예는 EGFR 항체, EGF 항체, 및 EGFR 저해제인 분자와 같은, EGFR(상피 성장 인자 수용체) 반응을 저해할 수 있는 약제; VEGF(혈관 내피 성장 인자) 저해제; 및 erbB2 수용체에 결합하는 유기 분자 또는 항체와 같은 erbB2 수용체 저해제, 예를 들어 헤르셉틴(HERCEPTIN)™(USA, 캘리포니아, 사우쓰 샌프란시스코의 제넨테크, 인크)을 포함한다.

EGFR 저해제는 예를 들어 WO 95/19970(1995년 7월 27일 공개), WO 98/14451 (1998년 4월 9일 공개), WO 98/02434(1998년 1월 22일 공개) 및 미국특허 제5,747,498호(1998년 5월 5일 등록)에 기재되어 있다. EGFR-저해제는 모노클로날 항체 C225 및 항-EGFR 22Mab(USA, 뉴욕, 임클론 시스템즈 인코퍼레이티드), 화합물 ZD-1839(아스트라제네카), BIBX-1382(베링거 인겔하임), MDX-447(USA, 뉴저지, 애넌데일의 메다렉스 인크) 및 OLX-103(USA, 뉴저지, 화이트하우스 스테이션의 머크 앤드 캄파니), VRCTC-310(벤테크 리서치) 및 EGF 융합 독소(매사추세츠, 홉킨톤의 세라젠 인크)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

VEGF 저해제, 예를 들어 SU-5416 및 SU-6668(USA, 캘리포니아, 사우쓰 샌프란시스코의 수젠 인크)이 또한 화학식 1의 화합물과 배합되거나 공동-투여될 수 있다. VEGF 저해제는 예를 들어, WO 99/24440(1999년 5월 20일 공개), PCT 국제출원 PCT/IB99/00797(1999년 5월 3일 출원), WO 95/21613(1995년 8월 17일 공개), WO 99/61422(1999년 12월 2일 공개), 미국특허 제5,834,504호(1998년 11월 10일 등록), WO 98/50356(1998년 11월 12일 공개), 미국특허 제5,883,113호(1999년 3월 16일 등록), 미국특허 제5,886,020호(1999년 3월 23일 등록), 미국특허 제5,792,783호(1998년 8월 11일 등록), WO 99/10349(1999년 3월 4일 공개), WO 97/32856(1997년 9월 12일 공개), WO 97/22596(1997년 6월 26일 공개), WO 98/54093(1998년 12월 3일 공개), WO 98/02438(1998년 1월 22일 공개), WO 99/16755(1999년 4월 8일 공개), 및 WO 98/02437(1998년 1월 22일 공개)에 기재되어 있고, 이들 그 전체로 참조에 의해 본원에 도입된다. 어느 구체적 VEGF 저해제의 다른 예는 IM862(USA, 워싱턴, 커크랜드의 사이트란 인크); 항-VEGF 모노클로날 항체 베바시주맵(캘리포니아, 사우쓰 샌프란시스코의 제넨테크, 인크); 리보자임(콜로라도, 볼더)과 카이론(캘리포니아, 에머리빌)로부터의 합성 리보자임인 앤지오자임(angiozyme)™이다.

GW-282974(글락소 웰컴 plc) 및 모노클로날 항체 AR-209(USA, 텍사스, 더 우드랜즈의 아로넥스 파마슈티칼즈 인크) 및 2B-1(카이론)과 같은 ErbB2 수용체 저해제는 화학식 1의 화합물과 병용하여 투여될 수 있다. 그러한 erbB2 저해제는, 각각 그 전체로 참조에 의해 본원에 도입되는 WO 98/02434(1998년 1월 22일 공개), WO 99/35146(1999년 7월 15일 공개), WO 99/35132(1999년 7월 15일 공개), WO 98/02437(1998년 1월 22일 공개), WO 97/13760(1997년 4월 17일 공개), WO 95/19970(1995년 7월 27일 공개), 미국특허 제5,587,458호(1996년 12월 24일 공개) 및 미국특허 제5,877,305호(1999년 3월 2일 등록)에 기재된 것들을 포함한다. 본 발명에서 유용한 ErbB2 수용체 저해제는 또한, 둘다 그 전체로 참조에 의해 본원에 도입되는 1999년 1월 27일 출원된 미국 가출원 제60/117,341호 및 1999년 1월 27일 출원된 미국 가출원 제60/117,346호에 기재되어 있다.

사용될 수 있는 다른 항증식제는 아래 미국 특허출원: 09/221946(1998년 12월 28일 출원); 09/454058(1999년 12월 2일 출원); 09/501163(2000년 2월 9일 출원); 09/539930(2000년 3월 31일 출원); 09/202796(1997년 5월 22일 출원); 09/384339(1999년 8월 26일 출원); 및 09/383755(1999년 8월 26일 출원)에 개시되고 청구되어 있는 화합물, 및 아래 미국 가특허출원: 60/168207(1999년 11월 30일 출원); 60/170119(1999년 12월 10일 출원); 60/177718(2000년 1월 21일 출원); 60/168217(1999년 11월 30일 출원), 및 60/200834(2000년 5월 1일 출원)에 개시되고 청구되어 있는 화합물을 포함하는, 효소 파네실 단백질 트랜스퍼라제의 저해제와 수용체 티로신 키나제 PDGFr의 저해제를 포함한다. 각각의 상기 특허출원과 가특허출원은 그들 전체로 참조에 의해 본원에 도입된다.

화학식 1의 화합물은 또한 CTLA4(세포독성 림프구 항원 4) 항체와 같은 항종양 면역반응을 증진시킬 수 있는 약제, 및 CTLA4를 차단할 수 있는 다른 약제; 및 다른 파네실 단백질 트랜스퍼라제 저해제와 같은 항-증식제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 비정상적 세포 성장 또는 암을 치료하는데 유용한 다른 약제와 함께 사용될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 구체적 CTLA4 항체는, 그 전체로 참조에 의해 본원에 도입되는 미국 가출원 제60/113,647호(1998년 12월 23일 출원)에 기재된 것들을 포함한다.

다른 태양에서, 본 발명은 화학식 1의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 프로드럭, 및 치료적 유효량의 도세탁셀을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

다른 태양에서, 본 발명은 화학식 1의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 프로드럭, 및 치료적 유효량의 도세탁셀을 포유류에게 투여함으로써, 인간을 포함하는 포유류에서 비정상적 세포 성장을 치료하는 방법을 제공한다. 화학식 1의 화합물 및 도세탁셀은 원하는 바와 같이, 별도로 또는 동일한 조성물 내에서 투여될 수 있고, 동일한 투약 일정 또는 상이한 투약 일정으로 투여될 수 있다.

정의

본원에 사용된 "비정상적 세포 성장"은 다르게 표시되지 않으면, 정상 조절 기작에 독립적인 세포 성장(예를 들어, 접촉 저해의 상실)을 말한다. 이것은 (1) 돌연변이된 티로신 키나제의 발현이나 수용체 티로신 키나제의 과잉발현에 의해 증식하는 종양 세포(종양); (2) 이상 티로신 키나제 활성화가 일어나는 다른 증식성 질환의 양성 및 악성 세포; 및 (3) 수용체 티로신 키나제에 의해 증식하는 임의의 종양의 비정상적 성장을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "치료하는"은 다르게 표시되지 않으면, 그러한 용어가 적용되는 장애나 증상, 또는 그러한 장애나 증상의 하나 이상의 징후를 반전, 완화, 진행을 저해하거나 예방하는 것을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "치료"는 다르게 표시되지 않으면, "치료하는"이 바로 위에서 정의된 바와 같이 치료하는 작용을 말한다.

본원에 사용된 어구 "약제학적으로 허용되는 염(들)"은, 다르게 표시되지 않으면 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 자연에서 염기성인 화합물은 다양한 무기 및 유기산과 광범위한 염을 형성할 수 있다. 그러한 염기성 화합물의 약제학적으로 허용되는 산 부가염을 제조하는데 사용될 수 있는 산은 비독성 산 부가염, 즉, 아세테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이카보네이트, 바이설페이트, 바이타르트레이트, 보레이트, 브로마이드, 칼슘 에데테이트, 캠실레이트, 카보네이트, 클로라이드, 클라뷸라네이트, 시트레이트, 디하이드로클로라이드, 에데테이트, 에디스리에이트, 에스톨레이트, 에실레이트, 에틸석시네이트, 퓨마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루타메이트, 글리콜릴아르사닐레이트, 헥실레소르시네이트, 하이드라바민, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 요오다이드, 이소티오네이트, 락테이트, 락토비오네이트, 라우레이트, 말레이트, 말레에이트, 만델레이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 뮤케이트, 나프실레이트, 니트레이트, 올리에이트, 옥살레이트, 파모에이트(엠보네이트), 팔미테이트, 판토테네이트, 포스페이트/디포스페이트, 폴리갈락튜로네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 수바세테이트, 석시네이트, 탄네이트, 타르트레이트, 테오클레이트, 토실레이트, 트리에티오도드, 및 발레레이트 염과 같은 약제학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 염을 형성하는 것들이다.

본원에 사용된 용어 "프로드럭"은, 다르게 표시되지 않으면 투여 후, 생체내에서 일부 화학적 또는 생리적 과정을 통해 약물을 방출하는 약물 전구체인 화합물을 의미한다(예를 들어, 생리적 pH로 된 프로드럭은 원하는 약물 형태로 전환된다).

본 발명은 또한, 하나 이상의 원자가 자연에서 보통 발견되는 원자량이나 질량수와 상이한 원자량이나 질량수를 갖는 원자에 의해 대체된 사실을 제외하고는 화학식 1에 언급된 것들과 동일한, 동위원소-표지된 화합물을 포함한다. 본 발명의 화합물에 도입될 수 있는 동위원소의 예는 각각 ²H, ³H, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸O, ¹⁷O, ³¹P, ³²P, ³⁵S, ¹⁸F 및 ³⁶Cl과 같은 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 불소 및 염소의 동위원소를 포함한다. 위에서 언급된 동위원소 및(또는) 다른 원자의 다른 동위원소를 함유하는 본 발명의 화합물, 그의 프로드럭, 및 상기 화합물이나 상기 프로드럭의 약제학적으로 허용되는 염 및 용매화물은 본 발명의 범위 내에 있다. 본 발명의 동위원소-표지된 특정 화합물, 예를 들어 ³H 및 ¹⁴C와 같은 방사성 동위원소가 도입된 것들은 약물 및(또는) 기질 조직 분포 어세이에 유용하다. 삼중수소, 즉 ³H, 및 탄소-14, 즉 ¹⁴C 동위원소는 그들의 제조의 용이성과 검출가능성으로 인해 특히 바람직하다. 또한, 이중수소, 즉 ²H와 같은 더 무거운 동위원소로의 치환은 더 큰 대사 안정성, 예를 들어 생체내 반감기의 증가 또는 용량 요구의 감소로부터 초래되는 특정 치료적 장점을 제공할 수 있고, 따라서 일부 상황에서 바람직할 수 있다. 본 발명의 화학식 1의 동위원소 표지된 화합물 및 그의 프로드럭은 일반적으로, 동위원소 표지되지 않은 시약을 용이하게 입수가능한 동위원소 표지된 시약으로 치환하여 표지되지 않은 화합물에 대해 기재된 과정을 수행함으로써 제조될 수 있다.

도 1은 ¹⁴C-표지된 화합물의 단일 경구 투약 후 개에서 확인된 화학식 1의 화합물의 대사물을 보여준다.

도 2는 ¹⁴C-표지된 화합물의 단일 경구 투약 후 마우스에서 확인된 화학식 1의 화합물의 대사물을 보여준다.

화학식 1의 화합물은 그들 전체로 참조에 의해 본원에 도입되는 미국특허 제6,531,491호 및 제6,534,524호(각각 2003년 3월 11일과 2003년 3월 18일에 등록)에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 특정 출발물질은 당업자에게 익숙한 방법에 따라 제조될 수 있고, 특정한 합성의 변형은 당업자에게 익숙한 방법에 따라 행해질 수 있다.

화학식 1의 화합물은 다양한 무기 및 유기산과 광범위하게 상이한 염들을 형성할 수 있다. 그러한 염은 포유류에게 투여하기 위해 약제학적으로 허용되는 것이어야 하지만, 실제로 약제학적으로 허용되지 않는 염으로서 반응 혼합물로부터 화학식 1의 화합물을 최초로 분리한 후 알칼리성 시약으로 처리하여 이를 유리 염기 화합물로 간단히 전환시키고, 이어서 이 유리 염기를 약제학적으로 허용되는 산 부가염으로 전환하는 것은 흔히 바람직하다. 본 발명의 염기 화합물의 산 부가염은 수성 용매 매질이나 메탄올이나 에탄올과 같은 적당한 유기 용매 중에서, 염기 화합물을 실질적으로 균등한 양의 선택된 무기 또는 유기산으로 처리함으로써 쉽게 제조된다. 용매를 조심스럽게 증발시킨 후, 원하는 고체 염이 쉽게 수득된다. 원하는 산 염은 또한, 용액에 적절한 무기 또는 유기산을 첨가함으로써 유기 용매 중의 유리 염기의 용액으로부터 침전시킬 수 있다.

화학식 1의 화합물의 투여는 작용 위치로 화합물을 전달할 수 있는 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 이들 방법은 경구 경로, 십이지장내 경로, 비경구 주사(정맥내, 피하, 근육내, 혈관내 또는 주입 포함), 국소 및 직장 투여를 포함한다.

화합물은 예를 들어, 경구 투여를 위해 정제, 캡슐, 환제, 분말, 서방성 제제, 용액, 현탁제로서, 비경구 주사를 위해 멸균 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로서, 국소 투여를 위해 연고 또는 크림으로서, 또는 직장 투여를 위해 좌제로서 적당한 형태로 제공될 수 있다. 화합물은 정확한 용량의 단일 투여를 위해 적당한 단위 제형에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 제형은 통상적인 약제학적 담체나 부형제, 및 활성 성분으로서 화학식 1의 화합물을 포함한다. 또한, 제형은 다른 의학적 또는 약제학적 물질, 담체, 애쥬번트 등을 포함할 수 있다.

예시적 비경투 투여 형태는 멸균 수용액, 예를 들어 수성 프로필렌글리콜 또는 덱스트로스 용액 중의 용액 또는 현탁액을 포함한다. 그러한 제형은 원하는 경우, 적당하게 완충될 수 있다.

적당한 약제학적 담체는 불활성 희석제 또는 충전제, 물 및 다양한 유기 용매를 포함한다. 제약 조성물은 원하는 경우, 향미제, 결합체, 부형제 등과 같은 부가적인 성분을 함유할 수 있다. 따라서 경구 투여를 위해, 시트르산과 같은 다양한 부형제를 함유하는 정제가 전분, 알긴산, 및 특정 복합체 실리케이트와 같은 다양한 붕해제와 함께, 수크로스, 젤라틴 및 아카시아와 같은 결합제와 함께 사용될 수 있다. 부가적으로, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 라우릴 설페이트 및 탈크와 같은 활택제가 흔히 타정 목적을 위해 유용하다. 유사한 타입의 고체 조성물이 또한 연질 및 경질 충전된 젤라틴 캡슐에서 사용될 수 있다. 그를 위해 바람직한 재료는 락토스나 유당 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 경구 투여를 위해 수성 현탁액이나 엘릭시르가 필요한 경우, 그 중의 활성 화합물은 물, 에탄올, 프로필렌글리콜, 글리세린, 또는 그들의 배합물과 같은 희석제와 함께 다양한 감미제나 향미제, 착색제나 염료, 및 원하는 경우 유화제나 현탁제와 배합될 수 있다.

본 발명의 제형의 바람직한 태양에서, 제형은 경구 제형, 보다 바람직하게는 정제나 캡슐이다.

본 발명의 방법의 바람직한 태양에서, 화학식 1의 화합물은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 경구 제형을 사용하여 경구로 투여된다.

방법은 임의의 원하는 용량 투여계획을 이용하여 화학식 1의 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 일 구체적 태양에서, 화합물은 1일 당 1회(quaque die, 또는 QD), 바람직하게는 1일 당 2회(bis in die, 또는 BID) 투여된다(더 또는 덜 빈번한 투여가 본 발명의 범위 내에 있지만). 화합물은 바람직하게는 절식 상태에서(투여 전후 2 시간 내에 식품이나 음료를 섭취하지 않음) 인간을 포함하는 포유류에게 투여될 수 있다. 특히 바람직한 태양에서, 용량은 BID, 절식이다.

특정량의 화학식 1의 화합물을 갖는 다양한 제형을 제조하는 방법은 당업자에게 알려져 있거나 명백할 것이다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easter, Pa., 15판(1975)을 참조.

AUC 혈장 값은 다양한 시간 간격으로, 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광측정(LC-MS/MS)에 의해서와 같이 화학식 1의 화합물이나 그의 활성 대사물의 혈장 농도를 직접 측정하고, 혈장 농도 대 시간 곡선 아래의 면적을 계산함으로써 결정될 수 있다. AUC를 계산하는 적당한 방법은 예를 들어, 부등변사각형 근사법의 이용과 같이, 당업계에 잘 알려져 있다.

상기 식에서, n은 데이터 포인트의 수이고, t_i와 C_i는 i번째 데이터 포인트의 시간 및 농도(x와 y값)이다. 24-시간 AUC 값은 투약 일정에 따라 측정된 혈장 농도를 정규화함으로써 결정될 수 있다. 소듐 바이설파이트가 농도 표준의 제조를 위한 재구성 용액에서 안정화제로 첨가된다.

화학식 1의 화합물은 VEGF-R, FGF-R, CDK 복합체, CHK1, CSF-R 및(또는) LCK와 관련된 키나제 활성의 변조 및(또는) 저해에 관한 우수한 성질을 갖는다.

아래 실시예에 나타내어진 바와 같이, 화학식 1의 화합물은 시험관내에서 HUVEC 아폽토시스(apoptosis)를 유도할 수 있고, HUVEC에서 VEGF 매개된 Akt와 eNOS 인산화를 저해할 수 있고, 화합물의 사용을 중지한 후 HUVEC에서 VEGFR-2 인산화에 대한 지속적 저해 효과를 나타낼 수 있고, 기질 단백질 피브로넥틴 상에서 PDGF BB 유도된 암세포 이동을 저해할 수 있다. 화학식 1의 화합물은 이동과 침범을 저해함으로써 PDGFR-주도된 종양 진행에 대한 활성을 가질 수 있다.

화학식 1의 화합물은 또한 탁솔™, 보다 바람직하게는 도세탁셀과 병용되었을 때 종양 성장 저해에서 더 효과적인 활성을 나타낸다. 어느 한 약제의 단독 보다는 공동-요법에서 더 현저한 종양 퇴화가 관찰되었다.

본 발명은 추가로 화학식 1의 화합물을 투여함으로써 예를 들어, 포유류 조직에서 단백질 키나제 활성을 변조하거나 저해하는 방법에 관한 것이다. 단백질 키나제 활성의 변조제로서의 본 발명의 화합물의 활성, 예를 들어 키나제 활성은 생체내 및(또는) 시험관내 어세이를 포함하는 당업자에게 이용가능한 방법 중 어느 것에 의해 측정될 수 있다. 활성 측정을 위한 적당한 어세이의 예는 Parast C. 등, BioChemistry, 37, 16788-16801(1998); Jeffrey 등, Nature, 376, 313-320(1995); WIPO 국제공개번호 WO 97/34876; 및 WIPO 국제공개번호 WO 96/14843에 기재된 것들을 포함한다. 이들 성질은 예를 들어, 아래 실시예에 기재된 생물학적 시험 과정 중 하나 이상을 사용하여 측정될 수 있다.

아래 제공되는 실시예 및 제조예는 본 발명의 제형과 방법을 추가로 설명하고 예시한다. 본 발명의 범위는 아래 실시예에 의해 어떤 식으로든 제한되지 않음이 이해되어야 한다.

실시예 1

화학식 1의 화합물을 (1) 다수의 일정: sid, 주말 투약 휴일 및 간헐적 투약 하에서 생체내 효능; (2) 이종이식 모델에서 도세탁셀과 병용되었을 때의 효능; (3) 내피 세포에서 시험관내 eNOS 및 Akt 인산화; (4) 세포 배양물 및 생체내에서 니트로 옥사이드 및 관련 산물의 농도; 및 (5) 화합물에 대한 잠재적 생체마커로서의 전체 혈액 세포에서 c-Kit 신호의 사용에 대해 시험하였다.

생물학적 시험; 효소 어세이

VEGF, FGF 및 기타와 같은 성장 인자에 의한 세포 증식의 자극은 그들 각각의 수용체의 티로신 키나제의 각각 자가인산화의 유도에 의존적이다. 따라서, 이들 성장 인자에 의해 유도된 세포 증식을 차단하는 단백질 키나제 저해제의 능력은 수용체 자가인산화를 차단하는 그의 능력과 직접적으로 상관되어 있다. 화합물의 단백질 키나제 저해 활성을 측정하기 위하여, 아래 제작물이 고안되었다.

어세이를 위한 VEGF-R2 제작물: 이 제작물은 티로신 키나제 활성을 저해하는 시험 화합물의 능력을 결정한다. 키나제 삽입 도메인의 68 잔기 중 50 중심 잔기가 결여된 인간 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGF-R2)의 시토졸 영역의 제작물(VEGF-R2Δ50)을 배큘로바이러스/곤충 세포 시스템에서 발현하였다. 전장 VEGF-R2의 1356 잔기 중, VEGF-R2Δ50은 잔기 806-939 및 990-1171과, 또한 야생형 VEGF-R2에 비해 키나제 삽입 도메인 내에 하나의 점 돌연변이(E990V)를 함유한다. 정제된 제작물의 자가인산화를 4 ℃에서 2 시간 동안, 5% 글리세롤 및 5 mM DTT를 함유하는 100 mM HEPES, pH 7.5 중의 3 mM ATP 및 40 mM MgCl₂ 존재 하에서 4 μM 농도의 효소의 인큐베이션에 의해 수행하였다. 자가인산화 후, 이 제작물은 야생형 자가인산화된 키나제 도메인 제작물과 본질적으로 균등한 촉매 활성을 갖는 것으로 나타났다. Parast 등, Biochemistry, 37, 16788-16801(1998) 참조.

어세이를 위한 FGF-R1 제작물: 인간 FGF-R1의 세포내 키나제 도메인을 Mohammadi 등, Mol. Cell. Biol., 16, 977-989(1996)의 잔기 넘버링 시스템에 따라, 내생적 메티오닌 잔기 456으로부터 출발하여 글루타메이트 766까지 배큘로바이러스 벡터 발현 시스템을 이용하여 발현시켰다. 부가적으로, 제작물은 또한 아래 3개의 아미노산 치환을 갖는다: L457V, C488A 및 C584S.

어세이를 위한 LCK 제작물: LCK 티로신 키나제를, N-말단에 아래 두 아미노산 치환을 갖는, 아미노산 잔기 223으로부터 출발하여 잔기 509 단백질의 끝까지의 N-말단 결실물로서 곤충 세포에서 발현시켰다: P233M 및 C224D.

어세이를 위한 CHK-1 제작물: C-말단에 His-태그된 전장 인간 CHK-1(FL-CHK-1)을 배큘로바이러스/곤충 세포 시스템을 이용하여 발현시켰다. 그것은 476 아미노산 인간 CHK-1의 C-말단에 6개의 히스티딘 잔기(6×His-태그)를 함유한다. 단백질을 통상적인 크로마토그래피 기술에 의해 정제하였다.

어세이를 위한 CDK2/사이클린 A 제작물: CDK2를 배큘로바이러스 발현 벡터로 감염된 곤충 세포로부터 공개된 방법을 이용하여 정제하였다(Rosenblatt 등, J. Mol. Biol., 230, 1317-1319(1993)). 사이클린 A를 전장 재조합 사이클린 A를 발현하는 E. 콜라이 세포로부터 정제하고, 말단절단된 사이클린 A 제작물을 제한된 단백분해에 의해 생성하고 이미 설명된 바와 같이 정제하였다(Jeffrey 등, Nature, 376, 313-320(1995)).

어세이를 위한 CDK4/사이클린 D 제작물: 인간 CDK4와 사이클린 D3의 복합체, 또는 사이클린 D1과 인간 CDK4 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제의 융합 단백질(GST-CDK4)의 복합체를 상응하는 배큘로바이러스 발현 벡터로 공동-감염된 곤충 세포로부터 전통적인 생화학적 크로마토그래피 기술을 이용하여 정제하였다.

VEGF-R2 어세이: 커플링된 분광광도측정(FLVK-P) 어세이

포스포릴 전달을 수반하는 ATP로부터의 ADP의 생산을 포스포에놀피루베이트(PEP) 및 피루베이트 키나제(PK)와 락틱 데하이드로게나제(LDH)를 갖는 시스템을 사용하여 NADH의 산화와 커플링시켰다. NADH의 산화를 벡크만 DU 650 분광광도계로 340 ㎚에서의 흡광도(ε₃₄₀ = 6.22 ㎝^-1mM^-1)의 감소를 따라 모니터링하였다. 인산화된 VEGF-R2Δ50(아래 표에서 FLVK-P로 표시된)에 대한 어세이 조건은 아래와 같았다: 1 mM PEP; 250 μM NADH; 50 유닛의 LDH/㎖; 20 유닛의 PK/㎖; 5 mM DTT; 5.1 mM 폴리(E₄Y₁); 1 mM ATP; 및 200 mM HEPES, pH 7.5 중의 25 mM MgCl₂. 비인산화된 VEGF-R2Δ50(아래 표에서 FLVK로 표시된)에 대한 어세이 조건은 아래와 같았다: 1 mM PEP; 250 μM NADH; 50 유닛의 LDH/㎖; 20 유닛의 PK/㎖; 5 mM DTT; 20 mM 폴리(E₄Y₁); 3 mM ATP; 및 200 mM HEPES, pH 7.5 중의 60 mM MgCl₂ 및 2 mM MnCl₂. 어세이를 5 내지 40 nM의 효소로 시작하였다. 변화하는 농도의 시험 화합물 존재 하에 효소 활성을 측정하여 K_i 값을 결정하였다. 데이터를 효소 동력학 및 칼레이다그래프(Kaleidagraph) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

ELISA 어세이: 포스포가스트린의 형성을 기질로서 바이오티닐화된 가스트린 펩티드(1-17)를 이용하여 모니터링하였다. 바이오티닐화된 포스포가스트린을 스트렙타비딘 코팅된 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 이용하여 고정화한 후 호스래디쉬 퍼옥시다제에 컨쥬게이션된 항-포스포티로신-항체를 이용하여 검출하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제의 활성을 2,2'-아지노-디-[3-에틸벤자티아졸린 설포네이트(6)] 디암모늄 염(ABTS)을 이용하여 모니터링하였다. 전형적 어세이 용액은 2 μM 바이오티닐화된 가스트린 펩티드; 5 mM DTT; 20 μM ATP; 26 mM MgCl₂; 및 200 mM HEPES, pH 7.5 중의 2 mM MnCl₂를 함유하였다. 어세이를 0.8 nM의 인산화된 VEGF-R2Δ50으로 시작하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제 활성을 ABTS, 10 mM을 이용하여 어세이하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제 반응을 산(H₂SO₄) 첨가로 중지시킨 후, 405 ㎚에서 흡광도를 판독했다. 변화하는 농도의 시험 화합물 존재 하에 효소 활성을 측정하여 K_i 값을 결정하였다. 데이터를 동력학 및 칼레이다그래프 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

FGF-R 어세이: 아래와 같은 농도 변화를 제외하고는, VEGF-R2에 대해 상기된 바와 같이 분광광도측정 어세이를 수행하였다: FGF-R = 50 nM, ATP = 2 mM 및 폴리(E₄Y₁) = 15 mM.

LCK 어세이: 아래와 같은 농도 변화를 제외하고는, VEGF-R2에 대해 상기된 바와 같이 분광광도측정 어세이를 수행하였다: LCK = 60 nM, MgCl₂ = 0 mM, 폴리(E₄Y₁) = 20 mM.

CHK-1 어세이: 합성 기질 펩티드 신타이드-2(PLARTLSVAGLPGKK)로의 포스포릴 전달을 수반하는 ATP로부터의 ADP의 생산을 피루베이트 키나제(PK)와 락틱 데하이드로게나제(LDH)의 작용을 통해 포스포에놀피루베이트(PEP)를 사용하여 NADH의 산화와 커플링시켰다. NADH의 산화를 HP8452 분광광도계를 이용하여 340 ㎚에서의 흡광도(ε₃₄₀ = 6.22 ㎝^-1mM^-1) 감소를 따라 모니터링하였다. 전형적인 반응 용액은 4 mM PEP; 0.15 mM NADH; 28 유닛의 LDH/㎖; 16 유닛의 PK/㎖; 3 mM DTT; 0.125 mM 신타이드-2; 0.15 mM ATP; 및 50 mM 트리스, pH 7.5 중의 25 mM MgCl₂; 및 400 mM NaCl을 함유하였다. 어세이를 10 nM의 FL-CHK-1으로 시작하였다. 변화하는 농도의 시험 화합물 존재 하에 최초 효소 활성을 측정함으로써 K_i 값을 결정하였다. 데이터를 효소 동력학 및 칼레이다그래프 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

HUVEC 증식 어세이: 이 어세이는 인간 탯줄 정맥 내피 세포("HUVEC")의 성장 인자-자극된 증식을 저해하는 시험 화합물의 능력을 결정한다. HUVEC 세포(계대 3-4, 클로네틱스, 코포레이션)를 T75 플라스크에서 EGM2 배양 배지(클로네틱스 코포레이션)에서 해동시켰다. 24 시간 후 신선한 EGM2 배지를 플라스크에 가하였다. 4 또는 5 일후, 세포를 다른 배양 배지(10% 우태아혈청(FBS), 60 ㎍/㎖ 내피세포 성장 보충물(ECGS) 및 10 ㎍/㎖ 헤파린으로 보충된 F12K 배지)에 노출시켰다. 대수적으로 성장하고 있는 HUVEC 세포를 그 후 실험에 사용하였다. 10,000 내지 12,000 HUVEC 세포를 100 ㎕의 풍부한(rich), 배양 배지(상기한)에 96-웰 디쉬에 플레이트하였다. 세포를 이 배지에서 24 시간 동안 부착하도록 하였다. 그 후 배지를 흡인 제거하고 115 ㎕의 기아 배지(F12K + 1% FBS)를 각 웰에 가하였다. 18 시간 후, 기아 배지 중의 1% DMSO에 용해된 15 ㎕의 시험 물질 또는 이 비히클을 단독으로 각 처리 웰에 가하였다; 최종 DMSO 농도는 0.1%였다. 1 시간 후, 기아 배지 중의 20 ㎕의 150 ng/㎖ hrVEGF₁₆₅를 무처리된 대조군을 포함하는 것을 제외한 모든 웰에 가하였고, 최종 VEGF 농도는 20 ng/㎖였다. MTT 염료 환원으로 72 시간 후에 세포 증식을 정량하고, 그 때 세포를 4-5 시간 동안 MTT(프로메가 코포레이션)에 노출시켰다. 정지 용액(프로메가 코포레이션)을 첨가하여 염료 환원을 정지시키고, 570 및 630 ㎚에서의 흡광도를 96-웰 분광광도계 플레이트 리더 상에서 결정하였다.

암세포 증식(MV522) 어세이: 단백질 키나제 저해제가 암을 치료하기 위해 혈관신생을 차단하는데 치료적 유용성을 가지는지 여부를 결정하기 위해서는, 저해제가 키나제 수용체를 발현하지 않는 세포에서 세포 증식을 비특이적으로 차단하지 않음을 증명하는 것이 중요하다. 이는 암세포를 이용하여 증식 어세이를 수행함으로써 행해진다. 암세포에서 세포 증식을 측정하는 프로토콜은 HUVEC 세포에서 측정을 위해 사용된 것과 유사하다. 2000 폐암세포(UCSD로부터 얻은, MV522주)를 성장 배지(2 mM 글루타민과 10% FBS로 보충된 RPMI1640 배지)에 접종하였다. 세포를 시험 물질 및(또는) 비히클을 첨가하기 전 1 일 동안 부착하도록 하였다. 세포를 HUVEC 어세이에 사용된 동일한 시험 물질로 동시에 처리하였다. 세포 증식을 시험 물질에 노출한 지 72 시간 후에 MTT 염료 환원 어세이로 정량했다.

C-Kit 효능 결정: NCI-H526(ATCC) 세포를 저해제에 의한 c-Kit에 대한 효능을 결정하기 위해 사용하였다. 세포를 포화 미만(sub-confluency)까지 성장시키고 18 시간 동안 기아 배지에서 인큐베이션하였다. 저해제를 가하고 세포를 2.3% 알부민과 1 mM Na₃VO₄(시그마)의 존재 하에 37 ℃에서 45 분간 인큐베이션하였다. SCF, c-Kit 성장 인자를 배양물에 50 ng/㎖의 최종 농도로 가하였다. 5 분후 세포를 냉 PBS로 2× 헹구고 용해(lysis) 완충액(50 mM 트리스, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF, 1% NP40, 1 mM Na₃VO₄ 및 프로테아제 저해제 칵테일)에서 용해시켰다. 각 용해물로부터의 1 ㎎의 총 단백질을 이용하여 면역침전을 수행하고, 4 ℃에서 4 ㎍/㎖ CD117 ab-3(K45, 네오마커즈)와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날 아침 항체 복합체를 단백질 A 비드에 컨쥬게이션시켰다. SDS PAGE와 웨스턴 블랏 분석을 1:1000의 인산화된 수용체에 대한 항-포스포티로신 항체 4G10(업스테이트 바이오테크놀로지), 또는 항-c-Kit 수용체 항체 sc-1493(C-14, 산타 크루즈)을 이용하여 수행하였다. 블랏을 화학발광 시약 ECL 플러스로 가시화하였다. 인영상화기(phosphorimager, 스톰 846, 몰레큘라 다이나믹스)를 블랏에 있는 신호의 정량을 위해 사용하였다.

동물과 포유류의 전체 말초혈액 세포에서 c-kit 양성 세포의 감소를 화학식 1의 화합물의 활성에 대한 생체마커로 이용할 수 있다.

ENOS 및 Akt 인산화 측정: HUVEC(클로네틱스)을 저해제에 의한 eNOS 및 Akt에 대한 효능을 결정하기 위해 사용하였다. 세포를 포화 미만까지 성장시키고 18 시간 동안 기아 배지에서 인큐베이션하였다. 저해제를 가하고 세포를 2.3% 알부민과 1 mM Na₃VO₄(시그마) 존재 하에 37 ℃에서 45 분간 인큐베이션하였다. 배양 배지에 VEGF를 50 ng/mL로 첨가했다. 5 분후 세포를 냉 PBS로 2× 헹구고 용해 완충액(50 mM 트리스, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF, 1% NP40, 1 mM Na₃VO₄ 및 프로테아제 저해제 칵테일)에서 용해시켰다. 30-40 ㎍의 총 단백질을 웨스턴 방법에 의해 분석하였다. eNOS 및 Akt 인산화를 포스포-eNOS(Ser 1177) #9571 또는 포스포-Akt(Ser 473) #9271 항체(둘 다 셀 시그널링으로부터)를 이용하여 측정하였다. 단백질은 NOS3(C-20) sc-654(산타 크루즈) 또는 Akt 항체 #9272(셀 시그널링)을 이용하여 검출하였다. 모두 1:3000으로 사용되는 항 토끼 HRP 결합된 이차 항체를 필요로 한다. 블랏을 화학발광 기질 슈퍼 시그널 웨스트 듀라(피어스)로 가시화하였다. 알파 이노테크로부터의 알파 영상화기 8800을 블랏에 있는 신호의 정량을 위해 사용하였다.

마우스 PK 어세이: 마우스에서 약물의 약동력학(예를 들어, 흡수와 제거)을 아래 실험을 이용하여 분석하였다. 시험 화합물을 0.5% CMC 비히클 중의 현탁액이나 30:70(PEG400:산성화된 H₂O) 비히클 중의 용액으로 제제화하였다. 이 현탁액 또는 용액을 경구(p.o.) 또는 복강내(i.p.)로 C3H 암컷 마우스(n=4)에게 투여하였다. 혈액 샘플을 시점: 투약 후 0 시간(투약 전), 0.5 시간, 1.0 시간, 2.0 시간 및 4.0 시간에 안와 출혈을 통해 수집하였다. 2500 rpm에서 5 분간 원심분리하여 각 샘플로부터 혈장을 수득하였다. 혈장으로부터 유기 단백질 침전 방법으로 시험 화합물을 추출하였다. 각 출혈시마다 50 ㎕의 혈장을 1.0 ㎖의 아세토니트릴과 배합하고, 2 분간 볼텍싱한 후 4000 rpm에서 15 분간 회전시켜 단백질을 침전시키고 시험 화합물을 추출시켰다. 다음으로, 아세토니트릴 상등액(시험 화합물을 함유하는 추출물)을 새로운 시험관에 붓고 N₂ 기체 증기 하에 열판(25 ℃) 위에서 증발시켰다. 건조된 시험 화합물 추출물을 함유하는 각 튜브에 125 ㎕의 이동상(60:40, 0.025 M NH₄H₂P0₄ + 2.5 ㎖/ℓ TEA:아세토니트릴)을 가하였다. 시험 화합물을 볼텍싱에 의해 이동상에 재현탁하고, 4000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 더 많은 단백질을 제거하였다. UV 검출기를 갖는 휴렛 팩커드 1100 시리즈 상에서의 시험 화합물 분석을 위해 각 샘플을 HPLC 바이알에 부었다. 각 샘플로부터, 95 ㎕를 페노메넥스-프로디지(Phenomenex-Prodigy) 역상 C-18, 150×3.2 ㎜ 칼럼 상에 주입하고 10 분에 걸쳐 45-50% 아세트니트릴 구배 흐름으로 용출하였다. 시험-화합물 혈장 농도(㎍/㎖)를 상기한 방법으로 혈장 샘플로부터 추출된 공지된 농도의 시험 화합물을 이용한 표준 곡선(피크 면적 대 농도 ㎍/㎖)과 비교하여 결정하였다. 표준 및 미지의 그룹과 함께, 분석의 일관성을 보증하기 위하여 세 그룹(n=4)의 정성 대조군(0.25 ㎍/㎖, 1.5 ㎍/㎖ 및 7.5 ㎍/㎖)을 실행하였다. 표준 곡선은 R2 > 0.99를 가졌고 정성 대조는 모두 그들의 예측값의 10% 이내에 있었다. 정량된 시험 샘플을 칼레이다그래프 소프트웨어를 이용하여 가시적 디스플레이를 위해 플로팅하고 그들의 약동력학 지수를 윈 논린(WIN NONLIN) 소프트웨어를 이용하여 결정하였다.

인간 간 마이크로좀(HLM) 어세이: 인간 간 마이크로좀에서의 화합물 대사를 아래와 같은 LC-MS 분석 어세이 과정으로 측정하였다. 먼저, 인간 간 마이크로좀(HLM)을 해동시키고 냉 100 mM 인산칼륨(KPO₄) 완충액으로 5 ㎎/㎖로 희석하였다. 적절한 양의 KP0₄ 완충액, NADPH-재생 용액(B-NADP, 글루코스-6-포스페이트, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 및 MgCl₂ 함유), 및 HLM을 37 ℃에서 10 분간 13×100 ㎜ 유리관에서 예비-인큐베이션하였다(시험 화합물 당 3 튜브 - 3개 한벌). 시험 화합물(최종 5 μM)을 각 튜브에 가하여 반응을 개시하고 온화한 볼텍싱에 의해 혼합한 후, 37 ℃에서 인큐베이션하였다. t=0, 2 시간에, 250-㎕ 샘플을 각 인큐베이션 튜브로부터 제거하여 1 mM 빙냉 아세토니트릴을 0.05 μM 레세르핀과 함유하는 12×75 ㎜ 유리관으로 분리하였다. 샘플을 4000 rpm에서 20 분간 원심분리하여 단백질과 염을 침전시켰다(벡크만 알레그라 6KR, S/N ALK98D06, #634). 상등액을 새로운 12×75 ㎜ 유리관으로 옮기고 스피드-백(Speed-Vac) 원심분리 진공 증발기로 증발시켰다. 샘플을 0.1% 포름산/아세토니트릴(90/10) 200 ㎕에서 재구성하고 강하게 볼텍싱하여 용해시켰다. 그 후 샘플을 별도의 폴리프로필렌 미세원심분리관으로 옮기고 14000×g에서 10 분간 원심분리하였다(피셔 마이크로 14, S/N M0017580). 각 시점(0 및 2 시간)에 각 복제물(#1-3)에 대해, 각 시험 화합물의 분취 샘플을 하기하는 LC-MS 분석을 위한 단일 HPLC 바이알 삽입물(총 6개 샘플)로 합쳤다.

합쳐진 화합물 샘플을 휴렛-팩커드 HP1100 다이오드 어레이 HPLC와 양성 전자분무 SIR 모드(각 시험 화합물의 분자 이온을 특이적으로 스캐닝하도록 프로그램된)로 운전하는 마이크로매스 쿼트로 Ⅱ 트리플 쿼드러플 질량 분광계로 이루어진 LC-MS 시스템에 주입하였다. 각 시험 화합물 피크를 각 시점에 통합하였다. 각 화합물에 대해 각 시점에서의 피크 면적(n=3)을 평균하고, 2 h에서의 이 평균 피크 면적을 0 시간에서의 평균 피크 면적으로 나누어 2 h에 남아있는 백분율 시험 화합물을 얻었다.

시험관내 HUVEC 아폽토시스 어세이

ELISA에 의한 아폽토시스의 정량: HUVEC 세포의 아폽토시스를 세포 용해물 중 세포질 히스톤-관련 DNA 단편을 정량하는 세포 사멸 검출 Elisa 플러스(카탈로그 #1775425, 로슈 바이오케미컬즈, 독일, 만하임)를 이용하여 측정하였다. 제조자의 지시를 약간 변형하여 방법을 수행하였다. 간략하게는, 굶주린 HUVEC 세포를 VEGF(20 ng/㎖) 존재 하에 다양한 농도의 화합물 A로 처리하였다. 다양한 시점에서 세포의 세포질 분획을 수집하고, 마이크로타이터 플레이트에 코팅된 일차 항-히스톤 mAb와 퍼옥시다제에 커플링된 이차 항-DNA mAb를 이용하는 샌드위치 ELISA에서 항원 출처로 사용하였다. 발색 퍼옥시다제 기질을 첨가하고 405 ㎚(기준 파장 490 ㎚)에서 분광광도계로 흡광도를 측정하여 아폽토시스 세포의 수를 결정하였다.

TUNEL에 의한 아폽토시스의 가시화: 아폽토시스 세포의 동소(in situ) 검출을 TdT-매개 dUTP 닉크 말단 표지(TUNEL) 기술을 이용하여 수행하였다. 간략하게, 8 웰 랩-테크 챔버 슬라이드에서 키운 HUVEC 세포를 밤새(O/N) 기근시킨 후 다양한 농도의 화합물 A로 6 시간 동안 처리하였다. 그런 다음 세포를 4% 파라포름알데히드에 고정하고, 트리톤 X-100으로 투과화(permeabilization)하여 말단 트랜스퍼라제와 플루오레세인-dUTP를 포함하는 뉴클레오티드의 혼합물(데드엔드(Deadend) 형광측정 TUNEL 시스템, 프로메가, 카탈로그 #G3250)에서 제조자의 지시에 따라 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 프로피디움 요오다이드(PI) 용액으로 반대염색하였다. 양성으로 염색된 플루오로세인과 PI 표지된 세포를 가시화하고 형광 현미경으로 촬영하였다.

PDGF 매개 세포 이동 어세이: U87MG 세포를 이 어세이에 사용하였다. 6개의 웰 플레이트를 0.5 ng/㎖ 피브로넥틴과 밤새 예비-인큐베이션하였다. 다음 날 U87MG 세포를 각 웰에 플레이트하고 포화(confluence)까지 성장하도록 했다. 세포를 0.1% FBS를 함유하는 기아 배지와 밤새 인큐베이션하였다. 피펫 팁으로 ∼1 ㎝ 스크래치를 만들고 세포를 기아 배지로 세척하였다. 그런 다음, 플레이트를 0.5 ng/㎖ 피브로넥틴과 1 시간 동안 인큐베이션한 후 다시 세척하였다. 기아 배지 중에 100 ng/LI rhPDGF BB 및 화합물 A를 함유하는 실험 배지를 도입하였다. 0 내지 15 시간 사이에 세포를 촬영하고 이동을 가시화하였다.

세포 VEGFR-2 및 하류 분자 인산화 어세이: HUVECs(클로네틱스)를 포화 미만까지 배양하고 기아 배지(F12K + 0.1% FBS)에서 18 시간 동안 인큐베이션하였다. 화합물 A를 2.3% 알부민 및 1 mM Na₃VO₄(시그마)의 존재 하에 세포에 가하였다. 45 분후, VEGF를 배양물에 50 ng/㎖의 최종 농도로 가하였다. 5 분후 세포를 냉 PBS로 헹구고 용해 완충액(50 mM 트리스, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF, 1% NP40, 1 mM Na₃V0₄ 및 프로테아제 저해제 칵테일)에서 용해시켰다. 용해물로부터 1 밀리그램의 총 단백질을 항-Flk-1 C-1158(산타 크루즈)을 이용하여 면역침전시켰다. 항체 복합체를 단백질 A 비드에 컨쥬게이션시키고 SDS PAGE/웨스턴 분석을 수행하였다. 인산화된 VEGFR-2 및 단백질을 각각 항 포스포티로신 항체 4G10(업스테이트 바이오테크놀로지)와 항-Flk-1 C-20(산타 크루즈)를 각각 이용하여 검출하였다. eNOS와 Akt에 대해, 세포를 위와 동일하게 처리하였다. 총 30-40 ㎍의 단백질을 이용하여 웨스턴 분석을 수행하였다. eNOS와 Akt 인산화를 포스포-eNOS(Ser 1177, #9571) 또는 포스포-Akt(Ser 473, #9271) 항체(셀 시그널링)를 이용하여 표지하였다. 단백질을 NOS3 C-20(sc-654, 산타 크루즈) 또는 Akt 항체 #9272(셀 시그널링)를 이용하여 측정하였다. HRP 결합된 항-토끼 IgG를 이차 항체로 사용하였다. 모든 블랏을 화학발광 기질 슈퍼 시그널 웨스트 듀라(피어스)를 이용하여 가시화하였다. 신호를 알파 이노테크로부터의 알파 영상화기 8800을 이용하여 정량하였다.

워시아웃(Washout) 실험: HUVEC 세포를 상기한 바와 같이 처리하였다. 화합물 A(10 nM)로 45 분간 인큐베이션하고 VEGF(50 ng/㎖)로 5 분간 자극한 후, 상등액을 제거하고 세척하여 VEGF와 Na₃VO₄를 함유하는 기아 배지로 교체하였다. 용해하고 인산화 및 전체 VEGFR-2에 대한 면역침전 및 웨스턴을 이용하여 처리하기 전에(상기 참조) 원하는 시간 동안 세포를 추가로 인큐베이션하였다. 다른 실험에서, 세포를 상기한 바와 같은 전체 시간 동안 VEGF로 처리하고 원하는 시점에 VEGFR-2 인산화와 총 VEGFR-2를 유사하게 측정하였다. 워시아웃 동안 신호를 밀도계로 정량하였다. 각 실험으로부터의 최대 자극(5 분)의 강도를 서로 정규화하고 각 시점에서의 포스포-VEGFR-2의 강도를 두 실험 간에 비교하여, 처리하지 않았지만 VEGF-자극된 세포에 대한 VEGFR-2 인산화 회복을 측정할 수 있도록 하였다.

종양 모델: 인간 MV522(결장암) 및 MDA-MB-231(유방암) 모델에 대해, 무흉선 마우스(n = 8∼12)에 5×10⁶ 세포/위치를 이식하였다(s.c.). 쥐 루이스 폐암 모델에 대해서는, 종양 단편(1-2 ㎟)을 B6D2F1 마우스의 오른쪽 옆구리에 투관침(trocar)-이식하였다. 투약은 보통 7 일(MV522) 또는 평균 종양 크기가 150-200 ㎣에 도달하였을 때(MDA-MB-231) 시작하였다.

화학식 1의 화합물을 0.5% CMC/H₂0에 제제화하고 PO, BID로 투여하였다. 도세탁셀을 7% EtOH/3% 폴리소르베이트/90% H₂O에 제제화하고 매주 정맥내로 투약하였다. 처리는 보통 3-4 주간 지속되었다. 종양의 기하학적 길이와 폭을 전자 캘러퍼를 이용하여 주 3회 측정하였다. 종양 부피를 0.4×[길이×(폭)²]으로 계산하였다. 데이터는 평균±SEM으로 보고하였다. 연구 끝에, 종양과 조직을 절제하고 칭량하여, 분석을 위해 수집하였다. 약물 농도의 분석을 위해 혈장을 수집하였다.

결과는 표 1-3에 나타내어져 있다.

화합물 1의 효능 및 선택성
표적	효소 활성, K_i(nM)	수용체 인산화, IC₅₀(nM)^a
VEGFR-2(KDR)	1.1	0.25
VEGFR-1(Flt-1)	8.3	1.2^b
VEGFR-3(Flt-4)	nd	0.29
PDGFR-β	1.3	2.5
c-Kit	nd	2
FGFR-1	56	218
^a 세포 증식 어세이에 의해 측정; ^b IP/IB에 의해 2.3% 알부민 존재하에 측정; nd: 결정되지 않음.

스크리닝되었지만 K_i 계산을 위한 한계 위인 다른 효소는 cMet, LCK, c-Src, FAK, Pyk2, IRL, BTK, CDK1, CDK2, CDK4, PKA, PKC, PLK 및 Chk1였다.

MDA-MB-231 인간 유방암 모델에서 화합물 1과 도세탁셀의 공동-투여에 대한 연구 설계
화합물 1(㎎/㎏)^a	도세탁셀^b	용량 선택 근거
25	0	ED₉₀
5	0	ED₅₀
1	0	저용량
0	20	마우스에 대한 70% MTD
0	10	인간 MTD에 균등하게 계산
0	2	저용량
25	20	내성 및 DDI
5	10	상가성(additivity) 및 DDI
5	2	상가성 및 DDI
1	10	상가성 및 DDI
1	2	상가성 및 DDI
^a po, bid, 매일; ^b iv, 1회/주

도세탁셀과 화합물 1의 병용 요법이 MDA-MB-231 이종이식 모델에서 더 큰 항-종양 활성을 나타냈다.
화합물 1(㎎/㎏)^a	도세탁셀^b	PR^*	CR^**
0	0	0	0
25	0	3	0
5	0	3	0
1	0	0	0
0	20	4	0
0	10	6	0
0	2	0	0
25	20	12	0
5	10	10	2
1	10	7	2
5	2	0	0
1	2	0	0
^a po, bid, 매일; ^b iv, 1회/주

병용 그룹은 완전 및 부분적인 종양 퇴화 발생의 증가를 나타냈다. 종양 성장 속도는 약제를 병용하였을 때 더 큰 정도로 감소하였다. 병용 치료는 단일 약제 단독과 동일하게 잘 견뎌졌다.

실시예 2

화학식 1의 화합물, 6-[2-(메틸카바모일)페닐설파닐]-3-E-[2-(피리딘-2-일) 에테닐]인다졸을 고형암을 갖는 환자에게 변화하는 용량으로 투여하였다. 30명의 환자(13명의 남성, 17명의 여성)를 경구 제형, 정제 형태의 화학식 1의 화합물을 BID 또는 QD 일정으로 이용하여 치료하였다. 주기는 각각 28 일이었다. 구체적 종양 진단은 유방(11), 갑상선(5), 신세포(5), 폐(4) 및 기타(5)였다. 약동력학 데이터를 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광계(LC-MS/MS)로 측정하였다. 혈액 샘플을 투여 시간으로부터 1/2 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 8 시간 및 12 시간의 시점에 주기의 15 일에 채취하였다.

약동력학 결과(15 일 평균값)를 표 4에 나타내었다. 환자는 다르게 표시되지 않으면 절식하지 않았다. 괄호 안의 숫자는 백분율로 표현된 변화 계수이다. 표에서, C_max는 화학식 1의 화합물의 최대 관찰 혈장 농도이고, AUC(0-24)는 24-시간 AUC 혈장 농도이고, T_1/2는 농도 대 시간 플랏으로부터 결정된 반감기이다. 표제 "PK를 갖는 환자 #"는 약동력학 데이터가 얻어진 환자의 수를 가리킨다.

투약 일정 및 양	환자 #/PK를 갖는 환자 #	C_max(ng/㎖)	AUC(0-24)(ng·hr/㎖)	T_1/2(hr)
5 ㎎ BID	6/6	27.1(36)	257(39)	2.2(16)
5 ㎎ BID 절식	8/6	54.5(48)	311(76)	2.7(39)
15 ㎎ QD	6/6	78.6(54)	797(96)	3.5(46)
20 ㎎ BID	4/3	129.4(86)	1524(87)	3.1(51)

또한, 제1 코호트(n = 6)에 있는 환자는 10 ㎎ QD 내지 30 ㎎ BID(PK는 나타내지 않음) 범위의 개별화된 투약을 받았다. 절식 대 급식 상태에서, 혈장 노출은 더 높았고(약 49%) 환자-내 가변성은 감소되었다. 현재 최대 허용 용량(MTD)은 5 ㎎ BID 절식으로 결정되었다. MTD 보다 높은 용량에서 용량-제한 독성(DLTs)은 고혈압(HTN), 발작, 상승된 간 기능 시험치, 췌장염, 질식 및 위염이었다. 또한, NSCLC를 갖는 2명의 반응 환자는 화합물 치료 중지 후 1/3 주에, 치명적인 각혈을 일으켰다. 비-용량 제한적 단백뇨도 관찰되었다. MTD 미만 또는 그와 동일한 용량에서, DLT는 1 환자에서 2급 위염으로 제한되었다. 비-용량-제한적 HTN이 7/14 환자에서 관찰되었고 통상적인 고혈압 의약에 의해 관리되었다. RECIST 기준에 의한 두 지속적 부분 반응이 관찰되고(신세포와 상악동의 선양낭성암종) 이 격심하게 예비치료된 집단의 5 환자에서 4 개월(4-13+ 개월 범위) 이상 안정한 질병이 지속하였다. dceMRI를 이용하여, 21 환자의 예비 분석을 수행하여 기저, 및 2, 28 및 56 일에 화학식 1의 화합물에 의해 유도되는 혈관 효과를 측정하였다. 평균 K^trans(P. S. Tofts, G. Brix, D. L. Buckley, J. L. Evelhoch, E. Henderson, M. V. Knopp, H. B. W. Larsson, T. Lee, N. A. Mayr, G. J. M. Parker, R. E. Port, J. Taylor 및 R. M. Weisskoff, Estimating Kinetic Parameters from Dynamic Contrast-Enhanced T₁-Weighted MRI of a Diffusable Tracer: Standardized Quantities and Symbols, Journal of Magnetic Resonance Imaging, 10: 223-232 (1999))와 조영 강도 X 시간 곡선(IAUC) 하 최초 면적에서의 백분율 변화를 각 지수 종양에 대해 계산하였다(환자 당 n = 1-4). 종양 혈관 반응을 2 일까지 기저 지수 값에서의 50% 이상의 감소로 정의하였다. 종양 혈관 반응에서의 급성(2 일) 감소(K^trans와 IAUC에서의 50% 이상의 감소)가 6/18 평가가능한 환자에서 관찰되었고, 11/18는 K^trans와 IAUC 둘다에서 40% 이상의 감소를 나타내었다. 스캔이 갖는 기술적 문제로 인해, 영상 세트는 평가불가능하였다. 이 실시예는 화학식 1의 화합물이 임상 반응 및 급성 종양 혈관 변화에 의해 입증된 바 매우 활성적인 약제임을 보여준다.

실시예 3

손상되지 않거나 담도-캐뉼라 삽입된 비글 개에게 30 ㎎ 유리 염기/㎏ 용량의 [¹⁴C]-표지된 화학식 1의 화합물을 경구 투여한 후, 현저한 대사가 관찰되었다. 생체변환 경로는 산소화(모노- 또는 디-), 글루큐로니드화, 글루코실화 및 산소화 후 설페이트화 또는 글루코실화를 포함하였다. 도 1은 확인된 대사물을 보여준다. 혈장에서, M12(N-산화물)가 검출가능한 유일한 대사물이다. 뇨에서, M5(데피리디닐 카르복실산)가 주요 대사물이다. 주요 담즙 대사물은 M8(설페이트)와 M12를 포함한다. 주요 분변 대사물 M1의 화학 구조는 미지로 남아있다.

화합물의 단일 경구 투약 후 비글 개에서 [¹⁴C]-유래된 방사성의 배설 양상은 수컷과 암컷에 대해 유사하였고, 방사성이 분변을 통해 일차적으로 배설되었다. 손상되지 않은 수컷에 대한 평균 회수는, 손상되지 않은 암컷에 대해 분변에서의 80.9% 및 뇨에서의 7.0%의 회수에 비해 분변에서 85.5% 및 뇨에서 5.3%였다. 담도-캐뉼라 삽입된 수컷 개는 담즙에서 상대적으로 작은 분획의 방사성(8.3% 회수)을 배출하였고, 분변(52.7%) 및 뇨(11.3%)에서 부가적인 방사성이 회수되었다. 담도-캐뉼라 삽입된 개로부터의 뇨 및 담즙 방사성의 합친 총계는 투여된 방사성의 대략 20%가 위장 흡수되었음을 암시한다. 모든 샘플에서 총 평균 회수는 손상되지 않은 수컷 및 암컷에 대해 각각 92.4% 및 92.6%였고, 담도-캐뉼라 삽입된 수컷에 대해 89.6%였다. 모든 대사물의 프로파일화 및 구조 규명은 래디오-HPLC 검출기(β-RAM)와 전자분무(ESI)와 양성 또는 음성 모드의 대기압 화학적 이온화(APCI) 출처를 갖는 MS 검출기와 인라인으로 커플된 HPLC를 이용하여 수행하였다.

실시예 4

화학식 1의 화합물은 [¹⁴C]-표지된 화합물의 단일 경구 투여 후 CD-1 마우스에서 현저하게 대사된다. 낮은 백분율의 변화되지 않은 약물이 뇨와 분변에서 회수되었고, 다양한 Ⅰ기 및 Ⅱ기 대사물이 관찰되었다. 생체변환 경로는 산소화(모노- 또는 디-), 글루큐로니드화, 글루코실화 및 산소화 후 글루큐로니드화 또는 글루코실화를 포함하였다. 확인된 대사물은 도 2에 나타내어져 있다. 혈장에서, 변화되지 않은 약물과 M12(N-옥사이드)가 두 주요 성분이다. M7(글루큐로니드)은 뇨와 분변 모두에서 가장 중요한 대사물이다.

50 ㎎ 유리 염기/㎏ 용량의 [¹⁴C] AG-013736을 수컷 CD-1 마우스에게 단일 경구 투여한 후, 대부분의 [¹⁴C]-유래된 방사성은 분변에서 회수되었다. 투약 48 시간 후에 방사성의 평균(n = 2) 회수(%용량)는 분변에서 65.8%, 뇨에서 12.7%였다. 배설물에서 방사성의 제거속도는 신속하여 투약 후 24 시간 내에 ∼72%의 용량이 회수되었다. 대사물의 방사성 프로파일화 및 구조 특성분석은 LC-RAM-MS 방법으로 수행하였다.

도 1 및 2에 나타낸 대사물 이외에, 기타 공지된 대사물은 화학식 1a에 나타낸 활성 des-메틸 대사물을 포함한다.

실시예 5

면역조직화학으로 종양 미세혈관 밀도(MVD)를 측정하여 혈관신생을 평가하였다. 동결된 종양 단편을 혈관 표면 마커 CD-31에 대해 염색하고, 조직 단편의 몇몇 구역에 있는 혈관의 양을 수동으로 정량하였다. 연구 결과, 2 내지 3 주간 화학식 1의 화합물의 PO BID 투여는 대조 종양에 비해 치료된 종양에서 혈관의 수를 70% 감소시킨 것으로 나타났다. 치료 후의 이러한 미세혈관 밀도의 감소는 LLC, MV522 및 M24met를 포함하여 사용된 모든 종양 모델에서 관찰되었다. LLC 종양 모델에서 삼투압 알젯(Alzet) 펌프로 전달할 때, 화학식 1의 화합물은 성장을 현저하게 저해하였다. 세 연구로부터의 데이터는 LLC 모델에서 이 분류의 물질에 의해 달성될 수 있는 최대 종양 성장 저해가 78%임을 나타내었다. 55±17 ng/㎖(N = 3)정도의 낮은 혈장 농도에서 90%의 최대 성장 저해가 달성되었다. 이 농도를 생물학적 활성 농도(BAC)로 명명했다. 50% 최대 성장 저해는 28±11 ng/㎖(N = 3)의 혈장 농도와 관련되었다. 이 농도를 최소 효능 농도(MEC)로 명명했다. 동일한 연구에서 PO BID 투약 후 720 ng·hr/㎖의 AUC_(0-24)가 40% 최대 성장 저해(MGI)을 일으킨 반면, 1 연구 그룹에서, 화합물의 연속적 주입으로 나타난 70%의 MGI는 574 ng·hr/㎖의 AUC(0-24)와 관련되었다. 이들 결과는 이 모델에서 보여진 항종양 효능이 최저(trough) 농도에 의해 결정되고 마우스에서, 지속적인 낮은 농도의 화합물이 최대 항종양 효능을 나타내기에 충분할 수 있음을 암시한다.

화학식 1의 화합물은 인간 유방암 이종이식 모델 MDA-MB-231에서 단일 약제로서 효과적이었다. 이 모델에서 화학식 1의 화합물과 도세탁셀의 배합물을 이용한 효능 연구를 위한 준비에서, 무투약 누드 마우스에서의 예비 연구를 수행하여 PK에 대한 잠재적 약물-약물 상호작용의 효과와 내성을 결정했다. 15 또는 30 ㎎/㎏ 도세탁셀을 3 주간 1 주당 1회 IV 투여한 후, 대조군과 비교한 체중 감소(각각 7% 및 11%)를 도세탁셀-처리된 동물에서 확인하였다. 도세탁셀 단독 처리된 동물과 도세탁셀 및 화학식 1의 화합물(16 일간 30 ㎎/㎏/일; PO)의 배합물이 제공된 동물 사이에 체중 차이는 관찰되지 않았다. 도세탁셀 투여는 화학식 1의 화합물의 AUC에 영향을 미치지는 않았지만, AG-013736의 C_max 값이 화학식 1의 화합물 단독과 비교하여 병용 그룹에서 현저하게 감소했다.

선택된 조직(간, 신장, 심장, 비장, 위, 소장 및 대장, 난소, 흉골, 관절)의 조직학적 검사가 이 연구에서 단일 약제로서 화학식 1의 화합물을 처리한 마우스에서 표적 기관 영향을 밝히지 못하였다. 도세탁셀-처리된 마우스에서 관찰된 변화는 난포 괴사와 최소 내지 중등도의 골수 저세포성(hypocellularity)을 포함하였다. 화학식 1의 화합물과 도세탁셀의 병용 처리는 난소에 대한 도세탁셀의 영향을 악화시키지 않았지만, 화학식 1의 화합물/도세탁셀 배합물이 제공된 동물에서 골수 저세포성 강도의 증가가 관찰되었다(최소 내지 중간). 또한, 증가된 강도의 저세포성의 이차적 효과와 같이, 골수 출혈이 병용-처리된 동물에서 관찰되었다.

화학식 1의 화합물과 도세탁셀을 MDA-MB-231 종양 모델에서 효능 측정을 위해 병용하였다. 화학식 1의 화합물 단독(25, 5 및 1 ㎎/㎏, PO, BID, 3 주간 제공)은 용량-의존적 종양 성장 저해를 일으켰다. 2 ㎎/㎏은 아니지만, 20 및 10 ㎎/㎏의 도세탁셀 단독(IV, 매주) 또한 효과적이었다. 화학식 1의 화합물과 도세탁셀 사이에 유익한 치료적 상호작용이 있을 수 있는 것 같다. 이러한 이점은 고용량 및 중간 용량 모두에서 약물을 병용할 때 보다 명백하였다. 고- 및 중-용량 병용 아암(arms)에서 부분적 퇴화(종양 크기에서 16% 내지 97% 감소)와 완전한 반응의 발생은, 동일한 용량에서 개개 약제 단독의 그룹에서보다 훨씬 더 컸다. 연구의 제한된 그룹과 상대적으로 짧은 시한으로 인해, 이것은 결정적인 발견은 아니다. 화학식 1의 화합물은 모든 용량에서 잘 견뎌졌다. 모든 다른 그룹에 비해, 화학요법제의 세번째 투약 후 고-용량 병용 그룹(25 ㎎/㎏의 화합물 1 및 20 ㎎/㎏의 도세탁셀)에서 평균 체중의 3 내지 7%가 감소하였다. 약동력학 분석은 화학식 1의 화합물의 AUC 값이 도세탁셀 존재 하에 영향을 받지 않지만, C_max 값은 화학식 1의 화합물 단독 그룹에 비해 병용 그룹에서 현저하게 감소되었음을 입증하고 있다.

도세탁셀과 결합된 화학식 1의 화합물의 항-종양 효능을 LLC 모델에서 조사하였다. LLC 모델은 도세탁셀에 대해 내성이 매우 높다. 보고된 MTD(30 ㎎/㎏ 주 용량, iv)에서, 이 세포독성제로는 종양 성장 지연(TGD)이 거의 나타나지 않았다(TGD = 3.2 일). 큰 원발성 종양으로 인해 모든 마우스를 실험 28일 내에 안락사시켰다. 반대로, 화학식 1의 화합물 단독 약제는 용량-의존적이고 통계학적으로 유의한 TGD(10 ㎎/㎏에서 13.4 일 및 30 ㎎/㎏에서 15.4 일, PO, BID)를 생성하였다. 그러나, 약제는 폐로의 전이를 지연시킬 뿐, 중지시키지 못하였다. 저용량 병용 그룹(TGD = 15.2 일)은 아니지만, 고용량 병용 그룹의 TGD(20.4 일)는 단일 약제 단독 중 어느 하나와 통계학적으로 상이하였다(각각 P = 0.0079 및 P = 0.254). 더 많은 동물(3/10)이 고용량 병용 그룹에서 목적 종점에 도달하였지만, 저용량 병용 그룹에서는 그렇지 않았다. 결론적으로, 화학식 1의 화합물과 도세탁셀의 고용량 병용 요법은 어느 단일요법 단독보다 원발성 종양 성장과 전이를 더 지연시킬 수 있지만, 완전히 치료하지는 못하였다.

MV522 종양 모델을 이용하는 한 연구는 단일 1일(QD) 60 ㎎/㎏ PO 용량의 화학식 1의 화합물이 30 ㎎/㎏ PO, BID가 했던 것과 유사한 종양 성장 저해 효과를 일으킴을 입증하였다(p = 0.154). 또한, 동일한 투약 농도를 사용한 매일 PO BID와 비교하여, 연속 5일 동안 30 ㎎/㎏의 PO, BID에 이어서 투약 휴일 2일로 투약되었을 때 항종양 효능은 떨어지지 않는 것 같았다(p = 0.223). 이들 결과는 비임상 종양 모델에서, 화학식 1의 화합물에 QD 또는 특정의 임시 투약 일정을 제공하고 현저한 항종양 효능을 달성하도록 기대하는 것이 가능할 수 있음을 암시한다.

MV522 이종이식 모델에서 항-종양 효능을 생산하는데 요구되는 수용체 저해의 시간 양과 화학식 1의 화합물의 농도를 조사하였다. 그 결과, PO 투약으로(QD 또는 BID), EC₅₀(5 ng/㎖)을 초과하는 대략 24-시간의 매일 노출이 ≥50% 항종양 효능을 위해 필요한 것으로 나타났다. 90% 종양 성장 저해를 달성하기 위해서는 40-60 ng/㎖ 이상의 혈장 농도에서 최소 4-시간의 매일 노출이 필요하였다. 위 경계를 넘는 노출이 부가적인 효능을 보장하지는 못하였다. BID 또는 QD 그룹에서 유사한 체중 손실이 있었고, 둘 다 5% 미만이었다. 따라서, 적절한 용량과 노출 시간이 주어지면 QD 투여계획은 BID 투여계획 만큼 효과적일 수 있다.

알젯 펌프를 통해 연속적으로 노출시키는 것이 규칙적인 주기적 투약보다 화학식 1의 화합물에 의한 항종양 효능을 더 크게 나타낸다는 것도 입증되었다. 10 ㎎/㎖로 펌프로 전달하면 종양 정지를 일으키는 30 ng/㎖의 일정한 평균 전신 노출이 달성되었다. 반대로, 산출된 EC₉₀을 초과하는 화학식 1의 화합물의 혈장 농도를 생성하는 포화 용량(PO, BID)은 종양 성장 지연만을 달성할 수 있었다. 따라서, 화학식 1의 화합물의 지속적 전신 노출이 매일 2회 경구 투약 계획 보다 종양을 치료하는데 더 효과적인 것으로 나타났다.

간헐적 투약 계획에 의한 화학식 1의 화합물의 항-종양 효능도 연구하였다. 처리 그룹은 아래와 같았다: 매일 비히클 투여, 간헐적 비히클 투여, 30 ㎎/㎏의 일일 용량(BID), 및 30 ㎎/㎏의 간헐적 용량. 간헐적 투약 계획은 아래와 같았다: 주기-1(12∼18일 - 투약, 19∼28일 - 투약 중지), 및 주기 2(29∼36일 - 투약, 37∼44일 - 투약 중지). 평균 종양 크기가 250 ㎣일 때 투약을 시작하였고, 모두 AG-013736(PO, BID)을 투여했다. 전체적으로, 간헐적 및 매일 BID 투약 사이에 유의한 차이가 있었으며, 연속적인 매일 투약 계획이 성장을 지연시키는데 더 효과적이었다. 간헐적으로 투약된 약물 그룹에 대해, 종양은 투약이 중지된 뒤 3-4 일 이내에 다시 정상적인 성장 속도에 도달하였다. 그러나, 종양 성장 저해는 주기-2 투약 2 일내에 회복되었다. 예상된 바와 같이, 퇴화는 어느 그룹에서도 보이지 않았다.

본 발명을 구체적이고 바람직한 태양을 참조로 하여 설명하였지만, 당업자는 일상적인 실험과 본 발명의 실시를 통해 변화와 변형이 가해질 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 상기 설명에 의해 제한되지 않지만, 첨부된 청구범위와 그들의 균등물에 의해 정해지고자 의도된다.

Claims

화학식 1의 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물, 또는 그들의 혼합물을 포유류에게 투여한 후 25 내지 4500 ng·hr/㎖의 화학식 1의 화합물 또는 그의 활성 대사물의 24-시간 AUC 혈장 값을 제공하는데 유효한 양으로 포함하는, 포유류에게 투여하기 위한 제형.

<화학식 1>
제1항에 있어서, 24-시간 AUC 혈장 값이 100 내지 800 ng·hr/㎖인 제형.
제1항에 있어서, 경구 제형인 제형.
화학식 1의 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물, 또는 그들의 혼합물을 0.5 내지 30 ㎎의 양으로 포함하는 제형.

<화학식 1>
제4항에 있어서, 양이 2 내지 10 ㎎인 제형.
제4항에 있어서, 경구 제형인 제형.
포유류에게 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 제형을 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 비정상적 세포 성장을 치료하는 방법.
제7항에 있어서, 제형을 경구로 투여하는 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 제형을 1일 당 적어도 1회의 투약 빈도로 투여하는 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 제형을 1일 당 적어도 2회의 투약 빈도로 투여하는 방법.
제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류가 투여 단계 전 적어도 2 시간, 투여 단계 후 적어도 2 시간, 또는 투여 단계 전과 후 모두 적어도 2 시간 동안 절식하는 방법.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 비정상적 세포 성장이 암인 방법.
제12항에 있어서, 암이 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 결장암, 유방암, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 외음부암, 호치킨병, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연질 조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구성 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신세포암, 신우암, 중추신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 척수축암, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 및 그들의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 유사분열 저해제, 알킬화제, 항-대사물, 삽입성 항생제, 성장 인자 저해제, 세포 주기 저해제, 효소, 토포이소머라제 저해제, 생물학적 반응 변형제, 항체, 세포독성제, 항-호르몬, 항-안드로겐 및 그들의 혼합물로 구성된 군으부터 선택되는 항-종양제를 공동-투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 항-종양제가 도세탁셀인 방법.