상기한 본 발명의 목적들은 진세노사이드 F1과 EGCG 혼합물을 유효성분으로 함유하는 조성물의 형태로 구현될 수 있다. 본 발명에 의한 조성물은 피부 세포사멸 등에 관여하여 피부 노화 방지, 피부세포 활성 유지 등의 작용을 한다.
바람직하게는, 상기 진세노사이드 F1과 EGCG의 혼합물 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~10 중량%의 양으로 함유될 수 있다. 또한, 상기 진세노사이드 F1과 EGCG의 비율은 중량비로 1:0.1~10의 비율로 함유되는 것이 바람직하다.
보다 구체적으로, 본 발명은 진세노사이드 F1과 EGCG 혼합물을 유효성분으로 함유하는, 저선량의 자외선에 의해 유도되는 세포사멸 억제제를 제공한다.
또, 본 발명은 진세노사이드 F1과 EGCG 혼합물을 유효성분으로 함유하는, 자외선에 의해 감소되는 Bcl-2 발현 조절제를 제공한다.
또한, 본 발명은 진세노사이드 F1과 EGCG 혼합물을 유효성분으로 함유하는, 자외선에 의해 감소되는 Brn-3a 발현 조절제를 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
본 연구진에 의해, 진세노사이드 F1 자체는 Bcl-2의 발현을 증가시키지는 않지만 자외선에 의해 Bcl-2의 발현이 감소되는 것을 억제하는 것으로 확인되었다. 즉, 진세노사이드 F1은 Bcl-2의 전사조절인자인 Brn-3a의 발현을 조절함으로써 Bcl-2의 발현 농도를 정상세포 수준으로 유지하는 것이며, 이로 인해 저선량의 자외선에 의해 피부세포가 사멸되는 것을 방지할 수 있는 것이다. 한편, 고선량의 자외선 조사에 대해서는 Bcl-2 발현이 감소되어 세포사멸 과정이 그대로 진행되기 때문에, 피부암으로 발전하는 위험성을 제거할 수 있다.
또한, 본 연구진은 진세노사이드 F1이 상기한 효과에 있어서 EGCG와 상승 작용을 한다는 것을 후술하는 실시예를 통해 확인하였다. 보다 구체적으로, 단독 처리시에는 효과가 없는 낮은 농도의 두 화합물을 혼합하여 인간 피부세포주인 HaCaT 세포에 처리했을 때, 자외선 조사에 의해 감소되었던 Bcl-2의 발현이 정상적인 농도로 유지되며, 이를 통해 세포사멸이 억제된다는 것을 확인하였다. 또한, 이전의 연구 결과를 토대로 EGCG와의 상승 작용에 있어서도, 세포사멸 억제 효과가 Bcl-2에 특이적인 전사조절인자인 Brn-3a의 발현을 조절함으로써 일어난다는 것을 다시 한번 확인하였다. 더구나, 두 화합물을 동시에 처리했을 때에만, 암억제 단백질인 Rb의 탈인산화를 막아서 세포사멸을 억제하는 효과를 보였다. 위의 결과로부터 진세노사이드 F1과 EGCG는 낮은 농도로 사용하여도 서로 상승작용을 통하여 세포내에 항상 일정량의 Bcl-2의 농도가 유지될 수 있도록 하며, Rb 단백질의 탈인산화를 막아서 세포가 사멸되는 것을 방지하는 효능을 가진다는 것을 알 수 있다.
따라서, 진세노사이드 F1과 EGCG는 서로 상승 작용을 통하여 세포내에 항상 일정량의 Bcl-2의 농도가 유지될 수 있도록 하여 세포가 사멸되는 것을 방지할 수 있다. 또한, 진세노사이드 F1 자체는 Bcl-2의 발현을 증가시키지 않으므로 암 발생의 부작용 없이, 자외선에 의한 세포사멸을 억제, 세포손상을 방지하여 피부노화를 억제할 수 있는 물질로서의 활용 가능한 용도를 제공한다.
이에, 본 발명은 진세노사이드 F1과 EGCG 혼합물을 유효성분으로 함유하는 피부외용제 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 자외선에 의한 피부손상 및 이로 인한 피부노화를 억제하는 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 조성물은 화장료로 제형화될 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명에서 이용되는 진세노사이드 F1은 인삼으로부터 제조된 정제 사포닌을 물이나 완충용액과 같은 수성용매 또는 물이나 완충용액과 같은 수성용매와 유기용매의 혼합액에 용해시킨 후 페니실리움속에서 분리한 나린지나제 및 아스퍼질러스속에서 분리한 펙티나제 중 적어도 하나와 반응시킴으로써 얻은 화합물이다. 그러나, 진세노사이드 F1을 획득하는 방법에 있어서 위의 방법에 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리 범위가 이들 실시예에 한정되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.
<참조예 1> 인삼 정제 사포닌의 제조 :
홍삼(담배인삼공사, 6년산 홍삼) 2㎏에 물을 포함한 메탄올 4ℓ를 넣고, 3회 환류 추출한 후, 15℃에서 6일간 침적시켰다. 그 후, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압농축하였다. 농축액을 물에 현탁한 후에, 에테르 1ℓ로 5회 추출하여 색소를 제거하였다. 수층을 1-부탄올 500㎖로 3회 추출하여 얻은 1-부탄올층 전체를 5% KOH로 처리한 후 증류수로 세척하였다. 이어서, 감압농축하여 1-부탄올 추출액을 얻고, 이를 소량의 메탄올에 녹인 다음, 대량의 에틸아세테이트에 추가하였다. 얻은 침전물을 건조하여 인삼 정제 사포닌 70g을 얻었다.
<참조예 2> 진세노사이드 F1의 제조 :
참고예 1의 인삼 정제 사포닌 10g을 시트레이트 완충용액(pH4.0) 1000㎖에 용해시키고, 여기에 페니실리움속에서 분리한 나린지나제(Sigma, St. Louis, MO) 15g을 첨가하여 40℃의 수욕상에서 48시간 동안 교반시키면서 반응시켰다. 반응이 종료된 후 10분간 가열하여 효소를 실활시키고, 반응액은 동량의 에틸아세테이트로 3회 추출하여 농축하였다. 얻은 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (클로로포름:메탄올=9:1)로 분리하여 진세노사이드 F1 1.5g을 얻었다.
<실시예 1> 진세노사이드 F1과 EGCG 동시 처리에 의한 HaCaT 세포의 사멸 억제 효과 :
[단계 1] 세포주와 세포 배양
인체 피부 세포주(human keratinocyte)인 HaCaT(Dr. N.E. Fusenig(Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ), Heidelberg, Germany)로부터 구하였다)을 10% 우혈청을 포함한 DMEM 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Gibco 1210-0038)에서 배양하였고, 배양은 모두 37℃, 5% CO2 배양기에서 수행하였다.
[단계 2] 진세노사이드 F1과 EGCG 동시 처리에 의한, 자외선 조사시 유도되는 HaCaT 세포의 사멸 억제
단계 1에서 배양된 세포주를 트립신으로 처리하여 단일세포 현탁액을 만든 후, 6-well에 2´105개씩 분주하여 24시간 배양하였다. 그런 다음, 우혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지로 교환하여 다시 24시간 동안 배양한 후, 2mM의 진세노사이드 F1; 10mM의 EGCG; 2mM의 진세노사이드 F1과 10mM의EGCG를 혼합한 것; 5mM의 진세노사이드 F1; 및 50mM의 EGCG를 각각 처리하였다. 진세노사이드 F1은 100% 에탄올에 녹여서 항상 배지의 1/1000의 농도가 포함되도록 하였고, EGCG(Sigma)는 디메틸설폭시드(DMSO)에 녹여서 배지의 1/1000의 농도가 포함되도록 하였다. 24시간 동안 각 화합물들을 처리한 후, 인산완충용액(PBS)으로 세척하고, PBS를 넣은 상태에서 60mJ/㎠ 농도의 UVB를 조사하였다. 그런 다음 PBS를 버리고, 다시 같은 농도의 각 화합물이 포함된 배지로 교환하였다. 약물을 처리하지 않은 세포를 대조구로 동일하게 배양하였다.
자외선 조사 24시간 후, 각 화합물들을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT, Sigma) 용액을 넣고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이후 DMSO를 넣고 녹인 후 ELISA reader(Thermo Max, Molecular Devices Co.)를 이용하여 540㎚의 파장에서 형성된 포르마잔 다이의 광학적 농도(OD)을 측정하였다. 자외선을 조사하지 않은 세포의 OD값을 100%로 계산하여 상대적인 값을 세포의 생존수로 나타내었으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 보는 바와 같이, 2mM의 진세노사이드 F1 또는 10mM의EGCG를 단독으로 처리했을 때에는, 처리하지 않은 대조구와 비교하여, 자외선에 의해 사멸되는 세포수가 차이가 없었다. 그러나, 2mM의 진세노사이드 F1과 10mM의EGCG를 혼합하여 처리한 세포의 경우, 처리하지 않은 세포에 비교하여, 자외선에 노출되었을 때 약 2배 정도 세포 사멸이 억제되었다. 이것은 5mM의 진세노사이드 F1 단독 또는 50mM의 EGCG 단독을 각각 처리한 경우와 같은 정도의 세포 사멸 억제 효과를 보였다.
<실시예 2> 진세노사이드 F1과 EGCG 동시 처리에 의한 PARP 단백질의 절단 억제 효과 :
[단계 1] 세포주와 세포 배양
실험에 이용된 세포주와 세포 배양은 실시예 1의 단계 1에서와 동일하였다.
[단계 2] 진세노사이드 F1과 EGCG 동시 처리에 의한, 자외선 조사시 유발되는 PARP 단백질의 절단 억제
단계 1에서 배양된 세포주를 트립신으로 처리하여 단일세포 현탁액을 만든 후, 6-well에 2´105개씩 분주하여 24시간 배양하였다. 그런 다음, 우혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지로 교환하여 다시 24시간 동안 배양한 후, 2mM의 진세노사이드 F1; 10mM의 EGCG; 2mM의 진세노사이드 F1과 10mM의EGCG를 혼합한 것; 5mM의 진세노사이드 F1; 및 50mM의 EGCG를 각각 처리하였다. 진세노사이드 F1은 100% 에탄올에 녹여서 항상 배지의 1/1000의 농도가 포함되도록 하였고, EGCG(Sigma)는 DMSO에 녹여서 배지의 1/1000의 농도가 포함되도록 하였다. 24시간 동안 각 화합물들을 처리한 후, PBS로 세척하고, PBS를 넣은 상태에서 60mJ/㎠ 농도의 UVB를 조사하였다. 그런 다음 PBS를 버리고, 다시 같은 농도의 각 화합물이 포함된 배지로 교환하였다. 약물을 처리하지 않은 세포를 대조구로 동일하게 배양하였다.
자외선 조사 24시간 후, 약물들을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포를 PBS로 세척하고, 트립신을 처리하여 세포를 수거하였다. 여기에, 8M 우레아, 2% CHAPS, 50mM DTT, 2M 티오우레아(thiourea), 2mM PMSF 및 100㎍/㎕ 류펩틴(leupeptine)이 함유된 단백질 추출 완충용액 500㎕을 처리한 후 10분간 상온에서 방치하였다. 그런 다음, 4℃에서 10분간 15,000´g의 중력가속도로 원심분리하여 상층액을 수거한 후, BIO-Rad Protein Dye Reagent™을 이용하여 단백질을 정량하였다. 단백질 20㎍을 8% SDS-PAGE를 이용하여 크기별로 분리한 후, 50V로 12시간 동안 PDF(BioRad) 막에 블로팅하였다. 이 블롯을 5% 무지방 우유 용액으로 1시간 동안 블로킹한 후, 1차 항체로 polyclonal anti-PARP(Santa Cruz)를, 2차 항체로 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 anti-rabbit IgG(Amersham)를 이용하고, Amersham사의 ECL(enhanced chemiluminescence) 키트를 이용하여 항체 반응시켰다. 반응시킨 블롯은 X선 Fuji 필름에 감광시킨 후 현상하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 필름 상의 밴드는 PowerLook 2100 XL(UMAX)를 이용하여 스캐닝한 후, ImageMaster 2D Elite(Amersham Biosciences) 이미지 분석프로그램을 이용하여 분석하였다. PARP 단백질의 절단된 양은 대조구의 절단된 양을 기준으로 하여 상대적인 값으로 나타내었다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보는 바와 같이, 2mM의 진세노사이드 F1과 10mM의EGCG를 혼합하여 처리한 세포의 경우, 처리하지 않은 세포 또는 같은 농도의 각 화합물을 단독으로 처리했을 때와 비교하여, 자외선 조사에 의해 일어나는 PARP 단백질의 절단화 현상이 1.4배 정도 감소하였다.
<실시예 3> 진세노사이드 F1과 EGCG 동시 처리에 의한 Bcl-2의 발현 감소 억제 효과 :
[단계 1] 세포주와 세포 배양
실험에 이용된 세포주와 세포 배양은 실시예 1의 단계 1에서와 동일하였다.
[단계 2] 진세노사이드 F1과 EGCG 동시 처리에 의한, 자외선 조사시 유발되는 Bcl-2의 발현 감소 억제
단계 1에서 배양된 세포주를 트립신으로 처리하여 단일세포 현탁액을 만든 후, 6-well에 2´105개씩 분주하여 24시간 배양하였다. 그런 다음, 우혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지로 교환하여 다시 24시간 동안 배양한 후, 2mM의 진세노사이드 F1; 10mM의 EGCG; 2mM의 진세노사이드 F1과 10mM의EGCG를 혼합한 것; 5mM의 진세노사이드 F1; 및 50mM의 EGCG를 각각 처리하였다. 진세노사이드 F1은 100% 에탄올에 녹여서 항상 배지의 1/1000의 농도가 포함되도록 하였고, EGCG(Sigma)는 DMSO에 녹여서 배지의 1/1000의 농도가 포함되도록 하였다. 24시간 동안 각 화합물들을 처리한 후, PBS로 세척하고, PBS를 넣은 상태에서 60mJ/㎠ 농도의 UVB를 조사하였다. 그런 다음 PBS를 버리고, 다시 같은 농도의 각 화합물이 포함된 배지로 교환하였다. 약물을 처리하지 않은 세포를 대조구로 동일하게 배양하였다.
자외선 조사 24시간 후, 약물들을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포를 PBS로 세척하고, 트립신을 처리하여 세포를 수거하였다. 여기에, 8M 우레아, 2% CHAPS, 50mM DTT, 2M 티오우레아, 2mM PMSF 및 100㎍/㎕ 류펩틴이 함유된 단백질 추출 완충용액 500㎕을 처리한 후 10분간 상온에서 방치하였다. 그런 다음, 4℃에서 10분간 15,000´g의 중력가속도로 원심분리하여 상층액을 수거한 후, BIO-Rad Protein Dye Reagent™을 이용하여 단백질을 정량하였다. 단백질 20㎍을 8% SDS-PAGE를 이용하여 크기별로 분리한 후, 50V로 12시간 동안 PDF(BioRad) 막에 블로팅하였다. 이 블롯을 5% 무지방 우유 용액으로 1시간 동안 블로킹한 후, 1차 항체로 polyclonal anti-Bcl-2(Santa Cruz)를, 2차 항체로 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 anti-rabbit IgG(Amersham)를 이용하고, Amersham사의 ECL(enhanced chemiluminescence) 키트를 이용하여 항체 반응시켰다. 반응시킨 블롯은 X선 Fuji 필름에 감광시킨 후 현상하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 필름 상의 밴드는 PowerLook 2100 XL(UMAX)를 이용하여 스캐닝한 후, ImageMaster 2D Elite(Amersham Biosciences) 이미지 분석프로그램을 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 보는 바와 같이, 자외선을 조사했을 때, 약물을 처리하지 않은 세포의 경우, Bcl-2 단백질은 거의 발현되지 않았다. 2mM의 진세노사이드 F1 또는 10mM의 EGCG를 단독으로 처리했을 때에도 약물을 처리하지 않은 대조구와 비교하여 Bcl-2 발현에 큰 차이가 없었다. 그러나, 두 화합물을 동시에 처리한 세포의 경우 자외선을 조사했을 때도 조사하지 않은 경우와 비교하여 거의 차이가 없을 정도로 발현이 유지되었다. 즉, 두 화합물을 동시에 처리하면, 처리하지 않은 경우나 또는 각 화합물을 단독으로 처리했을 때와 비교하여 Bcl-2 단백질의 발현이 3배 정도 증가하였다.
<실시예 4> 진세노사이드 F1과 EGCG 동시 처리에 의한 Brn-3a의 발현 감소 억제 효과 :
[단계 1] 세포주와 세포 배양
실험에 이용된 세포주와 세포 배양은 실시예 1의 단계 1에서와 동일하였다.
[단계 2] 진세노사이드 F1과 EGCG 동시 처리에 의한, 자외선 조사시 유발되는 Brn-3a의 발현 감소 억제
단계 1에서 배양된 세포주를 트립신으로 처리하여 단일세포 현탁액을 만든 후, 6-well에 2´105개씩 분주하여 24시간 배양하였다. 그런 다음, 우혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지로 교환하여 다시 24시간 동안 배양한 후, 2mM의 진세노사이드 F1; 10mM의 EGCG; 2mM의 진세노사이드 F1과 10mM의EGCG를 혼합한 것; 5mM의 진세노사이드 F1; 및 50mM의 EGCG를 각각 처리하였다. 진세노사이드 F1은 100% 에탄올에 녹여서 항상 배지의 1/1000의 농도가 포함되도록 하였고, EGCG(Sigma)는 DMSO에 녹여서 배지의 1/1000의 농도가 포함되도록 하였다. 24시간 동안 각 화합물들을 처리한 후, PBS로 세척하고, PBS를 넣은 상태에서 60mJ/㎠ 농도의 UVB를 조사하였다. 그런 다음 PBS를 버리고, 다시 같은 농도의 각 화합물이 포함된 배지로 교환하였다. 약물을 처리하지 않은 세포를 대조구로 동일하게 배양하였다.
자외선 조사 24시간 후, 약물들을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포를 PBS로 세척하고, 트립신을 처리하여 세포를 수거하였다. 여기에, 8M 우레아, 2% CHAPS, 50mM DTT, 2M 티오우레아, 2mM PMSF 및 100㎍/㎕ 류펩틴이 함유된 단백질 추출 완충용액 500㎕을 처리한 후 10분간 상온에서 방치하였다. 그런 다음, 4℃에서 10분간 15,000´g의 중력가속도로 원심분리하여 상층액을 수거한 후, BIO-Rad Protein Dye Reagent™을 이용하여 단백질을 정량하였다. 단백질 20㎍을 8% SDS-PAGE를 이용하여 크기별로 분리한 후, 50V로 12시간 동안 PDF(BioRad) 막에 블로팅하였다. 이 블롯을 5% 무지방 우유 용액으로 1시간 동안 블로킹한 후, 1차 항체로 polyclonal anti-Brn-3a(Santa Cruz)를, 2차 항체로 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 anti-rabbit IgG(Amersham)를 이용하고, Amersham사의 ECL(enhanced chemiluminescence) 키트를 이용하여 항체 반응시켰다. 반응시킨 블롯은 X선 Fuji 필름에 감광시킨 후 현상하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 필름 상의 밴드는 PowerLook 2100 XL(UMAX)를 이용하여 스캐닝한 후, ImageMaster 2D Elite(Amersham Biosciences) 이미지 분석프로그램을 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 보는 바와 같이, Brn-3a 단백질은 자외선 조사에 의해 그 발현이 감소되었다가, 두 화합물을 동시에 처리했을 때만 다시 발현이 회복되었다.
<실시예 5> 진세노사이드 F1과 EGCG 동시 처리에 의한 Rb 단백질의 탈인산화 억제 효과 :
[단계 1] 세포주와 세포 배양
실험에 이용된 세포주와 세포 배양은 실시예 1의 단계 1에서와 동일하였다.
[단계 2] 진세노사이드 F1과 EGCG 동시 처리에 의한, 자외선 조사시 유발되는 Rb 단백질의 탈인산화 억제
단계 1에서 배양된 세포주를 트립신으로 처리하여 단일세포 현탁액을 만든 후, 6-well에 2´105개씩 분주하여 24시간 배양하였다. 그런 다음, 우혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지로 교환하여 다시 24시간 동안 배양한 후, 2mM의 진세노사이드 F1; 10mM의 EGCG; 2mM의 진세노사이드 F1과 10mM의EGCG를 혼합한 것; 5mM의 진세노사이드 F1; 및 50mM의 EGCG를 각각 처리하였다. 진세노사이드 F1은 100% 에탄올에 녹여서 항상 배지의 1/1000의 농도가 포함되도록 하였고, EGCG(Sigma)는 DMSO에 녹여서 배지의 1/1000의 농도가 포함되도록 하였다. 24시간 동안 각 화합물들을 처리한 후, PBS로 세척하고, PBS를 넣은 상태에서 60mJ/㎠ 농도의 UVB를 조사하였다. 그런 다음 PBS를 버리고, 다시 같은 농도의 각 화합물이 포함된 배지로 교환하였다. 약물을 처리하지 않은 세포를 대조구로 동일하게 배양하였다.
자외선 조사 24시간 후, 약물들을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포를 PBS로 세척하고, 트립신을 처리하여 세포를 수거하였다. 여기에, 8M 우레아, 2% CHAPS, 50mM DTT, 2M 티오우레아, 2mM PMSF 및 100㎍/㎕ 류펩틴이 함유된 단백질 추출 완충용액 500㎕을 처리한 후 10분간 상온에서 방치하였다. 그런 다음, 4℃에서 10분간 15,000´g의 중력가속도로 원심분리하여 상층액을 수거한 후, BIO-Rad Protein Dye Reagent™을 이용하여 단백질을 정량하였다. 단백질 20㎍을 8% SDS-PAGE를 이용하여 크기별로 분리한 후, 50V로 12시간 동안 PDF(BioRad) 막에 블로팅하였다. 이 블롯을 5% 무지방 우유 용액으로 1시간 동안 블로킹한 후, 1차 항체로 polyclonal anti-Rb(Santa Cruz; 모든 형태의 Rb(과인사화, 저인산화 형태 등) 감지)를, 2차 항체로 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 anti-rabbit IgG(Amersham)를 이용하고, Amersham사의 ECL(enhanced chemiluminescence) 키트를 이용하여 항체 반응시켰다. 반응시킨 블롯은 X선 Fuji 필름에 감광시킨 후 현상하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 같은 블롯을 6.25 mM Tris, 2% SDS, 100mMb-머캡토에탄올의 용액으로 50℃에서 10분씩 2번 세척하였다. 다시 5% 무지방 우유 용액으로 1시간 동안 블로킹한 후, 1차 항체로 monoclonal anti-underphosphorylated Rb(BD Biosciences; 저인산화 형태의 Rb만 감지)를, 2차 항체로 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG(Amersham)를 이용하고, Amersham사의 ECL(enhanced chemiluminescence) 키트를 이용하여 항체 반응시켰다. 반응시킨 블롯은 X선 Fuji 필름에 감광시킨 후 현상하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 필름 상의 밴드는 PowerLook 2100 XL(UMAX)를 이용하여 스캐닝한 후, ImageMaster 2D Elite(Amersham Biosciences) 이미지 분석프로그램을 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 보는 바와 같이, Rb 단백질은, 약물 단독 처리시나 처리하지 않았을 때에는 자외선 조사에 의해 탈인산화가 일어나서 저인산화 형태가 나타났지만, 두 화합물을 혼합하여 동시에 처리했을 때에는 이러한 Rb 단백질의 탈인산화가 억제되어 모든 형태의 Rb 단백질이 존재하게 되었다.
이하, 본 발명에 따른 진세노사이드 F1 및 EGCG를 함유하는 외용제 조성물을 제형예를 들어 설명하지만, 본 발명의 외용제 조성물의 제형이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.
제형예 1 : 유연화장수
성 분 |
함량(중량%) |
베타인 |
4.0 |
낫토검 |
0.1 |
셀룰로오스검 |
5.0 |
에탄올 |
5.0 |
부틸렌글리콜 |
5.0 |
폴리옥시에틸렌 경화피마자유 |
0.2 |
초산토코페롤 |
5.0 |
방부제 |
미량 |
색소 |
미량 |
EGCG |
0.0005 |
진세노사이드 F1 |
0.0001 |
정제수 |
to 100 |
제형예 2 : 영양화장수
성 분 |
함량(중량%) |
세틸에틸헥사노에이트 |
5.0 |
세토스테아릴알콜 |
1.5 |
친유형모노스테아린산 스테아레이트 |
1.2 |
스쿠알란 |
2.0 |
폴리솔베이트 60 |
1.2 |
솔비탄세스퀴올레이트 |
0.8 |
글리세린 |
8.0 |
트리에탄올아민 |
0.2 |
카르복시비닐폴리머 |
0.2 |
EGCG |
0.001 |
진세노사이드 F1 |
0.001 |
방부제 |
미량 |
색소 |
미량 |
향 |
미량 |
정제수 |
to 100 |
제형예 3 : 영양크림
성 분 |
함량(중량%) |
밀납 |
1.0 |
글리세릴스테아레이트 |
2.0 |
세토스테아레이트 |
2.5 |
폴리솔베이트 60 |
1.2 |
솔비탄세스퀴올레이트 |
0.4 |
세틸에틸헥사노에이트 |
5.0 |
스쿠알란 |
7.0 |
유동파라핀 |
8.0 |
글리세린 |
8.0 |
프로필렌글리콜 |
5.0 |
식물추출물 |
5.0 |
EGCG |
0.05 |
진세노사이드 F1 |
0.01 |
방부제 |
미량 |
색소 |
미량 |
향 |
미량 |
정제수 |
to 100 |
제형예 4 : 에센스
성 분 |
함량(중량%) |
글리세린 |
15.0 |
프로필렌글리콜 |
5.0 |
셀룰로오스검 |
0.1 |
낫토검 |
5.0 |
히아루론산추출물 |
8.0 |
아미노프로판술폰산 |
2.0 |
카르복시비닐폴리머 |
0.3 |
에탄올 |
5.0 |
폴리옥시에틸렌 경화피마자유 |
0.5 |
트리에탄올아민 |
0.3 |
EGCG |
0.1 |
진세노사이드 F1 |
0.01 |
방부제 |
미량 |
향 |
미량 |
색소 |
미량 |
정제수 |
to 100 |
제형예 5 : 로션
성 분 |
함량(중량%) |
글리세릴스테아레이트 |
1.5 |
폴리솔베이트 60 |
1.5 |
솔비탄세스퀴올레이트 |
0.5 |
세틸에틸헥사노에이트 |
2.0 |
스쿠알란 |
3.0 |
글리세린 |
8.0 |
카르복시비닐폴리머 |
0.5 |
가수분해콜라겐 |
1.0 |
트리에탄올아민 |
0.5 |
EGCG |
1.0 |
진세노사이드 F1 |
0.5 |
방부제 |
미량 |
향료 |
미량 |
색소 |
미량 |
정제수 |
to 100 |
제형예 6 : 연고
성 분 |
함량(중량%) |
카프린/카프릴 트리글리세리드 |
10.0 |
액상 파라핀 |
10.0 |
솔비탄세스퀴올레이트 |
6.0 |
옥틸도데세스-25 |
10.0 |
세틸에틸헥사노에이트 |
10.0 |
스쿠알란 |
1.0 |
살리실산 |
1.0 |
프로필렌글리콜 |
15.0 |
솔비톨 |
1.0 |
EGCG |
0.01 |
진세노사이드 F1 |
0.01 |
정제수 |
to 100 |
제형예 7 : 분무제
성 분 |
함량(중량%) |
트리에탄올아민 |
0.2 |
폴리비닐피롤리돈/비닐아세테이트 |
3.0 |
프로필렌글리콜 |
8.0 |
폴리아크릴레이트 |
0.2 |
EGCG |
0.0005 |
진세노사이드 F1 |
0.0001 |
정제수 |
to 100 |