KR20040077764A

KR20040077764A - 암 침윤 및 전이의 예방 및 치료를 위한 합성 펩티드 및그의 용도

Info

Publication number: KR20040077764A
Application number: KR10-2004-7011323A
Authority: KR
Inventors: 라쓰 마티아스; 쉬리랑 넷케; 알렉산드라 니츠빅키
Original assignee: 라쓰 마티아스
Priority date: 2002-01-23
Filing date: 2003-01-23
Publication date: 2004-09-06
Also published as: DE60326539D1; RU2346043C2; HRP20040732A2; JP2005515262A; EP1468085B1; MXPA04007170A; NO20034146L; US20030139345A1; ZA200405328B; US8012935B2; CN1622992A; NZ533738A; NO20034146D0; IL162714A0; CN101007844A; LV13289B; EE200400030A; EP1468085A1; WO2003062413A1; BR0302819A

Abstract

본 발명은 메탈로프로테이나제 기질-2(MMP-2)의 85 내지 92번 아미노산에 상응하는 PRKPKWDK(서열 2) 펩티드, 및 서열 2의 단편, 유사체 및 동족체를 포함하는 합성 펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 암 침윤 및 전이의 저해제로서 이러한 펩티드의 용도에 관한 것이고, 또한 MMP에 의한 세포외 기질의 분해와 관련된 암 및 다른 병리학적 상태의 예방 및 치료에서의 치료적 용도에 관한 것이다.

Description

암 침윤 및 전이의 예방 및 치료를 위한 합성 펩티드 및 그의 용도{SYNTHETIC PEPTIDES AND USES THEREOF FOR THE PREVENTION AND THERAPY OF CANCER INVASION AND METASTASIS}

종양성 질환을 포함한 다양한 병리학적 상태는 메탈로프로테이나제 기질(MMP)의 활성 증가와 관련이 있다. MMP는 세포외 기질(ECM)을 분해할 수 있는 세린 프로테이나제의 하나의 군이다. MMP는 효소원의 형태로 세포외 기질에 분비된다. 활성화시, MMP 효소 활성이 활성화되고 ECM을 소화하는데, 이는 암 전이에서 주된 역할을 하는 것으로 나타난 과정이다.

이들은 MMP류의 소수 이상의 프로테이나제로서, 이들로는 MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9 및 MMP-13이 있다. 암에서 MMP-2는 1차 종양 성장 및 종양전이에 연루된다. 이러한 특정 MMP는 암의 침윤 및 전이에 있어서 암의 전파의 필수 조건으로서 콜라겐 및 다른 세포외 기질(ECM) 단백질을 소화할 수 있다.

항암제의 설계 및 시험에 많이 노력이 이루어지고 있지만, ECM의 MMP-매개성 소화를 효과적으로 차단하여 암 및 다른 질환의 전파를 약화시킬 수 있는 무독성 치료제가 여전히 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 암 세포 침윤을 효과적으로 차단할 수 있는 합성 펩티드를 구현한다. 이들 제제 및 그에 대한 항체의 이점은 암 침윤 및 전이를 차단하기 위한 임상적 용도에서의 유용성이다.

본 발명의 목적은 암 침윤 및 암 전이의 차단에 효과적인 메탈로프로테이나제 기질 2 서열 중 특정 아미노 서열(85-92)과 유사한 아미노산 서열을 갖는 합성 올리고펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 아미노산 서열 PRKPKWEDK를 갖는, 암 침윤 및 전이의 차단에 유용한 합성 펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 암 질환을 예방 및 치료하기 위하여 본 출원에 개시된 합성 펩티드를 사용하는 방법이다. 이 실시양태의 추가의 양상은 암 침윤 및 전이를 차단하기 위하여 유효량의 합성 펩티드를 사용하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 PRKPKWDK(서열 2)를 갖는 올리고펩티드를 제공한다.

바람직하게는, 올리고펩티드는 약 6 내지 약 20개의 잔기로 이루어진다. 가장 바람직하게는, 올리고펩티드는 약 8 내지 약 10개의 잔기로 이루어진다.

바람직하게는, 합성 펩티드의 농도는 1μM 내지 500μM이다. 가장 바람직하게는, 합성 펩티드의 농도는 50μM 내지 200μM이다.

본 발명의 다른 목적은 제약상 허용가능한 담체 및 올리고펩티드를 포함하는 제약 조성물에 포함되는 면역원성 올리고펩티드이다. 올리고펩티드는 백신으로서 사용될 수 있다. 올리고펩티드를 포함하는 제약 조성물을 사용하여 올리고펩티드의 서열(예컨대, 서열 2)을 갖는 항원결정기를 포함하는 단백질에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 생체내 및 시험관내에서 달성되는 조성물 및 방법이다.

본 발명은 인간 MMP-2에 유사한 아미노산 서열을 갖는 합성 올리고펩티드를 제공한다.

본 발명은 또한 N-말단의 하나 이상의 아미노산 잔기를 생략함으로써 암 세포 침윤 및 전이를 차단하는 개질된 올리고펩티드를 제공한다.

본 발명은 C-말단의 하나 이상의 아미노산 잔기를 생략함으로써 암 세포 침윤 및 전이를 차단하는 개질된 올리고펩티드를 제공한다.

본 발명은 N-말단 및 C-말단의 하나 이상의 아미노산 잔기를 생략함으로써 암 세포 침윤 및 전이를 차단하는 개질된 올리고펩티드를 제공한다.

본 발명은 제공된 서열내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환 잔기의 전하 및 극성의 고려없이 치환시킴으로써 암 세포 침윤 및 전이를 차단하는 개질된 올리고펩티드를 제공한다.

본 발명은 제공된 서열내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 유사한 전하 및(또는) 극성을 갖는 아미노산 잔기로 치환시킴으로써 암 세포 침윤 및 전이를 차단하는 개질된 올리고펩티드를 제공한다.

본 발명은 제공된 서열내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 생략함으로써 암 세포 침윤 및 전이를 차단하는 개질된 올리고펩티드를 제공한다.

본 발명은 둘 이상의 개질에 의해 암 세포 침윤 및 전이를 차단하는 개질된 올리고펩티드를 제공한다.

본 발명은 각각 하나 이상의 올리고펩티드 반복체(들)에 공유 결합된 올리고펩티드 서열을 1회 이상 반복함으로써 암 세포 침윤 및 전이를 차단하는 개질된 올리고펩티드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 합성 펩티드를 면역원으로서 사용하여 항체를 생성하고, 이렇게 생성된 항체가 암 침윤 및 전이를 효과적으로 차단할 수 있게 하는 것이다.

본 발명은 정맥내 적용 또는 다른 치료적으로 허용가능한 방식에 의해 MMP-2의 대사 작용 또는 상호작용을 직접적으로 및 경쟁적으로 감소시키거나 차단하기 위한 하나 이상의 올리고펩티드의 예방적 또는 치료적 용도를 제공한다.

본 발명은 MMP5의 대사 상호작용을 부분적으로 또는 완전히 차단할 수 있는 특정 면역 반응을 자극하기 위하여 하나 이상의 올리고펩티드를 피하 적용에 의해 또는 다른 허용가능한 방식으로 백신으로서 적용함으로써 MMP의 대사 작용 또는 상호작용을 간접적으로 감소시키거나 차단하기 위한 하나 이상의 올리고펩티드의 예방적 또는 치료적 용도를 제공한다. 바람직한 실시양태는 MMP-2를 포함한다.

본 발명은 올리고펩티드가 합텐에 커플링되어 면역 반응을 증진시키고 이로써 치료 효능을 증진시키는 하나 이상의 올리고펩티드의 예방적 및 치료적 용도를 제공한다.

본 발명은 MMP-2 단백질의 합성 속도를 세포 수준에서 특이적으로 저해하거나 감소시키는 피드-백(feed-back) 조절자로서 기능하기 위한 하나 이상의 올리고펩티드의 예방적 또는 치료적 용도를 제공한다.

본 발명은 MMP-2와 관련된 질환의 진단 또는 당해 질환의 진행 또는 퇴행의 임상적 모니터링을 위한 특정 항체 생성용 백신으로서 암 세포 침윤 및 전이를 차단할 수 있는 하나 이상의 올리고펩티드를 제공한다.

본 발명은 암의 예방 또는 치료를 위한 암 세포 침윤 및 전이를 차단하는 하나 이상의 올리고펩티드의 용도를 제공한다.

본 발명은 암 세포 침윤 및 전이를 차단하는 하나 이상의 올리고펩티드의 용도를 제공하며, 이때 이들 올리고펩티드는 환자에게 백신, 주사액, 주입액, 흡입물, 좌제 또는 그밖의 제약상 허용가능한 담체 및(또는) 전달 수단으로서 적용될 수 있다.

본 발명은 암 침윤 및 전이에 대하여 저해 활성을 나타내는 합성 펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드는 메탈로프로테이나제 기질-2(MMP-2)의 85 내지 92번 아미노산에 상응하는 PRKPKWDK(서열 2) 펩티드, 및 서열 2의 단편, 유사체 및 동족체를 포함한다. 본 발명은 또한 인간 암 침윤 및 전이의 저해제로서 이러한 펩티드의 용도에 관한 것이고, 또한 MMP에 의한 세포외 기질의 분해와 관련된 암 및 다른 병리학적 상태의 예방 및 치료에서의 치료적 용도에 관한 것이다.

도 1은 효소 MMP2의 아미노산 서열을 나타낸다. 저해 활성 연구를 위하여 선택된 아미노산 서열은 알아보기 쉽도록 네모로 표시하였다. 다른 이(로이타 앤드 어소시에이츠(Loitta and Associates))에 의해 MMP2의 활성을 저해하는 것으로나타난 아미노산 서열 TMRKPRCGNPDVAN(역시 네모로 표시함)을 참조용으로 사용하였다.

도 2는 시험된 다양한 올리고펩티드의 비교 저해 효과를 나타낸다. 올리고펩티드 PRKPKWDK는 인간 흑색종 암 세포 A2058에 대하여 매트리겔(Matrigel) 분석을 사용하여 암 세포 침윤을 차단하는데 매우 유효하다.

도 3은 인간 흑색종 암 세포 A2058에 대하여 매트리겔 분석을 사용하여 암 세포 침윤을 차단하는데 있어서 올리고펩티드 PRKPKWDK의 저해 효과를 나타낸다.

도 4는 인간 유방암 세포 MCF7에 대하여 매트리겔 분석을 사용하여 암 세포 침윤을 차단하는데 있어서 올리고펩티드 PRKPKWDK의 저해 효과를 도시한다.

정의:본원에 사용된 바와 같이, "펩티드"란 용어는 펩티드 결합에 의해 공유 결합된 둘 이상의 아미노산을 포함하는 유기 화합물을 가리키며, 펩티드는 디펩티드(2개의 아미노산 잔기를 함유함), 트리펩티드(3개의 아미노산) 등일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "올리고펩티드"란 용어는 전형적으로 길이가 30개 미만의 잔기를 함유하는 펩티드를 가리킨다. 올리고펩티드의 길이는 정확한 항원결정기가 유지된다면 본 발명에서 중요하지 않다. 바람직하게는, 올리고펩티드는 가능한 작으면서도 큰 올리고펩티드의 실질적으로 모든 생물학적 활성을 유지할 수 있고, 암 세포 침윤 및 전이를 차단하는데 유효하다.

"올리고펩티드"는 본 출원에서 "합성 펩티드"와 호환적으로 사용된다. 본 발명에서 사용된 올리고펩티드는 "단리된", 그러나 "생물학적으로 순수한" 합성 펩티드이다.

본원에 사용된 바와 같이, 아미노산 잔기를 나타내는 1글자 기호는 다음과 같다: A(알라닌); R(아르기닌); N(아스파라긴); D(아스파르트산); C(시스테인); Q(글루타민); E(글루탐산); G(글리신); H(히스티딘); I(이소류신); L(류신); K(라이신); M(메티오닌); F(페닐알라닌); P(프롤린); S(세린); T(트레오닌); W(트립토판); 및 Y(티로신).

아미노산 치환은 전형적으로 단일 잔기로 이루어진다. 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 임의의 혼합은 함께 올리고펩티드로 될 수 있다. 보존된 아미노산 치환은 하나 이상의 아미노산을 유사한 전하, 크기 및(또는) 소수성 특징을 갖는 아미노산으로 대체하는 것으로 이루어진다(예를 들어, 글루탐산(E)의 아스파르트산(D)으로의 아미노산 치환). 비보존된 치환은 하나 이상의 아미노산을 다른 전하, 크기 및(또는) 소수성을 갖는 아미노산으로 대체함으로 이루어진다(예를 들어, 글루탐산(E)의 발린(V)으로의 치환). 본 발명은 암 세포 침윤 및 전이를 차단하는 효능이 실질적으로 변하지 않는다면, 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 임의의 혼합에 대한 올리고펩티드의 보존적 변화를 포함할 것이다.

라쓰(Rath) 등(문헌[J. Applied Nutr. 44:62-69, 1992]; 문헌[J. Orthomolecular Med. 8:11-20, 1993])은 높은 최대 친수성 및 배좌 및 전하를 갖는 올리고펩티드 서열이 다수 질환의 발병을 매개한다고 가정하였다. 이 가정에 따르면, MMP 효소내의 선택된 서열의 아미노산은 기질내 상보성 서열에 결합됨으로써 효소의 작용을 방해할 수 있다. 이 개념은 올리고펩티드가 효소내 아연 분자를 방해한다는 점에서, 리오타 등(미국 특허 제5,372,809호)에 의해 상술된 것과는 완전히 다르다. 세포내 상이한 유형의 단백질의 착체가 세포내 단백질의 활성을 변경할 수 있음(가빈(Gavin) 등의 문헌[Nature 415:141-147, 2002])을 나타내는 실험적 증거는 본질적으로 상기 가정을 확인한다. 언급된 참조문헌은 참조로 인용된다.

본 발명에서, 본 발명자들은 MMP-2의 아미노산 서열내 가능한 올리고펩티드 서열을 확인하였고, 시험 모델로서 암 세포에 의한 ECM의 시험관내 침윤을 사용하여 이들 올리고펩티드 서열이 MMP-2의 기능적 활성을 효과적으로 방해함을 발견하였다.

작용의 임의의 이론 또는 메카니즘에 의해 제한됨이 없이, 본 발명은 암 세포 침윤 및 전이를 효과적으로 차단할 수 있는 올리고펩티드를 제공한다.

하나의 작용 메카니즘은 MMP-2가 특이적 결합 부위에 의해 표적 ECM 분자에 결합하는 것일 수 있다. 따라서 이러한 결합 부위의 차단은 MMP-2가 그의 ECM 기질 분자에 결합하는 것을 방지하고, ECM의 파괴를 저해하여, 암 및 다른 질환이 신체 전체에 걸쳐 전파되는 것을 방지할 수 있다.

MMP-2 단백질내의 몇몇 가능한 결합 부위가 확인되었고, 본 발명은 이들 올리고펩티드 서열의 합성 유사체가 ECM 파괴를 방지하는데 유효함을 제공한다. 치료적 올리고펩티드 중 하나는 PRKPKWDK인데, 이는 암 세포의 침윤을 약 90% 저해하는 것으로 나타난다.

본 발명은 또한 다른 MMP-관련 질환에서의 올리고펩티드의 치료적 용도를 제공한다. MMP-2는 ECM내 그의 표적 분자에 결합하는데 동일한 부위를 사용할 수 있기 때문에, 본 발명에서 개시된 올리고펩티드는 다른 질환을 유사하게 방해할 수 있다. 따라서, 본원에 청구된 합성 올리고펩티드의 예방적 및 치료적 용도는 암에 제한되지 않고, MMP에 의한 ECM의 파괴와 관련된 심혈관 질환 및 그밖의 병리학적 상태에 사용될 수 있다. 이들 올리고펩티드는 환자에게 백신, 주사액, 주입액, 흡입물, 좌제 또는 다른 제약상 허용가능한 담체 및(또는) 전달 수단으로서 적용될 수 있다.

본 발명의 펩티드 및 배합물을 투여하는 방법은 경구, 정맥내, 피하, 경피 및 국소 투여와 같은 다수의 공지된 투여 경로 중 임의의 경로를 사용한다. 본 발명의 바람직한 방법은 비경구 투여용 제약 조성물을 사용한다.

본 발명은 혈액 시험 또는 다른 적합한 진단 시험을 통해 MMP(특히, MMP-2)와 관련된 질환을 진단하는데 사용되는 분석 및 이러한 질환의 진행 또는 퇴행의 임상적 모니터링을 위한 항체를 생성시키는 백신으로서 사용될 수 있는 올리고펩티드를 제공한다.

본 발명은 암 세포 침윤을 차단하는데 유효한 합성 펩티드를 구현한다. 이들 제제 및 이들에 대한 항체의 이점은 암 침윤 및 전이를 예방 및 치료하기 위한 임상 용도에서의 유용성이다. 바람직하게는, 서열 2의 아미노산을 갖는 합성 올리고펩티드가 암 침윤 및 전이를 차단하는데 유용하다. 더 바람직하게는, 합성 펩티드는 암 침윤 및 전이를 차단하기 위한 제약 배합물에 포함된다.

올리고펩티드는 잔기 수 약 6 내지 약 20일 수 있다. 가장 바람직하게는, 올리고펩티드는 잔기 수 약 8 내지 약 10이다. 가장 바람직하게는, 합성 올리고펩티드의 길이는 8개의 아미노산 잔기를 함유한다.

본 발명의 다른 목적은 항체를 생성하는 면역원으로서 합성 펩티드를 사용하여 이렇게 생성된 항체가 암 침윤 및 전이를 효과적으로 차단할 수 있게 하는 것이다.

바람직하게는, 합성 올리고펩티드의 길이는 8개의 아미노산 잔기를 함유한다. 본 발명의 다른 목적은 제약상 허용가능한 담체 및 올리고펩티드를 포함하는 제약 조성물에 포함되는 면역원성 올리고펩티드이다. 올리고펩티드는 백신으로서 사용될 수 있다. 올리고펩티드를 포함하는 제약 조성물을 사용하여 올리고펩티드의 서열(예컨대, 서열 2)을 갖는 항원결정기를 포함하는 단백질에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있다.

본 발명은 인간 MMP-2의 단백질내의 아미노산 서열과 유사한 아미노산 서열을 갖는 합성 올리고펩티드를 제공한다.

합성 올리고펩티드의 아미노산 말단 및(또는) 카르복시 말단은 각각 아미노 기(-NH₂) 또는 카르복시(-COOH) 기를 포함할 수 있다. 또 다르게는, 올리고펩티드 아미노 말단은, 예를 들어 소수성 기를 나타낼 수 있는데, 그의 비제한적인 예로는카르보벤질, 단실, t-부톡시카르보닐, 데카노일, 나프토일 또는 다른 탄수화물 기; 아세틸 기; 9-플루오레닐메톡시-카르보닐(FMOC) 기; 개질된 비천연 아미노산 잔기가 있다. 또 다르게는, 합성 올리고펩티드 카르복시 말단은, 예를 들어 아미도 기; t-부톡시카르보닐 기; 또는 개질된 비천연 아미노산 잔기를 나타낸다. 또 다르게는, 본 발명은 N-말단 또는 C-말단의 아미노산 잔기를 생략함으로써 암 세포 침윤 및 전이를 차단하는 합성 올리고펩티드를 포함한다. 본 발명은 또한 제공된 서열내의 아미노산 잔기를 치환 잔기의 전하 및 극성의 고려없이 치환시킴으로써 암 세포 침윤 및 전이를 차단하는 개질된 올리고펩티드를 제공한다.

본 발명은 또한 하나 이상의 아미드 연결이 임의로는 아미드가 아닌 연결, 바람직하게는 치환된 아미드 또는 아미드의 동배체로 대체되는 펩티드 유사체를 기대함을 이해하여야 한다. 따라서, 펩티드내의 아미노산 잔기는 일반적으로 아미노산으로 기술되고, 본 발명의 바람직한 실시양태는 펩티드에 의해 예시되며, 당업자라면 비아미드 연결을 갖는 실시양태에서, 본원에 사용된 "아미노산" 또는 "잔기"라는 용어는 아미노산의 측쇄와 구조상 유사한 기를 갖는 다른 이관능성 잔기를 가리키는 것임을 알 것이다. 또한 아미노산 잔기는 차단되거나 차단되지 않을 수 있다.

본 발명은 하나 이상의 올리고펩티드 반복체(들)에 공유 결합된 올리고펩티드 서열을 1회 이상 반복함으로써 암 세포 침윤 및 전이를 차단하는 개질된 올리고펩티드를 제공한다.

본 발명은 정맥내 적용에 의해 또는 다른 치료적으로 허용가능한 방식으로MMP-2의 대사 작용 또는 상호작용을 직접적으로 및 경쟁적으로 감소시키거나 차단하기 위한 하나 이상의 올리고펩티드의 예방적 또는 치료적 용도를 제공한다.

본 발명은 MMP의 대사 상호작용을 부분적으로 또는 완전히 차단할 수 있는 특정 면역 반응을 자극하기 위하여 하나 이상의 올리고펩티드를 피하 적용에 의해 또는 다른 허용가능한 방식으로 백신으로서 적용함으로써 MMP의 대사 작용 또는 상호작용을 간접적으로 감소시키거나 차단하기 위한 하나 이상의 올리고펩티드의 예방적 또는 치료적 용도를 제공한다. 바람직한 실시양태는 MMP-2를 포함한다.

본 발명은 올리고펩티드가 합텐에 커플링되어 면역 반을을 증진시키고 치료 효능을 증진시키는 하나 이상의 올리고펩티드의 예방적 및 치료적 용도를 제공한다.

본 발명은 MMP-2 단백질의 합성 속도를 세포 수준에서 특이적으로 방지 또는 감소시키는 피드-백 조절자로서 기능하기 위한 하나 이상의 올리고펩티드의 예방적 또는 치료적 용도를 제공한다.

본 발명은 MMP-2와 관련된 질환의 진단 또는 당해 질환의 진행 또는 퇴행의 임상적 모니터링을 위한 특정 항체 생성용 백신으로서, 암 세포 침윤 및 전이를 차단할 수 있는 하나 이상의 올리고펩티드를 제공한다.

본 발명은 암의 예방 또는 치료, 예를 들어 감염성 질환, 심혈관 질환 및 퇴행성 질환의 예방 또는 치료를 위한, 비제한적으로 암 세포 침윤 및 전이를 비롯한 인간 질환을 차단하는 하나 이상의 올리고펩티드의 용도를 제공한다.

본 발명은 MMP-2와 관련된 질환의 예방 또는 치료를 위한 암 세포 침윤 및전이를 차단하는 하나 이상의 올리고펩티드의 용도를 제공한다.

본 발명은 환자에게 백신, 주사액, 주입액, 흡입물, 좌제 또는 다른 제약상 허용가능한 담체 및(또는) 전달 수단으로서 적용될 수 있는, 암 세포 침윤 및 전이를 차단하기 위한 하나 이상의 올리고펩티드의 용도를 제공한다.

본 발명의 조성물은 임의의 멸균, 생체적합성 제약 담체(비제한적인 예: 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스 및 물)에 투여될 수 있는 하나 이상의 다른 제제(예: 안정화 화합물)와 혼합된 펩티드 또는 펩티드들의 형태일 수 있다. 조성물은 환자에게 단독으로, 또는 다른 제제, 약물 또는 호르몬과 함께 투여될 수 있다. 제약상 허용가능한 담체는 또한 제약상 사용될 수 있는 제제로의 활성 화합물의 가공을 촉진하는 부형제 및 보조제로 이루어질 수 있다. 제형화 및 투여를 위한 기술에 대한 추가의 상세한 것은 본원에 참조로 인용된 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa.]의 최근판에서 찾을 수 있다. 제약 조성물은 염으로서 제공될 수 있고, 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 비제한적인 예로 포함하는 많은 산으로 형성될 수 있다. 염은 상응하는 자유 염기 형태보다는 수성 또는 다른 양성자성 용매내에서 더 가용성인 경향이 있다.

본 발명은 혈액 시험 또는 다른 적합한 진단 시험을 통한 MMP(특히, MMP-2)와 관련된 질환의 진단 및 당해 질환의 진행 또는 퇴행의 임상적 모니터링에 사용되는 분석을 위한 항체를 생성하기 위하여 백신으로서 사용될 수 있는 올리고펩티드를 제공한다.

하기의 실시예는 본 발명의 실시를 설명하기 위한 것이며 본 발명의 범주를 제한하려는 것이 아니다.

올리고펩티드 서열

하전된 아미노산이 풍부한 높은 최대 친수성의 영역에 관한 MMP-2의 아미노산 서열을 소프트웨어 프로그램으로 확인하였다. 본 발명의 올리고펩티드는 당업계에 널리 공지된 기술에 의해 합성되거나 또는 제조될 수 있다(예를 들어, 본원에 참조로 인용된 크레이톤(Creighton)의 문헌[Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., N. Y.(1983)] 참조). 본 발명에서 제조되고 사용되는 올리고펩티드는 하기 표 1에 기재되어 있다.

다양한 암 세포에 의한 매트리겔 막을 통한 매트리겔 침윤 및 이동에 대한 이들 올리고펩티드의 저해 효과는 "개선된 매트리겔 침윤 챔버"(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), USA)를 사용하여 평가하였다. 리오타 등에 의해 항-MMP-2 활성을 갖는 것으로 나타난 올리고펩티드 TMRKPRCGNPDVAN을 올리고펩디드의 참조물로서 사용하였다.

확인된 다양한 올리고펩티드 서열 및 연구에서의 용도

올리고펩티드	서열 번호
GDVAPKTDKE	서열 1
PRKPKWDK	서열 2
EDYDRDKKY	서열 3
GRSDGLM	서열 4
NYDDDRKW	서열 5
LPPDVQRVD	서열 6
RYNEVKKKMDP	서열 7

일반 실험 조건

확인된 올리고펩디드는 주문 합성되었다. 이들은 매트리겔 침윤 연구에 사용되었다.

(a) 매트리겔 침윤 연구

이 연구는 "개선된 매트리겔 침윤 챔버"(벡톤 디킨슨, USA)를 사용하여 수행하였다.

인간 흑색종 세포에 대한 연구에서, 인간 섬유아세포-NHDF(클로네틱스(Clonetics))를 "매트리겔" 삽입물에 접종하고, 전면 생장에 이르도록 두었다. 이렇게 하여 체내의 암 세포 주위의 생체내 조건을 가깝게 모의하였다. 그 다음, 인간 흑색종 세포 A2058을 삽입물에 접종하였다. 다양한 수준의 선택된 올리고펩티드가 첨가된 섬유아세포 배양물로부터의 콘디쇼닝화된 배지를 챔버에 첨가하였다. 시스템을 약 24시간 동안 배양하였다. 이 시기가 끝나면 삽입물의 상부 표면의 세포를 닦아 내었다. 매트리겔 막을 침윤하여 삽입물의 저부 표면으로 이동한 세포를 "퀵 스테인(quick stain)"으로 염색하고 현미경으로 계수하였다. 저해율은 콘트롤("0" 수준의 올리고펩티드)과 비교하여, 막을 통해 이동하지 못한 세포의 수에 의해 계산되었다. 콘트롤의 저해 활성을 "0"으로 생각하였다. 침윤 분석으로부터의 s 배지는 자이모그램(zymogram) 연구를 위해 복관하였다.

인간 유방암 세포 MCF7에 관한 연구에서, 과정은 NHDF 대신에 MRC5(ATCC) 섬유아세포를 사용한 것을 제외하고는, 흑색종 세포의 경우 사용된 것과 본질적으로 유사하였다.

인간 유방암 세포 MDA-MB 231에 관한 연구에서, 섬유아세포-MRC5(ATCC) 세포를 웰에 도말하였다. 나머지 과정은 MCF7 세포에 관한 연구에서와 동일하였다.

(b) 자이모그램 연구

침윤 연구에서의 다양한 웰로부터의 배지(25 내지 30㎕)를 "노벡스(Novex)" 자이모그램 겔(인비트로젠(Invitrogen))에 적용하였다. 겔을 제조자가 권장하는 바와 같이 전개시키고 염색하였다. 공지의 분자량을 근거로 하여 메탈로프로테이나제 기질(MMP)을 확인하였다.

실시예 1

흑색종 세포 A2058에 의한 매트리겔 침윤 및 이동에 대한 다양한 올리고펩티드 서열의 저해 효과

인간 흑색종 암 세포의 침윤 저해에 대하여 7가지의 올리고펩티드(이들의 아미노산 서열은 표 1을 참조함)를 시험하였다. 아미노산 서열 PRKPKWDK를 갖는 올리고펩티드는 차단 활성을 나타내었다. TMRKPRCGNPDVAN을 갖는 올리고펩디드는 PRKPKWDK가 나타낸 73%에 비하여 약 11%의 저해를 나타내었다(도 1).

아미노산 서열 LPPDVQRVD를 갖는 올리고펩티드 VI은 또한 약간의 방해 활성을 나타내었다(즉, 약 20%). 아미노산 서열 GDVAPKTDKE를 갖는 올리고펩티드 "I"는 100μM 농도까지 어떠한 활성도 나타내지 않았지만(도 2에 나타내지 않음), 동일한 농도에서 PRKPKVVDK는 63%를 나타내었다.

실시예 2

흑색종 세포 A2058에 의한 매트리겔 침윤 및 이동에 대한 올리고펩티드PRKPKWDK의 저해 효과

이 연구에서, 배지내 PRKPKWDK의 농도는 0 내지 150μM로 변하였다. 올리고펩티드는 흑색종 세포에 의한 침윤을 50μM 농도에서 약 37%로부터 150μM에서 73%로 점차 저해하는 것으로 나타났다(도 3).

매트리겔 막은 ECM과 유사하며, 막의 다른쪽으로 돌파하고 이동하는 암 세포의 능력은 체내에서 전이하는 암 세포의 능력을 나타낸다. 올리고펩티드는 3가지 상이한 유형의 암 세포의 침윤을 상당히 감소시킬 수 있었다. 이러한 시험 시스템에서, 활성은 ECM에 대한 것이었다. 본 발명자들은 본 연구에 의해 올리고펩티드가 체내에서 ECM의 분해를 방해하여 ECM의 분해가 기본 병변인 질환의 진행에 불리한 영향을 줄 수 있음을 분명히 나타낸다고 결론지었다.

실시예 3

이 연구에서, 본 발명자들은 인간 유방암 세포 MCF7(ATCC)에 의한 매트리겔 침윤 및 이동에 대한 PRKPKWDK의 저해 효과를 결정하였다. 흑색종 세포의 경우, 이 올리고펩티드는 암 세포 침윤을 저해하였다. 150μM 농도에서의 저해율은 약 70%이었다. 이것은 200μM 농도에서 약 90%로 증가하였다(도 4).

실시예 4

이 경구에서, 본 발명자들은 다른 인간 유방암 세포 MDA-MB 231에 의해 PRKPKWDK의 저해 활성을 조사하였다. 150μM 농도에서의 저해율은 약 94%이었다.

실시예 5

다음으로 본 발명자들은 올리고펩티드가 효소가 분비된 후 효소의 작용을 방해할 수 있는 것으로 평가하였다. 자이모그램 연구 결과, 다양한 암 세포에 의해 분비된 MMP-2의 양에 대한 PRKPKWDK의 저해 효과를 나타나지 않았다(데이터를 나타내지 않음).

본 발명의 많은 실시양태를 기술하였다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 요지 및 범주를 벗어나지 않고 다양한 변형을 행할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 다른 실시양태는 본 발명의 청구의 범위내에 포함된다.

전술한 내용은 상당히 상세하게 기술되었지만, 서열은 설명을 위해 제시된 것이지 제한적인 것은 아니다. 당업자의 한계 및 능력 이내인 상기 개시된 기술의 등가물을 포함한 개질 및 개선은 본원에 첨부된 청구의 범위의 범주에 포함된다. 당업자라면, 본원에 기술된 본 발명의 개념으로부터 벗어나지 않고 상기 설명의 상세내용에 관하여 다수의 변형, 변경 및 변화가 이루어질 수 있음을 쉽게 알 것이다. 예를 들어, 본원에 기술된 기본 서열의 개질(화학적 또는 효소적)도 또한 본 발명의 한계 이내이다. 예를 들어, 개시된 서열은 디펩티드 또는 트리펩티드일 수 있다. 또한, 개시된 서열은 이 잔기를 펩티드의 아미노 또는 카르복실 말단에 포함하도록 개질될 수 있다. 서열은 또한 이들의 활성을 증가시키기 위하여 화학적으로 개질될 수 있다(예컨대, 서열의 카르복실 말단 부분의 아미드화). 따라서, 다양한 개질은 본 발명의 요지 및 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있고, 이러한 변화는 하기 청구의 범위에 기술된 본 발명의 범주내인 것으로 간주되어야 하는 것으로 이해된다.

<110> MATTHIAS RATH <120> SYNTHETIC PEPTIDES AND METHODS FOR TREATING CANCER INVASION AND METASTASIS <130> 11957/23 <150> 60/351,317 <151> January 23, 2002 <160> 7 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 1 Gly Asp Val Ala Pro Lys Thr Asp Lys Glu 1 5 10 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 2 Pro Arg Lys Pro Lys Trp Asp Lys 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 3 Glu Asp Tyr Asp Arg Asp Lys Lys Tyr 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 4 Gly Arg Ser Asp Gly Leu Met 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 5 Asn Tyr Asp Asp Asp Arg Lys Trp 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 6 Leu Pro Pro Asp Val Gln Arg Val Asp 1 5 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 7 Arg Tyr Asn Glu Val Lys Lys Lys Met Asp Pro 1 5 10

Claims

암 침윤 및 전이를 차단하는데 유용한, 메탈로프로테이나제-2(MMP-2) 서열의 특정 올리고펩티드 서열과 유사한 합성 올리고펩티드 서열.
제1항에 있어서, 서열 PRKPKWDK의 아미노산을 갖는 합성 올리고펩티드.
제2항에 있어서, 잔기 수 약 6 내지 약 20인 합성 올리고펩티드.
제2항에 있어서, 잔기 수 약 8 내지 약 10인 합성 올리고펩티드.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 농도 범위가 1μM 내지 500μM인 합성 올리고펩티드.
제5항에 있어서, 농도 범위가 50μM 내지 200μM인 합성 올리고펩티드.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 MMP-2와 유사한 아미노산 서열을 갖는 합성 올리고펩티드.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단에서 하나 이상의 산 잔기에 의해 개질된 합성 올리고펩티드.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, C-말단에서 하나 이상의 산 잔기에 의해 개질된 합성 올리고펩티드.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 및 C-말단에서 하나 이상의 산 잔기에 의해 개질된 합성 올리고펩티드.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제공된 서열내의 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환 잔기의 전하 및 극성의 고려없이 치환되는 합성 올리고펩티드.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제공된 서열내의 하나 이상의 아미노산 잔기가 유사한 전하 및(또는) 극성을 갖는 잔기에 의해 치환되는 합성 올리고펩티드.
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 둘 이상의 개질에 의해 개질된 합성 올리고펩티드.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 올리고펩티드 반복체에 공유 결합된 올리고펩티드 서열을 1회 이상 반복하는 합성 올리고펩티드.
항체를 생성하기 위한 면역원으로서의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 합성 올리고펩티드의 용도.
정맥내 적용에 의해 또는 치료적으로 허용가능한 방식으로 MMP-2의 대사 작용 또는 상호작용을 직접적으로 및 경쟁적으로 감소시키거나 차단하기 위한 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 합성 올리고펩티드의 용도.
MMP-2의 대사 상호작용을 부분적으로 또는 완전히 차단할 수 있는 특정 면역 반응을 자극하기 위하여 피하 적용에 의해 또는 임의의 다른 허용가능한 방식으로 합성 올리고펩티드를 백신으로서 적용함으로써 MMP의 대사 작용 또는 상호작용을 간접적으로 감소시키거나 차단하기 위한 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 합성 올리고펩티드의 용도.
합텐에 커플링되어 면역 반응을 증진시키는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 합성 올리고펩티드의 용도.
MMP-2 단백질의 합성 속도를 세포 수준에서 특이적으로 저해하거나 감소시키는 피드-백(feed-back) 조절자로서 기능하기 위한 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 합성 올리고펩티드의 용도.
MMP-2와 관련된 질환의 진단 또는 당해 질환의 진행 또는 퇴행의 임상적 모니터링을 위한 특정 항체 생산용 백신으로서의 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 합성 올리고펩티드의 용도.
환자에게 백신, 주사액, 주입액, 흡입물, 좌제 또는 다른 제약상 허용가능한 담체 및(또는) 전달 수단으로서 적용되어 암 세포 침윤 및 전이를 차단할 수 있는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 합성 올리고펩티드의 용도.