KR20030010637A - 인공조직용 지지체의 생산을 위한 수산물 유래 콜라겐의용도, 그 지지체 및 생체 재료 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인공조직용 지지체의 생산을 위한 수산물 유래 콜라겐의 용도에 관한 것이다.
콜라겐은 어류 피부 바람직하게는 천연의 형태로 편리하게 얻어진다.
본 발명은 오염 위험이 적으며 신규한 인공조직용 지지체를 생산할 수 있다.

Description

인공조직용 지지체의 생산을 위한 수산물 유래 콜라겐의 용도, 그 지지체 및 생체 재료{Use of collagen of aquatic origin for the producing of support designed for tissue engineering, and resulting supports and biomaterials}
콜라겐은 세포의 성장에 특별히 적합한 기질이며 이 때문에 생체 세포(living cells)를 포함하는 재건된 조직의 생산을 위한 몇몇의 형태들 예를 들어, 기질(matrices), 겔 또는 피막에서 매우 광범위하게 사용되어진다.
대단히 장래가 유망한 기술인, 인공조직 분야에서 콜라겐은 특별히 인조 피부나 연골을 생산해낸다. 만족할 만한 결과를 위해서, 콜라겐은 물리적 또는 화학적 가교결합이나, 단백질과 강하게 상호작용하는 천연의 거대분자의 존재, 또는 이 둘 간의 조합에 의한 세포 대사에 기인하는 효소적 분해(enzymatic degradation)으로부터 보호되어져야만 한다.
지금까지는 이러한 인공조직 적용을 위하여, 수용 세포를 위한 지지체 내에서 사용되어지는 콜라겐은 포유동물로부터 추출되어졌으며 가장 흔하게는 소의 피부로부터 추출되어졌다. 이러한 추출원(source)의 선택은 추출 후에 얻어지는 단백질의 좋은 기계적 성질, 효소적 분해에 대한 저항성 및 인간 콜라겐과 매우 유사한 아미노산 조성물에 기인하였다. 이러한 모든 이유들 때문에, 이 콜라겐이 인간 세포의 배양에 적당한 유일한 단 하나로 인정되어졌다.
2000년 3월 15일자 파세브 저널 제 14권의 제 4번(Faceb Journal vol. 14, N° 4)에서 Yeh 등(Yeh et al.)의 논문, "신규한 인공조직용 천연 기질 세포-기질 상호작용의 분석{A novel native matrix for tissue engineering. Analysis of cell-matrix interaction.}"은 생체적합성(biocompatibility)를 연구하기 위하여 인간 피부의 각질형성세포(keratinocytes) 및 섬유아세포(fibroblasts)와의 상호작용을 연구하기 위한 상어, 고래의 무세포적 콜라겐 기질의 용도를 환기시킨다.
더웬트(Derwent) 요약서 XP 002161598은 배양 물질로서 어류 유래의 콜라겐을 사용하는 방법을 묘사하는 1995년 3월 20일자로 공개된 마리노 포럼(Marino Forum)의 일본 특허출원 제 JP 07/075566호를 언급하고 있다.
그러나, 이 배양은 어류 세포를 가지고 처리한다.
유럽 특허 EP 0,753,313 A1은 해양 생물을 이용하는 연체 동물 또는 오징어로부터 추출한 키틴의 층(layer)이나 시트(sheet)를 포함하는 라미네이트(laminate)의 피부 대체물을 묘사한다. 여기에서, 키틴의 사용은 매우 중요하다. 왜냐하면 키틴 용액이 동결건조되어 졌을 때, 불용성의 생분해될 수 없는 해면(sponge)을 구성하는 키틴 구조가 얻어지며, 이 키틴은 인간 피부에 존재하는 효소에 의해 분해되지 않는다. 어류 피부의 콜라겐 겔은 키틴 층이나 시트 위에 부어질 수 있으며 이 둘은 약 일주일동안 냉장고 안에서 건조되어진다. 이러한 콜라겐 층은 밀도가 높으며 다공질이 아니다. 생체 세포가 파종될 수 없다. 이 문헌에서 묘사된 라미네이트는 자력으로 행동할 수 없는 라미네이트이며 이 후로 묘사되어지는 발명이 제공하는 것과는 대조적으로 생체 세포를 파종하여 이러한 세포의 생체 특성(character)을 유지하는 것을 기대하지 못한다.
이제, 본 발명자들은 기대치 않게 인간 세포가 어류 콜라겐, 바람직하게는 가교결합된 어류 콜라겐으로 구성된 특정 지지체 상부 또는 내부에서 매우 잘 발육되어지는 것을 발견하였다. 이러한 해양성 콜라겐은 바람직하게 경골 어류의 피부로부터 얻어지며 더욱 바람직하게는 무색소의 피부 부분을 가지는 어류로부터, 더욱 바람직하게는 가자미류로부터, 특별히 서대(sole), 문치가자미(dab), 터보트(turbot), 브릴(brill)과 같은 산업적인 어류 중 하나이며 상기 어류는 토막으로 썰어 사용한다. 더욱 바람직한 가자미류는 무색소의 복부 피부 부분이 잘 잘라지는 서대이다.
더 나아가, 본 발명자들은 이러한 생체 재료 내에서 배양된 인간 세포들이 정상적인 대사를 유지한다는 것을 주장할 수 있었다. 경골 어류 피부로부터 추출된 콜라겐을 가지는 생체 세포의 보존과 증식(proliferation)을 가능하게 하는 생체 적합성은 콜라겐이 가교결합, 특히 화학적으로 가교결합됨에 따라 특별히 당업자에게 명백하지 않았다. 이는 일반적으로 콜라겐의 가교결합은 가교결합된 콜라겐이 생체 세포 특별히 인간의 생체 세포에 대하여 생체 적합적이지 못하며 유독하다.
이러한 생체 재료는 피막, 압축 스폰지(compressed sponges) 또는 다공질 기질 중의 어느 하나일 수 있으며 이들은 하기 실시예에서 기재하는 제조방법과 함께설명될 것이다.
본 발명은 본질적으로 인공조직용 지지체의 생산을 위한 수산물 유래 콜라겐의 용도, 그 지지체 및 생체 재료에 관한 것이다.
도 1은 진피 등가물 내에서의 정상의 인간 섬유아세포의 분열증식을 보여준다. 가로축은 시간(일)로 나타내며, 세로축은 흡광도 ×1000으로 나타내며 100 단위로 증가하였다. 다이아몬드 점을 가진 곡선은 사용되어진 지지체가 수산 콜라겐, 이 경우에는 어류 콜라겐인 경우의 다공질 기질일 때 얻어진 결과이며 정사각형 점을 가진 곡선은 소의 콜라겐을 가지고 얻은 결과이다.
도 2는 진피 등가물에서의 섬유아세포의 분열증식을 위한 유사한 곡선을 보여준다. 가로축은 시간(일)로 나타내며, 세로축은 국제 단위로 표현되어진 형광 강도를 나타내며 이는 15,000에서 시작하고 10,000 단위로 증가한다. 닫힌 다이아몬드 점을 가진 곡선은 테스트 1에서 얻어진 형광을 나타내고 닫힌 정사각형 점을 가진 곡선은 테스트 2에서 얻어진 결과이고 열린 삼각형을 가진 곡선은 테스트 3에서 얻은 결과이며 십자 표시를 가진 곡선은 테스트 4에서 얻어진 결과이다.
본 발명의 목적은 신규한 생체 재료 즉, 지지체 위에서 배양되어지기 위한 그리고 정상의, 유전적으로 변형된 또는 악성 생체 세포를 포함하고 있는 신규한 생체 재료의 테두리 안에서 사용되어지기 위한 상기 생체 세포의 훌륭한 증식 그리고 그 이후 시험관 내 또는 생체 내 분열증식에 적합한 신규한 생체 재료를 형성하기에 적합한 인공조직용 지지체를 제공하는 것으로 구성되는 신규한 기술적 문제를 해결하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 저가의 제조비용으로 낮은 오염 위험을 가지고 신규한 인공조직용 지지체를 제공하고 이를 신규한 생체 재료를 공급하는데 특별히 적합하도록 만드는 것으로 구성되는 신규한 기술적 문제를 해결하는 것이다.
본 발명의 또 다른 주요 목적은 정상의, 유전적으로 변형된 또는 악성의 생체 세포를 시험관 내 또는 생체 내에서 증식시키는데 특별히 적합하고, 그 것의 구조가 포유동물 특별히 동물 또는 바람직하게 인간의 생체내 사용에 충분히 적합하면서 동시에 상기 포유동물 바람직하게는 인간의 새롭게 합성된 조직과 기존의 조직 간의 구별이 가능하도록 동물 또는 바람직하게는 인간과 같은 상기 포유동물의 조직구조와 다른 신규한 인공조직용 지지체를 제공하는 것으로 구성되는 신규한 기술적 문제를 해결하는 것이다.
본 발명은 처음으로 모든 이러한 기술적 문제들을 만족할만한 방식, 저비용,낮은 오염 위험 또는 오염 위험 없이 해결하는 동시에 당업자에게 특별히 명백하지 않으며 기대치 못했던 새롭게 합성된 조직을 쉽게 구별할 수 있도록 하였다.
따라서, 첫 번째 주안점으로 본 발명은 인공조직용 지지체의 생산을 위한 수산물 유래의 콜라겐의 용도에 관한 것이다.
본 발명에서 "수산물 유래의 콜라겐"은 수산물 유래 생물의 콜라겐을 포함하는 조직으로부터 유래된 콜라겐을 의미하는 것으로 이해된다; 이러한 생물은 당업자에게 잘 알려져 있으며 예를 들어, 모든 수생 포유동물, 특히 해양 포유동물, 해파리 및 바닷물고기 또는 민물고기를 포함한다. 더 나아가 당업자에게 이러한 생물의 피부가 필수적으로 콜라겐을 포함한다는 점은 알려져 있다. 바람직하게, 본 발명에서 "수산물 유래의 콜라겐"은 경골어류과 어류로부터, 더 특별하게는 무색소 부분을 가지는 어류로부터, 더욱 특별하게는 가자미류 및 특별히 상기에서 언급되어졌던 어류, 그리고 가장 바람직하게는 가자미류인 서대(sole)로부터 추출되어진다.
한 가지 유익한 실시예에서, 콜라겐은 어류 피부, 바람직하게는 그 것의 천연 형태로부터 얻어진다.
본 발명의 다른 유익한 실시예에서, 콜라겐의 기계적 강도 또는 효소적 소화(digestion)에 대한 저항성은 화학적 또는 물리적 가교결합에 의하여, 또는 콜라겐과 강하게 상호작용하는 천연의 거대분자의 첨가에 의하여, 또는 이들 두 과정의 조합에 의하여 증가되어진다.
본 발명의 또 다른 유익한 실시예에서, 콜라겐은 바람직하게 동결건조 단계를 거친 콜라겐 겔로부터 제조되어진 다공질 기질의 형태로 사용되어진다.
다른 유익한 변형예에서, 상기에서 언급한 다공질 기질은 물리적 방법, 바람직하게는 열 건조(thermal dehydration; TDH)에 의해 가교결합되어진다.
또 다른 유익한 변형예에서, 상기에서 언급된 다공질 기질은 화학적 방법, 바람직하게는 디페닐포스포릴라자이드(diphenylphosphorylazide; DPPA), 카보디이미드(carbodiimide), N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide) 또는 글루타알데히드(glutaraldehyde)를 이용한 화학적 방법에 의하여 가교결합되어진다.
본 발명의 유익한 실시예에서, 상기에서 언급한 콜라겐은 키토산과, 선택적으로 적어도 하나의 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan), 바람직하게는 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate)가 혼합된 해양성 콜라겐(바람직하게는 천연 콜라겐)으로부터 제조되어진 다공질 기질의 형태로 얻어질 수 있다.
본 발명의 다른 유익한 실시예에서, 상기에서 언급한 콜라겐은 콜라겐 겔로부터 제조되어진 다공질 기질의 형태로 제조되어질 수 있다. 상기 다공질 기질은 콜라겐 겔을 바람직하게는 공기 중에서 또는 가스성 유체에서 건조함으로써 제조되어진 콜라겐 피막 또는 고압축 콜라겐 스폰지 중의 하나로 구성되는 본질적으로 치밀한 콜라겐 막으로 적어도 한 면이 덮여져 있다.
본 발명의 다른 유익한 변형예에서, 상기에서 언급한 고압축 콜라겐 스폰지의 압축은 적어도 대략 50 바{대략 50.105파스칼(Pascal; Pa)}의 압력, 바람직하게는 50 바(50.105Pa) 내지 200 바(200.105Pa)의 압력에서 수행되어지며, 이러한 압축은 선택적으로 20℃ 내지 80℃의 온도, 바람직하게는 40℃ 내지 60℃의 온도에서 수행되어진다.
본 발명의 다른 유익한 특징에 따라, 두 층 즉, 다공질 층과 본질적으로 치밀한 막 중 적어도 하나는 특별히 청년 또는 중장년층 피실험자로부터 얻은 정상의, 유전적으로 변형된 또는 악성의 생체 세포를 포함한다.
본 발명의 한 가지 유익한 실시예에서, 생체 세포는 섬유아세포(fibroblasts), 각질형성세포(keratonocytes), 멜라닌세포(melanocytes), 혈액으로부터 유래된 랑게르한스 세포(Langerhans's cells), 혈액으로부터 유래된 내피세포(endothelial cells), 혈액 세포, 특별히 대식세포(macrophages) 또는 림프구(lymphocytes), 지방세포(adipocytes), 피지선세포(sebocytes), 연골세포(chondrocytes), 골세포(osteocytes), 골아세포(osteoblasts) 및 혈액으로부터 유래된 상피성촉각세포(Merkel's cells)로 구성되는 그룹으로부터 선택되어지며 상기 세포들은 정상의, 유전적으로 변형된 또는 악성의 세포들이다.
본 발명의 한 가지 특별히 유익한 실시예에서, 다공질 층은 정상의, 유전적으로 변형된 또는 악성의 섬유아세포를 포함하고 본질적으로 치밀한 막은 특별히 각질형성세포(keratonocytes), 멜라닌세포(melanocytes), 혈액으로부터 유래된 상피성촉각세포(Merkel's cells), 혈액으로부터 유래된 랑게르한스 세포(Langerhans's cells), 피지선세포(sebocytes), 혈액 및 신경 세포로부터 유래된 세포들로부터 선택된 정상의, 유전적으로 변형된 또는 악성의 생체 세포를 포함한다.
본 발명의 다른 유익한 실시예에서, 청년 피실험자로부터 얻은 세포를 이용하여 재건된 "어린(young)" 피부 또는 중장년층 피실험자로부터 얻은 세포로부터 얻은 재건된 "성숙(aged)" 피부 중 하나를 제조할 수 있다. 이러한 모델들은 피부 노화 과정에 대한 우리의 지식과 이러한 과정에 활성이 있는 작용제의 효과에 대한 연구를 증진시킬 수 있게 한다.
본 발명의 다른 특별히 유익한 실시예에서, 상기에서 언급한 본질적으로 치밀한 막은 특별히 그 전체가 냉동되어 동결건조되기 전에 막이 준비되어 콜라겐 겔상에 침적되어짐으로써 바람직하게는 콜라겐 스폰지를 포함하는 다공질 층과 조합되기 전에 제조되어진다.
두 번째 주안점으로, 본 발명은 또한 상기에서 정의되어진 또는 하기 상세한 설명과 실시예에서 온전히 그대로 얻어지는 수산물 유래의 콜라겐을 포함하는 인공조직용 지지체를 포함한다. 이는 일반적으로 본 발명의 필수적인 부분을 형성하고 당해 기술분야의 정세와 비교함으로써 신규한 것으로 나타나는 특징에 관한 것으로, 이러한 특징들은 그 것들의 기능과 그 것들의 보편성, 독립적으로 실시예의 문맥에서 얻어진다.
세 번째 주안점으로, 본 발명은 또한 생체 재료를 포함한다. 상기 생체 재료는 재건하는 접합적인 조직 또는 재건된 피부의 형태이고 상기에서 정의되고 또한 하기 상세한 설명으로부터 얻어지는 수산물 유래의 콜라겐으로부터 제조되어지며 상기 두 번째 주안점의 지지체를 위한 것이다.
본 발명의 상세한 설명과 청구항의 관점에서, "인공조직용 지지체" 표현은 시험관 내 또는 생체 내에서 정상의, 유전적으로 변형된 또는 악성의 생체 세포를 배양하고 분열증식시키는데 사용되는 지지체를 의미한다. 이러한 분열증식은 바람직하게는 동물을 포함하는 포유동물 바람직하게는 인간의 생체 내에 응용되어진다. 본 발명은 예를 들어 재건된 연결 조직(reconstituted connective tissues) 또는 재건된 피부(reconstitued skin)의 형태인 생체 재료의 제조를 위한 인공조직의 범주 내에서 특별하게 바람직한 용도를 가지는 것으로 이해되어진다. 이러한 범주 내에서, 첫 번째 단계는 일반적으로 재건된 연결 조직(reconstituted connective tissues) 또는 재건된 피부(reconstitued skin)의 형태와 같은 생체 재료를 주기 위하여 시험관 내에서 상기 생체 세포들을 가지고 지지체를 배양하는 것이며 그 다음 두 번째 단계는 재건된 연결 조직(reconstituted connective tissues) 또는 재건된 피부(reconstitued skin)의 형태와 같은 이러한 생체 재료를 예를 들어 동물 또는 바람직하게는 인간과 같은 포유 동물의 생체 내에서 외과적으로 손상되었거나 제거된 접합적인 조직을 재건하기 위하여, 또는 모든 의학적 동기를 위하여 외과적으로 손상되었거나 제거된 영역을 대체하기 위하여 피부를 제건하기 위하여 사용하는 것이다.
이롭게는, 인공조직용 지지체 또는 바람직하게는 재건된 연결 조직(reconstituted connective tissues) 또는 재건된 피부(reconstitued skin)의 형태와 같은 생체 재료는 특별히 조직의 노화 과정을 연구하기 위한 그리고 각별히 피부 노화 과정과 선택적으로 이러한 과정에 활성이 있는 원료 또는 성분의 효능을테스트하기 위한 청년 피실험자로부터 전적으로 얻었거나 또는 중장년 피실험자로부터 전적으로 얻은 세포들을 포함한다.
그러므로, 본 발명은 상기에서 언급한 새로운 기술적 문제에 대한 일반적인 해법을 제공하는 것이며 이 해법은 특별히 단순한 방식이고, 저가의 비용이 들며, 적은 오염 위험을 가질뿐만 아니라, 수산 콜라겐과 포유류의 콜라겐 또는 바람직하게는 생체 내 사용 과정에서 새롭게 합성되어진 인간 콜라겐 사이를 구별지을 수 있는 능력을 가진다.
사실상, 생체 인조 조직의 생산에서의 어류 콜라겐의 사용은 포유류 소스(source)와 비교되는 세 가지 주요 이점을 가진다:
·원료로써 일반적으로 사용되어지는 어류 껍질을 매우 청결한 조건 하에서 다량으로 얻을 수 있다.
·전염으로 인한 오염 위험이 매우 낮다. 특별히, 프리온(prion) 타입의 전염성 병원체의 알려진 위험이 없다.
·마지막으로, 어류 콜라겐의 아미노산 조성이 인간 콜라겐의 조성과 상대적으로 비슷하지 않음으로써, 두 단백질이 특별한 항체에 의하여 상대적으로 쉽게 구별되어질 수 있다. 이러한 계통적 분류법(methodology)은 특별히 "시험관 내" 테스트 또는 "생체 내" 치료 연구에 매우 가치가 있을 것이다.
게다가, 해양성 콜라겐의 용도는 매우 효과적으로 면역적 표지를 가능하게 할 것이며 해양성 콜라겐과 새롭게 합성된 콜라겐 사이를 구별할 수 있게 할 것이다.
어류 콜라겐은 프로테아제(proteases)에 의한 효소적 분해로부터 그 것을 보호하는 천연의 구조를 가지며 이 구조는 그 것의 기계적 특성에 대한 주요한 원인이 된다. 그러므로 추출 및 정제 실시 중 사용되는 처리들(treatment)이 가능한 한 적게 단백질 구조를 붕괴시킨다는 점은 매우 중요할 것이다. 이 것은 나선형의 구조와 분자간 및 분자내의 가교결합이 가능한 한 보호되어져야만 한다는 것을 의미한다. 본 발명자들은 이 것을 1994년 7월 19일자로 등록된 미국 특허 제 5331092호에서 묘사한 과정을 이행함으로써 좀 더 특별히 성취하였다. 그럼에도 불구하고, 특별한 적용을 위하여, 부분적으로 탈가교결합된(decrosslinked) 콜라겐, 예를 들어 아텔로콜라겐(atelocollagen) 즉, 텔로펩티드(telopeptide)가 없는 콜라겐의 사용을 상상해 보는 것이 가능하다.
그 다음, 대다수의 인공조직 적용을 위하여, 콜라겐의 기계적 특성이 강화되어질 것이며 효소적 소화에 대한 그 것의 저항성이 화학적 또는 물리적 가교결합 기술에 의하여 또는 단밸질과 강하게 상호작용하는 천연 거대분자의 첨가에 의하여 또는 마지막으로 두 과정의 조합 중 어느 하나에 의하여 증가되어질 것이다.
어류 콜라겐의 보호는 그 것의 천연 안정성이 포유류의 콜라겐의 그 것보다 더 낮기 때문에 더욱 중요하며 후자의 특성은 낮은 히드록시프롤린(hydroxyproline) 함유량에 기인한다.
상기에서 묘사한 생체 재료들은 생체 인조 조직을 생성하기 위하여 생체 세포와 함께 배양되어진다. 상기 인조 조직들은 "시험관 내" 테스트 분야 또는 상처 입은 조직을 치료하기 위한 약학 분야에서 사용되어진다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 인공조직용 지지체의 생산을 위한 본 발명의 범주 내에서 사용되어질 수 있는, 그러한 지지체뿐만 아니라 생체 재료를 구성하는 하기 수산물 유래 콜라겐의 형태들을 제조하는 것에 대한 실시예들에서 언급하는 상세한 설명으로부터 명백하여 질 것이며 이는 단순히 실례로서 주어지는 것일뿐이므로 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.
실시예에서, 다른 표시가 없는 한, 온도는 섭씨 온도로서, 압력은 대기압으로서, 퍼센트는 중량 퍼센트로서 주어진다.
실시예 1 내지 13은 콜라겐의 제조에 대한 실시예들이며 상기 콜라겐은 본 발명에 따라 인공조직용 지지체로서 사용되어질 수 있다.
실시예 14 내지 16은 명백히 수산물 유래 콜라겐 용도의 범주내에서 실시예 1 내지 13에서 제조되어진 형태들에 대한 비교 테스트들이며 이는 인공조직용 지지체의 생산 범주 내이다.
실시예 1: 천연 수산 콜라겐의 다공질 기질 제조
콜라겐은 1994년 7월 19일 등록된 미국 특허 제 5331092호의 기술에 의해 얻어진다.
A. 천연 수산 콜라겐의 제조
서대(sole) 복부 껍질을 마쇄한 후 0.78 g/L 포타슘 디하이드로겐포스페이트 및 21.7 g/L 디소듐 모노하이드로겐포스페이트를 포함하는 pH 7.8의 인산 완충용액으로 세척하여 콜라겐 겔을 제조하였다. 세척은 마쇄 물질(ground materials) kg 당 5L의 완충액의 비율로 한 시간동안 교반하면서 수행되어졌다. 인산 완충액은 마쇄 물질 kg 당 물 5L의 비율로 연수로 두 번 계속적으로 세척한 뒤 연속적으로 4000 rpm(로우셀렛 원심분리기; Rousselet centrifuge)에서 원심분리함으로써 제거되어졌다.
그 다음 마쇄 물질을 용액 10L에 마쇄 물질 1kg의 비율로 0.25 M 아세트산 용액을 이용하여 산성화하였다. 그 후 겔(gel)을 5분 동안 4000 rpm에서 원심분리하였다.
사용되어지기 위한 겔은 0.5 내지 2%의 콜라겐 농도를 가진 상기에서 수득한 상청액으로 구성된다.
B. 상기에서 수득한 콜라겐 겔로부터 다공질 기질의 제조
상기에서 얻은 겔을 20 g/cm2의 비율로 동결 건조 트레이(lyophilization tray)안으로 부어 넣었다. 그 후 -30℃에서 냉동하고 32℃ 이상에서 가열한 후 동결건조되었다. 총 동결건조 시간은 400 마이크로바(microbar)의 압력 하에서 16 시간이었다. 수득된 기질은 그 후 열 건조(thermal dehydration; TDH)에 의해 가교결합되어졌다. 열 건조는 16 시간동안 400 마이크로바의 진공하에서 110℃ 오븐에서 가열함으로써 수행되어졌다.
실시예 2: 1996년 7월 24일자 유럽 특허 제 466 829호에 개시된 기술에 의한 디페닐포스포릴라자이드(diphenylphosphorylazide; DPPA)를 이용하여 가교결합된 다공질 기질의 제조
실시예 1의 콜라겐 기질을 100 mL 디메틸포름아마이드(dimethylformamide; DMF)에 5 내지 250㎕ DPPA/g 콜라겐을 포함하는 용액 내에서 24 시간동안 배양하였다. 그 후 콜라겐을 DPPA를 제거하기 위하여 100 mL DMF로 헹구었다. DMF는 그 다음 pH 8.9의 붕산 완충용액(0.04 M 소듐 테트라보레이트, 0.04 M 붕산) 100mL로 헹굼으로써 제거되어졌다. 콜라겐은 최종적으로 동일한 붕산 완충용액안에서 하룻밤동안 배양되졌으며 붕산 완충용액은 그 후 6 시간동안 연수로 계속적으로 헹굼으로써 제거되어졌다.
실시예 3: 카보디이미드 및 N-히드록시숙신이미드를 이용하여 가교결합된 다공질 기질의 제조
실시예 1의 수산 콜라겐 기질을 0.23 내지 0.69 g/g 콜라겐 농도의 EDC(에틸디메틸아미노프로필카보디이미드; ethyldimethylaminopropylcarbodiimide)와 0.42 g/g 콜라겐 농도의 NHS(N-히드록시숙신이미드; N-hydroxysuccinimide)를 이용하여 가교결합시켰다.
연수로 헹군 후, 콜라겐을 다시 동결건조하였다.
실시예 4: 글라타알데히드를 이용하여 가교결합된 다공질 기질의 제조
실시예 1의 수산 콜라겐의 다공질 기질을 20℃에서 0.6 내지 1%의 GTA를 포함하는 용액 내에서 24 내지 96 시간동안 가교결합시켰다.
연수로 헹군 후, 콜라겐을 다시 동결건조하였다.
실시예 5: 1991년 5월 29일자 유럽 특허 제 296078호에 개시된 키토산 및 글리코사미노글리칸과 함께 실시예 1의 천연 수산 콜라겐을 이용하여 제조된 다공질 기질
2.5g의 키토산을 포함하는 356 mL의 물과 1.9 mL의 아세트산 용액; 및 400mL의 연수에 1g의 콘드로이틴 4-설페이트(chondroitin 4-sulfate)를 포함하는 용액을 600g의 1.5% 콜라겐 겔에 첨가하였다. pH가 대략 4.0인 혼합물을 그 후 교반하고 동결건조시켰다. 수득된 스폰지를 열 건조로 가교결합시켰다.
실시예 6: 콜라겐 피막으로 덮여진 실시예 1에서 묘사한 다공질 기질
A. 피막의 제조
고형분 함량이 0.3 내지 0.8%인 콜라겐 겔을 30℃ 오븐 또는 후드(hood) 아래에서 0.5g 겔/cm2트레이의 속도로 건조시켰다.
10 내지 40%의 글리세롤을 상기 콜라겐 겔에 첨가하였다.
상기 조건들 하에서 건조된 콜라겐은 투명한 피막을 형성하였다.
B. 상기에서 묘사한 다공질 기질과 피막의 조합
0.5% 내지 2%의 고체상 내용물을 가지는 수산 천연 콜라겐 겔을 cm2당 0.5g의 비율로 동결건조 트레이 안에서 침적시켰다. 콜라겐 피막이 상기 겔 위에 침적되어졌으며 그 후 그 전체를 동결건조시켰다. 수득된 동결건조물을 열 건조에 의해 가교결합시켰다.
실시예 7: 산-용해성 콜라겐 겔을 이용하여 제조되어지고 콜라겐 피막으로 덮여진 다공질 기질
본 과정은 피막 위로 겔을 붓는 것을 제외하고 실시예 6과 같다. 상기 피막은 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해 제조되어진 산-용해성의 콜라겐으로 이루어져 있다.
실시예 8: 아텔로콜라겐 겔을 이용하여 제조되어지고 콜라겐 피막으로 덮여진 다공질 기질
본 과정은 피막 위로 겔을 붓는 것과 같은 차이점을 제외하고 실시예 6과 같다. 상기 피막은 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해 제조되어진 아텔로콜라겐(atelocollagen), 즉 텔로펩타이드가 없는 콜라겐(telopeptide-free collagen)으로 이루어져 있다.
실시예 9: 키토산 및 글리코사미노글리칸과 함께 콜라겐으로 이루어지고 콜라겐 피막으로 덮여진 다공질 기질
본 과정은 콜라겐, 키토산 및 글리코사미노글리칸으로 이루어진 콜라겐 피막 위에 겔을 붓는 것을 제외하고 실시예 6과 같다. 상기 겔의 제조는 실시예 5에서 기술되어졌다.
실시예 10
콜라겐 피막으로 덮여진 상기에서 묘사한 모든 다공질 기질은 실시예 2, 3 및 4에서 묘사한 기술에 의해 가교결합되어질 수 있다.
실시예 11: 압축된 콜라겐 스폰지로 덮여진 실시예 1에서 묘사한 콜라겐만으로 된 다공질 기질
A. 압축 스폰지의 제조
실시예 1에서와 같이 제조되어진, 고형분 함량이 0.3 내지 1.5%인 콜라겐 겔을 0.5 내지 2 g/cm2무게의 스폰지를 얻기 위하여 동결건조시켰다.
동결건조물은 20 내지 60℃의 온도 범위와 50 내지 200 바(50 내지 200.105Pa)의 압력 범위에서 5 내지 60 초 동안 압축되어졌다.
B. 압축된 스폰지의 다공질 기질과의 조합
실시예 1에서 묘사된 콜라겐 겔이 cm2당 0.5g의 비율로 동결건조 트레이에서 침적되어졌다. 압축된 스폰지가 그 후 상기 겔 위에 침적되어졌으며 그 전체가 압축된 콜라겐 스폰지로 덮여진 다공질 콜라겐 스폰지를 얻기 위하여 동결건조되어졌다. 그 전체는 실시예 1에서 묘사된 대로 열 건조에 의해 가교결합되어졌다.
실시예 12: 압축된 스폰지로 덮여진 실시예 5에서 묘사된 콜라겐, 키토산 및 글리코사미노글리칸으로 이루어진 다공질 기질
실시예 5의 과정에 의해 제조되어진 콜라겐, 키토산 및 글리코사미노글리칸 겔을 cm2당 0.5g의 비율로 동결건조 트레이 안에서 침적시켰다. 그 후 압축된 스폰지가 상기 겔 위에 침적되어졌으며 그 전체가 동결건조되어졌다. 동결건조물은 그후 실시예 1에서 묘사되어진 바와 같이 열 건조에 의해 가교결합되어졌다.
실시예 13
압축된 콜라겐 스폰지로 덮여진 상기에서 묘사된 모든 다공질 기질들은 실시예 2, 3 및 4에서 묘사되어진 기술에 의해 가교결합되어질 수 있다.
실시예 14 내지 16: 소 및 수산물 유래의 콜라겐 기질의 세포 대사를 비교하기 위한 테스트
실시예 14: 섬유아세포의 세포 생존능(cell viability) 테스트
I. 진피 등가물(dermis equivalents)의 제조
본 비교 실험을 위하여, 우선 실시예 2에 따른 DPPA-가교결합된 수산 다공질 기질을 제조하였다.
비교 방법에 의해, 소 유래의 기질(bovine matrix)이라 불리는, DPPA로 가교결합되어진 비교 다공질 기질이 실시예 2와 같은 조건 하에서 소 유래의 콜라겐을 가지고 제조되어졌다.
7회 계대배양한 젊은 기증자군으로부터 채취한 정상 인간의 섬유아세포를 수산 및 소 유래의 기질 각각에 분열증식과 단백질 합성 연구의 경우에는 cm2당 250,000 세포의 비율로, 조직학 연구를 위한 수산 및 소 유래의 기질의 경우에는cm2당 300,000 세포의 비율로 배양시켰다.
상기 수산 및 소 유래의 기질들을 10% 우태반혈청, 100 IU/mL 페니실린(penicillin), 25㎍/mL 젠타마이신(gentamycin), 1㎍/mL 암포테리신 B(amphotericin B) 및 50㎍/mL 비타민 C를 50/50 (v/v) 비율로 첨가한 DMEM/HAM F12로 구성된 배지(medium) 안에서 배양시켰다.
상기 배양은 1 달동안 수행되어졌으며 배지는 일 주일에 3번 교환하여 주었다.
II. 수행되어진 분석들
1) MTT와의 반응에 의한 세포 생존능의 측정
1 중량%의 MTT(즉, 3-(4-(dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 2.5 시간동안 배양하였다.
상기 배양 기간 이후에, 변환된 생성물(conversion product)(포마잔 블루; formazan blue)를 DMSO에 용해시켜서 그것의 흡광도(optical density)를 550nm에서 측정하였다.
얻어진 흡광도는 숙신산염 탈수소 효소의 활성에 비례하였다. 이는 밝은 황색 테트라졸리움염(bright yellow tetrazolium salt) 즉, MTT를 포마잔의 청색 결정으로 변환시킬 수 있다.
세포 생존능은 배양 후 1, 5, 7 및 22일과 한 달에 측정되어졌다.
측정 값을 결정하기 위하여, 각 기질에서 6개의 시료를 준비하였다.
결과
일(days) 수산 기질 평균 표준편차 소 유래의 기질 평균 표준편차
1 487 24 403 40
5 604 19 393 59
7 520 56 398 64
22 608 30 680 40
상기 결과들은 또한 도 1에 덧붙여진 곡선을 위하여 사용되어졌다.
다이아몬드 점을 가진 곡선은 수산물 유래의 기질로부터 얻은 결과이며 정사각형 점을 가진 곡선은 소 유래의 기질로부터 얻은 결과이다.
상기 결과는 전체적으로 놀랍게도 수산물 유래의 기질이 정상 인간의 섬유아세포의 생존뿐만 아니라 이러한 정상의 인간 섬유아세포의 분열증식을 가능하게 하는 지지체를 만들어 냈으며 동시에 처음 3주 동안 훨씬 더 좋은 배양 지지체를 만들어 내었음을 보여준다.
따라서, 놀랍게도 상기 결과로부터 수산물 유래의 콜라겐이 특별히 생체 세포, 특별하게 바람직하게는 인간의 생체 세포를 포함하는 생체 재료를 형성하기 위한 시험관 내 그리고 심지어 생체 내에서의 적용을 위한, 특별히 인공조직용 지지체의 생산에 적합함을 결론지을 수 있었다.
2) 단백질 합성의 측정
진피 등가물의 준비에 대하여 상기에서 보고한 조건들 하에서 한 달 동안 배양한 후 얻은 진피 등가물을 한 달동안 성숙 분열시킨 후, 우태반혈청이 없는 배양액에서의 3일에 걸친 단백질 합성을 평가하였다.
분석은 피어스(Pierde)의 microBCA 방법에 의해 수행되어졌다.
세포 밀도는 상기에서 묘사한 조건 하에서 MTT 테스트에 의해 병행하여 평가되어졌다.
상대 단백질 함량은 흡광도(optical density) 또는 OD로서 표현되어진 세포 밀도의 단위(unit) 당 단백질 함량에 해당되며, 그래서 해당 세포 농도는 등가이다. 수득된 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
단백질 합성의 결과
지지체의 콜라겐 수산 기질 소 유래의 기질
평균 * 평균 *
세포 밀도(OD) 2.12 0.09 1.91 0.13
단백질(㎍/mL) 494 48 499 32
상대 단백질 함량 233 18 262 23
*: 평균 표준 편차
표 I에서와 같이, 평균은 6개의 시료들로부터 구하였다.
3) 조직학
21일 동안 수산 및 소 유래의 콜라겐 기질을 배양한 후 얻은 진피 등가물을 2% 파라포름알데하이드 용액(paraformaldehyde solution)으로 고정시킨 후 오스뮴 테트록사이드 용액(osmium tetroxide solution)에서 후고정(post-fixed)시킨 뒤, 건조시키고, 에폰(Epon)에 넣어, 박편을 만든 다음 CMEAGB(프랑스, 라이온; Lyon, France)에서 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy)(Jeol 1200)에 의하여 관찰하였다.
결론
상기 결과는 기질이 수산 또는 소의 것인지 그 여부와 관계없이 3차원적 기질의 매우 훌륭한 군체 형성을 나타내었다. 3주 동안 배양한 후, 세포 밀도는 기질 양쪽 모두 동등하였다. 그러나, 수산물 유래의 기질은 배양 첫 주 분열증식 연구에 의해 나타난 바와 같이 실험 초기에 더 좋은 세포 유착이 가능한 것으로 보였으며 따라서 짧은 배양 시간동안 더 좋은 군체 형성이 가능하다.
단백질 합성에 관한 한, 섬유아세포 합성 능력(상대적인 단백질 함량)은 또한 배양 한달 이후 동일하였다.
이러한 결과는 발육되어진 수산 콜라겐 기질이 훌륭한 품질의 진피 등가물을 제조하는 것을 가능하게 함을 나타내 주며 이러한 기질을 가지고 얻은 결과가 소 유래의 콜라겐 기질을 가지고 얻은 결과와 유사하였다.
투과 전자 현미경에서, 섬유아세포는 소 및 수산 유래의 기질에서 관찰되어질 수 있었다. 양쪽 기질에서, 풍부한 새롭게 합성된(neosynthesized) 세포외(extracellular) 기질의 존재가 감지되어졌다. 새롭게 합성된 세포외 기질은 침적된 콜라겐의 섬유 조직의 주기적인 줄무늬의 덕분으로 초기 스폰지의 3차원적 기질을 형성하는 콜라겐 다발(clusters)와 비교하여 구별되어질 수 있었다.
실시예 15: 세포 생존능에 대한 수산 콜라겐 기질의 가교결합의 다른 타입이 주는 영향
하기 테스트들은 세포 생존력에 대하여 수산 콜라겐 기질의 가교결합의 다른타입이 주는 영향을 연구하기 위하여 수행되어졌다.
I) 진피 등가물의 제조
a) 사용된 지지체 또는 기질
다른 비율의 콜라겐을 포함하는 다공질 층 또는 기질을 생산하기 위한 콜라겐 겔 내에서 다른 가교결합제(crosslinking agent)를 선택적으로 사용하여 다양한 콜라겐 지지체 또는 기질을 제조하였다:
1) 테스트 1
본 테스트를 위하여, 다공질 스폰지의 형태인 다공질 기질을 1.3 중량% 수산 콜라겐으로부터 제조된 수산 콜라겐 겔로부터 생산하였다. 상기 다공질 기질은 -80℃에서 냉동되어졌으며 실시예 2에 따라 표준의 동결건조를 수행한 후 건조 상태에서 스폰지 g당 250㎕의 비율로 DPPA로 가교결합되어졌다.
2) 테스트 2
본 테스트를 위하여, 수산 스폰지의 형태인 다공질 지지체를 0.7 중량%의 수산 콜라겐을 포함하는 수산 콜라겐 겔로부터 제조하였다. 상기 다공질 지지체는 -80℃에서 냉동되어진 후 표준 동결건조를 수행하였으며 테스트 1에서와 같이 건조 스폰지 g당 250㎕의 비율로 DPPA로 가교결합되어졌다.
3) 테스트 3
본 테스트를 위하여, 건조 스폰지 g당 0.46g의 비율로 실시예 2에 따라 EDC를 이용하여 가교결합을 수행한 점 이외에는 테스트 1과 같은 과정을 수행하였다.
4) 테스트 4
1.1 중량%의 수산 콜라겐을 포함하는 수산 콜라겐 겔로부터 얻은 수산 콜라겐 스폰지를 포함하는 다공질 지지체를 제조하였다. 상기 지지체를 -80℃에서 냉동시킨 후 표준 동결건조를 수행하였으며, 수산 콜라겐 1.1 중량%의 비율인 점을 제외하고 테스트 2에서와 같이 건조 스폰지 g당 250㎕의 비율로 DPPA로 가교결합시켰다.
상기 모든 테스트들에서, 수산 콜라겐은 실시예 2에서와 같이 서대의 복부 껍질로부터 얻었다.
b) 상기 기질상에서의 섬유아세포의 배양
정상의 인간 섬유아세포를 실시예 14에서와 같이 사용하였다. 다만, 상기 세포들은 8회 계대배양한 것을 취하였다.
접종을 cm2당 275,000 세포의 비율로 수행하였다.
배양액은 10 중량%의 우태반혈청, 100 IU/mL 페니실린, 25 ㎍/mL 젠타마이신, 1㎍/mL 암포테리신 B 및 50㎍/mL 비타민 C를 50/50(v/v)의 비율로 첨가한 DMEM/HAM F12로 구성된다.
배양은 1달 동안 수행되어졌으며 배양액은 일 주일에 3번 교환되어졌다.
4개의 기질을 테스트의 각 타입에 대한 값을 얻기 위하여 각 테스트를 위하여 사용하였으며 평균 표준편차를 측정하였다.
II) 수행되어진 분석
알라마 블루(산화 환원 반응 마커)와의 반응에 의한 세포 생존능 측정
배양액으로부터 취한 시료의 세포 생존능을 측정하고자 하는 순간 사용되어진 배양액에 대하여 2중량%의 비율로 알라마 블루(alamar blue)를 첨가하였다.
37℃에서 2시간 30분동안 배양(incubation)한 후, 530nm 여기파장(excitation) 및 590nm 방출파장(emission)에 따라 형광 강도를 측정하였다. 얻은 형광 강도는 세포의 대사 활성에 비례하였다.
세포 생존능을 배양 후 1, 4, 6, 11 및 17일에 10개의 시료에 대하여 측정하였다.
결과를 하기 표 3에 나타내었다.
결과는 시간 함수(function of time)로서 형광의 국제 단위로 표시하였다.
세포 생존력(형광의 IU)
시간(일) 테스트 1 테스트 2 테스트 3 테스트 4
평균 SD* 평균 SD* 평균 SD* 평균 SD*
1 21,734 1184 30,535 1888 25,528 6820 28,461 3805
4 31,611 920 35,623 3544 36,404 3570 45,126 2930
6 43,144 2500 35,244 2095 37,819 4170 41,254 3396
11 42,808 1481 38,532 2537 42,442 3112 44,508 2329
17 45,484 2426 45,094 1470 43,963 8285 43,939 4521
순서 1 2 3 4
*: 표준편차
표 3의 결과는 덧붙여진 도 2에서 또한 사용되어졌다.
도 2는 진피 등가물의 섬유아세포 분열증식의 곡선을 보여준다.
닫힌 다이아몬드 점을 가진 곡선은 테스트 1에 해당되고, 닫힌 정사각형 점을 가진 곡선은 테스트 2에 해당되며, 삼각형을 가진 곡선은 테스트 3에 해당되고,십자 표시를 가진 곡선은 테스트 4에 해당된다.
가로축은 시간(일)로 표시되었으며, 세로축은 형광 강도를 나타내었으며 형광 강도는 15,000을 시작으로 55,000까지 10,000의 단위 눈금을 가지도록 하였고 IU로 표시하였다.
상기 결과들은 하기 결론을 보여준다.
결론
상기 결과는 제조된 다른 기질들이 배양 17일 이후 섬유아세포의 훌륭한 성장을 가능케 하였음을 나타내었다. 수산 콜라겐 기질의 제조와 관계없이, 섬유아세포는 그들의 3차원적 지지체에 잘 부착되었으며 기질을 이식하기 위하여 매우 급속하게 분화되었다.
분열증식 윤곽(profile)은 하나의 기질에서 다른 기질까지 매우 약간만 변경되었다. 다만 섬유아세포 밀도는 준비과정과 관계없이 배양 17일 이후 비슷하였다.
DPPA 또는 EDC 중 어느 하나를 이용하여 수행한 다른 가교결합의 타입은 세포의 재생에 영향을 주지 않는 것으로 보인다. 실질적으로 배양 3주 이후, 기질의 안정성(stability)이 뛰어났으며 소화와 위축(contraction)은 거의 일어나지 않았다.
실시예 16: 새롭게 합성된 인간 콜라겐의 동정 및 분석을 위한 수산 콜라겐의 이점을 증명하는 테스트
본 테스트는 조직학이 면역적 표지를 이용하여 수행된 점을 제외하고 실시예14와 유사하다.
테스트는 하기와 같이 수행되어졌다:
1) 진피 등가물의 제조
실시예 14의 조건들 하에서 배양을 수행하여 실시예 14의 진피 등가물을 얻었다.
그러므로 상기 배양은 3 주동안 수행되어졌으며 배양액은 일 주일에 3번 교환되어졌다. 정상의 인간 섬유아세포가 실시예 14에서 나타낸 바와 같이 cm2당 300,000 세포의 비율로 접종되어졌다.
2) 조직학적 연구
a) 종래 조직학적 연구
고정은 4 중량%의 농도에서 파라포름알데하이드로 이루어졌으며 그 후 얻은 물질을 건조하여 파라핀에 넣었다. 그 다음 파라핀을 제거하고 재수화(rehydration)시킨 후 7㎛ 절편(sections)을 준비하고 말로리 하이든하인(Mallory Haidenhain)으로 착색(stain)시켰다.
b) 면역적 표지(Immunolabeling)
4 중량%의 파라포름알데하이드로 다시 고정하였다. 얻어진 물질을 티슈 텍 오시티 화합물(Tissue Tek OCT compound) 즉, 미국 인디아나주 엘크하트 마일스사(Miles, Elkhart, Indiana, USA)로부터 얻은 봉입액(inclusion liquid)에 넣었고, 7㎛ 절편을 냉장고에 준비하여 두었다.
면역적 표지가 하기를 이용하여 수행되어졌다:
i. 일차 항체(토끼 유래의 항-인간 콜라겐 타입 I 항체)(1/40 희석), 및
ii.이차 항체{FITC(Fluorescein IsoThioCyanate)가 결합된 항-토끼 항체}(1/160 희석).
DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole dilactate)가 대비염색제(counterstain)로서 사용되어졌다.
3) 결과
수산물 유래의 기질과 소 유래의 기질로 이루어진 지지체들이 섬유아세포가 부착되는 더 많은 또는 덜 헐거운 구멍을 형성하였음을 발견하였다.
섬유아세포가 재건된 피부의 생산을 위한 진피 등가물을 순조롭게 덮는 표면에서 더 큰 비율로 발견되어졌다. 섬유아세포의 분포는 수산 및 소 유래의 스폰지에서 모두 균일하였다.
면역적 표지에서, 소 유래의 콜라겐으로 형성된 기질이 항-인간 콜라겐 타입 I 항체(교차; crossing)에 의해 표지된 점을 발견하였다.
다른 한편으로, 수산물 유래의 기질이 항-인간 콜라겐 항체에 의해 단지 매우 약하게 표지되었다.
그러므로, 수산 콜라겐으로 구성된 스폰지의 용도는 새롭게 합성된 세포외 기질의 동정에 유리하다.
상기 결과들은 다른 항체에 대한 다른 항원의 반응에 대한 하트만 교수의 연구(Professor Hartmann's studies)에 의하여 설명되어진다. 이는 하기 표 4 또는하트만 테이블(Hartmann's table)에 주어진 면역적 표지 후 흡광도 측정에 의하여 결정되어진다.
인간, 소 및 어류 콜라겐을 이용한 교차 반응
항원
서대 타입 I 콜라겐 인간 타입 I 콜라겐 소의 I 타입 콜라겐
항체
20111(225)
1/25 190 > 815
1/50 210 > 548
1/100 73 1233 234
1/200 43 605 136
1/400 56 326 165
50121(03)
1/25 180 1550 >
1/50 130 1094 >
1/100 158 536 >
1/200 96 305 967
1/400 109 215 728
50171(01)
1/25 1880 64 73
1/50 1043 193 32
1/100 571 51 33
1/200 523 51 87
(>: 2000 보다 더 큰 흡광도)
상기 결과들을 OD ×103(λ= 450nm에서의 흡광도)로 표시하였다.
기호 해석:20111 (225): 항-인간 콜라겐 타입 I
50121 (03): 항-소 콜라겐 타입 I
50171(01): 항-어류 (서대) 콜라겐 타입 I
상기 결과를 나타내는 표는 면역적 표지에서 항체(항-인간 타입 I 콜라겐, 항-소 타입 I 콜라겐, 항-서대 타입 I 콜라겐)와 관계없이, 인간 콜라겐과 서대 콜라겐 사이의 차이가 인간 콜라겐과 소의 콜라겐 사이 보다 훨씬 더 크다는 점을 보여준다. 결과적으로, 어류 콜라겐 기질에서, 인간 섬유아세포에 의하여 합성되어진 콜라겐이 훨씬 더 쉽게 동정되어질 수 있다. 이로써 어류 콜라겐 기질안에서 합성되어진 콜라겐을 항-인간 타입 I 콜라겐 항체로 면역적 표지를 수행함으로써 얻어지는 상기에서 묘사한 결과가 본 발명의 특별히 기대치 못한 유익한 결과를 구성함을 확인할 수 있었다.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 인공조직용 지지체의 생산을 위한 수산물 유래 콜라겐의 용도, 그 지지체 및 생체 재료에 관한 것으로 생체 세포를 시험관 내 또는 생체 내에서 증식시키는데 특별히 적합하고 포유동물 바람직하게 인간의 생체내 사용에 충분히 적합하면서 동시에 상기 포유동물 바람직하게는 인간의 새롭게 합성된 조직과 기존의 조직을 쉽게 구별할 수 있도록 포유동물 바람직하게는 인간의 조직구조와 다른 신규한 인공조직용 지지체를 제공함으로써 피부인공조직산업 및 생체재료산업상 유용한 발명인 것이다.

Claims (15)

  1. 경골어류의 피부로부터 유래된 수산물 유래의 인공조직용 지지체를 제조하기 위한 콜라겐의 용도.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 콜라겐이 경골어류, 바람직하게는 무색소의 피부 부분을 가지는 어류, 바람직하게는 가자미류, 특히 서대(sole), 문치가자미(dab), 터보트(turbot), 브릴(brill)와 같은 산업적인 어류, 가장 바람직하게는 서대의 피부로부터 유래됨을 특징으로 하는 인공조직용 지지체를 제조하기 위한 콜라겐의 용도.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 콜라겐이 화학적 가교결합이나 물리적 가교결합 과정, 또는 콜라겐과 강하게 상호작용하는 천연 거대분자의 첨가과정, 또는 상기 두 과정의 조합 중 어느 하나에 의하여 증가된 기계적 강도 또는 효소적 소화에 대한 저항성을 가짐을 특징으로 하는 인공조직용 지지체를 제조하기 위한 콜라겐의 용도.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라겐이 동결건조 단계를 거친 콜라겐 겔로부터 제조되어진 다공질 기질의 형태로 사용되어짐을 특징으로 하는 인공조직용 지지체를 제조하기 위한 콜라겐의 용도.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 다공질 기질이 물리적 방법, 바람직하게는 열건조에 의하여 가교결합되어짐을 특징으로 하는 인공조직용 지지체를 제조하기 위한 콜라겐의 용도.
  6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 다공질 기질이 화학적 방법, 바람직하게는 디페닐포스포릴라자이드(diphenylphosphorylazide; DPPA), 카보디이미드(carbodiimide), N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide) 또는 글루타알테히드(glutaraldehyde)를 처리함으로써 가교결합되어짐을 특징으로 하는 인공조직용 지지체를 제조하기 위한 콜라겐의 용도.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라겐이 키토산과 선택적으로 적어도 하나의 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan), 바람직하게는 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate)과 혼합된 수산물 유래의 콜라겐, 바람직하게는 천연 형태인 수산물 유래의 콜라겐으로부터 제조되어진 다공질 기질을 포함함을 특징으로 하는 인공조직용 지지체를 제조하기 위한 콜라겐의 용도.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라겐이 콜라겐 겔로부터 제조된 다공질 기질을 포함하고 상기 다공질 기질은 바람직하게는 공기 중에서 또는 가스성 유체에서 콜라겐 겔을 건조함으로써 제조되어진 콜라겐 피막 또는 압축된 콜라겐 스폰지로부터 선택된 본질적으로 치밀한 콜라겐 막으로 적어도 한 면이 덮여져 있음을 특징으로 하는 인공조직용 지지체를 제조하기 위한 콜라겐의 용도.
  9. 제 6항, 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 다공질 층과 본질적으로 치밀한 막 중 적어도 어느 하나가 특별히 청년 또는 중장년의 피실험자로부터 유래된 정상 생체 세포, 유전적으로 변형되거나 악성의 생체 세포로 구성된 그룹으로부터 선택되는 생체 세포를 포함함을 특징으로 하는 인공조직용 지지체를 제조하기 위한 콜라겐의 용도.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 생체 세포가 섬유아세포(fibroblasts), 각질형성세포(keratonocytes), 멜라닌세포(melanocytes), 혈액으로부터 유래된 랑게르한스 세포(Langerhans's cells), 혈액으로부터 유래된 내피세포(endothelial cells), 혈액 세포, 특별히 대식세포(macrophages) 또는 림프구(lymphocytes), 지방세포(adipocytes), 피지선세포(sebocytes), 연골세포(chondrocytes), 골세포(osteocytes), 골아세포(osteoblasts) 및 혈액으로부터 유래된 상피성촉각세포(Merkel's cells)로 구성되는 그룹으로부터 선택되어지는 정상의, 유전적으로 변형된 또는 악성의 생체 세포임을 특징으로 하는 인공조직용 지지체를 제조하기 위한 콜라겐의 용도.
  11. 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 상기 다공질 층은 정상의, 유전적으로 변형된 또는 악성의 섬유아세포로부터 선택된 생체 섬유아세포를 포함하고; 상기 본질적으로 치밀한 막은 각질형성세포(keratonocytes), 멜라닌세포(melanocytes), 혈액으로부터 유래된 상피성촉각세포(Merkel's cells), 혈액으로부터 유래된 랑게르한스 세포(Langerhans's cells), 피지선세포(sebocytes), 혈액세포 및 신경세포로부터 유래된 세포들 중에서 선택된 정상의, 유전적으로 변형된 또는 악성의 생체 세포를 포함함을 특징으로 하는 인공조직용 지지체를 제조하기 위한 콜라겐의 용도.
  12. 제 8항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 압축된 콜라겐 스폰지의 압축은 50 바(50.105Pa), 바람직하게는 50 바(50.105Pa) 내지 200 바(200.105Pa)의 범위의 압력하에서 수행되어지고 선택적으로 20℃ 내지 80℃의 온도 범위, 바람직하게는 40℃ 내지 60℃의 온도 범위 내에서 수행되어짐을 특징으로 하는 인공조직용 지지체를 제조하기 위한 콜라겐의 용도.
  13. 제 8항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 본질적으로 치밀한 막은 콜라겐 스폰지와 콜라겐 겔의 조합물이 냉동되어 동결건조되기 전에 막이 준비되어 콜라겐 겔상에 침적되어짐으로써 바람직하게는 콜라겐 스폰지를 포함하는 다공질 층과 조합되기 전에 제조되어짐을 특징으로 하는 인공조직용 지지체를 제조하기 위한 콜라겐의 용도.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에서 정의한 콜라겐을 포함함을 특징으로 하는 인공조직용 지지체.
  15. 재건 연결 조직(reconstructing conjunctive tissue) 또는 재건된 피부의 형태이고, 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에서 정의한 콜라겐으로부터 제조되어지며, 특별히 조직 노화 과정 그 중에서도 피부의 노화 과정을 연구하고 결과적으로 상기 과정에 활성 성분의 효능을 테스트하기 위한 청년 피실험자로부터 전적으로 유래되거나 또는 중장년 피실험자로부터 전적으로 유래된 세포를 포함함을 특징으로 하는 생체 재료(biomaterial).
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