KR19980046135A

KR19980046135A - 애엽 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역억제제

Info

Publication number: KR19980046135A
Application number: KR1019960064424A
Authority: KR
Inventors: 이동훈; 이원철
Original assignee: 구형우; 한솔제지 주식회사
Priority date: 1996-12-11
Filing date: 1996-12-11
Publication date: 1998-09-15
Also published as: KR100247566B1

Abstract

본 발명은 애엽 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역억제제에 관한 것으로서, 더욱 상세하기로는 국화과의 애엽을 수용성 유기용제나 물을 사용하여 추출하여 얻은 애엽 추출물을 유효성분으로 함유시켜 장기이식시 발생하는 거부반응 제어작용 및 자가면역질환의 치료에 효과적인 면역억제제에 관한 것이다.

Description

애엽 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역억제제

애엽(Artemisia argyiLevl. et Vant.,A. lavandulaefoliaDC.,A. princeps var. orientalis(pampan.)Hara)은 국화과(Compositae)에 속하는 식물로서, 예로부터 생약으로 많이 사용하여 왔다. 동의보감에서는 온경지혈(溫經止血), 산한제습(散寒除濕), 축한습(逐寒濕), 이기혈(理氣血), 조경(調經), 안태(安胎), 지혈(止血) 등의 한의학적 약리작용이 있다고 기술하고 있다.

애엽에 대한 연구는 주로 그 함유성분에 관한 것이 대부분이나, 일부 문헌에서는 애엽의 약리작용에 대하여 연구한 결과를 발표한 바도 있다[Yoshikawa et al., Chem. Pharm. Bull., 44(9) 1656 ∼ 1662(1996); Tan Renxiang et al., Planta Med., 58(4) 370 ∼ 372(1992); Yano et al., Phytochemistry, 11(8) 2577 ∼ 2579(1974) 등]. 이러한 연구결과에 의하면, 애엽에는 세스퀴테르펜(sesquiterpene), 트리테르펜(triterpene), 플라본(flavone), 케톤 유도체(ketone derivatives) 등이 함유되어 있는 것으로 보고되어 있다. 그리고, 애엽의 약리작용으로는 항암효과[일본특허공개 평7-206839호], 항균효과[중국특허공개 제1070545호, 제1053169호], 천식억제[Zhongeaoyao 13(6) 1 ∼ 5(1982)], 항앨러지[Wakan Iyakugaku Zasshi 12(3) 241 ∼ 9(1995)) 등의 효과가 있는 것으로 보고되어 있다.

그러나, 애엽과 관련된 어떠한 문헌에서도 애엽의 함유성분에 대하여 면역억제능을 연구한 결과는 없었다.

본 발명자들은 생약제로 널리 이용되고 있는 애엽으로부터 추출 분리한 애엽 추출물이 우수한 면역억제능을 가지고 있음을 알게 됨으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 애엽 추출물을 유효성분으로 함유시켜 장기이식시 발생하는 거부반응 제어 또는 자가면역질환 치료에 유용한 면역억제제를 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 애엽 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역억제제를 그 특징으로 한다.

본 발명에 따른 애엽 추출물의 추출과정을 보다 자세히 설명하면 다음과 같다.

환류냉각장치가 설치된 추출기에 건조된 애엽의 전초를 넣고 약 24시간동안 끓여서 추출하고 여과하는데, 이때 추출용매는 애엽 중량의 10 ∼ 20배를 사용한다. 여액은 모으고, 잔사는 다시 추출하여 여과하며 이 조작을 여러번 반복한다. 이렇게 얻은 여액 전부를 추출에 사용한 유기용제가 모두 없어질 때까지 감압 농축한다.

추출용제로는 수용성 유기용제 또는 물을 사용하는 바, 수용성 유기용제로는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올과 같은 저급알코올, 아세톤과 같은 케톤류, 디옥산과 같은 수용성 에테르류를 사용한다. 이러한 수용성 용매는 한가지만을 단독으로 사용하거나, 또는 두종류 이상을 서로 혼합 사용하거나 물을 섞어 사용하여도 무방하다.

상기와 같은 추출과정에 의해 얻은 추출물로부터 수용성 물질만을 분리한다. 수용성물질의 분리는 여과나 용매추출의 방법이 사용가능하나, 용매추출의 방법을 이용할 경우 물과 유기용매에 모두 녹는 물질에 대한 손실이 발생할 수 있으므로 용매추출의 방법 보다는 여과에 의해 수용성 물질을 분리하는 것이 수율면에서 바람직하다.

분리한 수용성 분획에 대해서는 분자량 10,000 이하의 고분자 물질만을 수득하는데, 10,000 이상의 고분자 물질도 약간의 활성을 보이지만 10,000 이하의 물질에 비하여 활성이 현저히 떨어지기 때문이다. 10,000 이상의 고분자 물질을 제거하기 위해서는 여과막(Membrane Filter)을 이용하거나 크로마토그래피 등의 방법을 사용한다.

위와같은 방법으로 분리한 분획에 대해서는 안전한 보관을 위하여 동결건조를 하고 가능하다면 냉장보관한다.

또한, 본 발명에서 얻은 유효 활성분획에 통상의 무독성 약제학적으로 수용 가능한 담체, 보강제 및 부형제를 첨가하여 경구투여 또는 비경구투여할 수 있다. 경구투여용 제형으로는 정제, 트로케제(troches), 로젠지(lozenge), 수용성 또는 유성 현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐 또는 엘릭시르제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해서는 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수전분 또는 고구마전분과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활제가 함유된다. 캡슐제의 경우는 상기에서 언급한 물질이외에도 지방유와 같은 액체담체를 함유한다. 비경구투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내주사 또는 흉부내주사 주입방식에 의한다. 비경구투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 유효 활성분획을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위투여형으로 제제한다.

이와같은 본 발명을 다음의 실시에에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1:활성물질의 분리

건조한 애엽의 전초 500 g을 추출기에 넣고, 여기에 95% 에탄올 5 ℓ를 가하고 환류 냉각기를 설치하여 80 ℃에서 24시간 추출하였다. 추출 후 혼합물은 여과하고 잔사는 상기와 동일한 방법으로 3회 반복하여 추출하였다. 회수여액을 모두 모아서 60 ℃ 이하에서 감압증류하였다. 농축액은 증류수에 녹이고 0.1 ㎛ 여과막(Membrane Filter)을 이용하여 여과하였다. 회수된 여액을 분자량 10,000 이하의 물질을 통과시키는 여과막을 이용하여 여과하였다. 여기서 얻은 분자량 10,000 이하의 물질을 동결건조하여 면역억제 활성물질 5 g을 얻었다.

실시예 2 : 시럽제의 제조

유효성분 2%(중량/부피)를 함유하는 시럽을 다음과 같은 성분들로 제조하였다.

상기 실시예 1의 유효활성분획(2 g), 사카린(0.08 g) 및 당(25.4 g)을 증류수(80 g)에 용해시켰다. 이 용액에 글리세린(8.0 g), 향미료(0.04 g), 에탄올(4.0 g) 및 소르브산 (0.4 g)이 증류수에 녹아있는 용액을 투입하고 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다.

실시예 3 : 정제의 제조

유효성분 15 mg이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

상기 실시예 1의 유효활성분획(250 g)을 락토오스(175.9 g), 감자전분(180 g) 및 콜로이드성 규산(32 g)과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 매쉬(mesh) 체(sieve)를 통과시켰다. 이것은 건조시키고, 여기에 감자전분(160 g), 활석(50 g) 및 스테아린산 마그네슘(5 g)을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

실시예 4 : 주사액제

상기 실시예 1의 유효활성분획(1 g), 염화나트륨(0.6 g) 및 아스코르브산(0.1 g)을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖ 용액을 얻었다. 이 용액을 병에 넣고, 20℃에서 30분간 가열하여서 멸균시켰다.

실시예 5:면역억제 활성의 측정

상기 실시예 1에서 분리 추출된 애엽 추출물이 면역반응억제에 미치는 효능을 관찰하기 위한 탐색실험으로서 마우스 비장 림프구의 증식억제효과를 관찰하였다.

정상 마우스의 비장세포로부터 분리한 림프구를 10% 우태아 혈청이 첨가된 RPMI 1640 배지(이하, 완전배지라 함)에 6×10⁶/㎖로 부유시키고, 이 세포부유액을 50 ㎕씩 플레이트(96 well round bottemed plate)에 분주하였다. 대조군은 150 ㎕씩의 완전배지를 상기의 플레이트에 첨가하고, 실험대조군은 완전배지에 콘카나발린 A(Concanavalin A) 4 ㎕/㎖를 용해시킨 용액 50 ㎕와 완전배지에 100 ㎕를 함께 넣었다. 실험군은 생약추출액을 완전배지로 계열 희석하고 이 용액을 각각의 웰(well)에 50 ㎕, 그리고 완전배지를 50 ㎕씩 함께 넣어 웰당 전체량이 200 ㎕가 되게 하였다.

모든 플레이트는 37 ℃, 5% CO₂항온항습기(이하, 배양기라 함)에 넣어 3 ∼ 4일간 배양하고 10 ㎕(0.1 μCi)의³H-TdR(Tritiated thymidine, 20.0 Ci/mmol)을 각 웰에 첨가하여 6시간 연장 배양하였다. 배양 후는 세포수집기(cell harvester)로 각 웰의 세포들을 글라스 필터 화이버(glass filter fiber)에 흡착시키고 건조시킨 후, 신틸레이션 베타 계수기(Scintillation beta counter)로 세포내에 함유된³H-TdR의 양을 측정하여 림프구의 증식 억제반응을 조사하였다. 그 결과는 다음 표1에 나타내었다.

콘카나발린 A를 사용한 결과
유효활성분획 투입량(mg/㎖)	β-계측(세포내 함유된³H-TdR)	증식억제효과(%)
51.30.30.08대조군	526112496184737481520	99998842-

한편, 생약추출물이 마우스 림프구의 혼합배양에 미치는 효과에 대한 실험은 BALB/B 마우스의 림프구 부유액 50 ㎕(1.5×10⁶/㎖)와 방사된 C57BL/6 마우스 림프구 부유액 50 ㎕(1.5×10⁶/㎖)를 함께 넣고 대조군은 완전배지를 100 ㎕, 실험군은 완전배지로 계열 희석한 생약 추출액을 100 ㎕씩을 넣어 상기와 같은 방법으로 배양하고 측정하였다.

상기와 같은 방법으로 평가한 마우스 비장 림프구 증식억제 효과는 다음 표2과 같다.

마우스 림프구의 혼합배양한 결과
유효활성분획 투입량(mg/㎖)	β-계측(세포내 함유된³H-TdR)	증식억제효과(%)
52.51.30.60.30.15대조군	1842082301651271564204	969595969796-

실시예 5 : 독성실험

상기 실시예 1의 유효활성분획에 대하여 다음과 같은 독성실험을 실시하였다.

·대상동물 : BALB/c mouse

·투입경로 : 복막내 주사

·투입방법 : 다음 표3에 의해 매일 일정량 투입

실험집단(5마리/집단)	투입량(mg/kg/일)	투입일(생존한 마우스/투입한 마우스)
실험집단(5마리/집단)	투입량(mg/kg/일)	1	2	3	4	5	15
1234	500100020004000	5/55/55/51/5	5/55/55/50/5	5/55/51/5	5/55/50/5	5/55/5	5/55/5

본 발명에 따른 애엽 추출물은 자가면역질환의 치료와 장기이식에서의 거부반응을 제어하는 등 다양한 면역억제능을 가지는 바, 이러한 애엽 추출물은 광범위한 면역억제제의 유효성분으로 매우 유용하다.

Claims

애엽(Artemisia argyiLevl. et Vant.,A. lavandulaefoliaDC.,A. princeps var. orientalis(pampan.)Hara) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 면역억제제
제 1 항에 있어서, 상기 애엽 추출물은 애엽을 수용성 유기용제 또는 물로 추출 분리하여 얻은 것임을 특징으로 하는 면역억제제.
제 1 항에 있어서, 상기 애엽 추출물은 분자량 10,000 이하의 수용성 고분자인 것임을 특징으로 하는 면역억제제.
제 1 항의 면역억제제를 장기이식거부반응 및 자가면역질횐 치료에 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.