KR102481211B1 - SNP marker for chronic sensorineural tinnitus diagnosis and diagnosis method using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 이명 진단용 SNP 마커 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 전장 유전체 연관 분석(Genome-wide association study; GWAS)을 이용하여 이명 환자들의 유전체 DNA의 단백질 코딩 부위를 분석한 결과, 단일염기다형성(SNP) 부위인 chr22:38485200 위치의 SNP 및 dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978이 만성 감각신경성 이명 환자와 밀접하게 연관되어 있는 것을 규명하였는 바, 상기와 같은 SNP 마커는 이명의 진단 또는 발병 예측을 위한 유전자 진단 시약을 개발하는데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.The present invention relates to a SNP marker for diagnosing tinnitus and a diagnostic method using the same. As a result of analyzing the protein coding region of genomic DNA of tinnitus patients using genome-wide association study (GWAS), the present inventors found that a single It was found that the polymorphism (SNP) SNP at position chr22:38485200 and the dbSNP databases rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978 are closely associated with patients with chronic sensorineural tinnitus. It is expected that it can be usefully used to develop genetic diagnostic reagents for prediction.
Description
본 발명은 이명 진단용 SNP 마커 및 이를 이용한 이명 진단 방법 등에 관한 것이다.The present invention relates to a SNP marker for diagnosing tinnitus and a method for diagnosing tinnitus using the same.
일반적으로 이명이란 외부의 자극이 없는데도 소리를 느끼는 것(the sensation of sound without external stimulation)으로 청각계의 이상 중 가장 흔하게 접하는 증상 중의 하나이다. 이명은 불면증, 집중력 상실, 우울증을 유발하여 일상 생활을 방해하고, 정상인의 95%이상에서 일생에 한번 이상 이명을 경험하며 전체인구의 17%가 이명으로 불편함을 겪고 이 중 5%정도가 병원을 찾을 정도로 심한 이명을 느낀다. In general, tinnitus is the sensation of sound without external stimulation, and is one of the most common symptoms among hearing abnormalities. Tinnitus causes insomnia, loss of concentration, and depression, interfering with daily life. More than 95% of normal people experience tinnitus at least once in their lifetime, and 17% of the total population suffer from tinnitus, and about 5% of them are hospitalized. I feel tinnitus severe enough to find
이명은 객관적 이명과 주관적 이명으로 구분되며, 관찰자에 의해 소리가 확인 가능한 객관적 이명은 혈관, 근육, 관절 등에 의해 발생되는 소리가 들리는 것으로 원인을 비교적 명확하게 규명할 수 있다. 주관적 이명 또는 감각신경성 이명은 가장 흔한 형태의 이명이지만, 아직 그 발병 원인이 명확하게 알려져 있지 않다. 말초 청각계에서부터 중추신경계까지 발생할 수 있는 어떠한 변화도 이명의 원인이 될 수 있으며, 단일 원인보다는 복합적인 원인에 의해 이명이 발생하는 것으로 생각되고 있다. 이러한 이명 발생 원인의 복잡성과 불명확성은 이명 양상의 다양성을 유발하고, 특히 치료에 대한 반응이 다양하게 되는 원인이 된다. Tinnitus is divided into objective tinnitus and subjective tinnitus. Objective tinnitus, which can be confirmed by an observer, is the hearing of sounds generated by blood vessels, muscles, joints, etc., and the cause can be identified relatively clearly. Subjective tinnitus, or sensorineural tinnitus, is the most common form of tinnitus, but its cause is still unknown. Any change that can occur from the peripheral auditory system to the central nervous system can cause tinnitus, and it is thought that tinnitus is caused by multiple causes rather than a single cause. The complexity and uncertainty of the causes of tinnitus cause the diversity of the patterns of tinnitus, and in particular, cause the response to treatment to vary.
지금까지 감각신경성 이명의 치료는 주관적인 이명의 증상과 청력검사 결과만 고려되었으며, 환자의 유전학적 특성과 같은 환자 개개인의 차이는 반영되지 못하였던 것이 사실이다. 정밀의료(Precise medicine)은 이러한 이명 치료의 한계를 극복할 수 있는 방법으로, 유전학적, 생물학적, 정신사회적 특성을 고려하여 환자 개개인에게 가장 적합한 치료법을 제시하는 방법이다. 따라서 이명의 유전학적 원인을 규명하는 것은 정밀의료의 측면에서 필수적인 요소가 된다. Until now, treatment of sensorineural tinnitus has only considered subjective tinnitus symptoms and hearing test results, and it is true that individual differences such as genetic characteristics of patients have not been reflected. Precise medicine is a method that can overcome the limitations of tinnitus treatment, and is a method of presenting the most suitable treatment for each patient in consideration of genetic, biological, and psychosocial characteristics. Therefore, identifying the genetic cause of tinnitus is an essential element in terms of precision medicine.
한편, 유전체연구 기술 발달에 힘입어 한 사람에 존재하는 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism; SNP)과 질병발생과의 관련성을 동시에 살펴보는 전장 유전체 연관 분석(Genome-wide association study; GWAS) 방법이 대세를 이루게 되었다. 전장 유전체 연관 분석은 약 50만-200만 개 SNP의 유전자형을 탐색하여 질병과의 연관성을 통계적으로 분석하는 방법을 일컫는다. 현재까지 이 방법으로 다양한 유전변이들이 전 세계적으로 발굴되었으며, GWAS를 이용한 질환에 대한 감수성 유전자들을 동정하고자 하는 시도가 이루어지고 있다.On the other hand, thanks to the development of genome research technology, the Genome-wide association study (GWAS) method, which simultaneously examines the relationship between Single Nucleotide Polymorphism (SNP) and disease occurrence in a person, is popular. has achieved Whole genome association analysis refers to a method of statistically analyzing associations with diseases by searching for genotypes of about 500,000 to 2 million SNPs. Until now, various genetic mutations have been discovered worldwide by this method, and attempts are being made to identify susceptibility genes for diseases using GWAS.
이명은 높은 유병률에도 불구하고 이명과 관련된 유전 연구는 아직 미비한 실정이다. 그러나 GWAS를 이용하여 탐색된 SNP를 이용하면 이명 환자들의 유전적 특성을 예측할 수 있으므로 가장 적합한 치료 방법을 제시하는데 도움이 될 수 있을 것으로 기대된다. Despite the high prevalence of tinnitus, genetic research related to tinnitus is still incomplete. However, since the genetic characteristics of tinnitus patients can be predicted using SNPs searched for using GWAS, it is expected to be helpful in suggesting the most appropriate treatment method.
이에 본 발명자들은 이명과 관련된 유전자형을 확인하기 위해 동일한 표본 크기를 이용하여 변이(variant)를 검출하는 데에 있어, GWAS 분석을 수행한 결과, 유의한 SNP들을 확인하여 이명의 진단 또는 발병 예측을 위한 유전자 진단 시약 개발 등에 활용하고자 하였다.Accordingly, the present inventors performed GWAS analysis in detecting variants using the same sample size to identify genotypes related to tinnitus, and as a result, identified significant SNPs and identified genes for diagnosis or prediction of onset of tinnitus. It was intended to be used for the development of diagnostic reagents.
본 발명자들은 GWAS 분석을 통해 이명 환자들의 유전체 DNA의 단백질 코딩 부위를 분석하여 이명 환자와 밀접하게 연관되어 있는 SNP들을 확인하였는 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.The present inventors analyzed protein coding regions of genomic DNA of tinnitus patients through GWAS analysis to identify SNPs closely associated with tinnitus patients, and based on this, the present invention was completed.
이에, 본 발명의 목적은 chr22:38485200 위치의 단일염기다형성(SNP), dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(SNP)의 검출 제제를 포함하는, 이명 진단 또는 발병 예측용 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to diagnose tinnitus, including a detection agent for at least one single nucleotide polymorphism (SNP) selected from the group consisting of a single nucleotide polymorphism (SNP) at position chr22: 38485200, dbSNP database rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978 Or to provide a composition for predicting onset.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 이명 진단 또는 발병 예측용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing or predicting the onset of tinnitus, including the composition.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 SNP를 이용하여 이명의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 이명의 발병 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for providing information necessary for diagnosing tinnitus and a method for providing information necessary for predicting the onset of tinnitus using the SNP.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the description below. There will be.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 chr22:38485200 위치의 단일염기다형성(SNP), dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(SNP)의 검출 제제를 포함하는, 이명 진단 또는 발병 예측용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention includes a single nucleotide polymorphism (SNP) at position chr22: 38485200, a detection agent for at least one single nucleotide polymorphism (SNP) selected from the group consisting of dbSNP databases rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978 To provide a composition for diagnosing or predicting the onset of tinnitus.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 이명 진단 또는 발병 예측용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for diagnosing or predicting the onset of tinnitus, including the composition.
또한, 본 발명은 피검체로부터 수득한 시료 중의 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기서열에 chr22:38485200 위치의 단일염기다형성(SNP), dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP가 존재하는 경우, 피검체가 이명을 가진 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 이명의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention is a single nucleotide polymorphism (SNP) at position chr22: 38485200 in the base sequence of a single nucleotide polymorphism (SNP) site in a sample obtained from a subject, and one selected from the group consisting of dbSNP database rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978 Provided is a method for providing information necessary for diagnosis of tinnitus, comprising the step of determining that the subject has tinnitus when an abnormal SNP exists.
또한, 본 발명은 피검체로부터 수득한 시료 중의 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기서열에 chr22:38485200 위치의 단일염기다형성(SNP), dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP가 존재하는 경우, 피검체가 이명에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 이명의 발병 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention is a single nucleotide polymorphism (SNP) at position chr22: 38485200 in the base sequence of a single nucleotide polymorphism (SNP) site in a sample obtained from a subject, and one selected from the group consisting of dbSNP database rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978 Provided is a method for providing information necessary for predicting the onset of tinnitus, comprising the step of determining that the subject has a high risk of tinnitus when an abnormal SNP exists.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 이명은 만성 감각신경성 이명일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As one embodiment of the present invention, the tinnitus may be chronic sensorineural tinnitus, but is not limited thereto.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 검출 제제는 chr22:38485200 위치의 SNP, rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP를 검출할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the detection agent may be a primer or probe capable of detecting one or more SNPs selected from the group consisting of chr22: SNP at position 38485200, rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978, but is not limited thereto .
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As another embodiment of the present invention, the kit may be a RT-PCR kit or a microarray chip kit, but is not limited thereto.
또한, 본 발명은 chr22:38485200 위치의 단일염기다형성(SNP), dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(SNP)의 검출 제제를 포함하는 조성물의 이명 진단 용도를 제공한다.In addition, the present invention is a single nucleotide polymorphism (SNP) at position chr22: 38485200, dbSNP database rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978 Selected from the group consisting of at least one single nucleotide polymorphism (SNP) Use of a composition comprising a detection agent provides
또한, 본 발명은 chr22:38485200 위치의 단일염기다형성(SNP), dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(SNP)의 검출 제제를 포함하는 조성물의 이명 발병 예측 용도를 제공한다.In addition, the present invention is a single nucleotide polymorphism (SNP) at position chr22: 38485200, dbSNP database rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978 Selected from the group consisting of one or more single nucleotide polymorphisms (SNPs) Detection of a composition comprising a tinnitus onset prediction provide use.
본 발명자들은 전장 유전체 연관 분석(Genome-wide association study; GWAS)을 이용하여 이명 환자들의 유전체 DNA의 단백질 코딩 부위를 분석한 결과, 단일염기다형성(SNP) 부위인 chr22:38485200 위치의 SNP 및 dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978이 만성 감각신경성 이명 환자와 밀접하게 연관되어 있는 것을 규명하였는 바, 상기와 같은 SNP 마커는 이명의 진단 또는 발병 예측을 위한 유전자 진단 시약을 개발하는데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.The present inventors analyzed the protein coding region of the genomic DNA of tinnitus patients using genome-wide association study (GWAS), and as a result, the single nucleotide polymorphism (SNP) site chr22: SNP and dbSNP database at position chr22: 38485200 As it was found that rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978 are closely related to patients with chronic sensorineural tinnitus, the above SNP markers can be usefully used to develop genetic diagnostic reagents for diagnosis or prediction of onset of tinnitus. It is expected.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 단일염기다형성(SNP) 선별 과정에서 데이터 처리 및 데이터 품질 관리 과정을 도식화한 도면으로, DQC는 dish 품질 관리 (dish quality control), APT는 분석 파워 툴(analysis power tools), QC는 품질 관리(quality control), SNP는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphisms), MDS는 다차원 척도법(multidimensional scale)을 각각 의미한다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 PLINK를 이용한 GWAS 분석에 대한 전체적인 개략도를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 SNP에 대한 연관성 분석 결과를 나타낸 도면이다.1 is a diagram illustrating a data processing and data quality control process in a single nucleotide polymorphism (SNP) screening process according to an embodiment of the present invention, DQC is dish quality control, and APT is an analysis power tool ( analysis power tools), QC stands for quality control, SNP stands for single nucleotide polymorphisms, and MDS stands for multidimensional scale.
2 is a diagram showing an overall schematic diagram of GWAS analysis using PLINK according to an embodiment of the present invention.
3 is a diagram showing the results of association analysis for SNPs according to an embodiment of the present invention.
본 발명은 chr22:38485200 위치의 단일염기다형성(SNP), dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(SNP)의 검출 제제를 포함하는, 이명 진단 또는 발병 예측용 조성물을 제공한다.The present invention is a single nucleotide polymorphism (SNP) at position chr22: 38485200, dbSNP database rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978 For diagnosis or onset of tinnitus, including an agent for detecting at least one single nucleotide polymorphism (SNP) selected from the group consisting of composition is provided.
본 발명에 있어서, "다형성(polymorphism)"이란 유전적으로 결정된 집단 내에서 2 이상의 대체적 서열 또는 대립형질(또는 대립유전자)의 발생을 의미하며, "단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)"은 하나의 염기의 다형성을 의미한다. 구체적으로 유전체에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 예를 들어, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예를 들어 AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG, AAGT[G/G]AG)처럼 단일염기에서 차이를 포함하는 경우, 두 개의 대립유전자(A 또는 G)라고 부르며, 일반적으로 거의 모든 SNP는 두 개의 대립 유전자를 가진다. 또한 SNP가 특정 질환과 유전적으로 밀접하게 연관되어 있는 경우에는, SNP는 확인된 정상인(normal) 또는 야생형(wild-type, WT) 개체 또는 대립유전자와 비교하여 특정 위치의 하나의 염기에 변이가 발생한 것을 의미하기도 한다.In the present invention, "polymorphism" means the occurrence of two or more alternative sequences or alleles (or alleles) within a genetically determined population, and "single nucleotide polymorphism (SNP)" means one refers to the polymorphism of the base of Specifically, a single base (A, T, C, or G) in the genome refers to the diversity of DNA sequences occurring between members of a species or between paired chromosomes of an individual. For example, when three DNA fragments from different individuals contain differences in a single base, such as AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG, and AAGT[G/G]AG , called two alleles (A or G), and generally almost all SNPs have two alleles. In addition, when an SNP is genetically closely related to a specific disease, the SNP is a mutation in one base at a specific position compared to an identified normal or wild-type (WT) individual or allele. it also means
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 chr22:38485200 위치의 SNP, dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP를 진단 마커로 검출한다.In the present invention, the composition detects one or more SNPs selected from the group consisting of chr22:38485200 position SNP, dbSNP database rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978 as a diagnostic marker.
본 발명에 있어서, chr22:38485200 위치의 SNP는 인간의 22번 염색체 상의 38485200번째 염기가 G에서 T로 치환된 것일 수 있다.In the present invention, the SNP at position chr22:38485200 may be a substitution of G to T at base 38485200 on human chromosome 22.
본 발명에 있어서, SNP rs1924089는 인간의 13번 염색체 상의 49318097번째 염기가 A에서 G 또는 T로 치환된 것일 수 있다.In the present invention, SNP rs1924089 may be 49318097 base on
본 발명에 있어서, SNP rs1039239는 인간의 4번 염색체 상의 186667811번째 염기가 A에서 C, G, 또는 T로 치환된 것일 수 있다.In the present invention, SNP rs1039239 may be a substitution of base 186667811 from A to C, G, or T on
본 발명에 있어서, SNP rs11064191은 인간의 12번 염색체 상의 6545413번째 염기가 G에서 C로 치환된 것일 수 있다.In the present invention, SNP rs11064191 may be 6545413 base on
본 발명에 있어서, SNP rs9682978은 인간의 3번 염색체 상의 43733184번째 염기가 A에서 G 또는 T로 치환된 것일 수 있다.In the present invention, SNP rs9682978 may be 43733184 base on
본 발명에 있어서, 상기 이명은 만성 감각신경성 이명일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the tinnitus may be chronic sensorineural tinnitus, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, "이명"은 외부에서 음자극이 없는데도 소리를 느끼는 것으로 각종 질환 또는 내이의 청각 세포의 손상으로부터 기인된다. 현재 이명의 85%는 청각 세포의 손상으로부터 기인되는 것으로 알려져 있으며, 청각 세포 손상에 의한 이명은 강한 소음, 노화, 약물 부작용, 알레르기, 외이도 및 중이염증으로부터 기인된다.In the present invention, "tinnitus" is caused by various diseases or damage to auditory cells of the inner ear to feel sound even in the absence of external sound stimulation. Currently, 85% of tinnitus is known to be caused by damage to auditory cells, and tinnitus caused by hearing cell damage is caused by strong noise, aging, drug side effects, allergies, inflammation of the external auditory canal and middle ear.
본 발명에 있어서, "감각신경성 이명"은 주관적 이명이라고도 하며 주로 노인성 난청, 소음성 난청, 돌발성 난청, 만성 중이염에 동반된 감각신경성 난청에 의하거나, 아스피린이나 혹은 귀에 해로운 약을 지속적으로 복용한 경우에 발생하기도 하며, 내이 혈관의 순환장애, 메니에르병 등의 경우처럼 달팽이관의 질환으로 발생하거나, 머리의 외상에 의한 뇌의 기능 변화, 뇌종양, 청신경 종양 등 청각신경 경로의 질환에 의해 발생하며, 또한 이런 원인들이 전혀 없이 원인 미상으로 발생하는 경우도 흔히 있으며 특히 정신적으로나 육체적으로 심한 스트레스에 의해 촉발되기도 한다. 특히 최근에는 기계 산업의 발달에 의한 직업적 소음성 난청뿐만 아니라 군대생활 중 사격이나 젊은이들이 큰 소리로 음악을 들어 내이에 손상을 받아 발생하는 경우 등 소음에 의한 이명이 매우 증가하는 추세이다.In the present invention, "sensory neural tinnitus" is also referred to as subjective tinnitus, and is mainly caused by sensorineural hearing loss accompanied by age-related hearing loss, noise-induced hearing loss, sudden hearing loss, chronic otitis media, or when taking aspirin or drugs harmful to the ear continuously. It may occur due to cochlear disease, such as circulatory disorders of the inner ear vessels and Meniere's disease, or by diseases of the auditory nerve pathway, such as brain function changes due to head trauma, brain tumors, and auditory nerve tumors. In addition, it is common for these causes to occur without any known cause, especially triggered by severe mental or physical stress. In particular, in recent years, not only occupational noise-induced hearing loss due to the development of the machinery industry, but also cases of noise-induced hearing loss, such as shooting during military life or damage to the inner ear caused by young people listening to loud music, tend to increase tinnitus due to noise.
본 발명에 있어서, “검출”은 목적하는 물질의 존재(발현) 여부를 측정 및 확인하는 것, 또는 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준)의 변화를 측정 및 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 같은 맥락에서, 본 발명에서 상기 SNP의 발현수준을 측정하는 것은 발현 여부를 측정하는 것(즉, 발현 유무를 측정하는 것), 또는 상기 SNP의 질적, 양적 변화 수준을 측정하는 것을 의미한다. 상기 측정은 정성적인 방법(분석)과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있다. SNP 존재 여부 측정에 있어서 정성적 방법과 정량적 방법의 종류는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 기술한 실험법들이 이에 포함된다. 각 방법 별로 구체적 SNP 수준 비교 방식은 당업계에 잘 알려져 있다.In the present invention, “detection” means both measuring and confirming the presence (expression) of a target substance, or measuring and confirming a change in the presence (expression level) of a target substance. In the same context, measuring the expression level of the SNP in the present invention means measuring whether or not it is expressed (ie, measuring whether or not it is expressed) or measuring the level of qualitative or quantitative change of the SNP. The measurement can be performed without limitation including both qualitative methods (analysis) and quantitative methods. Types of qualitative and quantitative methods for determining the presence of SNPs are well known in the art, and the experimental methods described herein are included. A specific SNP level comparison method for each method is well known in the art.
본 발명에 있어서, 상기 검출 제제는 chr22:38485200 위치의 SNP, rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP를 검출할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the detection agent may be a primer or probe capable of detecting one or more SNPs selected from the group consisting of chr22:38485200 position SNP, rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, "프라이머(primer)"는 DNA 합성의 개시점(starting point)으로 작용하는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)이다. 프라이머는 적합한 완충액(buffer)와 온도 조건에서 주형(template)인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고, DNA 중합효소가 프라이머에 주형 DNA에 상보적인 염기를 갖는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가하여 연결함으로써 DNA가 합성된다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며, 염기 구성과 길이에 따라 주형 가닥에 결합하는 온도(melting temperature, Tm)가 달라진다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서 상기 SNP 부위의 cDNA 또는 genomic DNA의 염기서열을 참조하여 본 발명에 따른 검출 제제인 프라이머쌍을 용이하게 디자인할 수 있다. SNP를 검출하기 위한 프라이머는 각 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, DNA 합성을 통해 mRNA 또는 cDNA의 특정 구간을 증폭하여 mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 충분하다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트(쌍)으로 구성된다.In the present invention, a "primer" is a short single-stranded oligonucleotide that serves as a starting point for DNA synthesis. A primer specifically binds to a polynucleotide, which is a template, in an appropriate buffer and temperature conditions, and DNA polymerase adds a nucleoside triphosphate having a base complementary to the template DNA to the primer and connects the DNA. is synthesized Primers generally consist of 15 to 30 nucleotide sequences, and the melting temperature (Tm) of binding to the template strand varies depending on the nucleotide composition and length. The sequence of the primer does not have to have a sequence completely complementary to a part of the base sequence of the template, and it is sufficient to have sufficient complementarity within a range capable of hybridizing with the template and performing the specific function of the primer. Therefore, in the present invention, a primer pair, which is a detection agent according to the present invention, can be easily designed by referring to the nucleotide sequence of the cDNA or genomic DNA of the SNP site. Primers for detecting SNPs do not have to have sequences that are perfectly complementary to each gene sequence, as long as they have a length and complementarity suitable for the purpose of measuring the amount of mRNA by amplifying a specific section of mRNA or cDNA through DNA synthesis. Suffice. The primers for the amplification reaction consist of a set (pair) that complementarily binds to the template (or sense) and the opposite side (antisense) of both ends of a specific section of the mRNA to be amplified.
본 발명에 있어서, "프로브(probe)"는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA), DNA 등에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 프로브는 대립형질(또는 대립유전자, allele)을 검출하기 위한 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출 방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 본 발명에서 상기 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 프로브는 공개된 한국인 유전자 칩 디자인을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, "probe" refers to RNA or DNA having a length of several to several hundred base pairs that can specifically bind to mRNA, cDNA (complementary DNA), or DNA of a specific gene. It refers to fragments of polynucleotides such as, and is labeled, so that the presence or absence of the target mRNA or cDNA to be bound and the expression level can be confirmed. Probe selection and hybridization conditions can be appropriately selected according to techniques known in the art. The probe may be used in a diagnostic method for detecting an allele (or allele). The diagnostic methods include detection methods based on hybridization of nucleic acids, such as Southern blotting, and may be provided in a form pre-bound to a substrate of a DNA chip in a method using a DNA chip. In the present invention, the primer or probe may be chemically synthesized using a phosphoramidite solid support synthesis method or other well-known methods. In the present invention, the probe may use an open Korean gene chip design, but is not limited thereto.
본 발명에서, 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 검출하고자 하는 표적이 되는 폴리뉴클레오티드와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.In the present invention, the primer or probe may be chemically synthesized using a phosphoramidite solid support synthesis method or other well-known methods. In addition, primers or probes may be modified in various ways according to methods known in the art to the extent that hybridization with a target polynucleotide to be detected is not hindered. Examples of such modifications are methylation, capping, substitution of one or more natural nucleotides with homologs, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages such as methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates, carbamates, etc. ) or charged linkages (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.), and binding of fluorescent or enzymatic labeling materials.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 또는 프로브는 본 발명의 chr22:38485200 위치의 SNP, dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP를 검출할 수 있는 것이라면 특정 서열로 한정되지 않는다.In the present invention, the primer or probe is not limited to a specific sequence as long as it can detect at least one SNP selected from the group consisting of the SNP at position chr22:38485200 of the present invention, rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978 in the dbSNP database.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 이명 진단 또는 발병 예측용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for diagnosing or predicting the onset of tinnitus, including the composition.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the kit may be a RT-PCR kit or a microarray chip kit, but is not limited thereto.
상기 키트는 이명의 진단용 마커인 SNP 마커를 증폭을 통해 확인하거나, SNP 마커의 발현 수준을 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 이명의 발병을 예측 또는 조기 진단할 수 있다.The kit can predict or early diagnose the onset of tinnitus by confirming the SNP marker, which is a diagnostic marker for tinnitus, through amplification or by checking the expression level of the SNP marker to the mRNA expression level.
상기 RT-PCR 키트는 상기 SNP 부위를 포함하는 핵산을 증폭할 수 있는 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.The RT-PCR kit may include each pair of primers capable of amplifying nucleic acids containing the SNP site, in addition to a test tube or other appropriate container, reaction buffer, deoxynucleotides (dNTPs), and Taq-polymerization. enzymes such as enzymes and reverse transcriptase, DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water, sterile water, and the like. In addition, a primer pair specific to a gene used as a quantitative control may be included.
상기 마이크로어레이 칩 키트는 상기 SNP 부위를 포함하는 핵산이 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 포함할 수 있다. 상기 마이크로어레이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다. 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.The microarray chip kit may include a microarray having a substrate on which a nucleic acid including the SNP site is immobilized. The microarray may be composed of a conventional microarray except for including the polynucleotide, primer or probe of the present invention. Hybridization of nucleic acids on microarrays and detection of hybridization results are well known in the art. The detection is, for example, by labeling a nucleic acid sample with a fluorescent material, for example, a label material capable of generating a detectable signal including materials such as Cy3 and Cy5, followed by hybridization on a microarray and the labeling material. A hybridization result can be detected by detecting a signal arising from
또한, 본 발명은 피검체로부터 수득한 시료 중의 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기서열에 chr22:38485200 위치의 SNP, dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP가 존재하는 경우, 피검체가 이명을 가진 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 이명의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention is a SNP at position chr22: 38485200 in the nucleotide sequence of a single nucleotide polymorphism (SNP) site in a sample obtained from a subject, at least one SNP selected from the group consisting of rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978 in the dbSNP database. In this case, it provides a method for providing information necessary for diagnosis of tinnitus, including determining that the subject has tinnitus.
또한, 본 발명은 피검체로부터 수득한 시료 중의 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기서열에 chr22:38485200 위치의 SNP, dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP가 존재하는 경우, 피검체가 이명에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 이명의 발병 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention is a SNP at position chr22: 38485200 in the nucleotide sequence of a single nucleotide polymorphism (SNP) site in a sample obtained from a subject, at least one SNP selected from the group consisting of rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978 in the dbSNP database. In this case, it provides a method for providing information necessary for predicting the onset of tinnitus, comprising determining that the subject has a high risk of tinnitus.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 시퀀싱(sequencing), 엑솜 시퀀싱(exome sequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화(microarray hybridization), 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization), PCR 연장 분석 및 Taqman 기법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the method includes sequencing, exome sequencing, microarray hybridization, allele specific PCR, and dynamic allele-hybridization techniques. specific hybridization), PCR extension analysis, and one or more methods selected from the group consisting of Taqman technique, but is not limited thereto.
또한, 본 발명은 chr22:38485200 위치의 SNP, dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(SNP)의 검출 제제를 포함하는 조성물의 이명 진단 용도를 제공한다.In addition, the present invention provides a tinnitus diagnosis use of a composition comprising an agent for detecting at least one single nucleotide polymorphism (SNP) selected from the group consisting of chr22: SNP at position 38485200, dbSNP database rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978.
또한, 본 발명은 chr22:38485200 위치의 SNP, dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(SNP)의 검출 제제를 포함하는 조성물의 이명 발병 예측 용도를 제공한다.In addition, the present invention provides a composition comprising an agent for detecting at least one single nucleotide polymorphism (SNP) selected from the group consisting of chr22: SNP at position 38485200, dbSNP database rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978 Provides a use for predicting the onset of tinnitus.
본 발명에 있어서, "개체" 또는 “대상체”는 발병 예측 또는 진단을 하기 위한 피험자를 의미한다.In the present invention, "individual" or "subject" means a subject for prediction or diagnosis of onset.
본 발명에 있어서, “시료”는 발병 예측 또는 진단하고자 하는 대상체로부터 채취된 것이라면 제한없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 각종 분비물, 소변, 대변 등일 수 있다. 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 복수, 질 분비물 및 소변으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 신장 조직 또는 신장 사구체 조직일 수 있다. 상기 시료는 검출 또는 진단에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 균질화(homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.In the present invention, "sample" can be used without limitation as long as it is collected from a subject to be predicted or diagnosed, and for example, cells or tissues obtained by biopsy, blood, whole blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid, various It can be secretions, urine, feces, etc. It may preferably be selected from the group consisting of blood, plasma, serum, saliva, nasal fluid, sputum, ascites, vaginal secretion and urine, and may preferably be blood, plasma, serum, kidney tissue or kidney glomerular tissue. The sample may be pretreated prior to use for detection or diagnosis. For example, it may include homogenization, filtration, distillation, extraction, concentration, inactivation of interfering components, addition of reagents, and the like.
본 발명에 있어서, “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 모두 포함하는 개념이다. 본 발명에 있어서, 상기 진단은 조기 진단 또는 발병 예측을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, “diagnosis” means determining the susceptibility of a subject to a specific disease or disorder, determining whether an object currently has a specific disease or disorder, or suffering from a specific disease or disorder It is a concept that includes both determining the prognosis of an object, or therametrics (eg, monitoring the condition of an object to provide information about treatment efficacy). In the present invention, the diagnosis may mean early diagnosis or onset prediction, but is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에서는 GWAS 분석을 통해 이명 환자에서 유전체의 연관성을 확인한 결과, chr22:38485200 위치의 SNP가 이명과 가장 유의한 연관성을 가지는 것으로 확인되었으며(P<10-8), 상기 마커 외에 dbSNP 데이터베이스 rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978의 4가지 SNP 마커도 이명과 유의한 연관성을 나타내는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).In one embodiment of the present invention, as a result of confirming the association of the genome in tinnitus patients through GWAS analysis, it was confirmed that the SNP at position chr22: 38485200 had the most significant association with tinnitus (P<10 -8 ), and in addition to the above markers, It was also confirmed that four SNP markers in the dbSNP database rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978 showed a significant association with tinnitus (see Example 2).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, a preferred embodiment is presented to aid understanding of the present invention. However, the following examples are provided to more easily understand the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples.
[실시예][Example]
실시예 1. 실험 방법Example 1. Experimental method
1-1. 대상1-1. Target
실험군으로 2016 년 6 월부터 2019 년 9 월까지 서울성모병원 제3 의뢰센터의 이명 클리닉을 방문한 환자가 등록되었으며, 주관적 또는 객관적인 이명을 호소한 사람들 중 전문가에 의해 만성 감각신경성 이명 진단을 받은 환자 만이 실험군으로 등록되었다. 과거에 정신 질환 진단을 받은 18 세 미만, 70 세 이상, 임신 또는 모유 수유중인 환자는 실험군에서 제외되었다. 대조군으로는 한국 바이오뱅크 어레이(Korean Biobank Array) 데이터를 사용하여, 만성 감각신경성 이명 환자 111명 및 대조군 133명의 혈액을 이용하여 유전자형을 분석하였다.As an experimental group, patients who visited the Tinnitus Clinic of the Third Referral Center of Seoul St. Mary's Hospital from June 2016 to September 2019 were enrolled. were enrolled in the experimental group. Patients younger than 18 years of age, older than 70 years of age, pregnant or breastfeeding patients with a previous diagnosis of mental illness were excluded from the study group. As a control, genotype was analyzed using the blood of 111 patients with chronic sensorineural tinnitus and 133 controls using Korean Biobank Array data.
1-2. DNA 추출 및 유전자형 분석1-2. DNA extraction and genotyping
이명 환자의 DNA는 표준 절차를 사용하여 혈액 샘플에서 추출되었으며 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 유전자형 분석이 수행되었다. SNP 마커의 유전자형 분석을 위해 질병관리본부(KCDC)에서 제조한 게놈-와이드 휴먼(Genome-wide Human) SNP 칩을 사용하였다.DNA from tinnitus patients was extracted from blood samples using standard procedures and single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping was performed. For genotyping of SNP markers, a genome-wide human SNP chip manufactured by the Centers for Disease Control and Prevention (KCDC) was used.
1-3. GWAS(Genome-Wide Association Study) 분석1-3. Genome-Wide Association Study (GWAS) analysis
품질 관리(quality control, QC)는 각각 샘플 및 마커 수준에서 수행하였으며, 2,504 명의 피험자와 8470 만 SNP를 포함하는 1000 Genomes Project Phase 3과 Minimac2 및 SHAPEIT 알고리즘을 사용하여 SNP 연관 테스트를 로그 가산 모델을 기반으로 수행하였다. Quality control (QC) was performed at the sample and marker level, respectively, and the 1000
한국 바이오 뱅크 어레이를 사용하여 실험군의 310건의 케이스와 150건의 건강한 대조군에 대해 샘플 수준에서는 낮은 호출 속도(low call rate) 및 과도한 헤테로 비율(excessive hetero rate)(n=38), 다차원 척도법(Multidimensional scale)(n=4), 성 미스매치(gender mismatch)(n=4)를 통해 샘플을 필터링하여 실험군 275건, 대조군 139건의 샘플에 대해 연관성 테스트를 수행하였다.Low call rate and excessive hetero rate (n = 38) at sample level for 310 cases and 150 healthy controls in the experimental group using Korean biobank array ) (n = 4) and gender mismatch (n = 4) to filter samples, and an association test was performed on 275 samples in the experimental group and 139 samples in the control group.
대립 유전자 연관 연구는 PLINK 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. Allelic association studies were performed using PLINK software.
한국 바이오 뱅크 어레이의 800,000개 이상의 SNP 마커 중 SNPolisher failed SNP(n=94,533), 마커 호출 속도(marker call rates)<0.05(n=15,963), HWE(Hardy-Weinberg Equilibrium) 테스트 p-값<10-5(n=595), 마이너 대립 유전자 빈도(MAF)<0.01(n=202,639)인 SNP를 선택하였다. 또한, 유실률(missing rate)>0.05 인 SNP, 유실률>0.01 인 개체는 제외되었다. 이들 필터를 적용한 후, PLINK 1.919를 사용하여 SNP 마커에 대해 결합 테스트를 수행하였다. 연관성 시험의 p-값이 1×10-8 미만인 SNP를 후보 SNP로 판단하였다. 연관성 연구의 통계적 유의성은 환자와 대조군 피험자 간의 MAF를 비교하기 위해 카이-제곱 테스트(Chi-squared test)를 사용하여 평가되었다.Among more than 800,000 SNP markers in Korean biobank arrays, SNPolisher failed SNPs (n=94,533), marker call rates<0.05 (n=15,963), Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE) test p-value<10 - 5 (n = 595) and minor allele frequency (MAF) < 0.01 (n = 202,639) were selected. In addition, SNPs with a missing rate>0.05 and individuals with a missing rate>0.01 were excluded. After applying these filters, binding tests were performed for SNP markers using PLINK 1.919. SNPs with a p-value of less than 1×10 -8 in the association test were judged as candidate SNPs. Statistical significance of association studies was assessed using the Chi-squared test to compare MAF between patient and control subjects.
PLINK를 이용한 GWAS 분석에 대한 전체적인 개략도를 도 2에 나타내었다.An overall schematic diagram of the GWAS analysis using PLINK is shown in FIG. 2 .
실시예 2. 연관성 분석 결과 확인Example 2. Confirmation of correlation analysis results
발견 단계에서, 한국 바이오 뱅크 어레이를 사용하여 확인된 5억개 이상의 SNP 유전자형에 기초한 310건의 케이스와 150건의 건강한 대조군에 대해 연관성 테스트를 수행하였다.In the discovery phase, association tests were performed on 310 cases and 150 healthy controls based on over 500 million SNP genotypes identified using the Korea Biobank Array.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 하나의 SNP가 이명과 유의한 연관성을 나타내는 것으로 확인되었으며, 표 1에 나타낸 바와 같이 chr22:38485200 위치의 SNP가 이명과 유의한 연관성을 가지는 것으로 확인되었다(P<10-8). 도 3에서 Manhattan 플롯은 유전자형화된(genotyped) SNP의 -log10 P 값을 나타내며, 수평 및 수직 축은 각각 영 분포(null distribution)에서 예상되는 P 값과 관측된 P 값을 나타낸다. As a result, as shown in FIG. 3, one SNP was confirmed to have a significant association with tinnitus, and as shown in Table 1, the SNP at chr22:38485200 was confirmed to have a significant association with tinnitus (P < 10 -8 ). In FIG. 3, the Manhattan plot shows -log 10 P values of genotyped SNPs, and the horizontal and vertical axes represent expected P values and observed P values from a null distribution, respectively.
이때, 상기 chr22:38485200 위치의 SNP가 위치한 뇌-특이적 혈관신생 억제제 1-연관 단백질 2-유사 단백질 2(Brain-Specific Angiogenesis Inhibitor 1-Associated Protein 2-Like Protein 2, BAIAP2L2) 유전자와 관련된 질환을 하기 표 2에 나타내었다. 연관 점수(association score)는 https://docs.targetvalidation.org/getting-started/scoring를 기반으로 하여 계산되었으며, 점수가 높을수록 해당 질병과의 연관성이 높을 것으로 예상할 수 있다(https://doi.org/10.1093/nar/gky1133).At this time, the disease associated with the brain-specific angiogenesis inhibitor 1-associated protein 2-like protein 2 (Brain-Specific Angiogenesis Inhibitor 1-Associated Protein 2-
특히, 가장 연관성이 높게 확인된 두 가지 질환으로 감각신경성 난청이 관련되어 있었는데, 이것은 난청과 관련된 SNP 변이가 실제로 난청이 유발되지 않더라도 이명의 원인이 될 수 있는 가능성을 시사한다. In particular, sensorineural hearing loss was associated with sensorineural hearing loss as the two most correlated diseases, suggesting the possibility that SNP mutations associated with hearing loss may cause tinnitus even if hearing loss is not actually caused.
또한, P 값이 10-5 미만으로 정의되었을 때, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 이명과 연관성을 가진 4개의 다른 유전자좌(rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978)가 확인되었다. 이들 중 3 개의 SNP는 유전자 사이 영역(intergenic region)에 위치하였으며, 나머지 1개의 SNP는 코딩 유전자 SORBS2의 인트론 영역(intronic region)에 위치하였다.In addition, four other loci (rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978) associated with tinnitus were identified as shown in Table 3 below when the P value was defined as less than 10 -5 . Three of these SNPs were located in the intergenic region, and the remaining one SNP was located in the intronic region of the coding gene SORBS2.
이때, 상기 4개의 SNP가 위치한 유전자들과 각각 관련된 질환을 하기 표 4에 나타내었다. 관련 질환들 중 이명과 관련성이 있는 질환은 포함되어 있지 않았다. At this time, the diseases associated with the genes where the four SNPs are located are shown in Table 4 below. Among the related diseases, diseases related to tinnitus were not included.
상기 실시예에 따라 만성 감각신경성 이명에서 임상적 유의성이 있다고 판단되는 SNP들이 선별되었는 바, 본 발명의 SNP는 이명의 조기 진단 및 발병 예측에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.Since SNPs judged to have clinical significance in chronic sensorineural tinnitus were selected according to the above examples, the SNPs of the present invention are expected to be useful for early diagnosis and prediction of onset of tinnitus.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.The above description of the present invention is for illustrative purposes, and those skilled in the art can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.
Claims (8)
A single nucleotide polymorphism (SNP) at position chr22: 38485200, dbSNP database rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978 For diagnosis or prediction of onset of chronic sensorineural tinnitus, comprising a detection agent of one or more single nucleotide polymorphisms (SNPs) selected from the group consisting of composition.
상기 검출 제제는 chr22:38485200 위치의 SNP, rs1924089, rs1039239, rs11064191 및 rs9682978로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP를 검출할 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 조성물.
According to claim 1,
The detection agent is a primer or probe capable of detecting one or more SNPs selected from the group consisting of chr22: SNP at position 38485200, rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978, Composition.
A kit for diagnosing or predicting the onset of chronic sensorineural tinnitus, comprising the composition of claim 1.
상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 마이크로어레이 칩 키트인 것을 특징으로 하는, 키트.
According to claim 4,
Characterized in that the kit is an RT-PCR kit or a microarray chip kit.
In the nucleotide sequence of the single nucleotide polymorphism (SNP) site in the sample obtained from the subject, the SNP at position chr22: 38485200, the dbSNP database rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978 When one or more SNPs selected from the group consisting of exist, the subject A method for providing information necessary for diagnosis of chronic sensorineural tinnitus, comprising determining that a person has chronic sensorineural tinnitus.
In the nucleotide sequence of the single nucleotide polymorphism (SNP) site in the sample obtained from the subject, the SNP at position chr22: 38485200, the dbSNP database rs1924089, rs1039239, rs11064191 and rs9682978 When one or more SNPs selected from the group consisting of exist, the subject A method for providing information necessary for predicting the onset of chronic sensorineural tinnitus, comprising determining that a person has a high risk of developing chronic sensorineural tinnitus.
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| ANNICK GILLES 등, Frontiers in Neuroscience, 제11권, 논문번호 71, 페이지 1-10 (2017) |
| HAIDER, HAULA F. 등, Frontiers in Aging Neuroscience, 제9권, 논문번호 346, 페이지 1-11 (2017) |
| Takahisa Watabe 등, Scientific Reports, 제10권, 논문번호: 13023, 내부페이지 1-10 (2020.08.03.)* |
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