KR102303322B1

KR102303322B1 - 약산성 및 중성 pH 범위의 실리카 합성 펩타이드

Info

Publication number: KR102303322B1
Application number: KR1020190167062A
Authority: KR
Inventors: 백승필; 기미란; 민기하
Original assignee: 고려대학교 세종산학협력단
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2021-09-24
Also published as: KR20210076287A

Abstract

본 발명은 상온, 상압, 약염기 및/또는 중성 조건의 수용액 하에서 실리카 전구체로부터 실리카를 중합할 수 있는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 실리카 합성 펩타이드는 유해 부산물의 발생 없이 친환경적인 다기능성 실리카 합성 방법에 이용될 수 있고, 다양한 분야의 바이오 실리카 소재 합성에 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

약산성 및 중성 pH 범위의 실리카 합성 펩타이드{Peptides capable of silica deposition at acid and neutral pH}

본 발명은 상온, 상압, 약염기 및/또는 중성 조건의 수용액 하에서 실리카 전구체로부터 실리카를 중합할 수 있는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

산업화 이후 한정된 육상 가용자원의 소비 급증으로 인한 육상 자원 소재의 고갈로 인한 새로운 유용자원 개발이 국가적 미래를 위한 중요 이슈가 되고 있다. 따라서 미국, 유럽, 일본 등의 선진국들은 신규 원천 소재 개발 및 확보에 국가 역량을 집중시키고 있다. 여기에 더하여 환경오염으로 인한 지구 온난화 및 기후 변화 등은 인류의 생존을 위협하는 요인으로 작용하고 있어 경제성장과 환경보호를 동시에 추구하는 새로운 패러다임이 대두되고 있다.

해양 자원을 이용하여 환경 친화적인 방법을 통해 신소재를 생산화는 방법은 원천 기술의 확보뿐 아니라 친환경 산업으로 인한 국가적인 저탄소 녹색성장의 견인차 역할을 할 것으로 기대된다. 실리카는 특정 화학종들과 공유 결합이 가능하기 때문에 새로운 하이브리드 소재 (유기-무기 복합체) 합성에 중요하고, 또한 생체 적합한 소재로서 각 개별 소재의 단점을 보완할 수 있는 우수한 특성을 갖고 있다. 현재 실리카의 공업적 생산 공정은 고온, 강산 또는 강염기 조건이 요구되고 환경적으로 유해한 부산물 생성의 문제점이 있다.

그러나 해양 생명체인 스펀지와 규조류의 추출물 또는 유전학적 정보를 바탕으로 실리카를 생합성 하는 효소 및 펩타이드가 발견됨으로써 이들에 의해 생산된 환경 친화적 바이오실리카(biosilica) 및 이의 다양한 용도로의 응용성으로 인해 전 세계적으로 해양 유래 바이오 실리카 복합 소재 개발이 이슈가 되었다. 바이오실리카는 다양한 용도에 적합한 제형화가 가능하고, 에너지효율성, 기계적·화학적 물성, 생체적합성, 대량 생산성이 뛰어날 것으로 기대됨으로 바이오실리카 소재 확보를 위한 원천 기술의 보유는 매우 중요하다.

바이오실리카 합성을 위한 생체 분자가 규조류 등에서 발견된 이후로, 생체 실리카의 생체 내 생체 모방체 생성 연구가 진행되었으며, 새로운 실리카 형성 단백질 또는 펩타이드(SFP)가 개발되고 있다.

본 발명자들은 비교적 온화하고 환경 친화적 조건(예를 들어, 중성 pH, 실온, 대기압 등)에서 시험관 내 바이오 실리카 형성을 매개할 수 있는 새로운 SFP의 발굴을 위하여 아르기닌과 세린이 반복되는 특이한 서열의 펩타이드(RRSSGGRR)를 쿼리로 사용하여 미국 NCBI의 단백질 data base로부터 새로운 실리카 합성 펩타이드를 탐색하고, 이로부터 우수한 실리카 합성 활성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

KR 10-2012-0094494

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 신규의 실리카 합성 펩타이드와 이를 포함하는 실리카 합성용 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 신규의 실리카 합성 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 펩타이드일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 실리카 합성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 실리카 합성용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 조성물은 실리카 전구체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 실리카 전구체는 테트라에틸 오르토실리케이트, 테트라메틸 오르토실리케이트, 메틸 트리에톡시실란, 페닐 트리 에톡시실란, 디메틸 디메톡시 실란, 에틸 트리에톡시실란, 티타니아 테트라이소프로폭사이드 및 테트라에틸 게르마늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 인지질 또는 하이드록시아파타이트를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 실리카 합성 펩타이드와 실리카 전구체를 반응시키는 단계를 포함하는, 실리카 합성 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 반응은 상온, 상압, 및/또는 pH 5-7 조건 하에서 수행될 수 있다.

본 발명의 실리카 합성 펩타이드는 상온, 상압, 약산성 및/또는 중성 pH 환경 하에서 실리카를 합성할 수 있는바, 유해 부산물의 발생 없이 친환경적인 다기능성 실리카 합성 방법에 이용될 수 있고, 다양한 분야의 바이오 실리카 소재 합성에 적용될 수 있다.

도 1은 약염기 환경에서 본 발명의 9종 펩타이드의 실리카 합성 활성을 확인한 것으로서, 도 1a는 각 펩타이드에 의해 합성된 흰색 실리카 합성 침전물의 사진이고, 도 1b는 실리카 합성량을 정량하여 비교한 그래프이다.
도 2은 중성 환경에서 본 발명의 9종 펩타이드의 실리카 합성 활성을 확인한 것으로서, 도 2a는 각 펩타이드에 의해 합성된 흰색 실리카 합성 침전물의 사진이고, 도 2b는 각 pH 환경에 따라 실리카 합성량을 정량하여 비교한 그래프이다.

본 발명자들은 시험관 내에서 친환경적 조건 하에 바이오 실리카 형성을 매개할 수 있는 새로운 실리카 형성 단백질/펩타이드을 발굴하고자, 다양한 생물종에서 실리카 합성 아미노산 서열이 존재한다는 가정을 하고 아르기닌과 세린이 반복되는 서열 (RRSSGGRR)을 쿼리로 하여 미국 NCBI의 단백질 data base로부터 새로운 실리카 합성 펩타이드를 탐색하였으며 아미노산 서열 중에 실리카 형성과 관련 있는 아미노산(아르기닌)과 산성을 띄는 아미노산(글루타민산)을 기준으로 후보 실리카 합성 펩타이드를 선별하고 상기 펩타이드에서 실리카 합성 활성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

보다 구체적으로, 상기 쿼리 서열을 포함하거나 이와 유사한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 선별하고, 상기 단백질 내에서 실리카 합성 활성이 예상되는 아미노산 서열 부분을 결정하여 7종의 실리카 합성 후보 펩타이드를 선정하였다.

이어서, 쿼리 서열의 펩타이드를 포함한 8종의 후보 펩타이드의 실리카 합성 활성을 확인하고, 그 중에서 실리카 합성 활성이 가장 우수한 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 E.C 펩타이드의 전체서열을 반복서열로 하여 신규의 합성 펩타이드를 제작하고 이로부터 실리카 합성 활성을 확인하여 총 9종의 실리카 합성 펩타이드를 발굴하였다.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들은 본 발명의 9종 실리카 합성 펩타이드가 상온, 상압, 및 약산성 조건에서 실리카 합성 활성을 확인한 결과, 본 발명의 9종 펩타이드 모두 pH 5 및 pH 6 조건에서 실리카 합성 펩타이드로 알려진 공지의 R5 펩타이드보다 빠르게 보다 높은 효율로 실리카 침전을 유도하였으며, 특히 RSGH 펩타이드는 pH 5 환경에서 현저하게 우수한 실리카 침전 활성을 나타냄을 확인하였다(실시예 3 참조).

또한, 본 발명의 다른 실시예에서, 본 발명자들은 상온, 상압, 및 약산성 조건에서 실리카 합성 활성을 확인한 본 발명의 9종 펩타이드가 중성 환경에서도 실리카을 합성할 수 있는지 확인한 결과, 본 발명의 9종 펩타이드 모두 pH 7 환경에서도 우수한 실리카 합성 활성을 나타냄을 확인하였다(실시예 4 참조).

이에, 본 발명의 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드는 상온 및 상압 조건에서 실리카 전구체와 반응하여 실리카를 합성할 수 있으며, 특히 약산성과 중성의 환경 모두에서 우수한 실리카 합성 활성을 나타내어 환경적으로 유해한 부산물의 발생이 없는 친환경적 실리카 합성을 매개할 수 있다.

따라서, 본 발명의 실리카 합성 펩타이드는 상온 및 상압의 조건에서 중성 및 약산성의 수용액 하에서 실리카 전구체와 반응하여 실리카를 합성할 수 있으며, 상기 수용액은 pH 4 내지 8의 완충용액일 수 있으며, 바람직하게는 pH 5 내지 7일 수 있고, 더욱 바람직하게는 pH 5-6일 수 있다. 한편, 완충용액의 종류 및 농도는 특별히 제한되지 아니하나, 실리카 합성용 조성물의 적용 용도에 따라 적절히 변경될 수 있다.

또한, 상기 실리카 전구체는 그 종류에 특별히 제한되지 아니하나, 그 비제한적인 예로는 테트라에틸 오르토실리케이트, 테트라메틸 오르토실리케이트, 메틸 트리에톡시실란, 페닐 트리에톡시실란, 디메틸 디메톡시 실란, 에틸 트리에톡시실란, 티타니아 테트라이소프로폭사이드, 또는 테트라에틸 게르마늄 등이 있고, 이를 단독 또는 2종 이상 혼합일 수 있다.

본 발명에서 '실리카 합성 펩타이드'는 서열번호 1 내지 서열번호 9 중 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드로서, 실리카 합성 활성을 나타내는 범위 내에서 하나 이상의 아미노산이 치환 또는 결실될 수 있고, 추가의 아미노산을 포함할 수 있다.

본 발명의 실리카 합성 펩타이드 중에서 자연계에 존재하는 단백질 유래의 서열번호 1 내지 8의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 기원이 되는 단백질로부터 분리획득될 수 있으며, 본 발명의 9종 실리카 합성 펩타이드는 당해 기술분야에서 일반적으로 사용되는 유전공학적 또는 화학적 펩타이드 합성방법에 의해 획득될 수 있고, 화학적 합성 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법 등이 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드는 이를 암호화하는 재조합 핵산의 발현에 의한 유전공학적 방법에 의해 제조할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열 또는 그의 단편을 상기 핵산 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키며, 생성된 형질전환체를 상기 핵산 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, 배양물로부터 실질적으로 순수한 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있고, 이 경우 실리카 합성 펩타이드를 목적하는 용도에 따라서 형광 단백질 등의 다양한 유용 단백질과 융합시켜 제조할 수도 있다.

한편, 본 발명의 실리카 합성 펩타이드는 실리카 전구체 및 효소 또는 결합 펩타이드와 반응을 통해 효소 또는 결합 펩타이드가 고정된 실리카의 제조에 이용될 수 있다. 이 경우, 실리카에 의해 상기 실리카 합성 펩타이드 또는 유용 단백질과 융합된 실리카 합성 펩타이드가 코팅되도록 할 수 있다.

또한, 본 발명의 실리카 합성 펩타이드는 실리카 합성시 침전물로 뭉치지 않고 단일막으로 도포될 수 있도록 실리카 전구체 및 인지질과 반응시켜 단일막 형태의 실리카 제조에 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 실리카 합성 펩타이드는 실리카 전구체 및 인지질과 반응시켜 유무기 복합체의 실리카를 제조하는데 이용될 수 있으며, 상기 유무기 복합체 실리카에 열 또는 유기용매를 처리하여 유기물 제거함으로써 다공성 실리카를 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 실리카 합성 펩타이드는 유기물 외에 하이드록시아파타이트와 같은 무기물과 실리카 전구체와 반응시켜 실리카 복합체를 제조에 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 실리카 합성 펩타이드는 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 양쪽에 화학적, 물리적 공유 또는 비공유 결합에 의하여 직접 또는 다른 매개체를 이용하여 간접적으로 연결될 수 있는 형광물질, 조직 특이적 성분, 약제학적 활성성분, 미세 구조, 인지질, 또는 하이드록시아파타이트 등을 추가로 포함하여 실리카 전구체 등과 반응하여 실리카 복합체를 형성할 수 있다.

상기 형광물질은 특별히 제한되지는 않으나, 예컨대, 형광단백질, Dylight 488 NHE-ester dye, VybrantTM DiI, VybrantTM DiO, 양자점(quantum dots) 나노입자, 플루오로세인, 로다민, 루시퍼 엘로우, B-파이토에리쓰린, 9-아크리딘이소티오시아네이트, 루시퍼 엘로우 VS, 4-아세트아미도-4'-이소티오-시아나토스틸벤-2,2'-다이설폰산, 7-다이에틸아미노-3-(4'-이소티오시아토페닐)-4-메틸쿠마린, 석시니미딜-파이렌부티레이트, 4-아세트아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2,2'-다이설폰산 유도체, LC™-Red 640, LC™-Red 705, Cy5, Cy5.5, 리사민, 이소티오 시아네이트, 에리쓰로신 이소티오시아네이트, 다이에틸렌트리아민 펜타아세테이트, 1-다이메틸아미노나프틸-5-설포네이트, 1-아닐리노-8-나프탈렌 설포네이트, 2-소티토우이디닐-6-나프탈렌 설포네이트, 3-페닐-7-이소시 아나토쿠마린, 9-이소티오시아나토아크리딘트, 크리딘 오렌지 9-이(소티(2-벤족사조일릴)페닐)멜레이미드 사디 아졸, 스틸벤, 파이렌, 이벤도체, 형광 물질을 포함한 실리카, ⅡⅣ족 반도체 양자점, ⅢⅤ족 반도체 양자점, Ⅳ족 반도체 양자점, 또는 이다성분 혼성 구조체를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 상기 형광물질은 양자점 (quantum dots) 나노입자, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, ICG(indocyanine green), Cypate, ITCC, NIR820, NIR2, IRDye78, IRDye80, IRDye82, Cresy Violet, Nile Blue, Oxazine 750, Rhodamine800, 란탄나이드 계열 및 Texas Red로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용할 수 있고, 상기 양자점(quantum dots) 나노 입자인 경우에는 ⅡⅥ또는 ⅢⅤ족 화합을 사용할 수 있다. 이 경우 상기 양자점 나노입자는 CdSe, CdSe/ZnS, CdTe/CdS, CdTe/CdTe, ZnSe/ZnS, ZnTe/ZnSe, PbSe,PbS InAs, InP, InGaP, InGaP/ZnS 및 HgTe로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 사용할 수 있다.

또한, 상기 조직 특이적 결합성분은 항원, 항체, RNA, DNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘 (streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선 동위원소 표지성분, 또는 종양 마커 등과 특이적으로 결합할 수 있는 물질일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 약제학적 활성성분은 siRNA, 안티센스, 항암제, 항생제, 호르몬, 호르몬길항제, 인터루킨, 인터페론, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 엔도톡신, 림포톡시, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소로 표지된 성분, 심혈관계 약물, 위장관계 약물, 또는 신경계 약물 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

따라서, 본 발명의 실리카 펩타이드는 다양한 기능성 성분들이 결합된 실리카 복합체의 제조에 이용될 수 있으며, 상기 실리카 복합체는 약물전달체, 핵산, 단백질, 다당류 또는 병원균 검출용 바이오센서, 골대체재, 세포배양 코팅제, 3차원 스캐폴드, 조영제, 진단 프로브, 기능성 섬유, 필터 등에 이용될 수 있다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

[실시예]

실시예 1. 실리카 합성 활성이 있는 펩타이드 탐색

실리카 합성 활성을 갖는 펩타이드 탐색을 위하여 아르기닌과 세린의 반복 서열을 쿼리로 사용하여 NCBI의 단백질 data base(blast.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 새로운 실리카 합성 펩타이드를 탐색하였으며, 그 결과에서 실리카 형성과 관련 있는 아미노산(아르기닌)과 산성을 띄는 아미노산(글루타민산)을 기준으로 실리카 합성 활성을 가질 것으로 예상되는 7종의 후보 펩타이드를 선정하였다. 또한, 상기 7종 후보 펩타이드 중에서 실리카 합성 활성이 우수한 E.C 펩타이드의 전체를 반복서열로 합성하여 신규 펩타이드를 합성하고 이를 RSGH로 명명하였다. 쿼리 서열, 7종 후보 펩타이드 및 신규 합성 펩타이드의 구체적인 정보는 하기 표 1에 나타내었다.

서열번호	명칭	아미노산 서열	유래
1	Query	RRSSGGRR
2	G.S	RRSSGGRRSSGG	TLP18.3, Psb32 and MOLO-1 founding protein of phosphatase [Geodermatophilus sabuli] Sequence ID: SNX96730
3	H.A	RRSSSGGRRRSSSGG	p6.9 protein [Helicoverpa assulta nucleopolyhedrovirus]Sequence ID: AXR98075.1
4	W.A	RRSSGGSRKRDDKPRGDRRSSGG	DEAD/DEAH box helicase [Winogradskyella arenosi]Sequence ID: WP_114309887.1
5	T.O	RRRRGGRGRGRRRGRG	Hypothetical protein THAOC_33094, partial [Thalassiosira oceanica] GenBank: EJK48136.1
6	M.S	RRSSGGDDIGSADDRRSAGG	Kinesin-like protein KIF12 [Melanaphis sacchari]Sequence ID: XP_025201494.1
7	M.Y	RRSSGQGSSGDRRSS	Translation initiation factor IF-2 [Mizuhopecten yessoensis]Sequence ID: OWF35490.1
8	E.C	RRSGHSHEGRR	Nipped-B-like protein isoform X1 [Equus caballus]Sequence ID: XP_001499597.2
9	RSGH	RRSGHSHEGRRRRSGHSHEGRR	Double repeat of E.C peptide

구체적으로 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 퀴리로 사용한 8개의 아미노산 서열이며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 Geodermatophilus sabuli 유래의 TLP18.3, Psb32 and MOLO-1 founding protein of phosphatase의 아미노산 서열 655에서 666까지 선택하여 G.S로 명명하였으며, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 Helicoverpa assulta nucleopolyhedrovirus 유래의 p6.9 protein의 아미노산 서열 34에서 48까지 선택하였으며, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는Winogradskyella arenosi 유래의 DEAD/DEAH box helicase의 아미노산 서열 552에서 574까지 선택하였으며, 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 Thalassiosira oceanica 유래의 TLP18.3, Psb32 and MOLO-1 founding protein of phosphatase의 아미노산 서열 142에서 157까지이며, 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 Melanaphis sacchari 유래의 Kinesin-like protein KIF12의 아미노산 서열 668에서 687까지이며, 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 Mizuhopecten yessoensis 유래의 Translation initiation factor IF-2의 아미노산 서열 133에서 147까지이고, 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 Equus caballus 유래의 Nipped-B-like protein isoform X1의 아미노산 서열 1130에서 1140까지 선택하였고, 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 E.C 펩타이드의 동일한 반복서열로 RSGH로 명명하였다.

실시예 2. 실리카 합성 후보 펩타이드의 성질 확인

상기 실시예 1에서 선정한 실리카 합성 후보 펩타이드 중에서 자연계에 존재하는 단백질 유래의 8가지 펩타이드를 펩트론 사 (Peptron co. Daejeon, Korea)에 합성을 의뢰하여 순도 90%의 합성 펩타이드를 제작하였다. 합성된 펩타이드들의 이론적 특성은 PepDraw 프로그램(http://www.tulane.edu/~biochem/WW/PepDraw/index.html)을 이용하여 분석하였으며 이를 하기 표 2에 정리하였다.

명칭	길이(a.a)	분자량	등전점	총 전하	소수성
G.S	12	1218.6273	12.96	+4	+21.58 Kcal*mol^_1
H.A	15	1548.7920	13.09	+5	+24.31 Kcal*mol^_1
W.A	23	2529.3057	12.37	+6	+45.28 Kcal*mol^_1
T.O	16	1921.1479	13.44	+10	+32.90 Kcal*mol^_1
M.S	20	1990.9137	7.10	0	+37.17 Kcal*mol^_1
M.Y	15	1578.7549	12.49	+3	+25.76 Kcal*mol^_1
E.C	11	1333.6807	12.48	+3	+26.65 Kcal*mol^_1
Query	8	930.5207	12.96	+4	+18.36 Kcal*mol^_1
RSGH	22	2649.3509	12.71	+6	+45.40 Kcal*mol^_1

실시예 3. 약산성 환경에서 후보 펩타이드의 실리카 합성 활성 확인

각 펩타이드들은 펩트론 사에 합성을 의뢰하여 제작하였다. 합성된 펩타이드들의 실리카 합성 활성을 조사하기 위해 합성된 펩타이드를 1~5 mg/mL 농도가 되도록 3차 증류수로 녹인 후 Luckarift 등의 논문에서 제시된 방법을 따라 실리카 합성 활성을 조사하였다 (Luckarift et al, Nat Biotechnol 22:211-213, 2004). 대조구로는 실라핀 R5 펩타이드 (SSKKSGSYSGSKGSKRRIL)를 사용하였다.

구체적으로 실리카 합성 활성 확인은 NaOH로 pH를 8로 맞춘 0.1M NaH₂PO₄ 완충용액 80 ㎕과 1mM HCl 용액에 녹아 있는 1M TMOS (tetramethyl orthosilicate) 용액 10 ㎕을, 10 또는 25 mg/mL의 펩타이드 용액 10 ㎕과 혼합하여 상온에서 5분간 반응시킨 후 14000g에서 10초간 원심 분리하여 합성된 실리카를 침전시켰다. 실리카 합성 활성을 비교확인하기 위하여 대조구로 공지의 실라핀 펩타이드 R5를 이용하였으며, 시험구와 몰농도를 동일하게 하기 위하여 완충용액 85 ㎕, 1M TMOS 10 ㎕, 및 R5 펩타이드 5 ㎕를 혼합하여 상온에서 5분간 반응시키고 원심분리하여 실리카 합성량을 확인하였다.

이어서, 알코올로 2번, 증류수로 2번 침전물을 수세한 후 60 ℃에서 침전물을 건조시켰다. 건조된 실리카 침전물의 정량 분석을 위해 1M NaOH 용액에 넣어 95 ℃에서 30분간 반응시켜 분해시킨 후 몰리브데이트와 실리카가 반응하여 노란색의 발색 반응물을 형성하는 원리를 이용한 발색반응을 유도하였다. 이 반응에 사용된 용액들은 1M의 염산용액, 0.1N 황산용액에 녹인 2% 암모늄 몰리브데이트 (SolA), 5% 옥살산 용액 (SolB), 10% 아세톤에 녹아있는 200mM 아스코브르산 용액과 0.6%의 SDS (sodium dodecyl sulfate) 용액을 1:1로 섞은 SolC 용액이며 각 용액의 기능은 첫째, HCl은 NaOH로 가수분해된 실리카를 중화하기 위해 첨가하고 둘째로 실리카를 발색시킬 몰리브테이트 용액인 SolA를 첨가하여 5분간 반응시킨 후 인산기와 몰리브데이트와의 결합을 막기 위해 옥살산 용액인 SolB를 넣어주었다. 마지막으로 SolC를 첨가하면 아스코브르산이 실리카와 몰리브데이트의 복합체를 환원시켜 노란색에서 푸른 색으로 변화시켜 색의 세기를 더 증폭시켜주는 역할을 한다. 실리카 농도와 발색 세기가 비례 관계인 것을 이용하여 700 nm 에서의 흡광도를 읽어 합성된 실리카의 농도를 계산하였다.

실리카 합성 활성을 확인한 결과, 상기 표 1의 9종 후보 펩타이드 모두 약산성 조건에서 각각 10 ㎍ 첨가 시 TMOS로부터 곧 바로 실리카 침전 반응을 유도한 반면 대조구로 사용한 실라핀 펩타이드 R5는 5 ㎍ 첨가 시 실리카 침전이 거의 발생하지 않음을 확인할 수 있었다. R5의 경우 30 ㎍을 첨가하였을 때 실리카 침전반응이 일어났다 (도 1a 및 1b).

실시예 4. 중성 환경에서 후보 펩타이드의 실리카 합성 활성 확인

약산성 환경에서 실리카 합성 활성을 확인한 9종의 후보 펩타이드가 중성 조건에서도 실리카 합성 활성을 나타내는지 확인하고자 하였다. 상기 실시예 3의 방법과 동일하게 수행하되 펩타이드와 실리카 전구체의 반응 환경이 되는 완충용액의pH는 중성(pH 7)이 되도록 조절하였다.

그 결과, 상기 표 1의 9종 펩타이드 모두 중성 조건에서 각각 10 ㎍ 첨가 시 TMOS로부터 곧 바로 실리카 침전 반응을 유도함을 확인할 수 있었다(도 2a 및 도 2b 참조).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea University Research and Buisness Foundation <120> Peptides capable of silica deposition at acid and neutral pH <130> DHP19-600 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Query <400> 1 Arg Arg Ser Ser Gly Gly Arg Arg 1 5 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Geodermatophilus sabuli <400> 2 Arg Arg Ser Ser Gly Gly Arg Arg Ser Ser Gly Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Helicoverpa assulta nucleopolyhedrovirus <400> 3 Arg Arg Ser Ser Ser Gly Gly Arg Arg Arg Ser Ser Ser Gly Gly 1 5 10 15 <210> 4 <211> 23 <212> PRT <213> Winogradskyella arenosi <400> 4 Arg Arg Ser Ser Gly Gly Ser Arg Lys Arg Asp Asp Lys Pro Arg Gly 1 5 10 15 Asp Arg Arg Ser Ser Gly Gly 20 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Thalassiosira oceanica <400> 5 Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Gly Arg Gly Arg Arg Arg Gly Arg Gly 1 5 10 15 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Melanaphis sacchari <400> 6 Arg Arg Ser Ser Gly Gly Asp Asp Ile Gly Ser Ala Asp Asp Arg Arg 1 5 10 15 Ser Ala Gly Gly 20 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Mizuhopecten yessoensis <400> 7 Arg Arg Ser Ser Gly Gln Gly Ser Ser Gly Asp Arg Arg Ser Ser 1 5 10 15 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 8 Arg Arg Ser Gly His Ser His Glu Gly Arg Arg 1 5 10 <210> 9 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSGH_Double repeat of E.C peptide <400> 9 Arg Arg Ser Gly His Ser His Glu Gly Arg Arg Arg Arg Ser Gly His 1 5 10 15 Ser His Glu Gly Arg Arg 20

Claims

서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 실리카 합성 펩타이드.
서열번호 1 내지 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 실리카 합성용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 조성물은 실리카 전구체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 실리카 합성용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 실리카 전구체는 테트라에틸 오르토실리케이트, 테트라메틸 오르토실리케이트, 메틸 트리에톡시실란, 페닐 트리 에톡시실란, 디메틸 디메톡시 실란, 에틸 트리에톡시실란, 티타니아 테트라이소프로폭사이드 및 테트라에틸 게르마늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 실리카 합성용 조성물.
서열번호 1 내지 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 실리카 전구체를 반응시키는 단계를 포함하는, 실리카 합성 방법.
제5항에 있어서,
상기 반응은 상온 및 상압의 조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 실리카 합성 방법.
제5항에 있어서,
상기 반응은 pH 5 내지 7 조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 실리카 합성 방법.