KR102298234B1

KR102298234B1 - 효소 처리 돌외(Gynostemma Pentaphyllum) 및 호프(Humulus Lupulus) 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 주름개선 및 피부 탄력 증진용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102298234B1
Application number: KR1020210046419A
Authority: KR
Inventors: 이승우; 최연주; 유태선; 이대우; 김다애
Original assignee: 주식회사 리베코스; (주)더마랩
Priority date: 2021-04-09
Filing date: 2021-04-09
Publication date: 2021-09-06

Abstract

본 발명은 효소 처리 돌외 및 호프 혼합추출물을 함유하는 주름개선 및 탄력 증진용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 특정 효소 처리에 의하여 제조되는 돌외 및 호프 혼합추출물을 유효성분으로 함유하여 우수한 주름개선 및 피부 탄력증진 효과를 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

효소 처리 돌외(Gynostemma Pentaphyllum) 및 호프(Humulus Lupulus) 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 주름개선 및 피부 탄력 증진용 화장료 조성물{Cosmetic composition for improving skin wrinkle and elasticity containing complex extracts of Gynostemma Pentaphyllum and Humulus Lupulus}

경제 발전이 지속되면서 개인의 경제 수준이 높아져 개개인의 행복 추구와 노화방지에 대한 관심이 높아지고 있다. 또한 경제활동에 참여하고 있는 여성의 기회가 많아지면서 외적 미에 대한 욕구가 높아져 피부에 대한 중요성이 각광받고 있다. 안면 피부의 경우 타인이 볼 수 있는 가장 큰 요소로 연결되어 아름다움을 표현하는 중요한 요소이다. 아름다움을 표현하는 수단으로는 화장품이 있으며 그 기능으로는 미적기능 뿐만 아니라, 환경 공해 물질과 스트레스, 자외선 등의 외적인 요인과 면역세포의 기능저하, 세포 활성의 저하 등의 내적 요인에 기인한 자유 라디칼(Free Radical), 활성산소, 과산화물 등에 의한 단백질, 핵산, 세포막 지질 파괴 등의 피부 노화의 원인을 억제하는 기능이 중요시 되고 있다.

피부노화의 원인으로는 피부 세포에 있어서 지질, 단백질 및 DNS 등의 구성은 산화적 손상과 UVA에 의한 유전자 활성화에 활성 산소종이 영향을 줌에 따라, 피부 진피층의 콜라겐 섬유의 생합성과 분해에 영향을 주어 노화가 진행되며 주름이 생성된다. 한편, 엘라스타제(elastase)는 동물 결합 조직의 불용성 탄성 섬유 단백질인 엘라스틴(elastin)을 분해하는 효소인데, 콜라겐과 엘라스틴 같은 결합 조직을 지지하고 구성하는 단백질을 포함한 모든 단백질들을 가수 분해한다. 엘라스타제류의 단백질 분해효소는 다행핵 백혈구와 췌장 이외에도 혈소판, 단핵 백혈구, 거식세포 환경의 배지 그리고 평활근 세포들에서도 확인되었다. 백혈구 엘라스타제는 세린 프로티나아제(serine proteinase)에 속한다. 즉, 효소의 1차 배열에서 195번 위치에 있는 세린(serine)잔기의 수산화기가 기질의 발린(valine)이나 알라닌(alanine)의 a 탄소(a-carbonyl)를 공격하는 핵친화적인(nucleophilic) 그룹으로 작용한다. 반면, 섬유아세포 엘라스타제는 활성자리에 금속 이온을 포함하는 메탈로프로티나아제(metalloproteinase)에 속한다. 다행핵 백혈구의 엘라스타제 활성의 일부는 보체, 림프구의 활성화등과 같이 생체에 유용하게 작용하기도 하지만, 과다한 엘라스타제 활성은 피부 탄력 저하의 원인이 된다. 이와 같은 피부 노화를 억제하는 항노화 화장료에 대한 연구가 계속되고 있으며, 피부에 안전한 천연물 유래의 원료에 대한 요구가 있어왔다.

종래 대한민국 공개특허 제10-2018-0009993호 "효소 처리된 아이브라이트 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 탄력 및 주름 개선용 조성물"에는 셀룰라아제(cellulase), 펙티나아제(pectinase), 글루코시다아제(glucosidase) 및 탄나아제(tannase)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 당가수분해 효소 처리된 아이브라이트 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 탄력 및 주름 개선용 조성물이 개시되어 있고, 대한민국 공개특허 제10-2016-0057083호 "어류의 알 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물"에는 물메기 알(Liparis tessellatus egg) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 주름 개선, 피부 탄력 증진용 화장료 조성물이 개시되어 있다.

본 발명자들은 주름개선 및 피부 탄력증진에 효능이 있는 천연물 유래 화장료 개발을 위해 노력하였으며, 돌외 및 호프를 특정 효소 처리하여 혼합추출물로 제조하는 경우 그 상승효과에 의하여 엘라스타제의 발현을 억제하며, 콜라겐의 생합성을 촉진함으로써 우수한 주름개선 및 탄력증진 효과를 나타낸다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 효소 처리 돌외(Gynostemma Pentaphyllum) 및 호프(Humulus Lupulus) 혼합추출물을 함유하여 주름개선 및 피부 탄력증진 효과가 우수한 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 효소처리 돌외 및 호프 혼합추출물의 제조방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 효소 처리 돌외(Gynostemma Pentaphyllum) 및 호프(Humulus Lupulus) 혼합추출물을 함유하는 주름개선 및 피부 탄력증진용 화장료 조성물이 제공된다.

상기 효소는 β-글루코시다아제, 폴리갈락투로나제 및 메탈로프로테아제이다.

상기 혼합추출물은 돌외 및 호프가 각각 1~2:1~2의 중량비로 혼합되어 추출 제조되는 것이다.

상기 혼합추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.005~50중량%, 더욱 바람직하게는 0.01~20중량% 함유된다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면,

(A) 돌외와 호프를 각각 1~2:1~2의 중량비로 혼합하고, 추출용매를 가하여 추출물을 제조하는 단계;

(B) 상기 제조된 추출물에 β-글루코시다아제, 폴리갈락투로나제 및 메탈로프로테아제 혼합 효소를 가하여 가수분해하는 단계; 및

(C)효소 반응완료 후, 여과하고 농축하는 단계를 포함하는 효소처리 돌외 및 호프 혼합추출물의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 효소처리 돌외 및 호프 혼합추출물은 콜라겐 생성촉진, MMP-1 생성 억제 및 엘라스타제 활성저해 효과가 우수하므로, 이를 함유하는 화장료 조성물은 피부 주름개선 및 피부 탄력증진용 화장품으로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

본 발명은 돌외 및 호프 혼합추출물의 제조에 있어서, 특정한 혼합효소를 처리함으로써 콜라겐 생성촉진, MMP-1 생성 억제 및 엘라스타제 활성저해 효과가 우수한 주름개선 및 피부탄력증진용 화장료를 제조하는 것을 특징으로 한다.

돌외(Gynostemma pentaphyllum)는 쌍떡잎식물 박목 박과의 여러해살이 덩굴식물이다. 뿌리줄기는 옆으로 뻗고 마디에 흰털이 있고 엉키면서 자라지만 덩굴손으로 기어 올라가기도 한다. 잎은 어긋나고 5개의 작은잎을 가진 겹잎이며 좁은 달걀모양 타원형 또는 좁은 달걀모양이다. 끝의 작은잎은 작은 잎자루와 더불어 길이 4∼8cm, 나비 2∼3cm로서 끝이 뾰족하고 앞면 잎맥 위에 잔털이 있으며 가장자리에 톱니가 있다. 차로 이용되며 건강약초로서 비만, 신경통, 고혈압에 효과가 있음이 알려져 있고, 중국에서는 만성기관지염, 지해(止咳), 거담(祛痰), 소염해독 치료에 쓰인다.

호프(Humulus lupulus)는 삼과의 여러해살이 덩굴식물이다. 삼과 한삼덩굴속의 식물로 유럽과 아시아 온대산이며 길이 6∼12m로 자라고 줄기의 단면은 속이 빈 육각형이다. 잎은 마주달리고 큰 잎은 3∼5개, 때로는 7개까지 갈라진다. 작은잎은 심장형으로 모두 톱니가 있고 덩굴과 더불어 잔 가시가 있으며 뒷면에 향기가 있는 황색 선점(腺點)이 있다. 암꽃이 성숙하면 씨방과 포엽 밑부분 가까운 곳에 노란색의 작은 알갱이(黃色腺粒)들이 생긴다. 이것을 루풀린(lupulin)이라고 하며 향기와 쓴맛이 있어 맥주에 독특한 향료로 쓰인다. 쓴맛의 주성분은 후물론(humulon)과 루풀론(lupulon)이고 향기의 주성분은 후물렌(humulene)과 미르센(myrcene)이다.

본 발명에 따르면, 효소처리 돌외 및 호프 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 주름개선 및 피부 탄력 증진용 화장료 조성물이 제공된다.

상기 효소처리 돌외 및 호프 혼합추출물은 다음과 같이 제조된다. 먼저, 세척 건조된 돌외 및 호프를 혼합하여 혼합물을 제조한다. 돌외의 전초, 잎, 줄기 등이 사용될 수 있으며, 호프의 꽃 또는 전초가 사용될 수 있다.

바람직하게는 분쇄하여 사용하며, 상기 돌외 및 호프는 각각 1~2:1~2의 중량비율로 혼합한다. 2:1의 중량비율로 혼합하여 추출물을 제조하는 경우에 더욱 우수한 주름개선 및 피부 탄력증진 효과를 나타내므로 더욱 바람직하다.

상기 혼합물에 추출용매를 가하여 통상의 추출방법에 따라 추출물을 제조한다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 추출 용매로는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알콜, 아세톤, 클로로포름, 헥산, 아세토나이트릴 및 식물성 오일로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것이 사용될 수 있으며, 열수 추출하여 추출물을 제조한다. 상기 식물성 오일이란 식물의 씨나 과육 등을 압착 등의 방법으로 추출한 오일을 의미하는 것으로, 올리브오일, 해바라기씨오일, 야자오일, 아보카도오일 등이 사용될 수 있다. 상기 추출 용매의 양은 상기 혼합물 건조 중량의 1 ~ 15배, 바람직하게는 7 ~ 8배로 한다.

본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 혼합물을 용매에 침적 온도 40 ~ 70℃, 침적 시간 2 ~ 7시간 조건으로 수득한 추출물을 1~3일 방치한 후 여과포와 여과지를 이용하여 여과하고 회전감압 증발기로 건조하여 추출물을 제조한다.

이어서, 상기 제조된 돌외 및 호프 추출물을 효소 처리하여 가수분해시킨다. 다양한 효소들을 사용하여 그 활성을 비교하였으며, 그 결과 β-글루코시다아제(Novozyme, 대종상사, Viscozyme L) 폴리갈락투로나제(Novozyme, 대종상사, Pectinex Ultra SP-L), 메탈로프로테아제(Novozyme, 대종상사, Neutrase 0.8L)를 사용하는 경우 우수한 활성을 나타내었으며, 이들의 혼합 효소를 사용하는 경우에 가장 우수한 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 제조된 용매 추출물에 β-글루코시다아제, 폴리갈락투로나제 및 메탈로프로테아제를 포함하는 혼합 효소를 가하여 교반하면서 반응을 시킨다. 가온하여 효소반응을 종료시킨 후, 여과 및 농축하여 효소처리 돌외 및 호프 혼합추출물을 제조한다. 상기 혼합추출물은 돌외 및 호프 각각을 효소 처리하여 각각의 효소처리 추출물을 제조한 후 혼합하여 제조될 수도 있다.

이와 같이 제조된 효소처리 돌외 및 호프 혼합추출물은 효소처리를 하지 않거나, 일부의 효소만을 이용하여 제조된 혼합추출물에 비하여 더욱 우수한 엘라스타제 억제 활성, 콜라겐 생합성 촉진활성, MMP-1 생성 억제 활성을 나타내었다.

유효성분으로서의 상기 효소처리 돌외 및 호프 혼합추출물은 조성물 전체 중량에 대하여 0.005 ~ 50중량% 함유되며, 0.01~20 중량% 함유되는 것이 더욱 바람직하다. 0.005중량% 미만으로 함유되는 경우에는 활성이 약하며, 50중량%를 초과하는 경우 제형에 있어 불안정하다.

본 발명 화장료 조성물에는 유효성분으로서의 상기 효소처리 돌외 및 호프 혼합추출물 외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 팩, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

[실시예]

이하, 하기의 실시예와 시험예들을 통하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 돌외 추출물의 제조

돌외의 잎을 정제수로 세척한 뒤 건조시키어 100g을 증류수 2㎏에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(제품명 : Cosmos-660, 제조사 : 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

위의 방법으로 돌외를 추출한 후, 추출액을 300메쉬 여과지로 여과하고 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기기(제품명: Coolace CCA-1100, 제조사: EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후, 스프레이드라이어(모델명:B-290, BUCHI사 제품)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 : 180 ℃, 흡입기(Aspirator) 효율 : 100% (35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 : 25% (7.5㎖/분), 노즐 클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter) : 30㎜ (357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 표제의 추출 분말 10g을 얻었다.

제조예 2: 호프 추출물의 제조

호프의 꽃을 정제수로 세척한 후 건조시킨 호프 100g을 증류수 2㎏에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(제품명 : Cosmos-660, 제조사 : 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

위의 방법으로 호프를 추출한 후, 추출액을 300메쉬 여과지로 여과하고 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기기(제품명: Coolace CCA-1100, 제조사: EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후, 스프레이드라이어(모델명:B-290, BUCHI사 제품)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 : 180 ℃, 흡입기(Aspirator) 효율 : 100% (35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 : 25% (7.5㎖/분), 노즐 클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter) : 30㎜ (357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 표제의 추출 분말 10g을 얻었다.

제조예 3: 돌외 및 호프 혼합추출물의 제조

정제수로 세척한 뒤 건조시킨 돌외 및 호프 혼합물(중량비 2:1) 100g을 증류수 2㎏에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(제품명 : Cosmos-660, 제조사 : 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

위의 방법으로 돌외 및 호프 혼합물을 추출한 후, 추출액을 300메쉬 여과지로 여과하고 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기기(제품명: Coolace CCA-1100, 제조사: EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후, 스프레이드라이어(모델명:B-290, BUCHI사 제품)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 : 180 ℃, 흡입기(Aspirator) 효율 : 100% (35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 : 25% (7.5㎖/분), 노즐 클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter) : 30㎜ (357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 표제의 추출 분말 10g을 얻었다.

제조예 4: 효소(β-글루코시다아제)처리 돌외 및 호프 혼합추출물 제조

상기 제조예 3에서 제조된 돌외 및 호프 혼합추출물 10g을 아세테이트 버터(acetate buffer, pH 4.0) 500ml와 혼합하고, β-글루코시다아제 효소 25ml를 넣어 50℃에서 100rpm으로 4시간 동안 반응시켰다. 다음으로 90℃ 로 5분간 가온하여 효소반응을 완료한 후, 반응물을 진공 농축하였다. 농축물은 60℃에서 30시간 건조하였다.

제조예 5: 효소(폴리갈락투로나제)처리 돌외 및 호프 혼합추출물 제조

상기 제조예 3에서 제조된 돌외 및 호프 혼합추출물 10g을 아세테이트 버터(acetate buffer, pH 4.0) 500ml와 혼합하고, 폴리갈락투로나제 효소 25ml을 넣어 35℃에서 100rpm으로 4시간 동안 반응 시켰다. 다음으로 90℃ 로 5분간 가온하여 효소반응을 완료한 후, 반응물을 진공 농축하였다. 농축물은 60℃에서 30시간 건조하였다.

제조예 6: 효소(메탈로프로테아제)처리 돌외 및 호프 혼합추출물 제조

상기 제조예 3에서 제조된 돌외 및 호프 혼합추출물 10g을 아세테이트 버터(acetate buffer, pH 4.0) 500ml와 혼합하고, 메탈로프로테아제 효소 25ml를 넣어 50℃에서 100rpm으로 4시간 동안 반응 시켰다. 다음으로 90℃ 로 5분간 가온하여 효소반응을 완료한 후, 반응물을 진공 농축하였다. 농축물은 60℃에서 30시간 건조하였다.

제조예 7: 혼합 효소(β-글루코시다아제 및 폴리갈락투로나제)처리 돌외 및 호프 혼합추출물 제조

상기 제조예 3에서 제조된 돌외 및 호프 혼합추출물 10g을 아세테이트 버터(acetate buffer, pH 4.0) 500ml와 혼합하고, β-글루코시다아제 및 폴리갈락투로나제 혼합 효소 25ml를 넣어 50℃에서 100rpm으로 4시간 동안 반응 시켰다. 다음으로 90℃로 5분간 가온하여 효소반응을 완료한 후, 반응물을 진공 농축하였다. 농축물은 60℃에서 30시간 건조하였다.

제조예 8: 혼합 효소(β-글루코시다아제 및 메탈로프로테아제)처리 돌외 및 호프 혼합추출물 제조

상기 제조예 3에서 제조된 돌외 및 호프 혼합추출물 10g을 아세테이트 버터(acetate buffer, pH 4.0) 500ml와 혼합하고, β-글루코시다아제 및 메탈로프로테아제 혼합 효소 25ml를 넣어 50℃에서 100rpm으로 4시간 동안 반응시켰다. 다음으로 90℃ 로 5분간 가온하여 효소반응을 완료한 후, 반응물을 진공 농축하였다. 농축물은 60℃에서 30시간 건조하였다.

제조예 9: 혼합 효소(폴리갈락투로나제 및 메탈로프로테아제)처리 돌외 및 호프 혼합추출물 제조

상기 제조예 3에서 제조된 돌외 및 호프 혼합추출물 10g을 아세테이트 버터(acetate buffer, pH 4.0) 500ml와 혼합하고, 폴리갈락투로나제 및 메탈로프로테아제 혼합 효소 25ml를 넣어 50℃에서 100rpm으로 4시간 동안 반응시켰다. 다음으로 90℃로 5분간 가온하여 효소반응을 완료한 후, 반응물을 진공 농축하였다. 농축물은 60℃에서 30시간 건조하였다.

실시예 1: 혼합 효소(β-글루코시다아제, 폴리갈락투로나제 및 메탈로프로테아제)처리 돌외 및 호프 혼합추출물 제조

상기 제조예 3에서 제조된 돌외 및 호프 혼합추출물 10g을 아세테이트 버터(acetate buffer, pH 4.0) 500ml와 혼합하고, β-글루코시다아제, 폴리갈락투로나제 및 메탈로프로테아제 혼합 효소 25ml를 넣어 50℃에서 100rpm으로 4시간 동안 반응시켰다. 다음으로 90℃로 5분간 가온하여 효소반응을 완료한 후, 반응물을 진공 농축하였다. 농축물은 60℃에서 30시간 건조하였다.

시험예 1: 세포 독성 여부 확인

섬유아세포를 10% FBS를 첨가한 IMDM 배지에 5×10⁵의 세포농도로 접종하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 상기 제조예 및 실시예에서 제조한 추출물을 농도가 50, 100, 500, 1000㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 처리하여 24시간 배양한 후에 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazolium boromide, Sigma, U.S.A.)용액을 각 well에 100㎕씩 첨가한 후(3㎎/㎖) 4시간 동안 더 배양하였다. 이후 상층액을 제거하고, 150㎕의 디메틸설폭시드를 첨가한 후, 30분간 shaking하여 생성된 formazan을 녹여 multimicroplate reader(Molecular device Spectra max190)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 아래의 식에 따라 계산하였으며 그 결과는 하기의 표 1에 나타내었다.

세포 생존율(%)=시료첨가군의 흡광도/대조군의 흡광도 × 100

	세포 생존율(%)
	50㎍/㎖	100㎍/㎖	500㎍/㎖	1000㎍/㎖
제조예 1	100	100	100	100
제조예 2	100	100	100	100
제조예 3	100	100	100	100
제조예 4	100	100	100	100
제조예 5	100	100	100	100
제조예 6	100	100	100	100
제조예 7	100	100	100	100
제조예 8	100	100	100	100
제조예 9	100	100	100	100
실시예 1	100	100	100	100

상기 표 1의 결과에서 보는 바와 같이, 상기 제조예 및 실시예의 추출물 시료는 세포 독성을 나타내지 않았으며 안전에 문제가 없는 것을 확인하였다.

시험예 2 : 엘라스타제 억제 활성시험

엘라스타제 효소 용액(1,000 units/mL, Sigma, USA)을 구매하여 사용하였다. Buffer 용액에 각 시료를 희석하여 농도별로 녹인다. 실험은 투명한 96-웰 플레이트에서 진행하였으며, 각 웰의 최종 볼륨은 200㎕으로 하였다. Tris buffer 60㎕, 각 시료 100㎕, 기질(N-Succinyl-Ala3-NA) 20㎕를 96 well에 넣는다. 효소(Elastase)를 20㎕씩 각 well에 넣는다. 25℃에서 15분간 반응 시킨 뒤 410nm에서 흡광도를 측정하여 엘라스타제 활성 저해 효과를 측정하였다.

상기 제조예 및 실시예 추출물의 농도가 0.5, 1.0, 2.0, 3.0% 되는 용액을 시료로 엘라스타제 저해활성을 측정하였으며, 대조예로서 adenosine을 엘라스타제와 함께 적가하여 비교하였다. 저해율(%)은 아래의 식에 따라 계산하였으며, 그 결과는 하기의 표 2에 나타내었다.

엘라스타제 저해율(%)=(1-실험군의양/대조군의양) X 100

	저해율(%)
	0.5%	1.0%	2.0%	3.0%
제조예 1	20.9	25.6	30.2	35.6
제조예 2	15.6	26.5	34.5	41.2
제조예 3	12.3	28.6	36.5	42.5
제조예 4	20.3	30.5	38.5	46.5
제조예 5	21.4	35.2	41.2	49.5
제조예 6	26.2	38.5	46.5	51.5
제조예 7	29.5	35.6	49.5	56.5
제조예 8	25.6	30.8	46.5	55.5
제조예 9	28.4	39.5	44.5	59.8
실시예 1	34.8	53.1	65.6	71.5
Adenosine(0.04%)	72.3

상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 돌외 추출물(제조예 1) 및 호프 추출물(제조예 2) 보다는 돌외 및 호프 혼합추출물(제조예 3)에서 엘라스타제 저해율이 높게 나타났으며, 효소 처리하지 않은 추출물(제조예 1~3)이나, 하나의 효소로 하거나, 두 가지 혼합효소로 처리한 추출물(제조예 4~9)에 비하여 세 가지 혼합효소 처리하여 제조되는 실시예 1의 돌외 및 호프 혼합추출물 시료에서 보다 우수한 엘라스타아제 억제 활성을 나타내었다.

시험예 3: 콜라겐 생합성 촉진효과시험

섬유아세포를 10% FBS를 첨가한 IMDM 배지에 5×10⁵의 세포농도로 접종하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 제조예 및 실시예에서 제조한 추출물을 농도가 50, 100, 500, 1000㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가하여 18시간 동안 동일 조건에서 배양 후 1시간 동안 UV를 조사시켜 세포에 스트레스를 주었다. 이후 Trizol reagent(invitrogen, USA)를 이용하여 섬유아세포를 회수하여 mRNA를 추출하여 일련의 과정을 거쳐 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA로부터 PROCOLLAGEN TYPEⅠ유전자 부위를 증폭시켜 전기영동을 통해 유전자 발현 양을 확인하였으며, 유전자 증폭은 thermal cycler(GenePro, Hangzhou bioer tech., CHINA)를 사용하여 10x taq polymerase buffer, 10 mM dNTP, 10 pmol primer (F: AGC CAG CAG ATC GAG AAC AT, R: TCT TGT CCT TGG GGT TCT TG), taq polymerase를 혼합하고 증류수를 더하여 50 uL로 조정 후 95도 5분 1cycle/95도 1분/51도 2분/72도 1분 28 cycle 증폭, 72도에서 5분간 반응하는 조건으로 수행하였다. 생성된 procollagen의 발현율은 아래식에 따라 계산하였으며 대조군으로는 시료를 처리하지 않고 UV를 조사하지 않은 정상 섬유아세포를 사용하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

procollagen 발현율(%) = B/A x 100(%)

A: 상기 대조군에서의 procollagen 발현 량

B: 시료 처리 및 UV조사 섬유아세포의 procollagen 발현 량

	procollagen 발현율(%)
	50㎍/㎖	100㎍/㎖	500㎍/㎖	1000㎍/㎖
제조예 1	15.6	26.5	49.6	60.1
제조예 2	20.3	30.5	52.6	68.5
제조예 3	21.5	29.5	49.5	70.5
제조예 4	22.5	31.2	52.3	72.5
제조예 5	23.5	34.5	56.5	78.9
제조예 6	24.5	35.5	75.6	81.5
제조예 7	22.5	36.8	61.2	79.8
제조예 8	28.5	35.4	60.2	82.5
제조예 9	26.5	37.5	46.8	85.7
실시예 1	48.5	72.5	94.5	115.6
Adenosine(0.04%)	120.2

상기 표 3의 결과에서 보는 바와 같이, 돌외 추출물(제조예 1) 및 호프 추출물(제조예 2) 보다는 돌외 및 호프 혼합추출물(제조예 3)에서 프로콜라겐 발현율이 높게 나타났으며, 효소 처리하지 않은 추출물(제조예 1~3)이나, 하나의 효소로 하거나, 두 가지 혼합효소로 처리한 추출물(제조예 4~9)에 비하여 세 가지 혼합효소 처리하여 제조되는 실시예 1의 돌외 및 호프 혼합추출물 시료에서 현저히 높은 프로콜라겐 발현율을 나타내어, 우수한 콜라겐 생합성 촉진 효과가 있음이 확인되었다.

시험예 4: MMP-1 생성 억제 효과

인간 정상 피부세포인 섬유아세포(한국 세포주 은행, 대한민국)를 48-웰 마이크로 플레이트(Nunc. 덴마크)에 각 웰 당 1st 10⁶세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지(Sigma, 미합중국) 및 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후 상기 제조예 및 실시예에서 제조한 추출물을 농도가 50, 100, 500, 1000㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가한 후 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 MMP-1 분석 킷트(Amersham, 미합중국)를 이용하여 새로 합성된 MMP-1의 양(㎍/㎖)을 측정하고, 하기식에 따라 MMP-1 생성 억제율을 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다. 이때, MMP-1 생성 억제율의 양성 대조군으로 TGF-β(10㎎/㎖, Roche, 미합중국)를 사용하였다.

	MMP-1 생성억제율(%)
	50㎍/㎖	100㎍/㎖	500㎍/㎖	1000㎍/㎖
제조예 1	20.5	30.4	41.2	49.7
제조예 2	22.5	29.4	39.7	49.8
제조예 3	23.5	31.4	42.5	51.7
제조예 4	26.7	35.6	46.7	58.4
제조예 5	24.6	36.4	49.7	56.9
제조예 6	23.4	29.7	50.4	59.6
제조예 7	30.4	36.8	51.4	61.4
제조예 8	31.4	41.4	56.7	65.8
제조예 9	32.5	42.5	56.3	66.7
실시예 1	55.6	69.5	75.5	82.5
TGF-β(10㎎/㎖)	89.5

상기 표 4의 결과에서 보는 바와 같이, 상기 제조예의 추출물에 비하여 실시예 1의 효소처리 돌외 및 호프 혼합추출물 시료에서 MMP-1 생성 억제율이 더 높았으며, 대조군 TGF-β와 유사한 정도의 MMP-1 생성 억제율을 나타내었다.

제형예 1: 효소처리 돌외 및 호프 혼합추출물을 함유한 에멀젼 베이스 제조

본 발명의 효소처리 돌외 및 호프 혼합추출물(실시예 1)을 함유하는 에멀젼 베이스를 하기 표 5의 조성에 따라 통상의 방법으로 제조하였다.

원료	함량(중량%)
원료	제형예 1
실시예 1	2.0
밀납	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
미네랄오일	8.0
소르비탄세스퀴올리에이트	0.4
친유형 모노스테아린산 글리세린	0.5
스테아린산	1.0
글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
프로필렌글리콜	5.0
카르복시폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.16
페녹시에탄올	미량
향료	미량
정제수	잔량

제형예 2: 효소처리 돌외 및 호프 혼합추출물 함유 세럼 제조

본 발명의 효소처리 돌외 및 호프 혼합추출물(실시예 1)을 함유하는 세럼을 하기 표 6의 조성에 따라 통상의 방법으로 제조하였다.

원료	함량(중량%)
	제형예 2
실시예 1	-
잔탄검	0.1
폴리솔베이트 60	1.5
소르비탄세스퀴올리에이트	0.5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	8.0
소르비탄 스테아레이트	0.4
친유형 모노스테아린산 글리세린	0.5
스테아린산	1.0
글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
부탈렌글리콜	3.0
카르복시폴리머	0.15
트리에탄올아민	0.25
페녹시에탄올	미량
향료	미량
정제수	잔량

시험예 5: 제형 안정도 확인

제형예 1, 제형예 2에서 제조한 제형에 대하여 실내(25℃), 냉장(4℃) 및 항온(50℃)으로 일정하게 유지되는 실내, 냉장고 및 인큐베이터에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관 및 관찰(변색, 변취 및 분리)하며, 안정성을 확인 하였다. 결과는 하기 표 7에 나타내었다.

온도조건	안정성 확인 (변색, 변취 및 분리)
온도조건	제형예 1	제형예 2
실내 (25℃)	0	0
냉장(4℃)	0	0
항온(50℃)	0	0

<제형 안정 등급>

0 : 변화 없음, 1 : 미세한 변화, 2 : 변화, 3: 극심한 변화

상기 표 7에서 나타낸 바와 같이, 제형예 1, 제형예 2는 25℃, 4℃ 및 50℃ 온도 조건하에서 변색, 변취 및 분리 현상이 나타나지 않고 안정함이 확인되었다.

Claims

β-글루코시다아제, 폴리갈락투로나제 및 메탈로프로테아제 혼합효소 처리 돌외 및 호프 혼합추출물을 함유하는 주름개선 및 피부 탄력증진용 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 혼합추출물은 돌외 및 호프가 각각 1~2:1~2의 중량비로 혼합되어 추출 제조되는 것임을 특징으로 하는 주름개선 및 피부 탄력증진용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 혼합추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~20중량% 함유되는 것임을 특징으로 하는 주름개선 및 피부 탄력증진용 화장료 조성물.
(A) 돌외와 호프를 각각 1~2:1~2의 중량비로 혼합하고, 추출용매를 가하여 추출물을 제조하는 단계;
(B) 상기 제조된 추출물에 β-글루코시다아제, 폴리갈락투로나제 및 메탈로프로테아제 혼합 효소를 가하여 가수분해하는 단계; 및
(C)효소 반응완료 후, 여과하고 농축하는 단계를 포함하는 효소처리 돌외 및 호프 혼합추출물의 제조방법.