KR102264006B1 - Composition for inhibiting production of melanin and promoting decomposition of melanin - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a composition comprising an extract of Eriobotrya japonica leaves and spearmint. The composition according to the present invention has excellent effects of inhibiting melanin production and promoting decomposition, and can be applied to various fields such as cosmetics, food, and pharmaceuticals.

Description

멜라닌 생성 억제 및 분해 촉진용 조성물{COMPOSITION FOR INHIBITING PRODUCTION OF MELANIN AND PROMOTING DECOMPOSITION OF MELANIN}Composition for inhibiting melanin production and promoting decomposition {COMPOSITION FOR INHIBITING PRODUCTION OF MELANIN AND PROMOTING DECOMPOSITION OF MELANIN}

본 발명은 비파나무 잎 및 스피어민트의 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 멜라닌 생성 억제 및 분해 촉진 효과가 우수하여, 화장품, 식품, 의약품 등 다양한 분야에 적용될 수 있다.The present invention relates to a composition comprising an extract of loquat leaves and spearmint. The composition according to the present invention has excellent effects of inhibiting melanin production and promoting decomposition, and can be applied to various fields such as cosmetics, food, and pharmaceuticals.

멜라닌 분해 촉진용 For promoting the breakdown of melanin

인간의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리화학적 변화가 일어나며, 노화는 그 원인에 따라 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화(photo-aging)로 크게 구분될 수 있다. 자외선, 스트레스, 질병 상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감 등에 따라 자유라디칼이 활성화되어 피부 노화가 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고 세포 및 조직을 손상시키는데 이를 수 있다. 즉, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류, 핵산 등이 산화되어 피부세포 및 조직이 파괴됨에 따라, 피부 노화가 더 심해지게 된다. 특히, 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 피브로넥틴 등이 절단되어 심한 과다 염증반응을 일으키고 피부 탄력을 저하시키며, 이것이 더 심해질 경우 DNA 변이에 의해 돌연변이, 암 유발, 면역기능 저하를 야기한다.Human skin undergoes various physical and chemical changes during the aging process, and aging can be largely divided into intrinsic aging and photo-aging depending on the cause. Free radicals are activated depending on UV rays, stress, disease state, environmental factors, wounds, aging, etc., which can cause skin aging, and if this condition worsens, it destroys the antioxidant defense network that exists in the body and damages cells and tissues. It can lead to That is, as lipids, proteins, polysaccharides, nucleic acids, etc., which are major constituents of the skin, are oxidized and skin cells and tissues are destroyed, skin aging becomes more severe. In particular, the oxidation of proteins cuts collagen, hyaluronic acid, elastin, proteoglycan, fibronectin, etc., which are the connective tissues of the skin, causing a severe hyperinflammatory reaction and lowering skin elasticity. cause functional decline.

피부의 노화 과정에서 색소 침착에 의한 피부 변화가 수반되며, 이때 피부색에 영향을 주는 색소에는 멜라닌, 멜라조이드, 카로틴, 헤모글로빈 등이 있다. 이중 가장 중요한 것은 멜라닌으로, 멜라닌의 생합성에 영향을 미치는 요인은 자외선과 체내 호르몬 분비 정도이다. 멜라닌은 특별한 최대 흡수 파장이 없으며 전 영역의 빛을 흡수한다. 또한, 멜라닌은 활성산소종을 제거하는 기능이 탁월하나, 때로는 멜라닌 자체가 활성산소를 발생시키기도 하며, 멜라닌 구조 내의 카테콜이나 퀴논에 의하여 다른 물질을 환원시키거나 산화시키고, 멜라닌 자체가 자유라디칼의 성질을 나타내기도 한다. 따라서, 멜라닌은 UV를 흡수하는 역할을 통해 피부세포를 UV에 의한 손상으로부터 보호하는 역할도 하지만, 멜라닌형성(melanogenesis)이 과도하게 진행되면 멜라닌이 피부에 과다 침착하여 기미, 주근깨, 흑색종과 같은 피부색소침착 질환을 야기하므로, 멜라닌의 양의 균형을 적정 수준으로 유지하는 것이 요구된다.The aging process of the skin is accompanied by changes in the skin due to pigmentation. At this time, pigments that affect skin color include melanin, melasoid, carotene, hemoglobin, and the like. Among them, melanin is the most important, and the factors that affect the biosynthesis of melanin are ultraviolet rays and the degree of hormone secretion in the body. Melanin has no specific maximum absorption wavelength and absorbs light in all areas. In addition, melanin has an excellent function of removing reactive oxygen species, but sometimes melanin itself generates active oxygen, and reduces or oxidizes other substances by catechol or quinone in the melanin structure, and melanin itself is a free radical It also indicates character. Therefore, melanin plays a role in protecting skin cells from UV damage by absorbing UV, but when melanogenesis is excessive, melanin is excessively deposited on the skin, resulting in the appearance of spots, freckles, and melanoma. Because it causes skin pigmentation disease, it is required to maintain the balance of the amount of melanin at an appropriate level.

따라서, 멜라닌을 효과적으로 조절할 수 있는 물질을 찾아내기 위하여, 약학, 화장학, 식품 등 다양한 분야에서 연구가 활발히 진행 중이다. 그러나, 현재까지 연구된 결과는 멜라닌의 생합성 과정에 있어서 멜라닌의 생성을 저해하는 효능, 즉 예방학적 효능을 나타내는 물질에 대한 것들이 대부분이다. 반면, 기 생성된 멜라닌을 효율적으로 분해할 수 있는 물질, 즉 예방적인 효능에 그치지 않고 치료적인 효능도 나타낼 수 있는 물질에 대해서는 미충족 수요가 크게 존재한다.Therefore, in order to find a substance that can effectively control melanin, research is being actively conducted in various fields such as pharmaceuticals, cosmetics, and food. However, the results studied so far are mostly about substances that inhibit the production of melanin in the biosynthetic process of melanin, that is, show the prophylactic effect. On the other hand, there is a large unmet demand for a material capable of efficiently decomposing previously generated melanin, that is, a material capable of exhibiting therapeutic efficacy as well as preventive efficacy.

오토파지(autophagy)는 세포 내에서 손상되거나 불필요하게 된 구성요소 또는 세포 소기관을 분해하여 에너지원으로 재생산하는 과정을 일반적으로 지칭한다. 세포 내에서 더 이상 필요없게 된 단백질 또는 세포 구성성분들은 오토파지 활성이 증가됨에 따라 오토파고좀(autophagosome) 막으로 둘러쌓여 자가소포체를 형성한다. 여기에 리소좀이 융합한 후, 리소좀 내의 가수분해효소가 자가소포체 내의 물질을 분해하여 방출한다. 이와 같이 방출된 산물은 새로운 세포 소기관을 생성할 때 사용된다.Autophagy generally refers to the process of decomposing damaged or unnecessary components or organelles in cells and reproducing them as energy sources. Proteins or cellular components that are no longer needed in the cell are surrounded by an autophagosome membrane as autophagy activity is increased to form autophagosomes. After the lysosome is fused here, a hydrolase in the lysosome breaks down and releases the substance in the endoplasmic reticulum. These released products are used to create new organelles.

최근 오토파지에 대한 관심이 높아지면서 다양한 연구가 진행되고 있으며, 피부 노화 과정에서 중요한 역할을 하는 멜라닌이 오토파지에 의해 분해될 수 있다는 점에 대해서도 보고되고 있다. 이에 따라, 멜라노사이트에서 기 생성된 멜라닌을 오토파지에 의해 효과적으로 분해할 수 있는 물질에 대한 필요성이 매우 높다.Recently, as interest in autophagy increases, various studies are being conducted, and it is also reported that melanin, which plays an important role in the skin aging process, can be decomposed by autophagy. Accordingly, there is a very high need for a material that can effectively decompose melanin previously generated in melanocytes by autophagy.

종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자들은 오랜 기간 동안 연구한 결과, 비파나무 잎 및 스피어민트의 추출물이 멜라닌 생성 억제 효과 뿐만 아니라 멜라닌 분해 촉진 효과가 현저하게 우수하다는 점을 실험적으로 입증하여, 본 발명에 이르게 되었다.In order to solve the problems of the prior art, the present inventors have studied for a long period of time, experimentally demonstrating that extracts of loquat leaves and spearmint not only inhibit melanin production but also promote melanin degradation. came to

본 발명의 일구현예에 따르면, 비파나무 잎 및 스피어민트의 추출물을 포함하는 멜라닌 생성 억제 및 멜라닌 분해 촉진용 조성물이 제공된다.According to one embodiment of the present invention, there is provided a composition for inhibiting melanin production and promoting melanin degradation, comprising an extract of loquat leaves and spearmint.

상기 비파나무는 장미목 장미과에 속하며, 그 잎을 비파엽이라고 지칭하고 그 종자를 비파인이라고 지칭한다. 학명은 Eriobotrya Japonica이며, 한국, 일본, 중국 등에 분포한다. 비파나무 잎은 INCI(화장품 원료에 대한 국제 명명법; International Nomenclature Cosmetic Ingredient) 및 CFDA(중국 식품 및 약품 관리총구; Chinese Food and Drug Administration)에 등록되어 있다.The loquat belongs to the Rosaceae family, and its leaves are called loquat leaves and its seeds are called loquats. The scientific name is Eriobotrya Japonica, and it is distributed in Korea, Japan, and China. Loquat leaves are registered with INCI (International Nomenclature Cosmetic Ingredient) and CFDA (Chinese Food and Drug Administration).

상기 스피어민트는 박하속에 속하며, 학명은 Mentha Viridis, Mentha spicata 또는 Spearmint이며, 유럽과 아시아 등에 분포한다. 스피어민트는 INCI(화장품 원료에 대한 국제 명명법; International Nomenclature Cosmetic Ingredient) 및 CFDA(중국 식품 및 약품 관리총구; Chinese Food and Drug Administration)에 등록되어 있다.The spearmint belongs to the mint genus, and the scientific name is Mentha Viridis, Mentha spicata or Spearmint, and is distributed in Europe and Asia. Spearmint is registered with INCI (International Nomenclature Cosmetic Ingredient) and CFDA (Chinese Food and Drug Administration).

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 비파나무 및 스피어민트는 재배한 것, 채취한 것 또는 시판되는 것 등이 제한 없이 사용될 수 있다.In the composition according to the present invention, loquat and spearmint may be used without limitation, such as cultivated, collected, or commercially available ones.

본 발명에 사용되는 용어 "원물"은 원료가 되는 물질로서, 추출하기 이전의 원료 물질을 가리킨다.As used herein, the term “raw material” refers to a raw material before extraction as a raw material.

본 발명에 사용되는 용어 "추출물"은 생약을 적절한 추출용매로 추출하여 수득한 결과물을 의미하는데, 여기에는 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물, 또는 분획물이 포함되는 것으로 해석된다. 바람직하게는, 비파나무 잎 및 스피어민트의 복합물을 추출함으로써, 예를 들어 비파나무 잎 및 스피어민트 지상부가 건조된 형태의 조합물을 추출함으로써, 본 발명에 따른 조성물의 유효성분을 수득할 수 있다.As used herein, the term "extract" refers to a result obtained by extracting a crude drug with an appropriate extraction solvent, which includes an extract obtained by extraction treatment, a diluted or concentrated solution of the extract, a dried product obtained by drying the extract, and adjustments thereof It is construed to include an offering or a purified product, or a fraction. Preferably, the active ingredient of the composition according to the present invention can be obtained by extracting a complex of loquat leaves and spearmint, for example, by extracting a combination in a dried form of loquat leaves and spearmint aerial parts.

본 발명에 따른 추출물은 당업계에 공지된 일반적인 추출방법을 이용하여 제조할 수 있으며, 예를 들어 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출, 고온가압 추출 등의 방법을 사용할 수 있다. The extract according to the present invention can be prepared using a general extraction method known in the art, for example, hot water extraction, hot water extraction, cold extraction, reflux cooling extraction, ultrasonic extraction, high-temperature pressure extraction, etc. can be used. have.

본 발명에 따른 추출물을 제조하기 위해 사용되는 추출용매로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가알코올; 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합 형태가 포함될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 알코올이 추출용매로 사용될 수 있으며, 특히 바람직하게는 70% 에탄올이 사용될 수 있다. 상기 추출용매는 복합물의 건조 중량에 대해 약 4 내지 50배의 양으로 사용될 수 있다.The extraction solvent used for preparing the extract according to the present invention includes water; lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms, such as methanol, ethanol, propyl alcohol, and butyl alcohol; polyhydric alcohols such as glycerin, butylene glycol and propylene glycol; hydrocarbon solvents such as methyl acetate, ethyl acetate, benzene, hexane, diethyl ether, and dichloromethane; Or a mixture thereof may be included, but is not limited thereto. Preferably, alcohol may be used as the extraction solvent, and particularly preferably, 70% ethanol may be used. The extraction solvent may be used in an amount of about 4 to 50 times the dry weight of the complex.

바람직하게는, 본 발명의 조성물의 제조방법에 있어서 복합 추출물은 a) 비파나무 잎과 스피어민트를 70% 에탄올로 환류 추출하는 단계에 따라 수득할 수 있다. 예를 들어, a) 단계에서, 4℃ 내지 80℃의 온도에서 1 내지 24 시간 동안 70% 에탄올을 사용하여 비파나무 잎과 스피어민트를 추출할 수 있다. Preferably, in the method for preparing the composition of the present invention, the complex extract can be obtained by a) reflux extraction of loquat leaves and spearmint with 70% ethanol. For example, in step a), loquat leaves and spearmint may be extracted using 70% ethanol at a temperature of 4°C to 80°C for 1 to 24 hours.

선택적으로, 상기 a) 단계에 앞서, 비파나무 잎과 스피어민트의 원물을 세척하고 건조하는 단계를 포함할 수 있다.Optionally, prior to step a), washing and drying raw materials of loquat leaves and spearmint may be included.

선택적으로, b) 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 b) 단계에서, 1.0 ~ 0.2μm 필터로 여과할 수 있다.Optionally, b) filtering may be included. For example, in step b), it may be filtered with a 1.0 ~ 0.2μm filter.

선택적으로, c) 감압 농축하는 단계를 포함할 수 있다.Optionally, it may include the step of c) concentration under reduced pressure.

선택적으로, d) 여과액 또는 농축액을 분획하는 단계를 포함할 수 있다.Optionally, it may comprise the step of d) fractionating the filtrate or the concentrate.

선택적으로, e) 오픈 컬럼 크로마토그래피를 통해 분획물을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.Optionally, e) obtaining a fraction via open column chromatography.

상기 a), b), c), d) 또는 e) 단계에서 수득된 복합 추출물은 본 발명에 따른 조성물의 유효성분으로 포함될 수 있다.The complex extract obtained in steps a), b), c), d) or e) may be included as an active ingredient of the composition according to the present invention.

본 발명의 또다른 구현예에 따르면, 비파나무 잎 및 스피어민트의 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물이 제공된다.According to another embodiment of the present invention, there is provided a cosmetic composition comprising an extract of loquat leaves and spearmint as active ingredients.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 유효성분으로서 포함되는 추출물의 함량은 사용 목적, 사용 기간, 제형 종류, 투여 경로, 대상체의 피부 상태, 대상체의 멜라닌 축적 정도 등 다양한 요인을 고려하여 적합하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 복합 추출물의 함량은 화장료 조성물 전체 중량을 기준으로 0.0001 내지 10 중량%, 예컨대 0.001 내지 5 중량%일 수 있다.The content of the extract included as an active ingredient in the cosmetic composition according to the present invention may be suitably determined in consideration of various factors such as purpose of use, period of use, type of formulation, route of administration, skin condition of the subject, and degree of melanin accumulation in the subject. For example, the content of the complex extract may be 0.0001 to 10% by weight, such as 0.001 to 5% by weight, based on the total weight of the cosmetic composition.

상기 비파나무 잎 및 스피어민트는 복합 추출물의 전체 중량을 기준으로 각각 2 내지 98 중량%일 수 있다. 바람직하게는, 상기 비파나무 잎 및 스피어민트의 복합 추출물은 비파나무 잎 50.0 ~ 98.0 중량부 및 스피어민트 2.0 ~ 50.0 중량부를 포함할 수 있다.The loquat leaves and spearmint may be each in an amount of 2 to 98% by weight based on the total weight of the complex extract. Preferably, the complex extract of loquat leaves and spearmint may include 50.0 to 98.0 parts by weight of loquat leaves and 2.0 to 50.0 parts by weight of spearmint.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형 등의 형태로 제조될 수 있다. 이때, 본 발명의 화장료 조성물은 패치류, 연고류, 피부접착용 겔류, 크림류, 팩류, 화장수류, 에센스류, 스프레이류, 마스크류, 파운데이션류, 메이크업베이스류, 세정제류, 수(W)형, 유(O)형, 실리콘(S)형, 수중유(O/W)형, 유중수(W/O)형, 실리콘중수(W/S)형, 수중실리콘(S/W)형, 고체상, 액상 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있으며, 통상적으로 사용되는 화장료 제조방법이 적용될 수 있다.The cosmetic composition according to the present invention may be prepared in the form of a general emulsified formulation and a solubilized formulation using a conventionally known manufacturing method. At this time, the cosmetic composition of the present invention includes patches, ointments, gels for skin adhesion, creams, packs, lotions, essences, sprays, masks, foundations, makeup bases, detergents, water (W) type, Oil (O) type, silicone (S) type, oil-in-water (O/W) type, water-in-oil (W/O) type, water-in-silicone (W/S) type, silicone in water (S/W) type, solid, It can be prepared in various formulations such as liquid, and a method for preparing a cosmetic commonly used can be applied.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 효능 증진을 위해 상기 추출물 이외에 추가 성분을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 추가 성분은 추출물의 효능을 상쇄시키거나 감소시키지 않는다면 제한이 없다. 선택적으로, 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제, 담체 등을 추가로 포함할 수 있다. 선택적으로, 화장품 기능을 부가하거나 증대시키기 위하여 전형적으로 사용되는 성분들이 또한 추가될 수 있다. 예를 들면, 안정화제, 유화제, 점증제, 보습제, 액정 막강화제, pH 조절제, 항균제, 수용성 고분자, 피막제, 금속 이온 봉쇄제, 아미노산, 유기 아민, 고분자 에멀션, pH 조정제, 피부 영양제, 산화 방지제, 산화 방지조제, 방부제, 향료 등에서 선택되는 하나 이상의 수성 첨가제; 및 유지류, 왁스류, 탄화 수소유, 고급 지방산유, 고급 알콜, 합성 에스테르유 및 실리콘유 등에서 선택되는 하나 이상의 유성 첨가제 등일 수 있다.The cosmetic composition according to the present invention may further include additional ingredients in addition to the extract to enhance efficacy. For example, the additional ingredients are not limited as long as they do not counteract or reduce the efficacy of the extract. Optionally, it may further include adjuvants, carriers, etc. commonly used in the cosmetic field. Optionally, ingredients typically used to add or enhance cosmetic functions may also be added. For example, stabilizers, emulsifiers, thickeners, humectants, liquid crystal film strengthening agents, pH regulators, antibacterial agents, water-soluble polymers, film agents, sequestering agents, amino acids, organic amines, polymer emulsions, pH regulators, skin nutrients, antioxidants, one or more aqueous additives selected from antioxidants, preservatives, fragrances, and the like; and at least one oily additive selected from oils and fats, waxes, hydrocarbon oil, higher fatty acid oil, higher alcohol, synthetic ester oil, and silicone oil.

본 발명의 또다른 구현예에 따르면, 비파나무 잎 및 스피어민트의 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물이 제공된다.According to another embodiment of the present invention, there is provided a food composition comprising an extract of loquat leaves and spearmint as active ingredients.

상기 식품은 건강기능성 식품일 수 있다. 상기 용어 "건강기능성 식품"이란, 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환제 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 의미한다 . 여기서 "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.The food may be a health functional food. The term "health functional food" refers to food manufactured and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills, etc. using raw materials or ingredients useful for the human body. Herein, the term "functionality" refers to obtaining useful effects for health purposes, such as regulating nutrients or physiological actions with respect to the structure and function of the human body.

본 발명에 따른 식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 식품 조성물은 천연 식물 추출물을 유효성분으로서 포함하므로, 장기 복용 시 일반적으로 발생할 수 있는 부작용 또는 내성이 없다. 따라서, 본 발명에 따른 식품 조성물은 단독으로 사용하는 것도 가능할 뿐만 아니라, 멜라닌 생성 억제 및 멜라닌 분해 효과를 극대화하기 위한 목적으로 본 발명에 따른 화장료 조성물, 약학 조성물, 및/또는 다른 조성물 또는 다른 요법과 동시에 또는 순차적으로 사용하는 것도 가능하다.The food composition according to the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and during the preparation, it can be prepared by adding raw materials and components commonly added in the art. In addition, since the food composition according to the present invention contains a natural plant extract as an active ingredient, there is no side effect or resistance that may generally occur during long-term administration. Therefore, the food composition according to the present invention can be used alone as well as with the cosmetic composition, pharmaceutical composition, and/or other composition or other therapy according to the present invention for the purpose of maximizing the effect of inhibiting melanogenesis and decomposing melanin. It is also possible to use them simultaneously or sequentially.

본 발명에 따른 식품 조성물에 유효성분으로서 포함되는 추출물의 함량은 사용 목적, 사용 기간, 대상체의 피부 상태 또는 멜라닌 축적 정도, 원하는 효과 발생 시기 등에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 복합 추출물의 함량은 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 0.0001 내지 100 중량%, 예컨대 0.001 내지 10 중량%일 수 있다.The content of the extract included as an active ingredient in the food composition according to the present invention may be suitably determined according to the purpose of use, the period of use, the skin condition of the subject or the degree of melanin accumulation, the desired effect generation time, and the like. For example, the content of the complex extract may be 0.0001 to 100% by weight, such as 0.001 to 10% by weight, based on the total weight of the food composition.

상기 비파나무 잎 및 스피어민트는 복합 추출물의 전체 중량을 기준으로 각각 2 내지 98 중량%일 수 있다. 바람직하게는, 상기 비파나무 잎 및 스피어민트의 복합 추출물은 비파나무 잎 50.0 ~ 98.0 중량부 및 스피어민트 2.0 ~ 50.0 중량부를 포함할 수 있다.The loquat leaves and spearmint may be each in an amount of 2 to 98% by weight based on the total weight of the complex extract. Preferably, the complex extract of loquat leaves and spearmint may include 50.0 to 98.0 parts by weight of loquat leaves and 2.0 to 50.0 parts by weight of spearmint.

본 발명에 따른 식품 조성물은 효능 증진을 위해 유효성분 외에 추가 성분을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 추가 성분은 복합 추출물의 효능을 상쇄시키거나 감소시키지 않는 한, 기 생성된 멜라닌의 분해를 억제하는 효과를 나타내는 성분 또는 제제, 멜라닌의 생성을 차단 또는 억제하는 효과를 나타내는 성분 또는 제제 등일 수 있다.The food composition according to the present invention may further include an additional ingredient in addition to the active ingredient to enhance efficacy. For example, as long as the additional component does not offset or reduce the efficacy of the complex extract, a component or agent exhibiting an effect of inhibiting the decomposition of pre-generated melanin, a component exhibiting an effect of blocking or inhibiting the production of melanin, or formulations and the like.

상기 식품 조성물은 환제, 정제, 과립, 분말, 캡슐, 액상 등의 제형일 수 있다. 또한, 상기 식품의 종류는 특별한 제한되지 않는다. 상기 식품 조성물이 첨가될 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료, 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.The food composition may be in the form of pills, tablets, granules, powders, capsules, liquids, and the like. In addition, the type of the food is not particularly limited. Examples of foods to which the food composition can be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks , alcoholic beverages, vitamin complexes, and the like, and includes all foods in a conventional sense.

본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품에 사용되는 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제, 또는 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. The food composition of the present invention may contain various flavoring agents or natural carbohydrates used in conventional foods as additional ingredients. The natural carbohydrate may be monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol. As the sweetener, natural sweeteners such as taumatin and stevia extract, or synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame may be used.

본 발명의 또다른 구현예에 따르면, 비파나무 잎 및 스피어민트의 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물이 제공된다.According to another embodiment of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition comprising an extract of loquat leaves and spearmint as active ingredients.

상기 약학 조성물은 피부색소침착 질환의 치료 또는 예방용으로 제공될 수 있다. 멜라닌은 UV를 흡수하는 역할을 통해 피부세포를 UV에 의한 손상으로부터 보호하는 역할을 하므로, 인간에게 필수적인 성분이다. 본 발명에서 사용되는 용어 "피부색소침착 질환"이란, 멜라닌 색소와 같은 피부색소가 적정 수준보다 과다 생성됨에 따라 피부에 침착되어 야기되는 질환을 의미한다. 예를 들어, 피부암, 잡티, 기미, 주근깨, 검버섯, 흑색종, 일광흑색증(solar tigines), 노인성 색소반, 반점, 유전적 요인의 과색소침착, 대사 또는 약물 관련 기원의 과색소침착 등이 포함될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.The pharmaceutical composition may be provided for the treatment or prevention of skin pigmentation disease. Melanin plays a role in protecting skin cells from UV damage by absorbing UV rays, so it is an essential component for humans. As used herein, the term “skin pigmentation disease” refers to a disease caused by being deposited on the skin as a skin pigment such as melanin is produced in excess of an appropriate level. For example, skin cancer, blemishes, melasma, freckles, age spots, melanoma, solar tigines, senile pigmentation spots, macules, hyperpigmentation of genetic factors, hyperpigmentation of metabolic or drug-related origin, etc. may be included, but is not limited thereto.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 피부색소침착 질환의 증상이 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다. 또한, 용어 "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 피부색소침착 질환의 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term “treatment” refers to any action in which the symptoms of skin pigmentation disease are improved or cured by administration of the composition according to the present invention. In addition, the term "prevention" refers to any action of suppressing or delaying the symptoms of skin pigmentation disease by administering the composition according to the present invention.

본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되는 유효성분의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태, 연령, 성별 등에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 천남성 추출물은 약학 조성물 전체 중량을 기준으로 약 0.0001 내지 100 중량%의 양으로 포함될 수 있다.The content of the active ingredient contained in the pharmaceutical composition according to the present invention may be suitably determined according to the symptoms of the disease, the degree of progression of the symptoms, the patient's condition, age, sex, and the like. For example, the cheonnamseong extract of the present invention may be included in an amount of about 0.0001 to 100% by weight based on the total weight of the pharmaceutical composition.

본 발명에 따른 약학 조성물은 의약품의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 예를 들어 락토오스, 덱스트로오스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.The pharmaceutical composition according to the present invention may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceuticals. Carriers, excipients and diluents that may be contained in the composition include, for example, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose. , methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil.

본 발명에 따른 약학 조성물은 경구 투여 제형일 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 당업자에게 잘 알려진 기술을 이용하여 국소 투여를 위한 적합한 투여 제형으로 제형화될 수 있고, 상기 제형은 외용제, 발포정, 좌제 등을 포함할 수 있다. 일구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 상기 추출물을 당해 기술분야에서 잘 알려지고 일반적으로 사용되는 기제(base)와 혼합하여 외용제로 제형화될 수 있다. 상기 외용제는 에멀젼, 겔, 연고, 크림, 패치, 리니먼트, 파우더, 에어로졸, 스프레이, 로션, 세럼, 페이스트, 폼, 점적제, 현탁액 또는 팅크 등일 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention may be an oral dosage form. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations contain at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc. in the extract. It can be prepared by mixing. Liquid formulations for oral use include suspensions, solutions, emulsions, syrups, etc. In addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. . In addition, the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated into a dosage form suitable for topical administration using techniques well known to those skilled in the art, and the dosage form may include external preparations, effervescent tablets, suppositories, and the like. In one embodiment, the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated for external use by mixing the extract with a well-known and commonly used base in the art. The external preparation may be an emulsion, gel, ointment, cream, patch, linen, powder, aerosol, spray, lotion, serum, paste, foam, dropper, suspension or tincture.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 대상체에게 투여된다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 환자의 연령, 성별, 체중, 투여 경로, 질병의 정도 등에 따라 0.1 내지 100 mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있으며, 상기 범위에 제한되는 것은 아니다.The pharmaceutical composition according to the present invention is administered to a subject in a pharmaceutically effective amount. As used herein, the term "pharmaceutically effective amount" refers to an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level includes the subject type and severity, age, sex, drug activity, sensitivity to drugs, administration time, administration route and excretion rate, duration of treatment, factors including concurrent drugs, and other factors well known in the medical field. The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. It may also be administered single or multiple. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered in an amount of 0.1 to 100 mg/kg once to several times a day, depending on the age, sex, weight, administration route, degree of disease, etc. of the patient, but is not limited to the above range.

본 발명에 대해서는 하기의 실시예와 본 명세서에 첨부된 도면에 기초하여 보다 상세하게 설명될 것이나, 이는 본 발명의 권리범위를 제한하려는 것이 아니다. 또한, 당업계에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 취지를 해하지 않는 범위 내에서 본 발명에 대해 다양한 변형 및 수정을 가할 수 있을 것이다.The present invention will be described in more detail based on the following examples and drawings attached to the present specification, but it is not intended to limit the scope of the present invention. In addition, those of ordinary skill in the art will be able to make various changes and modifications to the present invention within the scope that does not impair the spirit of the present invention.

본 발명에 따른 복합 추출물을 포함하는 조성물은 피부 내 오토파지 활성을 유의적으로 증진시킬 수 있으며, 이에 따라 기 생성된 멜라닌의 분해를 촉진하는 것이 가능하다. 또한, 멜라닌의 과생성을 유의적으로 억제할 수 있다.The composition comprising the complex extract according to the present invention can significantly enhance autophagy activity in the skin, and thus it is possible to promote the decomposition of pre-generated melanin. In addition, it is possible to significantly inhibit the overproduction of melanin.

특히, 기 생성된 멜라닌의 분해 속도가 빠르므로, 과다 생성된 멜라닌으로 인해 발생하는 상태 또는 질환의 개선 또는 치료 효과를 신속하게 나타낼 수 있다. 따라서, 미용 효과를 조기에 얻고자 하는 대상체, 또는 멜라닌 과다침착으로 인한 질환을 앓고 있는 환자에게 유용하다.In particular, since the decomposition rate of the pre-generated melanin is fast, it is possible to quickly show the improvement or therapeutic effect of a condition or disease caused by the excessively generated melanin. Therefore, it is useful for a subject who wants to obtain a cosmetic effect at an early stage, or a patient suffering from a disease caused by melanin hyperdeposition.

더욱이, 본 발명에 따른 조성물에 유효성분으로서 포함되는 복합 추출물은 후술하는 시험에서 멜라닌을 독성 없이 분해한다는 것이 입증되었는바, 인체에 대한 안전성이 보장된다.Moreover, the complex extract included as an active ingredient in the composition according to the present invention has been proven to decompose melanin without toxicity in a test to be described later, ensuring safety for the human body.

이와 같은 본 발명의 조성물은 멜라닌 분해가 필요한 다양한 분야에 적용될 수 있는바, 화장품의 형태로 제공될 수도 있으며, 또다르게는 기능성 식품 또는 식품보충제의 형태로 제공될 수도 있으며, 의약품의 형태로 제공될 수도 있다.As such the composition of the present invention can be applied to various fields requiring melanin decomposition, it may be provided in the form of cosmetics, or alternatively, it may be provided in the form of functional food or food supplements, and may be provided in the form of pharmaceuticals. may be

도 1은 B16F1 흑색종에 대해 비파나무 잎 단일 추출물과 본 발명의 복합 추출물을 처리하였을 때 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 B16F1 흑색종에 대해 비파나무 잎 단일 추출물과 본 발명의 복합 추출물을 처리하였을 때 멜라닌 생성 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 B16F1 흑색종에 대해 본 발명의 복합 추출물의 정제 공정을 통해 수득한 우르솔산을 처리하였을 때 멜라닌 생성 억제 활성을 나타내 그래프이다.
도 4는 B16F1/GFP-LC3 흑색종에 대해 본 발명의 복합 추출물의 정제 공정을 통해 수득한 우르솔산을 처리하였을 때 오토파지 팩터(Autophagy factor) 활성을 나타내는 형광염색 현미경 사진, 및 녹색 형광 강도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
1 is a graph showing cell viability when treated with a single extract of loquat leaves and a complex extract of the present invention for B16F1 melanoma.
Figure 2 is a graph showing the melanin production inhibitory activity when treated with a single extract of loquat leaves and the complex extract of the present invention for B16F1 melanoma.
3 is a graph showing the melanin production inhibitory activity when treated with ursolic acid obtained through the purification process of the complex extract of the present invention for B16F1 melanoma.
4 is a fluorescence staining microscope photograph showing autophagy factor activity when treated with ursolic acid obtained through the purification process of the complex extract of the present invention for B16F1/GFP-LC3 melanoma, and green fluorescence intensity. It is a graph showing quantification.

이하에서 본 발명의 이해를 돕기 위해 구체적인 예를 들어 설명하기로 한다. 그러나, 하기의 실시예가 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 본 발명의 범위 내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능하다.Hereinafter, a specific example will be described to help the understanding of the present invention. However, the following examples should not be construed as limiting the present invention, and ordinary changes of those skilled in the art are possible within the scope of the present invention.

실시예 1Example 1

비파나무 잎 및 스피어민트를 시판되는 것을 구매하여 본 실험에 사용하였다. 비파나무 잎 및 스피어민트를 포함하는 원물 5kg(총 중량)은 다음과 같은 조성비로 준비하였다: 비파나무 잎 4.0kg (80.0 중량%), 스피어민트 1.0kg (20.0 중량%). 상기 원물에 10배 부피의 70% 에탄올을 첨가하여 80℃에서 3시간 동안 추출하고, 냉각 및 여과를 수행하고 농축건조하였다. 이에 따라 수득된 생성물을 후술하는 시험예에 사용하였다. Loquat leaves and spearmint were purchased commercially and used in this experiment. 5 kg (total weight) of a raw material containing loquat leaves and spearmint was prepared in the following composition ratio: loquat leaves 4.0 kg (80.0 weight %), spearmint 1.0 kg (20.0 weight %). 10 times the volume of 70% ethanol was added to the raw material, extracted at 80° C. for 3 hours, cooled and filtered, and concentrated to dryness. The product thus obtained was used in Test Examples to be described later.

비교예 1Comparative Example 1

상기 실시예 1처럼 준비한 비파나무 잎 5kg(총 중량)에 10배 부피의 70% 에탄올을 첨가하여 80℃에서 3시간 동안 추출하고, 냉각 및 여과 후 농축건조하였다. 이에 따라 수득된 생성물을 후술하는 시험예에 사용하였다. 10 times the volume of 70% ethanol was added to 5 kg (total weight) of loquat leaves prepared as in Example 1, extracted at 80° C. for 3 hours, cooled, filtered, and concentrated to dryness. The product thus obtained was used in Test Examples to be described later.

시험예 1: B16F1 흑색종에 대한 세포 독성Test Example 1: Cytotoxicity to B16F1 melanoma

상기 실시예 1의 복합 추출물과 비교예 1의 비파나무 잎 추출물의 세포독성을 확인하기 위하여 세포생존율(cell viability)을 측정하였다. In order to confirm the cytotoxicity of the complex extract of Example 1 and the loquat leaf extract of Comparative Example 1, cell viability was measured.

구체적으로, B16F1 흑색종(melanoma) 세포를 96-웰 플레이트에 6x103 cells/well이 되도록 분주하였다. 세포를 배양하기 위한 배지로서 10% FBS 및 1% Penicillin-Streptomycin(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)이 첨가된 DMEM 배지를 사용하였다. 그 후, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 하루 동안 배양하였다. 배지 상등액을 모두 제거한 후, α-MSH 1μM와 1% 농도의 시료가 처리된 배양배지를 첨가하고, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. Specifically, B16F1 melanoma cells were seeded in a 96-well plate at 6x10 3 cells/well. As a medium for culturing cells, DMEM medium supplemented with 10% FBS and 1% Penicillin-Streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) was used. Then, it was cultured for one day in a 5% CO 2 incubator at 37°C. After removing all of the medium supernatant, a culture medium treated with 1 μM of α-MSH and a sample concentration of 1% was added, and cultured at 37° C. in 5% CO 2 in an incubator for 24 hours.

MTS(Promega, G3581, Cell titer 96 Aqueous One Solution) 20μl를 첨가하고, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 2시간 동안 반응시킨 후, Envision(Perkin-Elmer, A485-MTS assay 96-well)을 이용하여 세포수를 측정하였다.20 μl of MTS (Promega, G3581, Cell titer 96 Aqueous One Solution) was added and reacted for 2 hours in an incubator at 5% CO 2 at 37° C., using Envision (Perkin-Elmer, A485-MTS assay 96-well) to measure the number of cells.

실험 결과를 나타낸 도 1에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 추출물은 0.5 ~ 1.0%의 사용량을 B16F1 흑색종 세포에 처리하였을 때, DMSO를 사용한 음성대조군에 비해 세포생존율의 유의적인 차이가 없었으며, 90% 이상의 세포생존율을 나타내었다. As can be seen in Fig. 1 showing the experimental results, when the extract according to the present invention was treated with B16F1 melanoma cells at an amount of 0.5 to 1.0%, there was no significant difference in cell viability compared to the negative control group using DMSO, It showed a cell viability of more than 90%.

따라서, 본 발명에 따른 추출물은 고농도로 사용하더라도 B16F1 흑색종 세포의 생존율에 대해 영향을 미치지 않는다. 이는 본 발명에 따른 추출물이 정상세포에 대한 독성과 같이 예상하지 못한 부작용을 나타내지 않는다는 것을 의미한다.Therefore, the extract according to the present invention does not affect the viability of B16F1 melanoma cells even when used at a high concentration. This means that the extract according to the present invention does not exhibit unexpected side effects such as toxicity to normal cells.

시험예 2. B16F1 흑색종 세포 내의 멜라닌 생성 저해Test Example 2. Inhibition of melanin production in B16F1 melanoma cells

B16F1 흑색종 세포를 6-웰 플레이트에 6x104 cells/well이 되도록 분주하였다. 세포를 배양하기 위한 배지로서 10% FBS 및 1% Penicillin-Streptomycin(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)이 첨가된 DMEM 배지를 사용하였다. 그 후, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 하루 동안 배양하였다. 배지 상등액을 모두 제거한 후, α-MSH 1μM이 처리된 배양배지를 첨가하고, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 48시간 동안 배양하였다. 여기서, α-MSH는 α-멜라노사이트 자극 호르몬(α-melanocyte stimulating hormone)을 가리키는 것으로서, 멜라닌 생성을 유도하는 물질이다. 그 후, 1% 농도의 시료를 배양배지를 첨가하고, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 Trypsinisation을 통해 세포를 회수하고, Solubilisation buffer에서 100℃에서 30분 동안 처리하여 용해하여, 405nm에서 흡광도를 측정하였다. B16F1 melanoma cells were seeded in a 6-well plate at a volume of 6x10 4 cells/well. As a medium for culturing cells, DMEM medium supplemented with 10% FBS and 1% Penicillin-Streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) was used. Then, it was cultured for one day in a 5% CO 2 incubator at 37°C. After removing all of the medium supernatant, a culture medium treated with 1 μM of α-MSH was added, and cultured at 37° C. in 5% CO 2 in an incubator for 48 hours. Here, α-MSH refers to α-melanocyte stimulating hormone, and is a substance that induces melanin production. Thereafter, a culture medium was added to the sample at a concentration of 1%, and incubated for 24 hours at 37° C. in 5% CO 2 in an incubator. After incubation, cells were recovered through Trypsinisation, lysed by treatment at 100° C. for 30 minutes in Solubilisation buffer, and absorbance was measured at 405 nm.

실험 결과를 나타낸 도 2에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 복합추출물은 비파나무 잎 단일 추출물에 비해 멜라닌 생합성을 유의적으로 더 높은 수준으로 저해한다. 비파나무 잎 단일 추출물도 멜라닌 생성 억제 효과가 우수하지만, 비파나무 잎과 스피어민트 복합 추출물은 멜라닌 생성 억제 효과가 유의적으로 더 우수하며, 이는 멜라닌 생성 저해에 따른 증진된 미백 효과를 나타내는 것이다.As can be seen in FIG. 2 showing the experimental results, the complex extract according to the present invention inhibits melanin biosynthesis at a significantly higher level than the single extract of loquat leaves. Although the loquat leaf single extract also has an excellent melanogenesis inhibitory effect, the loquat leaf and spearmint complex extract has a significantly better melanogenesis inhibitory effect, indicating an enhanced whitening effect according to the melanogenesis inhibition.

시험예 3. 복합 추출물 내 우르솔산의 동정Test Example 3. Identification of ursolic acid in the complex extract

실시예 1처럼 준비한 원물에 10배 부피의 70% 에탄올을 첨가하여 80℃에서 3시간 동안 추출하고, 냉각 및 여과 후 농축건조하여 1kg을 수득하였다. 10 times the volume of 70% ethanol was added to the raw material prepared as in Example 1, extracted at 80° C. for 3 hours, cooled and filtered, and concentrated to dryness to obtain 1 kg.

생성된 추출물을 물에 현탁하고, 헥산, 에틸 아세테이트, n-부탄올 순으로 연속적으로 분획하였다. 상기 복합추출물의 에틸 아세테이트 분획층을 감압농축기를 이용하여 농축하였다. 상기 농축액을 실리카겔(230-400메쉬, 머크)로 충진시킨 컬럼 크로마토그래피에 주입하여 클로로포름 3L를 첨가한 후, 클로로포름:메탄올을 49:1, 19:1, 9:1, 4:1, 1:1 비율의 전개 용매에 순차적으로 용출시키고, 용출된 분획 중에서 1번째 분획물을 수득하였다.The resulting extract was suspended in water and fractionated successively in the order of hexane, ethyl acetate, and n-butanol. The ethyl acetate fractional layer of the complex extract was concentrated using a reduced pressure concentrator. The concentrate was injected into column chromatography filled with silica gel (230-400 mesh, Merck), chloroform 3L was added, and chloroform:methanol 49:1, 19:1, 9:1, 4:1, 1: It was sequentially eluted with a developing solvent in a ratio of 1, and a first fraction was obtained among the eluted fractions.

상기 1번째 분획물을 디클로로메탄:메탄올(1:1)을 이동상으로 역상실리카겔(ODS-A, RP-18)로 충진시킨 컬럼크로마토그래피를 수행하였다. Sephadex LH-20을 충진시킨 컬럼크로마토그래피를 수행하여, 백색 고체 23mg을 수득하였다. 이에 따라 수득된 백색 고체는 하기 화학구조를 갖는 우르솔산이라는 점이 동정되었으며, HPLC-DAD를 통해 우르솔산의 순도가 89.50%라는 것이 확인되었다:The first fraction was subjected to column chromatography in which dichloromethane:methanol (1:1) was filled with reverse phase silica gel (ODS-A, RP-18) as a mobile phase. Column chromatography filled with Sephadex LH-20 was performed to obtain 23 mg of a white solid. It was identified that the white solid thus obtained was ursolic acid having the following chemical structure, and the purity of ursolic acid was confirmed to be 89.50% by HPLC-DAD:

Figure 112020095091314-pat00001
.
Figure 112020095091314-pat00001
.

시험예 4. B16F1 흑색종에서 멜라닌 생성 억제Test Example 4. Inhibition of melanin production in B16F1 melanoma

본 시험예에서는, 본 발명의 복합 추출물 내에 함유되어 있는 우르솔산이 멜라닌 생성에 미치는 영향을 평가하고자 하였다.In this test example, it was intended to evaluate the effect of ursolic acid contained in the complex extract of the present invention on melanin production.

B16F1 흑생종 세포를 6x104 cells/well이 되도록 6-웰 플레이트에 분주하고, 1μM의 α-MSH가 포함된 DMEM 배지를 공급하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 예비배양하였다. 24시간 후, 상기 시험예 3에서 수득된 우르솔산을 2가지 농도(5μM, 10μM)로 처리하고 48시간 동안 배양하였다. B16F1 melanoma cells were aliquoted in a 6-well plate so as to become 6x10 4 cells/well, and DMEM medium containing 1 μM of α-MSH was supplied and pre-cultured at 37° C., 5% CO 2 in an incubator for 24 hours. After 24 hours, the ursolic acid obtained in Test Example 3 was treated with two concentrations (5 μM, 10 μM) and cultured for 48 hours.

이어서, 배양액을 제거하고 PBS로 세척한 후, 트립신을 처리하여 세포를 마이크로튜브에 회수하였다. 회수된 세포는 10% DMSO가 함유된 1N NaOH를 첨가한 후, 100℃ 항온조에서 30분 동안 세포내 멜라닌을 용해하였다. ELISA 리더를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 내 멜라닌 함량을 하기 식에 따라 계산하였다.Then, the culture medium was removed, washed with PBS, and then treated with trypsin to collect cells in a microtube. The recovered cells were lysed with 1N NaOH containing 10% DMSO, and then intracellular melanin was dissolved in a thermostat at 100° C. for 30 minutes. By measuring the absorbance at 405 nm using an ELISA reader, the intracellular melanin content was calculated according to the following formula.

멜라닌 생성율(%) = (대조군의 반응 흡광도 - 추출물의 세포배양액 반응 흡광도/대조군의 반응 흡광도) x 100Melanin production rate (%) = (response absorbance of control group - absorbance of cell culture medium response of extract/response absorbance of control group) x 100

그 결과를 나타낸 도 3에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 복합 추출물에서 수득한 우르솔산은 멜라닌 생성 저해 효과를 농도 의존적으로 나타낸다는 것이 확인되었다.As can be seen in FIG. 3 showing the results, it was confirmed that ursolic acid obtained from the complex extract of the present invention exhibits a concentration-dependent effect of inhibiting melanin production.

시험예 5. B16F1 흑색종에서 멜라노파지 활성화에 의한 멜라노좀 분해Test Example 5. Melanosome degradation by melanophage activation in B16F1 melanoma

우르솔산은 암 세포에서 오토파지를 유도한다는 것이 보고된 바 있다(Luo J, Hu YL, Wang H. Ursolic acid inhibits breast cancer growth by inhibiting proliferation, inducing autophagy and apoptosis, and suppressing inflammatory responses via the PI3K/AKT and NF-κB signaling pathways in vitro. Exp Ther Med. 2017;14:3623-3631). It has been reported that ursolic acid induces autophagy in cancer cells (Luo J, Hu YL, Wang H. Ursolic acid inhibits breast cancer growth by inhibiting proliferation, inducing autophagy and apoptosis, and suppressing inflammatory responses via the PI3K/AKT and NF-κB signaling pathways in vitro. Exp Ther Med. 2017;14:3623-3631).

본 시험예에서는 본 발명에 따른 우르솔산이 B16F1 흑색종 세포에서 오토파지를 유도하는지 확인하고자 하였다.In this test example, it was attempted to determine whether ursolic acid according to the present invention induces autophagy in B16F1 melanoma cells.

오토파지 활성 마커로 사용되는 LC3 단백질에 GFP 형광 단백질을 tagging하여, B16F1 흑색종 세포주로부터 GFP-LC3 세포주(B16F1/GFP-LC3)를 획득하였다. 이어서, 상기 시험예 3에서 수득된 우르솔산을 2가지 농도(5μM, 10μM)로 B16F1/GFP-LC3 세포주에 처리하였다. GFP-LC3 cell line (B16F1/GFP-LC3) was obtained from B16F1 melanoma cell line by tagging GFP fluorescent protein to LC3 protein used as an autophagy activity marker. Then, the B16F1/GFP-LC3 cell line was treated with ursolic acid obtained in Test Example 3 at two concentrations (5 μM, 10 μM).

오토파지 활성 기작 동안, LC3Ⅰ 단백질은 LC3Ⅱ 단백질로 변환되어 자식포 활성에 관여한다. 즉, LC3Ⅰ 단백질이 LC3Ⅱ 단백질로 전환되면서 오토파고좀(autophagosome)이 형성되어 형광을 띄는 구형 베지클(vesicle)이 생성되며, 이에 따라 형광값이 증폭된다. 오토파고좀 막으로 둘러쌓인 형태의 세포 형광 이미지와 세기를 도 4에 나타내었다. 형광세기 값이 높을수록 기 생성된 멜라닌이 오토파지 과정에서 형성되는 오토파고좀에 의해 개별 아미노산으로 더 많이 분해되었다는 것을 의미한다. During the mechanism of autophagy activation, LC3I protein is converted to LC3II protein and is involved in autophagy activity. That is, as the LC3I protein is converted to the LC3II protein, an autophagosome is formed to generate a spherical vesicle with fluorescence, thereby amplifying the fluorescence value. The fluorescence image and intensity of a cell surrounded by an autophagosome membrane are shown in FIG. 4 . The higher the fluorescence intensity value, the more the previously generated melanin was decomposed into individual amino acids by the autophagosome formed in the autophagy process.

도 4에서 보여지는 바와 같이, 우르솔산은 멜라닌 세포 모델의 오토파지 활성을 증가시킨다는 것이 입증되었다.As shown in Figure 4, it was demonstrated that ursolic acid increases the autophagy activity of the melanocyte model.

Claims (7)

우르솔산을 함유하는 비파나무 잎 및 스피어민트의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는, 멜라닌 분해 촉진용 조성물로서,
상기 조성물은 기 생성된 멜라닌을 오토파지에 의해 분해하는 것인, 멜라닌 분해 촉진용 조성물.
A composition for promoting melanin decomposition comprising a complex extract of loquat leaves and spearmint containing ursolic acid as an active ingredient,
The composition is to decompose the previously generated melanin by autophagy, a composition for promoting melanin decomposition.
삭제delete 제1항에 있어서,
상기 복합 추출물은 물, 알코올, 또는 이들의 혼합물 중에서 선택된 용매를 이용하여 수득된 것을 특징으로 하는, 멜라닌 분해 촉진용 조성물.
According to claim 1,
The complex extract is characterized in that obtained using a solvent selected from water, alcohol, or a mixture thereof, a composition for promoting melanin decomposition.
삭제delete 제1항에 있어서,
상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는, 멜라닌 분해 촉진용 조성물.
According to claim 1,
The composition is a cosmetic composition, characterized in that the composition for promoting melanin decomposition.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는, 멜라닌 분해 촉진용 조성물.
According to claim 1,
The composition is a food composition, characterized in that the composition for promoting melanin decomposition.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 피부암, 잡티, 기미, 주근깨, 검버섯, 흑색종, 일광흑색증, 노인성 색소반, 반점, 유전적 요인의 과색소침착, 또는 대사 또는 약물 관련 기원의 과색소침착 중에서 선택되는 피부색소침착 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물인 것을 특징으로 하는, 멜라닌 분해 촉진용 조성물.
According to claim 1,
The composition is selected from the group consisting of skin cancer, blemishes, melasma, freckles, age spots, melanoma, solar melanosis, senile pigmentation, spots, hyperpigmentation of genetic factors, or hyperpigmentation of metabolic or drug-related origin. A composition for promoting melanin degradation, characterized in that it is a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of diseases.
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