KR102086282B1 - Sensor for Detecting Protease using Nanoparticle-Nucleic Acid-Peptide Complex - Google Patents

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KR102086282B1 KR1020190000361A KR20190000361A KR102086282B1 KR 102086282 B1 KR102086282 B1 KR 102086282B1 KR 1020190000361 A KR1020190000361 A KR 1020190000361A KR 20190000361 A KR20190000361 A KR 20190000361A KR 102086282 B1 KR102086282 B1 KR 102086282B1
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Abstract

A sensor for detecting protease according to the present invention provides a platform which can rapidly and accurately measure protease by making metal nanoparticles and a fluorescent substrate connected by peptide and nucleic acid to be in a fluorescent quenching state and then specifically emitting fluorescence when the peptide is decomposed by a specific protease, thereby being usefully used as cell-based non-destructive, real time measurement, fluid-based field disease diagnosis kits, etc.

Description

금속 나노입자-핵산-펩타이드 복합체를 이용한 단백질 분해 효소 검출용 센서{Sensor for Detecting Protease using Nanoparticle-Nucleic Acid-Peptide Complex}Sensor for Detecting Protease using Nanoparticle-Nucleic Acid-Peptide Complex}

본 발명은 금속 나노입자-핵산-펩타이드 복합체를 이용한 단백질 분해 효소 검출용 센서에 관한 것이다.The present invention relates to a sensor for detecting proteolytic enzymes using metal nanoparticle-nucleic acid-peptide complexes.

단백질은 우리 몸을 구성하고 있는 생체 물질 중 하나로, 세포 안에서 DNA로부터 전사 및 번역되어 다양한 기능을 수행한다. 특히, 질병을 진단하고 측정하는 데 있어서 과발현된 특정 단백질들은 바이오마커로 활용되고 있다. 따라서 단백질 바이오센서 개발은 질병 진단 및 의학분야에서 넓은 활용성으로 큰 주목을 받아왔다. 그 중에서 면역 반응을 기반으로 하는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 검출법이 주로 이용되었다. 비 검출법의 특징은 항원-항체 반응 기반으로 특이 단백질의 선택적 측정이 유리하고, 단백질 기반의 표적 물질에 제한이 없다는 장점이 있다. 그러나 항체 제작에 시간과 비용이 많이 발생하고, 항체의 안정성이 떨어져 바이오센서의 오작동을 유발할 수 있다는 한계점을 지니고 있다. Protein is one of the biological substances that make up our body, and is transcribed and translated from DNA in cells to perform various functions. In particular, certain overexpressed proteins are used as biomarkers in the diagnosis and measurement of diseases. Therefore, the development of protein biosensors has attracted great attention for its wide application in disease diagnosis and medicine. Among them, an ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) detection method based on an immune response was mainly used. The feature of non-detection is that the selective measurement of specific proteins on the basis of antigen-antibody response is advantageous and there is no limitation to protein-based target substances. However, there are limitations in that it takes a lot of time and money to produce the antibody, and that the stability of the antibody may be inferior and cause a malfunction of the biosensor.

이와 같은 면역 반응 기반의 단백질 바이오센서가 보유하고 있는 문제점들을 극복하기 위하여 수 많은 생체 물질들이 이용되었다. 질병과 관련된 단백질 중 효소의 성질을 가진 일부는 단백질을 분해하는 성질을 가지며 특히, 특정 펩타이드 서열을 인식하여 분해하는 특징을 가진다. 이와 같은 단백질의 성질을 이용하여, 특정 펩타이드 서열이 부착된 peptide-cleavage based biosensor에 대한 개발이 진행 중이다. 이는 항체 기반 바이오센서의 한계점인 고비용, 긴 시간 소요, 안정성 등의 단점을 극복할 수 있는 우수한 바이오센서의 검출법으로 주목을 받고 있다. 또한, 항체 기반 바이오센서에서 필요한 추가적인 신호 물질의 고정화 단계를 생략(label-free) 할 수 있어 사용자 입장에서 좀 더 쉽고 신속한 단백질 측정이 가능할 것으로 전망된다. Numerous biomaterials have been used to overcome the problems of these immune response-based protein biosensors. Some of the proteins related to the disease have the property of degrading the protein, and in particular, it recognizes and decomposes specific peptide sequences. Using the properties of these proteins, development of peptide-cleavage based biosensors with specific peptide sequences is underway. This is attracting attention as an excellent method for detecting biosensors that can overcome the disadvantages of high cost, long time, stability, etc., which are limitations of antibody-based biosensors. In addition, the immobilization step of the additional signal material required for antibody-based biosensors can be omitted (label-free), and it is expected that protein measurement will be easier and faster for the user.

형광 물질은 바이오센서에서 중요한 신호 물질 중 하나로 이용되고 있다. 특히, 형광 물질을 사용하면 단백질의 존재 여부를 육안으로 확인할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 형광 물질은 귀금속 나노 물질 표면과의 거리가 가까워지면 형광 발현이 되지 않는 성질이 있어(fluorescent quenching effect), 이를 단백질 혹은 DNA 결합 현상에 접목하여 바이오센서 제작에 응용된다. Fluorescent materials are used as one of the important signal materials in biosensors. In particular, the use of a fluorescent material has the advantage that the presence of a protein can be visually confirmed. In addition, the fluorescent material has a property of not being fluorescence when the distance from the surface of the precious metal nanomaterial is closer (fluorescent quenching effect), it is applied to the protein or DNA binding phenomenon is applied to the production of biosensor.

본 발명자들은 단백질 분해 효소의 존재 여부, 활성 및 농도 등을 효과적으로 검출할 수 있는 바이오 센서를 개발하고자 연구 노력한 결과, 단백질 분해 효소를 통해 형광 방출 신호의 소광-증폭 현상을 유도하는 금 나노 입자-DNA-펩타이드 복합체를 제조하고, 이 복합체를 이용할 경우, 단백질 분해 효소에 의해 펩타이드 분해 시 형광 신호가 증폭(Metal enhanced fluorescence, MEF)되는 효과가 나타나며 이를 통해 신속하고, 안정적으로 단백질 분해 효소를 검출할 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다. The present inventors have tried to develop a biosensor capable of effectively detecting the presence, activity, and concentration of proteolytic enzymes. As a result, the gold nanoparticle-DNA induces the quenching-amplification of the fluorescence emission signal through the proteolytic enzymes. -Peptide complexes are prepared, and when the complexes are used, the fluorescence signal is amplified (Metal enhanced fluorescence (MEF)) when peptides are decomposed by proteolytic enzymes, thereby quickly and stably detecting proteolytic enzymes. The present invention has been completed by elucidating that there is.

따라서, 본 발명의 목적은 단백질 분해 효소 검출용 센서를 제공하는 것이다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a sensor for detecting protease.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 단백질 분해 효소 검출용 센서를 이용하여 단백질 분해 효소를 검출하는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for detecting proteolytic enzymes using the protease detection sensor of the present invention.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 금속 나노입자 및 1 이상의 형광체를 포함하는 단백질 분해 효소 검출용 센서로서, 상기 금속 나노입자 및 상기 형광체는 핵산 및 단백질 분해 효소에 의해 절단 가능한 서열로 이루어진 펩타이드로 연결되는 것인, 단백질 분해 효소 검출용 센서에 관한 것이다. According to one aspect of the invention, the invention is a sensor for detecting proteolytic enzymes comprising metal nanoparticles and one or more phosphors, the metal nanoparticles and the phosphors are peptides consisting of a sequence cleavable by nucleic acids and proteolytic enzymes It is connected to, and relates to a sensor for detecting protease.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명자들은 단백질 분해 효소의 존재 여부, 활성 및 농도 등을 효과적으로 검출할 수 있는 바이오 센서를 개발하고자 연구 노력한 결과, 단백질 분해 효소를 통해 형광 방출 신호의 소광-증폭 현상을 유도하는 금 나노 입자-DNA-펩타이드 복합체를 제조하고, 이 복합체를 이용할 경우, 단백질 분해 효소에 의해 펩타이드 분해 시 형광 신호가 증폭(Metal enhanced fluorescence, MEF)되는 효과가 나타나며 이를 통해 신속하고, 안정적으로 단백질 분해 효소를 검출할 수 있음을 규명하였다. The present inventors have tried to develop a biosensor capable of effectively detecting the presence, activity, and concentration of proteolytic enzymes. As a result, the gold nanoparticle-DNA induces the quenching-amplification of the fluorescence emission signal through the proteolytic enzymes. -Peptide complexes are prepared, and when the complexes are used, the fluorescence signal is amplified (Metal enhanced fluorescence (MEF)) when peptides are decomposed by proteolytic enzymes, thereby quickly and stably detecting proteolytic enzymes. It was found out.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단백질 분해 효소 검출용 센서에서 금속 나노입자와 1 이상의 형광체는 핵산 및 단백질 분해 효소에 의해 절단 가능한 서열로 이루어진 펩타이드에 의해 연결될 수 있다. According to one embodiment of the invention, the metal nanoparticles and one or more phosphors in the proteolytic enzyme detection sensor may be linked by a peptide consisting of a sequence cleavable by nucleic acids and proteolytic enzymes.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단백질 분해 효소 검출용 센서는 하기의 구조식 1로 표시될 수 있다:According to one embodiment of the present invention, the protease detection sensor of the present invention may be represented by the following structural formula 1.

[구조식 1][Formula 1]

Figure 112019000376101-pat00001
Figure 112019000376101-pat00001

상기 A는 금속 나노입자이고, A is a metal nanoparticle,

상기 B는 형광체이며, B is a phosphor,

상기 C는 핵산이고,C is a nucleic acid,

상기 D는 단백질 분해 효소에 의해 절단 가능한 서열로 이루어진 펩타이드. D is a peptide consisting of a sequence cleavable by a proteolytic enzyme.

상기 금속 나노입자(A)에는 1 이상의 형광체(B)가 핵산(C) 및 단백질 분해 효소에 의해 절단 가능한 서열로 이루어진 펩타이드(D)에 의해 연결될 수 있다. One or more phosphors (B) may be linked to the metal nanoparticles (A) by a peptide (D) consisting of a nucleic acid (C) and a cleavable sequence by a proteolytic enzyme.

금속 나노입자는 표면 플라즈몬 공명 효과로 인해 형광 물질의 형광 방출 세기를 증폭시키는 특성을 가지고 있으며, 이러한 특성은 금속 나노입자와 형광 물질 사이에 일정 거리가 확보되어야 발현된다. 본 발명은 금속 나노입자의 특성을 이용하여, 금속 나노입자와 형광체가 펩타이드 및 핵산에 의해 연결되어 형광 소광 상태로 있다가 특정 단백질 분해 효소에 의하여 펩타이드가 분해되면 강한 형광을 특이적으로 발광할 수 있도록 핵산 가닥의 길이를 조절하였다. 그에 따라, 펩타이드가 분해되지 않은 상태에서는 금속 나노입자와 형광 물질이 인접하여 형광 소광 상태를 유지하다가 펩타이드가 단백질 분해 효소와 반응하여 분해되었을 때에는 핵산 가닥에 의해 금속 나노입자와 형광 물질 사이의 거리가 형광 세기가 증폭되는 상태로 전환된다. The metal nanoparticles have the property of amplifying the fluorescence emission intensity of the fluorescent material due to the surface plasmon resonance effect, which is expressed only when a certain distance is secured between the metal nanoparticles and the fluorescent material. The present invention utilizes the properties of metal nanoparticles, and the metal nanoparticles and the phosphors are connected by peptides and nucleic acids in a fluorescence quenching state, and when the peptides are decomposed by specific proteolytic enzymes, they can specifically emit strong fluorescence. The length of the nucleic acid strand was adjusted to make it. Accordingly, when the peptide is not degraded, the metal nanoparticles and the fluorescent material are maintained in the fluorescent quenching state adjacent to each other. When the peptide is decomposed by the proteolytic enzyme, the distance between the metal nanoparticles and the fluorescent material is increased by the nucleic acid strand. The fluorescence intensity is switched to amplified state.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단백질 분해 효소 검출용 센서를 이용하여 단백질 분해 효소의 존재 여부, 농도, 활성 및 억제를 효과적으로 측정할 수 있고, 영상화를 통하여 실시간으로 빠르게 스크리닝할 수 있으므로 약물 스크리닝에 응용할 수 있다. 또한, 세포 및 조직에 실시간 세포 영상화 및 비침습적 조직 영상화를 할 수 있어 생체 내 특정 조직 또는 세포에 존재하는 단백질 분해 효소의 존재 유무, 활성, 및 활성 억제 등을 쉽게 판별해 낼 수 있으므로 세포 영상, 특정 조직 영상, 약물전달체 등의 다양한 목적으로 사용될 수 있다.According to one embodiment of the present invention, by using the protease detection sensor of the present invention can effectively measure the presence, concentration, activity and inhibition of protease, and can be screened quickly in real time through imaging It can be applied to drug screening. In addition, real-time cell imaging and non-invasive tissue imaging can be performed on cells and tissues to easily determine the presence, activity, and inhibition of proteolytic enzymes present in specific tissues or cells in vivo. It can be used for a variety of purposes, including specific tissue imaging, drug carriers, and the like.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 예를 들어, DNA 일 수 있다. According to one embodiment of the invention, the nucleic acid may be DNA or RNA, for example DNA.

상기 핵산의 길이는 6 내지 10 nm, 6.5 내지 10 nm, 7 내지 10 nm, 7.5 내지 10 nm, 6 내지 9.5 nm, 6.5 내지 9.5 nm, 7 내지 9.5 nm, 7.5 내지 9.5 nm, 6 내지 9 nm, 6.5 내지 9 nm, 7 내지 9 nm, 7.5 내지 9 nm, 6 내지 8.5 nm, 6.5 내지 8.5 nm, 7 내지 8.5 nm 또는 7.5 내지 8.5 nm일 수 있고, 예를 들어, 8.0 내지 8.5 nm일 수 있다. The length of the nucleic acid is 6 to 10 nm, 6.5 to 10 nm, 7 to 10 nm, 7.5 to 10 nm, 6 to 9.5 nm, 6.5 to 9.5 nm, 7 to 9.5 nm, 7.5 to 9.5 nm, 6 to 9 nm, 6.5 to 9 nm, 7 to 9 nm, 7.5 to 9 nm, 6 to 8.5 nm, 6.5 to 8.5 nm, 7 to 8.5 nm or 7.5 to 8.5 nm, for example 8.0 to 8.5 nm.

상기 핵산의 서열은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, Poly T 서열일 수 있다. The sequence of the nucleic acid is not particularly limited and may be, for example, a Poly T sequence.

상기 펩타이드의 길이는 0.5 내지 5 nm, 1 내지 5 nm, 0.5 내지 4.5 nm, 1 내지 4.5 nm, 0.5 내지 4 nm, 1 내지 4 nm, 0.5 내지 3.5 nm, 1 내지 3.5 nm, 0.5 내지 3 nm, 1 내지 3 nm, 0.5 내지 2.5 nm, 1 내지 2.5 nm, 0.5 내지 2 nm, 1 내지 2 nm 또는 0.5 내지 1.5 nm일 수 있고, 예를 들어, 1 내지 1.5 nm일 수 있다. The length of the peptide is 0.5 to 5 nm, 1 to 5 nm, 0.5 to 4.5 nm, 1 to 4.5 nm, 0.5 to 4 nm, 1 to 4 nm, 0.5 to 3.5 nm, 1 to 3.5 nm, 0.5 to 3 nm, It may be 1 to 3 nm, 0.5 to 2.5 nm, 1 to 2.5 nm, 0.5 to 2 nm, 1 to 2 nm or 0.5 to 1.5 nm, for example 1 to 1.5 nm.

상기 금속 나노입자는 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu) 및 백금(Pt)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 예를 들어, 금(Au)일 수 있다. The metal nanoparticles may be selected from the group consisting of gold (Au), silver (Ag), copper (Cu), and platinum (Pt), for example, gold (Au).

상기 금속 나노입자의 크기는 1 내지 100 nm, 5 내지 100 nm, 10 내지 100 nm, 15 내지 100 nm, 1 내지 90 nm, 5 내지 90 nm, 10 내지 90 nm, 15 내지 90 nm, 1 내지 80 nm, 5 내지 80 nm, 10 내지 80 nm, 15 내지 80 nm, 1 내지 70 nm, 5 내지 70 nm, 10 내지 70 nm, 15 내지 70 nm, 1 내지 60 nm, 5 내지 60 nm, 10 내지 60 nm, 15 내지 60 nm, 1 내지 50 nm, 5 내지 50 nm, 10 내지 50 nm, 15 내지 50 nm, 1 내지 40 nm, 5 내지 40 nm, 10 내지 40 nm, 15 내지 40 nm, 1 내지 40 nm, 5 내지 40 nm, 10 내지 40 nm, 15 내지 40 nm, 1 내지 30 nm, 5 내지 30 nm, 10 내지 30 nm, 15 내지 30 nm, 1 내지 20 nm, 5 내지 20 nm, 10 내지 20 nm 또는 15 내지 20 nm일 수 있고, 예를 들어, 20 nm일 수 있다. The size of the metal nanoparticles is 1 to 100 nm, 5 to 100 nm, 10 to 100 nm, 15 to 100 nm, 1 to 90 nm, 5 to 90 nm, 10 to 90 nm, 15 to 90 nm, 1 to 80 nm. nm, 5 to 80 nm, 10 to 80 nm, 15 to 80 nm, 1 to 70 nm, 5 to 70 nm, 10 to 70 nm, 15 to 70 nm, 1 to 60 nm, 5 to 60 nm, 10 to 60 nm, 15 to 60 nm, 1 to 50 nm, 5 to 50 nm, 10 to 50 nm, 15 to 50 nm, 1 to 40 nm, 5 to 40 nm, 10 to 40 nm, 15 to 40 nm, 1 to 40 nm nm, 5-40 nm, 10-40 nm, 15-40 nm, 1-30 nm, 5-30 nm, 10-30 nm, 15-30 nm, 1-20 nm, 5-20 nm, 10-20 nm or 15 to 20 nm, for example 20 nm.

상기 형광체는 FITC(Fluoresceine Isothiocyanate), RITC(Rhodamine B Isothiocyanate), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor), 로드아민 레드-X(Rhodamine Red-X), 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로드아민(Tetramethylrhodamine), 캐스캐이드 블루(Cascade Blue), DAPI, 쿠마린류(Coumarine), 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 단실아민데(Dansylaminde), Cy3, Cy5 및 Cy7로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 예를 들어, FITC일 수 있다. The phosphor is Fluoresceine Isothiocyanate (FITC), Rhodamine B Isothiocyanate (RITC), Alexa Fluor, Rhodamine Red-X, Texas Red, Tetramethylrhodamine, Cascade Blue, DAPI, Coumarin, Lucifer Yellow, Dansylaminde, Cy3, Cy5, and Cy7, for example, It may be FITC.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 금속 나노입자에 2 이상의 형광체가 연결되는 경우, 상기 형광체는 동일한 파장을 갖는 2 이상의 형광체 또는 상이한 파장을 갖는 2 이상의 형광체가 연결되는 것일 수 있다. According to one embodiment of the present invention, when two or more phosphors are connected to the metal nanoparticles, the phosphors may be two or more phosphors having the same wavelength or two or more phosphors having different wavelengths.

상기 형광체는 아비딘(avidin) 또는 스트렙타비딘(streptavidin)이 결합되어 있는 것일 수 있고, 예를 들어, 스트렙타비딘이 결합되어 있는 것일 수 있다. The phosphor may be one in which avidin (avidin) or streptavidin are bound, for example, in which streptavidin is bound.

상기 핵산은 일 말단에 티올기(thiol group, -SH)가 도입되어 상기 금속 나노입자에 연결되고, 타 말단에 바이오틴(biotin)이 도입되어 상기 형광체에 연결되는 것일 수 있다. The nucleic acid may be one in which a thiol group (-SH) is introduced at one end thereof to be connected to the metal nanoparticle, and biotin is introduced at the other end thereof to be connected to the phosphor.

상기 펩타이드는 일 말단에 티올기(thiol group, -SH)가 도입되어 상기 금속 나노입자에 연결되고, 타 말단에 바이오틴(biotin)이 도입되어 상기 형광체에 연결되는 것일 수 있다. The peptide may have a thiol group (-SH) introduced at one end thereof to be connected to the metal nanoparticle, and biotin at the other end thereof to be connected to the phosphor.

상기 단백질 분해 효소는 카스파제(caspase), 트립신(trypsin), 카텝신(cathepsin), 우로키나아제(urokinase), MMP(matrix metalloproteinases), 트롬빈(thrombin), HIV-1 단백분해효소(HIV-1 protease), HSV-1 단백분해효소(HSV-1 protease), TEV 단백질분해효소(TEV protease), PSA(Prostate Specific Antigen) 및 세크레타아제(secretase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 예를 들어, 카스파제(caspase)일 수 있다. The protease is caspase, trypsin, cathepsin, caturosin, urokinase, matrix metalloproteinases, thrombin, HIV-1 protease, and HIV-1 protease. ), HSV-1 protease (HSV-1 protease), TEV protease (TEV protease), PSA (Prostate Specific Antigen) and secretases (secretase) may be selected from, for example , Caspase.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 카스파제(caspase)는 카스파제-3(caspase-3) 또는 카스파제-1(caspase-1)일 수 있고, 예를 들어, 카스파제-3(caspase-3) 일 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the caspase may be caspase-3 or caspase-1, for example, caspase-3. 3) can be.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단백질 분해 효소 검출용 센서에서 펩타이드는 카스파제에 의해 절단 가능한 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있고, 예를 들어, 서열목록 제1서열로 표시되는 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있다. According to one embodiment of the invention, the peptide in the protease detection sensor may be a peptide consisting of a sequence cleavable by caspase, for example, a peptide consisting of a sequence represented by the first sequence of the sequence list Can be.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질 분해 효소 검출용 센서에 목적 단백질 분해 효소를 가하는 단계; 및 상기 센서로부터 형광 신호를 측정하는 단계;를 포함하는 단백질 분해 효소의 검출 방법에 관한 것이다. According to another aspect of the present invention, the present invention comprises the steps of adding a proteolytic enzyme to the sensor for detecting the protease; And measuring a fluorescence signal from the sensor.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질 분해 효소 검출용 센서를 포함하는 단백질 분해 효소를 억제하는 물질의 스크리닝을 위한 조성물에 관한 것이다. According to another aspect of the present invention, the present invention relates to a composition for screening a substance for inhibiting a protease comprising the sensor for detecting the protease.

단백질 분해 효소는 넓은 범위에서 다양한 세포기능을 조절하는 역할을 하고, 이는 생리활성 물질의 분해를 통하여 이루어지기 때문에, 모든 생명체의 생명현상에 대한 단백질 분해효소의 기능 및 역할은 매우 중요하며 따라서, 특정 단백질 분해 효소의 결핍이나 부족 또는 과다발현은 암, 관절염, 퇴행성 신경질환, 심혈관계 및 자가 면역 염증질환 등의 원인이 될 수 있다.Proteolytic enzymes play a role in regulating various cellular functions in a wide range, and this is achieved through the decomposition of bioactive substances, so the function and role of proteolytic enzymes for the life phenomena of all living things is very important and therefore, specific Deficiency, lack or overexpression of proteolytic enzymes can cause cancer, arthritis, neurodegenerative diseases, cardiovascular and autoimmune inflammatory diseases.

본 발명의 단백질 분해 효소 검출용 센서는 생체 내 특정 조직 또는 세포에 존재하는 단백질 분해 효소의 존재 유무, 활성, 및 활성 억제 등을 쉽게 판별해 낼 수 있기 때문에 세포 영상, 특정 조직 영상, 약물전달체 등의 다양한 목적으로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 생체 내(in vivo) 및 생체 외(in vitro) 모두 적용이 가능하여, 신약 개발에 필요한 고성능 스크리닝(high-throughput screening) 방법 및 조기 질병 진단 등의 다양한 용도로 사용이 가능하다.Since the proteolytic enzyme detection sensor of the present invention can easily determine the presence, activity, and inhibition of protease present in specific tissues or cells in vivo, cell images, specific tissue images, drug carriers, etc. Can be used for various purposes. The composition can be applied both in vivo and in vitro , and can be used in various applications such as high-throughput screening methods and early disease diagnosis required for drug development.

본 발명에 따른 단백질 분해 효소 검출용 센서는 금속 나노입자와 형광체가 펩타이드 및 핵산에 의해 연결되어 형광 소광 상태로 있다가 특정 단백질 분해 효소에 의하여 펩타이드가 분해되면 강한 형광을 특이적으로 발광함으로써, 단백질 분해 효소를 신속하고 정확하게 측정할 수 있는 플랫폼을 제공하며, 향후 세포 기반의 비파괴, 실시간 측정 및 체액 기반의 현장 질병 진단 키트 등으로 유용하게 활용할 수 있다. The proteolytic enzyme detection sensor according to the present invention is the metal nanoparticles and the phosphor is connected by the peptide and nucleic acid in the fluorescence quenching state when the peptide is decomposed by a specific proteolytic enzyme specifically emits a strong fluorescence, It provides a platform for the rapid and accurate measurement of degrading enzymes, which can be useful for future cell-based non-destructive, real-time measurement and body fluid-based on-site disease diagnostic kits.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노입자-DNA-펩타이드 나노 복합체에 대한 모식도이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노입자 복합체(quenching), 형광물질(FITC) 및 Caspase-3 농도에 따른 금 나노입자 복합체의 펩타이드 분해 시 형광 세기를 나타내는 그래프이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노입자 복합체(quenching), 형광물질(FITC) 및 금 나노입자 복합체의 펩타이드 분해 시 형광 세기를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노입자 복합체의 Caspase-3 농도별 반응 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 반응 전 금 나노 복합체, PSA, Caspase-1, Caspase-3를 각각 반응시켰을 때 금 나노 복합체의 형광 세기를 나타낸 그래프이다. 1 is a schematic diagram of a gold nanoparticle-DNA-peptide nanocomposite according to an embodiment of the present invention.
Figure 2a is a graph showing the fluorescence intensity upon peptide decomposition of gold nanoparticle complex (quenching), fluorescent material (FITC) and Caspase-3 concentration according to an embodiment of the present invention.
Figure 2b is a graph showing the fluorescence intensity upon peptide degradation of gold nanoparticle complex (quenching), fluorescent material (FITC) and gold nanoparticle complex according to an embodiment of the present invention.
Figure 3 is a graph showing the reaction results of the Caspase-3 concentration of the gold nanoparticle complex according to an embodiment of the present invention.
Figure 4 is a graph showing the fluorescence intensity of the gold nanocomposite when the reaction of the gold nanocomposite, PSA, Caspase-1, Caspase-3 before the reaction according to an embodiment of the present invention.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. .

실시예 1: 금 나노 입자-DNA-펩타이드 복합체 제작 확인Example 1: Confirmation of gold nanoparticle-DNA-peptide complex preparation

특정 펩타이드 서열을 분해하는 효소 단백질을 측정하기 위해 본 연구에서는 금 나노 입자기반의 센싱 프로브를 제작하였다. 본 발명에서 사용하는 금 나노 입자는 BBInternational 사에서 판매 중인 20 nm 크기의 나노 입자이다. 도 1은 금 나노 입자에 DNA와 펩타이드, 형광물질을 고정화시키는 과정을 보여주는 개략도이다. In order to measure the enzyme protein that degrades a specific peptide sequence, in this study, a gold nanoparticle-based sensing probe was constructed. The gold nanoparticles used in the present invention are 20 nm size nanoparticles sold by BBInternational. 1 is a schematic diagram showing a process of immobilizing DNA, peptides and fluorescent materials on gold nanoparticles.

20 nm 크기의 금 나노입자에 thiolated DNA와 펩타이드를 차례로 붙인 후에, streatavidin-modified FITC (형광물질)을 반응시켜 도 1과 같은 형태의 나노 프로브를 제작하였다. 제작된 나노 복합체는 형광 quenching 효과를 통해 형광 발현이 되지 않으며, Caspase-3가 금 나노입자와 형광물질 사이의 펩타이드를 분해하면 형광 증폭 효과를 통해 형광 세기가 급격히 증가하게 된다.After attaching thiolated DNA and peptides to gold nanoparticles having a size of 20 nm in sequence, streatavidin-modified FITC (fluorescent material) was reacted to form nano-probes as shown in FIG. 1. The produced nanocomposites do not fluoresce through fluorescent quenching effect. When Caspase-3 decomposes peptides between gold nanoparticles and fluorescent substance, fluorescence amplification effect increases rapidly.

제작 과정을 좀 더 구체적으로 설명하자면, OD(optical density)=1의 20 nm 금 나노 입자 1 ml(7 x 1011)을 100 μM, 10 μl의 펩타이드(Biotin-SGDEVDSGC)와 반응시킨다. 4℃에서 3시간 동안 반응시킨 후, 원심분리기를 통한 washing을 진행하여 반응하지 않은 펩타이드와 금 나노 입자를 분리한다. 이 후 100 μM, 1 μl의 DNA를 금 나노 입자에 동일하게 반응시킨다. 전과 같은 washing 과정을 통해 분리된 금 나노 복합체는 이후 3% BSA(bovine serum albumin) 용액을 이용하여 passivation을 시켜준다(4℃, overnight). 이는 센서의 선택도를 높이는데 필수적인 과정이다. 동일하게 washing 과정을 거친 후, streptavidin이 달려 있는 형광물질 중 하나인 FITC를 금 나노 복합체에 반응시킨다. Streptavidin에 있는 4개의 반응기는 DNA와 펩타이드에 있는 biotin에 선택적으로 결합하여, 결과적으로 FITC의 형광을 quenching 하는 역할을 수행한다. To explain the fabrication process in more detail, 1 ml (7 x 10 11 ) of 20 nm gold nanoparticles having an optical density (OD) of 1 (7 x 10 11 ) is reacted with 100 μM and 10 μl of peptide (Biotin-SGDEVDSGC). After reacting at 4 ° C. for 3 hours, washing with a centrifuge separates the unreacted peptide and the gold nanoparticles. Thereafter, 100 μM and 1 μl of DNA are reacted with gold nanoparticles in the same manner. The gold nanocomposite separated through the washing process as before is then subjected to passivation using a 3% BSA (bovine serum albumin) solution (4 ° C., overnight). This is an essential process to increase the selectivity of the sensor. After the same washing process, FITC, one of the phosphors with streptavidin, is reacted with the gold nanocomposite. The four reactors in Streptavidin selectively bind to biotin in DNA and peptides, resulting in quenching of the fluorescence of FITC.

실시예 2: 제작된 금 나노 복합체의 금속 기반 형광 증폭 효과 확인Example 2: Confirmation of metal-based fluorescence amplification effect of the prepared gold nanocomposite

제작된 금 나노 입자-펩타이드-DNA 복합체는 형광 quenching 효과 및 증폭 효과를 통해 형광 세기를 비약적으로 증가시키기 위해 제작된 바이오센서 시스템이다. 좀 더 자세히 설명하자면, 형광물질이 금과 같은 귀금속 표면에 수 나노미터 이하의 거리를 유지하게 되면 형광 신호를 잃어버리는 quenching 효과가 일어나게 된다. 반면, 약 8 nm 정도의 일정한 거리를 유지하며, 금 나노 입자의 흡광 파장과 형광물질의 방출 파장이 일치하게 되면, 형광물질의 방출 세기가 수십 배 가량 증폭될 수 있다. 이를 형광 증폭 효과(metal-enhanced fluorescence, MEF) 라고 한다. 본 발명에서 금 나노입자와 형광물질을 결합해주는 생체물질은 펩타이드와 DNA 두 개로 구성되어 있다. 펩타이드의 길이는 대략적으로 1.4 nm(SGDEVDSGC, 9 amino acids)이고 DNA의 길이는 대략 8.2 nm(Poly T, 24 base) 정도이다. 즉, 두 개의 분자를 통해 연결된 형광물질은 quenching 상태로 유지되며, 펩타이드가 분해되어 DNA로만 연결되면 형광세기는 급격히 증가하게 된다.The fabricated gold nanoparticle-peptide-DNA complex is a biosensor system designed to dramatically increase fluorescence intensity through fluorescent quenching and amplifying effects. More specifically, the quenching effect of losing the fluorescent signal occurs when the phosphor is kept a few nanometers away from the surface of precious metals such as gold. On the other hand, while maintaining a constant distance of about 8 nm, if the absorption wavelength of the gold nanoparticles and the emission wavelength of the fluorescent material, the emission intensity of the fluorescent material can be amplified by several tens of times. This is called metal-enhanced fluorescence (MEF). In the present invention, a biomaterial that combines gold nanoparticles with a fluorescent material is composed of two peptides and DNA. The length of the peptide is approximately 1.4 nm (SGDEVDSGC, 9 amino acids) and the length of the DNA is approximately 8.2 nm (Poly T, 24 base). In other words, the fluorescent material connected through the two molecules is kept in the quenching state, and the fluorescence intensity is rapidly increased when the peptide is decomposed and only connected to DNA.

이를 확인하고자, 형광물질, 금 나노입자에 펩타이드와 DNA를 이용하여 형광물질과 연결시킨 금 나노입자 복합체 및 트립신으로 분해한 금 나노입자 복합체에 대하여 형광 세기를 측정하였다. 그 결과, 형광물질이 가지는 형광세기에 비해 금 나노입자-DNA-펩타이드가 결합된 형광물질의 세기는 현저히 작았으며, 펩타이드를 분해한 경우에는 2배 이상의 형광세기 증가를 보였다. 또한, DNA의 길이 확보를 위해 NaCl을 첨가하여 DNA를 stretching 시켜 형광을 증폭시켰을 경우에는 형광세기의 증가가 10배가 넘는 현상을 보였다(도 2b). 이를 통해, 금 나노입자-DNA-펩타이드 복합체로 구성된 나노 프로브가 형광 증폭을 잘 유도한다는 것을 확인할 수 있었다. To confirm this, the fluorescence intensity was measured for the gold nanoparticle complexes linked with the fluorescent material and the gold nanoparticle complexes decomposed with trypsin using peptides and DNA on the fluorescent material, gold nanoparticles. As a result, the intensity of the fluorescent material combined with the gold nanoparticle-DNA-peptide was significantly smaller than the fluorescence intensity of the fluorescent material, and when the peptide was decomposed, the fluorescence intensity increased by more than two times. In addition, when fluorescence was amplified by stretching the DNA by adding NaCl to secure the length of the DNA, the increase in fluorescence intensity was more than 10 times (Fig. 2b). Through this, it was confirmed that the nano-probe composed of gold nanoparticle-DNA-peptide complex well induced fluorescence amplification.

실시예 3: 발명된 금 나노 입자-DNA-펩타이드 복합체 기반 표적 단백질 정량화Example 3: Quantification of Target Protein Based on Invented Gold Nanoparticle-DNA-Peptide Complexes

제작된 금 나노 입자-DNA-펩타이드 복합체는 펩타이드의 분해 여부에 따라 형광 세기가 달라지는 현상을 보였다. 이와 같은 결과를 기반으로, 본 파트에서는 표적 단백질에 선택적으로 반응하여 분해되는 펩타이드 서열을 사용하여 표적 단백질의 정량화를 시도하였다. 표적 단백질은 특정 펩타이드 서열을 분해하는 성질을 가진 단백질이 모두 적용될 수 있으며, 본 발명에서는 예시로 대표적인 가수분해 단백질 중 하나인 caspase-3를 사용하였다. 본 단백질은 펩타이드 서열 중 DEV를 선택적으로 인식하여 분해하는 성질을 가진다. 따라서, 제작된 나노 복합체에 caspase-3를 농도별로 반응시킨 후에, 형광 세기를 측정하여 농도별 형광 세기를 비교하였다. 좀 더 구체적으로, 625 pg/ml부터 10,000 pg/ml까지의 caspase-3 를 테스트하였으며, 만들어진 금 나노 복합체와 1시간 동안 상온에서 반응한 후, 형광 측정 기기를 통해 520 nm의 형광세기를 측정하였다.  The produced gold nanoparticle-DNA-peptide complex showed a phenomenon that the fluorescence intensity varies depending on whether or not the peptide is degraded. Based on these results, this part attempts to quantify the target protein using a peptide sequence that selectively degrades in response to the target protein. As the target protein, all proteins having a property of degrading a specific peptide sequence may be applied. In the present invention, for example, caspase-3, which is one of representative hydrolytic proteins, was used. This protein has the property of selectively recognizing and degrading DEV in the peptide sequence. Therefore, after reacting caspase-3 with the produced nanocomposite by concentration, the fluorescence intensity was measured to compare the fluorescence intensity by concentration. More specifically, caspase-3 was tested from 625 pg / ml to 10,000 pg / ml, and reacted with the resulting gold nanocomposite at room temperature for 1 hour, and then measured fluorescence intensity of 520 nm through a fluorescence measuring instrument. .

도 3의 형광 spectrum은 caspase-3 반응 후 형광세기를 나타내는 그래프로써, Caspase-3를 312.5, 625, 1,250, 2,500, 5,000, 10,000 pg/ml의 농도로 반응시켰을 때의 형광 세기가 선형적으로 증가하는 것을 확인할 수 있다.3 is a graph showing the fluorescence intensity after the caspase-3 reaction. The fluorescence intensity linearly increases when the caspase-3 is reacted at concentrations of 312.5, 625, 1,250, 2,500, 5,000, and 10,000 pg / ml. You can see that.

또한, 625 pg/ml의 caspase-3 반응 시 형광신호와 아무것도 반응시키지 않았을 때의 형광 신호의 차이가 여전히 크기 때문에, 625 pg/ml 이하의 농도의 caspase-3도 측정할 수 있을 것으로 보인다.In addition, the caspase-3 concentration of 625 pg / ml or less can be measured because the difference between the fluorescence signal and the fluorescence signal when nothing is reacted is still large.

실시예 4: 발명된 금 나노 입자-DNA-펩타이드 복합체 기반 비표적 단백질 선택도 테스트Example 4: Non-target Protein Selectivity Test Based on Invented Gold Nanoparticle-DNA-Peptide Complexes

제작된 금 나노 입자 기반의 나노 복합체는 특정 펩타이드 서열의 선택적 분해 성질을 이용하여 제작된 단백질 바이오센서이다. 펩타이드 서열 중 DEV가 caspase-3에 선택적으로 분해되어 형광 신호가 증가하여 caspase-3의 농도를 측정할 수 있는 간단한 시스템이다. 본 센서가 실제 caspase-3에만 선택적으로 반응하여 형광신호가 증폭되는 것인지 확인하기 위해, 가수분해 성질이 있는 다른 두 개의 단백질을 동일한 조건으로 반응시켜 caspase-3 반응과 비교하여 형광 세기를 측정하였다. PSA와 Caspase-1은 Caspase-3와 동일하게 특정 펩타이드 서열을 분해하는 성질을 가지는 단백질로, 본 실험에서는 분해할 수 없는 펩타이드 서열이 금 나노 복합체에 존재하기 때문에 형광 세기를 증가시킬 수 없을 것으로 예상할 수 있다. The nanocomposite-based nanocomposites are protein biosensors fabricated using selective degradation properties of specific peptide sequences. It is a simple system to measure the concentration of caspase-3 because DEV is selectively degraded to caspase-3 in the peptide sequence to increase the fluorescence signal. In order to confirm whether the sensor selectively reacts only with caspase-3 and amplifies the fluorescence signal, two different proteins with hydrolytic properties were reacted under the same conditions, and the fluorescence intensity was measured by comparing with the caspase-3 reaction. PSA and Caspase-1 are proteins similar to Caspase-3 that decompose specific peptide sequences. In this experiment, peptide intensity cannot be increased because a peptide sequence that cannot be degraded exists in the gold nanocomposite. can do.

실험 과정에 대해 좀 더 상세히 설명하자면, 10 ng/ml의 동일한 농도의 PSA, Caspase-1과 Caspase-3를 금 나노 복합체와 1시간 동안 상온에서 반응한 후, 520 nm에서의 형광 세기를 측정하였다. 도 4는 각 단백질을 반응했을 때의 형광 신호를 보여주는 것으로, PSA와 Caspase-1를 반응시켰을 때의 형광 세기가 조금 증가하는 경향을 보이나 반응 전 형광 신호(quenching)와 큰 차이를 보이지 않으며, Caspase-3를 반응시켰을 때와 비교하면 형광 세기가 큰 차이를 나타낸다. 본 실험 결과를 통해, 금 나노 입자 기반의 형광 증폭 바이오센서가 선택적으로 Caspase-3를 측정할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.To explain the experimental process in more detail, after reacting PSA, Caspase-1 and Caspase-3 at the same concentration of 10 ng / ml with the gold nanocomposite at room temperature for 1 hour, the fluorescence intensity at 520 nm was measured. . Figure 4 shows the fluorescence signal when the reaction of each protein, the fluorescence intensity when the reaction of PSA and Caspase-1 tends to increase slightly, but does not show a big difference from the quenching signal before the reaction (quenching), Caspase Compared with the reaction of -3, the fluorescence intensity shows a large difference. Through the experimental results, it was confirmed that the fluorescence amplification biosensor based on gold nanoparticles can selectively measure Caspase-3.

<110> SOGANG UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION <120> Sensor for Detecting Protease using Nanoparticle-Nucleic Acid-Peptide Complex <130> PN180345 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Digestion peptide by Caspase-3 <400> 1 Ser Gly Asp Glu Val Asp Ser Gly Cys 1 5 <110> SOGANG UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION <120> Sensor for Detecting Protease using Nanoparticle-Nucleic          Acid-Peptide Complex <130> PN180345 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Digestion peptide by Caspase-3 <400> 1 Ser Gly Asp Glu Val Asp Ser Gly Cys   1 5

Claims (11)

금속 나노입자 및 1 이상의 형광체를 포함하는 단백질 분해 효소 검출용 센서로서, 상기 금속 나노입자 및 상기 형광체는 핵산 및 단백질 분해 효소에 의해 절단 가능한 서열로 이루어진 펩타이드로 연결되는 것인, 단백질 분해 효소 검출용 센서.
A proteolytic enzyme detection sensor comprising a metal nanoparticle and at least one phosphor, wherein the metal nanoparticle and the phosphor are linked to a peptide consisting of a cleavable sequence by a nucleic acid and a proteolytic enzyme. sensor.
제 1 항에 있어서, 상기 핵산의 길이는 6 내지 10 nm인 것인, 단백질 분해 효소 검출용 센서.
The sensor of claim 1, wherein the nucleic acid has a length of 6 to 10 nm.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드의 길이는 0.5 내지 5 nm인 것인, 단백질 분해 효소 검출용 센서.
The sensor of claim 1, wherein the peptide has a length of 0.5 to 5 nm.
제 1 항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu) 및 백금(Pt)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단백질 분해 효소 검출용 센서.
The sensor of claim 1, wherein the metal nanoparticle is selected from the group consisting of gold (Au), silver (Ag), copper (Cu), and platinum (Pt).
제 1 항에 있어서, 상기 형광체는 FITC(Fluoresceine Isothiocyanate), RITC(Rhodamine B Isothiocyanate), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor), 로드아민 레드-X(Rhodamine Red-X), 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로드아민(Tetramethylrhodamine), 캐스캐이드 블루(Cascade Blue), DAPI, 쿠마린류(Coumarine), 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 단실아민데(Dansylaminde), Cy3, Cy5 및 Cy7로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단백질 분해 효소 검출용 센서. 　The method of claim 1, wherein the phosphor is Fluoresceine Isothiocyanate (FITC), Rhodamine B Isothiocyanate (RITC), Alexa Fluor, Rhodamine Red-X, Texas Red, Tetramethyl Tetramethylrhodamine, Cascade Blue, DAPI, Coumarine, Lucifer Yellow, Dansylaminde, Cy3, Cy5 and Cy7 Sensor for the detection of proteolytic enzymes. 제 1 항에 있어서, 상기 형광체는 아비딘(avidin) 또는 스트렙타비딘(streptavidin)이 결합되어 있는 것인, 단백질 분해 효소 검출용 센서.
According to claim 1, The phosphor is avidin (avidin) or streptavidin (streptavidin) is bound, the proteolytic enzyme detection sensor.
제 1 항에 있어서, 상기 핵산 및 펩타이드는 일 말단에 티올기(thiol group, -SH)가 도입되어 상기 금속 나노입자에 연결되는 것인, 단백질 분해 효소 검출용 센서.
According to claim 1, wherein the nucleic acid and peptide is a thiol group (thiol group, -SH) is introduced at one end is connected to the metal nanoparticles, the proteolytic enzyme detection sensor.
제 1 항에 있어서, 상기 핵산 및 펩타이드는 일 말단에 바이오틴(biotin)이 도입되어 상기 형광체에 연결되는 것인, 단백질 분해 효소 검출용 센서.
The sensor for detecting proteolytic enzymes of claim 1, wherein the nucleic acid and the peptide are connected to the phosphor by introducing biotin at one end thereof.
제 1 항에 있어서, 상기 단백질 분해 효소는 카스파제(caspase), 트립신(trypsin), 카텝신(cathepsin), 우로키나아제(urokinase), MMP(matrix metalloproteinases), 트롬빈(thrombin), HIV-1 단백분해효소(HIV-1 protease), HSV-1 단백분해효소(HSV-1 protease), TEV 단백질분해효소(TEV protease), PSA(Prostate Specific Antigen) 및 세크레타아제(secretase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단백질 분해 효소 검출용 센서.
The method of claim 1, wherein the proteolytic enzymes are caspase, trypsin, cathepsin, urokinase, matrix metalloproteinases, thrombin, HIV-1 protease. Selected from the group consisting of enzyme (HIV-1 protease), HSV-1 protease (TEV protease), TEV protease (TEV protease), PSA (Prostate Specific Antigen) and secretase Phosphorus, protease detection sensor.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 단백질 분해 효소 검출용 센서에 목적 단백질 분해 효소를 가하는 단계; 및
상기 센서로부터 형광 신호를 측정하는 단계;를 포함하는 단백질 분해 효소의 검출 방법.
Adding a proteolytic enzyme to the sensor for detecting the protease of any one of claims 1 to 9; And
Measuring a fluorescence signal from the sensor.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 단백질 분해 효소 검출용 센서를 포함하는 단백질 분해 효소를 억제하는 물질의 스크리닝용 조성물.A composition for screening a substance that inhibits a protease comprising the sensor for detecting the protease of any one of claims 1 to 9.
KR1020190000361A 2019-01-02 2019-01-02 Sensor for Detecting Protease using Nanoparticle-Nucleic Acid-Peptide Complex KR102086282B1 (en)

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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090052236A (en) * 2007-11-20 2009-05-25 한국과학기술연구원 A dark quenched fluorogenic sensor for protease imaging, its preparation method, and use thereof
KR20120089913A (en) * 2010-12-21 2012-08-16 한국과학기술연구원 Metal nano-particle for multi-modal imaging and use thereof
KR101730036B1 (en) * 2015-01-20 2017-04-26 한국과학기술원 Method for Preparing Nanoparticle Cluster Using DNA Binding Protein
KR101847294B1 (en) * 2016-10-31 2018-04-10 성균관대학교산학협력단 Dna-peptide complex with high density functional groups, dna-peptide-nanomaterial complex and manufacturing method of the dna-peptide-nanomaterial complex, dna-metal nanowire and manufacturing method of the dna-metal nanowire

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090052236A (en) * 2007-11-20 2009-05-25 한국과학기술연구원 A dark quenched fluorogenic sensor for protease imaging, its preparation method, and use thereof
KR20120089913A (en) * 2010-12-21 2012-08-16 한국과학기술연구원 Metal nano-particle for multi-modal imaging and use thereof
KR101730036B1 (en) * 2015-01-20 2017-04-26 한국과학기술원 Method for Preparing Nanoparticle Cluster Using DNA Binding Protein
KR101847294B1 (en) * 2016-10-31 2018-04-10 성균관대학교산학협력단 Dna-peptide complex with high density functional groups, dna-peptide-nanomaterial complex and manufacturing method of the dna-peptide-nanomaterial complex, dna-metal nanowire and manufacturing method of the dna-metal nanowire

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Marcin Poreba et al, Chemical Reviews (2015), vol 115, pp 12546-12629. *

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