KR101939080B1

KR101939080B1 - 슈도모나스 베로니 균주 kacc 81051bp 및 이를 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR101939080B1
Application number: KR1020170137347A
Authority: KR
Inventors: 류지훈; 김윤빈
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2017-10-23
Filing date: 2017-10-23
Publication date: 2019-01-16

Abstract

본 발명의 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP은 식품위해미생물인 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대해 항균 활성을 나타내고, 건조한 환경에서도 환경 표면에 바이오필름을 형성할 수 있으므로, 상기 균주를 포함하는 조성물은 생물학적 제제로써 사용되어 식품, 농업, 환경 산업 등에 넓게 적용시킬 수 있다.

Description

슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP 및 이를 포함하는 조성물 {Pseudomonas veronii strain KACC 81051BP and composition for comprising the same}

본 발명은 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대해 항균 활성을 나타내는 신규 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP, 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7의 활성 억제 방법에 관한 것이다.

장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7은 그람 음성의 통성혐기성 세균으로, 1982년 미국에서 처음 발견되어 사람이나 동물의 장관에 서식하여 설사나 복통을 일으키는 병원성 대장균의 일종으로 알려져 있다. 상기 장출혈성 대장균은 전염성이 매우 강하고, 인체에 침입하게 되면 복통, 설사, 혈변 등을 유발하며, '베로톡신(verotoxin)'이라는 단백질 독소를 생성하여 적혈구의 파괴와 신장세포를 손상시킴으로써 용혈성 요독증을 유발할 수 있다. 상기 요독증이 발병하게 되면 그 후유증으로 신경계, 호흡기계, 순환계 등에 심각한 장애를 일으킬 수 있으며, 이러한 후유증은 5 내지 10%의 치사율을 갖는 것으로 보고되어 있다.

장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7은 동물의 변에 오염된 생간이나 육회, 햄버거 또는 야채를 65℃ 미만에서 설익혀 먹거나 동물의 분변에 오염된 식수를 마셨을 때 감염될 수 있으며, 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 감염된 환자를 통해서도 감염되는 것으로 알려져 있다. 최근 변화하는 식문화로 인해 대형 음식점과 집단 급식소를 중심으로 식중독의 발생이 증가하고 있다. 실제로, 식품의약안전처는 2012년부터 2016년까지 병원성 대장균에 의해 총 196건의 집단식중독과 총 9,609명의 환자가 우리나라에서 발생한 것으로 추정하고 있다(비특허문헌 1).

장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7은 다양한 식품 원재료에 존재하기도 하지만, 많은 경우 다양한 식품 생산 및 가공환경으로부터 식품으로 교차오염되어 식중독을 유발한다. 특히, 가축의 생산 및 가공환경의 경우, 축사를 비롯하여 수송환경 및 도축환경의 다양한 표면에서 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7의 존재가 보고된 바 있으며, 이러한 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7의 존재는 식품으로 교차오염 및 재오염에 주된 원인이 된다. 그러므로, 식품의 생산 및 가공환경에서 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7의 생육을 효과적으로 저해할 수 있는 살균처리 방법의 개발이 필요하다.

현재 환경표면에 오염된 위해미생물을 억제하기 위하여 하이포아염소산염(hypochlorite), 이산화염소(chlorine dioxide), 에탄올(ethanol), 과산화수소(hydrogen peroxide) 등과 같은 화학적 살균제가 개발되어 있고 이 살균제들의 우수한 살균력 역시 검증되어 있지만, 이러한 화학적 살균제는 작업자에게 피부염증 및 독성물질의 축적과 같은 부작용을 유발할 수 있다. 따라서 식품접촉표면에서 화학적 합성물 보다 천연물 제제를 이용하여 위해미생물을 억제할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.

바이오필름은 생물학적 또는 비생물학적 표면에 부착된 미생물과 미생물이 분비한 다당류(EPS; extracellular polymetric substances)의 결합층이다. 미생물들이 식품접촉표면에 바이오필름을 형성하게 되면 건조와 같은 환경스트레스에 저항성이 상당히 증가하게 된다. 만약 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대한 항균특성을 가진 길항미생물들을 이용하여 다양한 환경표면에 바이오필름을 형성시킨다면 이 표면은 건조환경에서도 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대한 지속적인 항균활성을 나타낼 수 있을 것이다.

현재까지 환경표면에 오염된 식중독세균을 억제할 수 있는 신규 미생물을 발굴한 사례는 거의 없고, 특히 바이오필름 형성을 유도하여 길항미생물들의 환경스트레스에 대한 저항성을 향상시킨 연구도 거의 진행된 바 없었다. 따라서 다양한 환경 표면에서 위해미생물을 억제할 수 있는 신규 미생물의 발굴은 계속적으로 이루어져야 하고, 발굴된 신규의 유용 미생물을 적용하기 위한 방법들 역시 개발되어야 한다.

식품의약품안전처 식품안전나라, 2012-2016. 식중독통계.

본 발명의 목적은 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대해 항균 활성을 나타내는 신규 균주인 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP (Pseudomonas veronii strain KACC 81051BP), 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7의 활성 억제 방법을 제공하는 것이다.

이에, 본 발명자들은 토양, 식품, 식품접촉표면으로부터 약 2,065 개의 다른 형태의 콜로니를 가지는 미생물을 분리하였고, 이 미생물 중 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대해 우수한 항균 활성을 나타내는 균주를 찾고자 노력한 결과, 신규한 슈도모나스 속 균주인 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81061BP를 상추에서 분리, 동정하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 따른 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP은 식품 유래의 슈도모나스 베로니 신규 균주이다. 비록 본 발명에서의 슈도모나스 베로니 균주는 식품으로부터 분리, 동정하기는 했으나, 입수 경로가 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에의 실시예를 통해 분리된 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대해 우수한 항균 효과를 나타내는 미생물의 동정 및 분류를 위한 16S rRNA 염기서열 분석 결과, SEQ ID NO: 1의 핵산서열(도 2)을 갖는 것으로 나타났다. 또한, 분석 결과, 상기 균주는 도 3의 계통수 (phylogenetic tree)에서 볼 수 있는 바와 같이, Pseudomonas veronii strain CIP 104663^T과 가장 높은 분자계통학적 유연 관계를 보였다.

따라서, SEQ ID NO: 1의 16S rRNA 염기서열을 갖는 본 발명의 미생물을 슈도모나스 베로니 균주 레투스-19(Pseudomonas veronii strain Lettuce-19)으로 명명하였으며, 국립농업과학원(KACC)에 2017년 08월 22일자로 기탁하였다(수탁번호 KACC 81051BP). 본 발명에 있어서, 상기 슈도모나스 베로니 균주 레투스-19(Pseudomonas veronii strain Lettuce-19)는 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP(Pseudomonas veronii strain KACC 81051BP)와 상호교환적으로 사용할 수 있다.

본 발명의 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP(Pseudomonas veronii strain KACC 81051BP)은 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대해 항균 활성을 나타냄으로써, 본 발명의 균주를 포함하는 조성물은 생물학적 제제로써 사용되어 식품, 농업, 환경 산업 등에 넓게 적용시킬 수 있다.

하기 실시예에서는, 본 발명의 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP는 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대해 항균 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, 상기 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP의 현탁액을 스테인리스 스틸에 분사 건조하여 배양한 표면에서 상기 균주의 개체수를 측정하여 바이오필름 형성 능력이 우수함을 확인하였다.

그러므로, 본 발명에 따른 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP는 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대한 항균성 물질로서 가축 및 축사 등에서 상기 병원성 대장균의 활성 억제 용도로 다양하게 활용될 수 있다.

이에, 본 발명의 한 구체예에서는, 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP, 이의 배양물, 이의 추출물 또는 이의 현탁물을 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물에 포함되는 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP는 생균체 또는 사균체로서 존재할 수 있으며, 또한 건조 또는 동결건조된 형태로 존재할 수도 있다. 다양한 조성물 내에 포함시키기 적합한 균주의 형태 및 제제화 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 추출물, 배양물, 농축물, 또는 현탁물 등의 형태로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구체예에서는 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP, 이의 배양물, 이의 추출물 또는 이의 현탁물을 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 항균용 조성물은 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대해 항균 활성을 나타낸다.

상기 장출혈성 대장균은 대표적인 병원성 대장균으로 알려져 있어, 장출혈성 대장균에 감염된 가축을 사람이 섭취하게 되면 출혈성 장염(hemorrhagic enteritis), 출혈성 대장염(hemorrhagic colitis), 용혈성 요독 증후군(hemolytic uremic syndrome; HUS), 용혈성 빈혈(hemolytic anemia), 혈소판 감소증(thrombin thrombocytopenia), 급성 신부전증(acute renal failure) 및 부종병(edema disease) 등의 심각한 대장균 감염증이 유발될 수 있다. 특히 상기 장출혈성 대장균은 인체에 침입하게 되면 베로톡신(verotoxin)이라는 단백질 독소를 생성할 수 있는데, 이 독소가 장관 상피세포에 손상을 줌으로써 출혈성 설사 등의 질환을 일으킬 수 있다.

따라서, 상기 조성물은 가축의 섭취로부터 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7의 감염에 의한 질환의 예방, 치료, 개선에 이용될 수 있으며, 바람직하게는 상기 동물은 소, 말, 돼지와 같은 가축을 포함한다.

또한, 본 발명은 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP, 이의 배양물, 이의 추출물 또는 이의 현탁물을 포함하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물을 제공한다.

사료로서 이용될 경우, 상기 조성물은 동물의 식이욕구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기곡분을 포함할 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩곡분, 또는 옥수수/콩곡분믹스로 주로 구성되어 있다.

사료 첨가제로서 이용될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립 형태로 제조될 수 있다. 상기 사료 첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산등의 유기산이나 인산 나트륨, 인산 칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 이용될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화 될 수 있으며, 통상의 사료성분을 함께 포함할 수 있다.

상기 사료 첨가제 및 사료는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제 등을 더 포함할 수 있다.

상기 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 탑드레싱으로서 또는 이들을 동물사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구 제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료 첨가제를 동물사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수전분, 락토오스, 수크로오스, 콩플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.

또한, 상기 사료 및 사료 첨가제는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료 첨가제는 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.

본 발명의 사료 또는 사료 첨가제는 포유류 및 가금류를 포함하는 다수의 동물식이에 적용할 수 있다.

상기 포유류로서 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치동물 및 실험용 설치동물뿐만 아니라, 애완동물(예: 개, 고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 한 구체예에서, 상기 사료 또는 사료 첨가제는 소의 사료 또는 사료 첨가제일 수 있다.

또한, 본 발명은 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP, 이의 배양물, 이의 추출물 또는 이의 현탁물을 포함하는 생물학적 방제제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 방제제에 사용되는 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP은 임의의 다른 성분을 전혀 첨가하지 않고 그대로 사용할 수 있다. 필요에 따라, 고체 담체 또는 액체 담체 등의 임의의 각종 담체와 합하여 제조된 조성물, 또는 첨가제 등의 제제용 보조제를 첨가하여, 균주 또는 물질을 수화제, 용액제, 현탁제, 과립제, 분제, 마이크로캡슐제 등으로 제제화하여 수득된 제형물을 사용할 수 있다. 상기 제제는 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP을 약 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니나 제제 1g 당 약 10³ 내지 10⁸ CFU의 상기 균주를 포함할 수 있다.

제제화에 사용되는 고체 담체로는 예를 들어, 미네랄 분말(예, 카올린클레이, 벤토나이트, 규조토, 합성 함수 산화규소, 탈크, 석영, 버미큘라이트, 펄라이트 등), 무기염(예, 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아 및 염화암모늄 등), 유기분말(소맥분, 대두분, 밀기울, 키틴, 쌀겨, 탈지분유 및 전지분유 등), 활성탄 및 탄산칼슘 등을 들 수 있다. 액체 담체로는, 예를 들어 물, 글리세롤, 식물유(예, 대두유 및 유채씨유), 액체 동물유(예, 어유), 에틸렌글리콜, 폴리(에틸렌글리콜), 프로필렌글리콜 및 폴리(프로필렌글리콜) 등을 들 수 있다.

제제용 보조제로는, 예를 들어 카제인, 젤라틴, 다당류(예, 전분가루, 아라비아고무, 셀룰로오스 유도체 및 알긴산), 리그닌 유도체, 벤토나이트, 당류, 식물유, 광물유, 합성 수용성 고분자(예, 폴리(비닐알콜), 폴리(아크릴산) 등), 프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜 등의 동결 방지제; 실리콘계 화합물 등의 소포제; 천연 다당류(예, 잔탄검 등), 무기물(예, 알루미늄 및 벤토나이트 등), 합성 수용성 고분자(예, 폴리(아크릴산) 등) 등의 증점제 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 방제제는 항균제, 축사 소독제, 음수 첨가제 등으로 적용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 방제제는 살충제, 살선충제, 살진드기제, 살진균제, 살균제, 제초제, 식물 생장 조절제, 전착제, 비료, 미생물 재료, 토양 개량제 등과 혼합하여 사용하거나, 또는 혼합하지 않고 동시에 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명은 상기 생물학적 방제제를 가축, 축사 또는 그 부근에 처리하는 단계를 포함하는, 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7의 활성 억제 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 장출혈성 대장균의 활성 억제 방법은 가축, 축사 또는 그 부근에 직접 처리하거나 바이오필름을 형성시켜 처리하는 단계를 모두 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 생물학적 방제제를 사료에 첨가하여 가축에게 급여하거나, 축사 또는 그 부근에 살포함으로써, 가축에 감염을 일으킬 수 있는 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7의 활성을 억제시키는 방법과 축사 및 그 부근환경에 상기 생물학적 방제제를 부착하거나 바이오필름 형성을 유도하여 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대해 항균성을 부여하는 방법 등을 포함할 수 있다.

앞서 설명한 바와 같이, 상기 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7의 활성을 억제시킴으로써, 장출혈성 대장균에 감염된 가축 및 가금류 등의 동물을 섭취함으로써 사람에게 유발되는 출혈성 장염(hemorrhagic enteritis), 출혈성 대장염(hemorrhagic colitis), 용혈성 요독 증후군(hemolytic uremic syndrome; HUS), 용혈성 빈혈(hemolytic anemia), 혈소판 감소증(thrombin thrombocytopenia), 급성 신부전증(acute renal failure) 및 부종병(edema disease) 등의 심각한 질병 등의 심각한 대장균 감염증을 예방할 수 있다. 또한, 장출혈성 대장균의 활성을 억제시킴으로써 상기 대장균에 의해 생산되는 베로톡신(verotoxin)의 단백질 독소 역시 예방할 수 있다.

또한, 본 발명은 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP, 이의 배양물, 이의 추출물 또는 이의 현탁물을 표면에 처리하는 단계를 포함하는 표면의 항균처리 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 표면에 처리하는 단계는 상기 균주, 균주의 배양물, 균주의 추출물 또는 균주의 현탁물을 표면에 분사하여 건조하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 분사 건조한 후, 20℃ 내지 30℃의 온도범위에서 3시간 내지 120시간 동안, 바람직하게는 6시간 내지 72시간 동안, 더 바람직하게는 12시간 내지 48시간 동안 배양기에서 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 표면은 스테인리스 스틸, 유리, 나무, 비닐, 플라스틱, 고무 또는 타일류일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

하기 실시예에서, 상기 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP의 현탁액을 스테인리스 스틸 쿠폰에 분사하여 건조한 후, 25℃의 온도에서 120시간 동안 배양한 결과, 배양 24시간만에 상기 균주의 개체수가 1000배 이상 증가하여 그 후에는 개체수가 유지되는 것을 확인함으로써, 상기 균주가 스테인리스 스틸 쿠폰에 바이오필름을 형성하여 항균 활성을 나타낼 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 따른 균주는 표면에 비선택적으로 바이오필름을 형성하여 스테인리스 스틸, 유리, 나무, 비닐, 플라스틱, 고무, 타일류 등의 표면에 바이오필름을 형성함으로써 항균 활성을 나타낼 수 있으므로, 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대해 지속적인 항균활성을 나타낼 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 균주의 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대한 항균 활성을 저해환의 형성을 통해 나타낸 결과이다.
도 2는 본 발명의 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP의 16S rRNA 유전자 염기서열을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP의 분자계통학적 유연 관계를 보여주는 계통수이다.
도 4는 본 발명의 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP의 바이오필름 성장 곡선을 그래프로 나타낸 결과이다.
도 5는 본 발명의 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP로부터 형성된 바이오필름의 건조 스트레스에 대한 저항성을 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP로부터 형성된 바이오필름의 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대한 항균활성을 확인한 결과이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[실시예 1] 토양, 식품, 식품접촉표면으로부터 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대해 항균력을 보이는 길항 미생물의 발굴

병원성 대장균인 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대해 항균 활성을 보이는 길항 미생물을 발굴하기 위하여, 토양, 식품 및 식품접촉표면으로부터 약 2,065개의 다른 형태의 콜로니를 가지는 미생물들을 분리하였다.

토양 샘플은 대한민국의 여러 산, 호수, 댐 등 약 30 곳의 주변 환경에 존재하는 흙을 채집하여 확보하였다. 흙은 10cm정도 깊이로 땅을 파서 내부에 있는 흙을 채취하였다. 이 흙 10g을 100ml의 멸균된 물에 현탁 시키고 1 내지 3시간 정도 25℃에서 200rpm으로 진탕배양하였다. 배양 후, 배양액에서 흙이 가라앉으면 상등액 0.1ml를 취해 humic acid vitamin agar에 도말하여 28℃에서 3일 내지 14일간 배양한 후 자란 미생물 콜로니를 백금이(inoculation loop)로 취하여 15% 글리세롤에 넣고 -20℃에서 냉동보관하였다.

냉동보관해둔 토양 유래 미생물의 단일 콜로니를 백금이를 이용하여 Bennet's agar에 획선 도말하고 25℃ 배양기에서 총 6일 동안 배양하였다. 이때, 3 일 배양 후, 균주가 잘 자랐는지 확인하여 잘 자라지 못한 균주는 멸균면봉을 이용하여 2차 획선 도말한 후 배양하였다.

6일 후 콜로니가 자라면 약 1 내지 5개의 콜로니를 작은 사이즈의 구슬이 포함된 10ml의 TSB에 접종하여 약 200rpm으로 25℃에서 3일 동안 진탕 배양하였다.

3일 배양 후, 이 토양미생물들을 TSA에 10㎕씩 점접종하고 15분 내지 30분 동안 층류 생물안전 캐비닛 후드(laminar flow biosafety cabinet hood)에서 건조 한 후, 25℃ 배양기에서 24시간 동안 정치 배양하였다.

식품으로부터 미생물을 분리하기 위하여 서울에 소재한 재래시장에 있는 상점들 중 무작위로 8곳을 선정하여 신선 채소(상추, 양상추, 양배추, 적양배추, 배추, 깻잎, 어린 양배추, 치커리 그리고 겨자잎)와 수산물(어류[고등어, 참조기], 갑각류[새우] 그리고 패류[홍합, 피조개])을 구입하였다.

10g의 신선 채소 또는 수산물을 100ml의 멸균된 0.1% 펩톤수(peptone water, PW)와 함께 400ml의 폴리올레핀 용기에 넣고 균질기를 이용하여 2분간 균질화하였다. 균질화 된 샘플들은 각각 0.1% PW로 희석하고, 0.1%(w/v) 피루빈산나트륨(sodium pyruvate)이 첨가된 TSA (tryptic soy agar) 배지에 평판 도말한 후, 25°C에서 48시간 동안 배양하였다. 배양한 후, 모양과 색깔이 서로 다른 콜로니들을 선별하여 백금이로 TSA 배지에 획선도말한 후 25℃에서 24시간 동안 배양하여 4℃에서 냉장보관하였다.

식품과 식품접촉표면에서 분리한 미생물의 경우 단일 콜로니를 10 ml의 TSB에 접종하여 25℃ 배양기에서 24시간 간격으로 세 번 계대배양하였다.

10ml의 TSB에서 배양한 식품 유래 미생물을 TSA에 각각 10㎕씩 점접종하고 층류 생물안전 캐비닛 후드(laminar flow biosafety cabinet hood)에서 15분 내지 30분 동안 건조한 후, 25℃ 배양기에서 24시간 동안 정치 배양하였다.

토양에서 분리한 미생물의 경우 점접종 3일 배양 후, 식품에서 분리한 미생물의 경우는 점접종 24 시간 배양 후, 45℃로 유지한 molten TSA 99 ml와 1ml의 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7 10⁷ CFU/ml을 혼합하여 10⁵ CFU/ml의 균을 포함하는 100ml의 agar를 준비하였다. 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7이 혼합된 agar를 균주가 자란 TSA에 10ml씩 분주하였다.

이 agar plate를 층류 생물안전 캐비닛 후드(laminar flow biosafety cabinet hood)에서 30분 동안 건조한 후, 37℃에서 24시간 배양하여 저해환의 크기를 확인하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보는 바와 같이, agar plate에 형성된 저해환의 직경을 측정한 결과, 식품으로부터 분리한 길항미생물에 의한 저해환의 직경이 1.2 cm로 크게 나타나는 것을 확인하였다.

[실시예 2] 길항 미생물의 동정

장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대해 항균력을 보인 길항 미생물(Lettuce-19)을 TSA 배지에 획선 도말하여 25℃에서 2일 동안 정치 배양한 뒤, 16S rRNA 유전자 서열 분석(Macrogen, KR)을 의뢰한 결과, SEQ ID NO: 1(도 2)의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다. 16S rRNA 유전자 서열정보는 미국 국립생물공학정보센터 (National Center for Biotechnology Information)의 blast 분석 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 통해 균을 동정하였다. 동정 결과 이 미생물은 슈도모나스 속(Pseudomonas spp.)일 가능성이 99%인 것으로 확인되었다.

이 슈도모나스 속(Pseudomonas spp.)의 종명을 확인하기 위하여, 계통도(phylogenetic tree)를 그려 분석하였다. 계통도는 분석된 16S rRNA 유전자 서열정보를 Mega software(version 5.05)의 neighbor-joining 방법으로 도시한 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, Pseudomonas veronii strain CIP 104663^T의 유전자 서열정보와 유사한 것으로 확인되어 슈도모나스 베로니 균주와 가장 높은 분자계통학적 유연 관계를 보였다. 따라서, 상기 균주를 슈도모나스 베로니 균주(P. veronii strain) KACC 81051BP으로 명명하였다.

[ 실시예 3] 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP의 바이오필름 형성 능력 확인

상기 실시예를 통해 식품에서 분리한 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP (P. veronii strain KACC 81051BP)의 단일 콜로니를 10ml의 TSB 배지에 접종하여 25℃ 배양기에서 48시간 간격으로 세 번 계대배양하였다.

10ml TSB에서 48시간 동안 배양한 P. veronii strain KACC 81051BP 배양액을 2,002 rcf로 원심분리한 후, 1ml의 현탁액 (약 9 log CFU/ml)을 99ml의 PBS(phosphate buffer saline)를 이용하여 100배로 희석하고, 동일한 방법으로 한번 더 희석하여 최종적으로 5 log CFU/ml의 P. veronii strain KACC 81051BP 현탁액을 준비하였다.

이렇게 준비한 현탁액을 스테인리스 스틸 쿠폰에 멸균된 스프레이를 이용하여 분사한 후, 1시간 동안 laminar flow biosafety hood에서 건조시킴으로써 쿠폰 표면에 단순 부착시킨 후, 스테인리스 스틸 쿠폰을 400 ml의 증류수로 세척함으로써 스테인리스 스틸 쿠폰 표면에 부착되지 않은 cells을 제거하였다.

P. veronii strain KACC 81051BP의 cells이 부착된 쿠폰에 4ml의 TSB를 공급하고 25℃ 배양기에서 최대 120시간 동안 저장하였고, 저장 24시간 마다 P. veronii strain KACC 81051BP의 개체수를 확인하여 바이오필름 형성 능력을 확인하였다. 이때, 스테인리스 스틸 표면에서 P. veronii strain KACC 81051BP의 개체수가 유의적으로 증가한 경우에 바이오필름이 형성되었다고 판단하였다. 도 4에 바이오필름이 형성되는 성장 곡선을 나타내었다.

25℃에서 최대 120시간동안 저장하여 스테인리스 스틸에서 P. veronii strain KACC 81051BP의 개체수를 확인한 결과(도 4), 스테인리스 스틸에 부착된 P. veronii strain KACC 81051BP의 초기 개체수는 2.9 log CFU/coupon이었고, 저장 24시간 만에 유의적으로 증가하였고, 저장 48시간 이후에는 8.7 log CFU/coupon까지 증가하였으나, 그 이후에는 개체수가 유지되었다. 이러한 결과는 TSB를 공급해준 후 25℃에 저장하는 동안에 P. veronii strain KACC 81051BP이 스테인리스 스틸 표면에 바이오필름을 형성할 수 있다는 것을 의미한다.

[ 실시예 4] 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP의 건조 환경 스트레스에 대한 저항성 확인

스테인리스 스틸 표면에 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP(P. veronii strain KACC 81051BP)을 부착시키기 위해, TSB 배지 10 ml에서 48시간 동안 25℃의 온도조건에서 배양된 P. veronii strain KACC 81051BP(약 5 log CFU/ml) 1 ml을 멸균된 스프레이를 이용하여 분사하고, 1시간 동안 건조시키면서 부착하였다.

스테인리스 스틸 표면에 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP (P. veronii strain KACC 81051BP)의 바이오필름을 형성시키기 위해, TSB 배지 10 ml에서 48시간 동안 25℃의 온도조건에서 배양된 P. veronii strain KACC 81051BP (약 5 log CFU/ml) 1 ml을 멸균된 스프레이로 분사하고 1시간 동안 건조시킨 후, TSB 배지 4 ml를 공급하여 25℃에서 5일 동안 저장하였다.

P. veronii strain KACC 81051BP이 단순 부착되었거나 또는 바이오필름이 형성된 스테인리스 스틸 쿠폰은 25℃, 43%의 상대습도 조건에서 5일 동안 저장하였고, 저장 24시간 마다 P. veronii strain KACC 81051BP의 개체수를 확인하였다. 그 결과를 도 5에 그래프로 나타내었다. 이때, 도 5에서 ○는 스테인리스 스틸 쿠폰에 단순 부착된 P. veronii strain KACC 81051BP을, □는 스테인리스 스틸 쿠폰 위에 바이오필름을 형성한 P. veronii strain KACC 81051BP을 의미한다.

그 결과, P. veronii strain KACC 81051BP이 단순 부착된 경우에는 그 개체수가 저장 96시간 이내 이론적 검출한계 (theoretical detection limit; 1.5 log CFU/coupon)이하로 감소하였지만, 바이오필름을 형성한 경우에는 그 개체수가 5.7 log CFU/coupon으로 유지되었다. 이러한 결과들은 테스트된 P. veronii strain KACC 81051BP이 스테인리스 스틸 표면에 바이오필름을 형성할 경우, 건조 환경에 대한 저항성이 증가한다는 것을 의미한다.

[실시예 5] 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP의 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대한 저감화 효과 확인

실시예 4와 동일한 방법으로 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP (P. veronii strain KACC 81051BP)의 바이오필름이 형성된 스테인리스 스틸 쿠폰을 준비한 후, E. coli O157:H7 현탁액을 0.1ml(약 5 log CFU/ml) 취하여 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP의 바이오필름을 포함한 또는 포함하지 않은 스테인리스 스틸 쿠폰 위에 18±2 drops 정도로 점접종(spot-inoculation)하였다. 그 후, 43%의 상대습도와 25℃의 온도조건에서 48시간 동안 저장하였고, 저장 0, 3, 6, 12, 24, 그리고 48시간 마다 E. coli O157:H7의 개체수를 확인하였다. 그 결과를 도 6에 그래프로 나타내었다. 이때, 도 6에서 ○는 P. veronii strain KACC 81051BP의 바이오필름을 포함하지 않는 스테인리스 스틸 쿠폰에 접종된 E. coli O157:H7를, □는 P. veronii strain KACC 81051BP의 바이오필름을 포함하는 스테인리스 스틸 쿠폰에 접종된 E. coli O157:H7를 의미한다.

실험 결과, 접종된 E. coli O157:H7의 초기 개체수는 4.1 log CFU/coupon이었다. 바이오필름을 형성하지 않은 스테인리스 스틸 쿠폰의 표면에 존재하는 E. coli O157:H7의 개체수는 저장 48시간 후에도 2.7 log CFU/coupon이 남아있었다. 반면에 P. veronii strain KACC 81051BP가 형성한 바이오필름을 포함하고 있는 스테인리스 스틸 쿠폰에 접종된 E. coli O157:H7가 더 빠르게 사멸하는 것을 확인하였다. 즉, P. veronii strain KACC 81051BP이 형성한 바이오필름에 노출된 E. coli O157:H7의 개체수는 저장시간 동안 유의적으로 감소하여, 저장 24시간 이내에 이론적 검출한계 (theoretical detection limit; 1.5 log CFU/coupon) 미만으로 감소되었다. 이를 통해 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP의 E. coli O157:H7에 대한 강한 살균력을 확인할 수 있었다.

국립농업과학원

KACC81051BP

20170822

<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> Pseudomonas veronii strain KACC 81051BP and composition for comprising the same <130> P17U13C1133 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1479 <212> RNA <213> Pseudomonas veronii strain Lettuce-19 <400> 1 ccctgctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc ggtagagaga 60 agcttgcttc tcttgagagc ggcggacggg tgagtaatgc ctaggaatct gcctggtagt 120 gggggataac gttcggaaac ggacgctaat accgcatacg tcctacggga gaaagcaggg 180 gaccttcggg ccttgcgcta tcagatgagc ctaggtcgga ttagctagtt ggtgaggtaa 240 tggctcacca aggcgacgat ccgtaactgg tctgagagga tgatcagtca cactggaact 300 gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca atgggcgaaa 360 gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggtcttcg gattgtaaag cactttaagt 420 tgggaggaag ggcagttacc taatacgtga ttgttttgac gttaccgaca gaataagcac 480 cggctaactc tgtgccagca gccgcggtaa tacagagggt gcaagcgtta atcggaatta 540 ctgggcgtaa agcgcgcgta ggtggttagt taagttggat gtgaaatccc cgggctcaac 600 ctgggaactg cattcaaaac tgactgacta gagtatggta gagggtggtg gaatttcctg 660 tgtagcggtg aaatgcgtag atataggaag gaacaccagt ggcgaaggcg accacctgga 720 ctgatactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag 780 tccacgccgt aaacgatgtc aactagccgt tgggagcctt gagctcttag tggcgcagct 840 aacgcattaa gttgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga 900 cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 960 ccaggccttg acatccaatg aactttctag agatagattg gtgccttcgg gaacattgag 1020 acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgtaac 1080 gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagca cgtaatggtg ggcactctaa ggagactgcc 1140 ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat catggccctt acggcctggg 1200 ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaga gggttgccaa gccgcgaggt ggagctaatc 1260 ccagaaaacc gatcgtagtc cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga agtcggaatc 1320 gctagtaatc gcgaatcaga atgtcgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1380 ccgtcacacc atgggaagtg ggttgcacca gaagtagcta gtctaacctt cggggggacg 1440 gttaccacgg tgtgattcat gactggggtg aagtctaaa 1479

Claims

수탁번호 KACC 81051BP의 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii) 균주.
슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP(Pseudomonas veronii strain KACC 81051BP), 이의 배양물, 이의 추출물 또는 이의 현탁물을 유효성분으로 포함하는, 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대한 항균용 조성물.
슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP(Pseudomonas veronii strain KACC 81051BP), 이의 배양물, 이의 추출물 또는 이의 현탁물을 포함하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물.
슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP(Pseudomonas veronii strain KACC 81051BP), 이의 배양물, 이의 추출물 또는 이의 현탁물을 포함하는, 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대한 생물학적 방제제.
제4항의 방제제를 가축, 축사 또는 그 부근에 처리하는 단계를 포함하는, 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7의 활성 억제 방법.
슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP(Pseudomonas veronii strain KACC 81051BP), 이의 배양물, 이의 추출물 또는 이의 현탁물을 표면에 처리하는 단계를 포함하는, 표면의 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7의 항균처리 방법.
제6항에 있어서,
표면에 처리하는 단계는 슈도모나스 베로니 균주 KACC 81051BP(Pseudomonas veronii strain KACC 81051BP), 이의 배양물, 이의 추출물 또는 이의 현탁물을 표면에 분사하여 배양하는 단계를 추가로 포함하는 표면의 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대한 항균처리 방법.
제7항에 있어서,
분사 후 20℃ 내지 30℃에서 6 내지 120시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 표면의 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대한 항균처리 방법.
제6항에 있어서,
표면은 스테인리스 스틸, 유리, 나무, 비닐, 플라스틱, 고무 및 타일류로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 표면의 장출혈성 대장균(E. coli) O157:H7에 대한 항균처리 방법.