KR101922961B1 - 갈변 현상이 억제된 유자박 음료 및 그의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 갈변 현상이 억제된 유자박 음료의 제조 방법에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 유자박 젖산 발효액에서 분리한 다당 분획(G-1)을 포함함으로써 갈변 현상이 억제되고, 기능성이 증대된 유자박 음료 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 유자박을 재활용하는 한편 갈변 현상이 억제되고 항산화능을 포함하는 기능성이 부가된 유자박 음료를 제공함으로써 자원의 재활용 및 농업기업의 소득을 증대시킬 수 있다.

Description

갈변 현상이 억제된 유자박 음료 및 그의 제조 방법{Process for preparing beverage comprising lactate fermented citron pomace with anti-browing properties}
본 발명은 갈변 현상이 억제된 유자박 음료의 제조 방법에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 유자박 젖산 발효액에서 분리한 다당 분획(G-1)을 포함함으로써 갈변 현상이 억제되고, 기능성이 증대된 유자박 음료 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
유자(yuza, Citrus junos SIEBex TANAKA)는 특유의 신맛과 향기를 갖고, 섬유질, 비타민, 항산화 물질 등으로 인해 건강 증진의 목적으로 유자청 및 쥬스 등의 음료로 이용되어 왔다(참조문헌: Kim 1997; Man and Hyun 2003).
그러나, 항산화 물질은 생과의 수확, 전처리(fresh-cut fruit), 착즙 및 저장 등 가공 저장과정에서 많은 변화를 가져온다. 이 변화는 항산화 품질 및 미생물학적 손상을 유발하게 된다(참조문헌: Irina I and Mohamed G. 2013). 그러므로 가공 및 저장 중에 발생하는 산화를 막는 것이 식품 산업에서 매우 중요하다(참조문헌: Koo HN et al., 2006).
산화는 미생물의 오염에 의한 부패 다음으로 식품의 품질을 저하시키는 중요한 요인이다. 그 중 가장 주된 산화 반응은 효소에 의한 갈변이다. 이 산화 반응은 polyphenoloxidase(PPO)와 peroxydase(POD) 같은 두 산화환원 효소에 의해 일어난다. PPO는 모노페놀을 디페놀로 히드록시화시켜 탈색 화합물을 천천히 형성하는 반면, POD는 디페놀을 퀴논으로 빠르게 전환시켜 붉은색의 화합물을 만든다(참조문헌: Queiroz, et al., 2008). 이 반응은 액포(vacuole)에 있는 페놀성 화합물과 cytoplasm에 있는 효소가 산소의 존재 하에서 섞일 때(절단, 마쇄, 보호막의 손실 등 물리적 작용) 만 일어난다. 이 갈변 반응에 의해 향기, 맛 및 영양적 가치의 손실이 나타난다(참조문헌: Toivonen and Brummell, 2008). 이 반응을 피하기 위한 방법으로는 polyphenol oxidase(PPO)를 불활성화시키거나 항산화제를 첨가하여 효소와 기질이 섞이지 않도록 하는 방법이 있다. 절단, 마쇄, 착즙 및 당침 등 일련의 물리적 shock에 의해 유자청 및 착즙액은 이 갈변현상에 매우 취약한 조건에 처해진다. 그러나 유자 착즙의 갈변 방지에 대한 연구는 거의 이루어지고 있지 않다.
한국 공개특허공보 제10-2010-0063884호(공개일자 2010년 06월 14일)에는 유자청을 이용한 유자음료 제조방법이 개시되어 있는데, 이는 원료 유자를 수세한 다음 과피, 과육, 씨 등으로 분리 절단한 후 설탕 등을 첨가하여 유자청을 제조하고 이를 이용하여 85℃~100℃에서 1~3시간 정제수와 교반 한 후 1차 여과 공정을 거쳐 95℃~99℃에서 살균 후 1㎛로 2차 여과 공정을 거치는 단계를 포함하나 갈변 현상의 억제에 관한 고려는 없다.
한국 공개특허공보 제10-2010-0063884호(공개일자 2010년 06월 14일)
Toivonen PMA. and Brummell DA. (2008). Biochemical bases of appearance and texture changes in fresh-cut fruit and vegetables. Postharvest Biology and Technology, 48:1-14.
지금까지 착즙 후 남은 유자박은 비료나 거름으로 이용되어 왔으나 본 발명자들은 이러한 유자박을 재활용하기 위한 방안을 찾기 위하여 예의 연구하던 중, 유자박을 젖산 발효시켜 본 결과 얻어진 발효액이 갈변 현상이 억제될 뿐만 아니라 항산화 활성을 비롯한 기능성을 갖는 것을 확인함으로써 유자박이 기능성 음료의 제조에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 목적은 착즙 후 남은 유자박을 이용하여 젖산 발효시켜 얻어진 발효액 및 발효액 중에 포함된 다당류를 주요 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 갈변 현상이 억제되고 항산화 활성을 지닌 유자박 음료 및 그의 제조 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명에 의하면 유자박을 재활용하는 한편 갈변현상이 억제되고 항산화능을 포함하는 기능성이 부가된 유자박 음료를 제공함으로써 자원의 재활용 및 농업기업의 소득을 증대시킬 수 있다.
도 1은 SDS-PAGE에 의해 계산된 G-1 분획의 분자량을 나타내는 사진이다.
도 2는 정제 단계에 의해 얻어진 다당분획 G-1의 박층 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 정제된 다당 분획 G-1의 아이오딘 산화 결과를 나타내는 그라프도이다.
도 4는 장기간 저장 동안 갈변의 변화를 나타내는 사진이다.
본 발명은, 일면에 있어서, 유자박 젖산 발효액에서 분리한 다당 분획을 주성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 갈변 현상이 억제된 유자박 음료를 제공한다.
본 발명은, 추가의 일면에 있어서,
상기 다당 분획은 분자량이 15,000 Da이고, 83~84개의 포도당으로 이루어지고, 1→6 분지를 가지는 β-1,4 glucan인 것을 특징으로 하는 갈변 현상이 억제된 유자박 음료를 제공한다.
본 발명은 다른 추가의 일면에 있어서,
상기 젖산 발효액은 Lactobacillus plantrum GAVOL-07(KCCM 11852P)을 MRS 액체 배지에 1 백금이를 접종하고 30℃에서 48시간 배양한 후 유자박 액상화 발효를 위한 스타터(starter)로 사용하고, 유자 박 1Kg에 정제수 300g를 첨가한 후 75℃에서 10분간 가열 살균을 시행하여 유자박 용액을 준비한 후, 스타터로 사용된 Lactobacillus plantrum GAVOL-07을 생리 식염수에 희석하여 8.0 log cfu/㎖를 상기 유자박 용액에 접종하고 35℃에서 48시간 배양하고, 배양이 완료된 배양물을 프레스 여과에 의해 잔사를 제거한 후 액상으로 얻은 것을 특징으로 하는 갈변 현상이 억제된 유자박 음료를 제공한다.
본 발명은, 다른 추가의 일면에 있어서,
상기 다당 분획은 유자박 젖산 발효액에 메탄올을 첨가하여 결정성을 갖는 다당 분획은 분리한 후, 잔존하는 유리 단백질을 분리하고 활성탄 컬럼 크로마토그래피에 의해 용출된 분획을 감압 농축하여 얻는 것을 특징으로 하는 갈변 현상이 억제된 유자박 음료를 제공한다.
이하, 본 발명에 따른 갈변 현상이 억제된 유자박 음료 및 그의 제조 방법에 대하여 첨부 도면을 참조하여 상세히 설명한다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정 해석되지 아니하며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시 예에 불과할 뿐이므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명자들은 갈변 억제 효과를 가지는 유자박 젖산 발효물을 첨가하여 영양성, 기능성이 증진되고, 저장성을 증대시켜 새로운 개념의 유자 음료를 개발하고자, 유자박 액상화 젖산 발효물의 갈변 억제 효과를 측정하고, 갈변 억제에 직접적인 영향을 미치는 성분을 분리 정제하였다.
그 결과, 섬유질 분해성 젖산균 Lactobacillus plantrum GAVOL-07 (KCCM11852P)을 이용한 유자박 발효물을 단백질 제거, 활성탄 컬럼 크로마토그래피를 행하여 60.26%의 PPO 저해 활성을 갖는 50% ethanol desorption 분획 G-1(수율: 3.51%(w/w))을 분리하였다.
이 분획은 1→6 분지를 가지는 β-1,4 glucan(분자량: 15,000 Da)인 것으로 판단되었다.
또한, G-1이 포함된 발효 유자박이 실제 제품에서 갈변억제 작용 여부를 판단하기 위하여 유자박 발효액이 첨가된(20%) 유자청을 제조하여 갈변 여부를 확인해 본바, 60일간 35℃에서 저장 60일까지 색의 변화가 천천히 일어났으며, 68.46%의 갈변 저하를 보여 산업적, 환경적으로 유용한 소재로의 전환 가능성을 확인하였다.
이하, 본 발명에 따른 유자박의 젖산 발효를 이용한 기능성 음료 및 그의 제조 방법에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.
유자의 갈변현상에 관련하여 단지 온도 및 용존산소의 양이 증가하면 갈변 현상이 증가하고, furfural 같은 일부 물질이 유자 쥬스의 갈변현상에 관여한다는 Sawamura 등의 보고(참조문헌: Saawamura M, et al., 1989, 1991) 외에는 그 예를 찾아 보기 어렵다.
유자를 비롯한 과일 쥬스의 갈변 현상을 막기 위해 ascorbic acid, glutathion, N-acetyl cystein 같은 항산화제(참조문헌: Oms-Oliu, Aguilo-Aguayo & Martin-Belloso, 2006; Arias, Gonzalez, Oria & Lopez-Buesa, 2007), EDTA, citric acid 같은 chelating agent(참조문헌: Du, Dou & Wu, 2012), pH를 3 이하로 조절하는 citric acid, erythorbic acid, ascorbic acid 같은 acidifying agent(참조문헌: Grimmet al., 2012)가 전통적으로 사용되어 왔으나, 최근 천연 갈변 저해제에 대한 관심의 증가로 감귤 과피, 양파(참조문헌: Chang et al., 2011) 등 추출물의 갈변 저해 효과에 대한 보고가 있으나, 이는 일부 과일의 신선 편이에 국한되어 있다. 또한, 이러한 천연 추출물의 사용시 유자 쥬스 본연의 맛, 향 및 색을 손상할 수 있어 적용하기 어려운 단점 및 과량의 당을 첨가하여 당침 유자청을 제조하는 유자의 경우 효소 반응 이외의 비효소 갈변 반응을 막을 수 없다는 단점이 있다.
최근 새로운 항산화제의 개발 방법은 젖산 발효를 통하여 과일 쥬스나 차의 항산화 활성을 향상시키는 방법과 새로운 항산화 물질로 식물 및 미생물 다당을 이용하는 방법이 주목받고 있다. Filannino P등, Hur SJ 등, Ng CC 등은 과일의 젖산발효시 항산화 효과가 증가하였다고 보고하였고(참조문헌: Filannino P. et al., 2013, Hur SJ. et al., 2014, Ng CC et al., 2011, Beena et al.).
젖산 발효 동안에 박테리오신, exo-polysaccharide 등의 물질을 생산하여 항산화 활성이 증가한다고 Divya J 등이 보고하였다(참조문헌: Div J et al. 2012).
Zhang 등은 다당의 구조 및 분자량에 따라 산화효소의 활성 및 래디칼 분해능에 영향을 미친다고 보고하였으며(참조문헌: Zhang et al., 2004), Wang 등은 배수오 다당이 타이로시나아제(tyrosinase)의 가역적 억제제(reversible inhibitor)로서 색소침착 억제제(hyperpigmentation inhibitor)로 이용될 수 있으며, 또한 안전하고 효과적인 식품 갈변 억제제(food browning inhibition agent)로 이용될 수 있다고 보고하였다. 이와 같이 젖산 발효에 의해 생성된 다당을 비롯한 성분이 항산화 및 갈변 억제에 유용함이 주목되고 있다.
본 발명자들은 유자청 및 유자 착즙액을 제조한 후 폐기되는 유자박을 섬유질 분해능을 가지는 유산균 Lactobacillus plantarum GAVOL-07로 발효하여 영양성분 및 기능성 성분이 증가된 액상 식품으로 전환하였다.
본 발명에서는 유자박 액상화 젖산 발효물의 갈변 억제 효과를 측정하고, 갈변 억제에 직접적인 영향을 미치는 성분을 분리 정제하였다. 갈변 억제 효과를 가지는 유자박 젖산 발효물을 첨가하여 영양성, 기능성이 증진되고, 저장성을 증대시켜 새로운 개념의 유자 음료를 개발하고자 하였다.
배양이 완료된 발효 음료(발효물)는 필터 프레스로 여과한 후, 얻어진 여액에는 필요에 따라 첨가제 배합하는 것이 상품성이나 소비자에게 더욱 기호성을 높일 수 있다.
얻어진 발효 원액은 소비자의 기호도에 맞는 식품 첨가제를 배합하여 기호도를 더욱 증대시키는 것이 바람직할 수 있다.
식품 첨가제는 최종 제품의 형태에 따라 통상의 보조제 또는 감미료, 예를 들면 아스코르브산, 시스테인, 감초, 맥류약엽분말, 서양산사자추출물, 세인트존스워트, 셀레늄효모, 비타민 B1, 비타민 C, 구연산, 니코틴산, 안식향 산나트륨, 아스파탐, 사카린, 펙틴, 말리톨, 솔비톨, 자일리톨, 구아검, 사과산, 타우린, 바이오틴, 액상과당, 탈지분유 및 올리고당으로 이루어진 군중에서 선택되는 하나 이상의 성분을 추가하여 기호도나 미감을 증대시킬 수 있다. 이들은 본 발명의 제품의 전체 중량을 기준으로 약 0.01~40 중량%로 사용하는 것이 적절하다.
음료는, 예를 들면, 상기 발효액 0.01~20 중량%, 감초 0.01~2 중량%, 구연산을 0.01~2 중량%, 사과산 0.01~2 중량%, 타우린 0.1∼2 중량%, 비타민 C 0.01~2 중량%, 비타민 B1 0.01~2 중량%, 바이오틴 0.01~2 중량%, 액상과당 0.01~2 중량% 등을 단독 또는 혼합하여 첨가하여 제조할 수 있다.
첨가제를 첨가한 후 얻어진 음료(배합물)은 85~95℃의 온도에서 7~12 분 동안 살균 처리한 후, 규격에 따라 포장하여 음료 제품을 제조한다.
본 발명에 따른 음료의 제형은, 당해 분야에서의 통상적인 방법에 따라, 예를 들면 유자청, 쥬스, 파우치제, 또는 드링크제 등의 음료의 형태로 제형화시켜 사용할 수 있다.
< 실시예 >
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명하다.
이후, 실시예 및 시험예에서 사용한 유자 박은 전남 나주 소재 (주)가보팜스에서 당침 후 착즙 여과한 박을 -20℃에서 저장 보관하면서 사용하였으며, 발효 유산균은 Lactobacillus plantarum GAVOL-07(수탁번호 KCCM 11852P)을 사용하였다.
실시예 1: 유자박 젖산 발효물의 제조
섬유질 분해능이 뛰어난 젓산균 Lactobacillus plantrum GAVOL-07(KCCM 11852P)을 MRS 액체 배지에 1 백금이를 접종하고 30℃에서 48시간 배양한 후 유자박 액상화 발효를 위한 스타터(starter)로 사용하였다. 유자 박 1Kg에 정제수 300g를 첨가한 후 75℃에서 10분간 가열 살균을 시행하여 유자박 용액을 준비하였다. 스타터로 사용된 Lactobacillus plantrum GAVOL-07을 생리 식염수에 희석하여 8.0 log cfu/㎖를 상기 유자박 용액에 접종하고 35℃에서 48시간 배양하였다. 배양이 완료된 배양물을 프레스 여과에 의해 잔사를 제거한 후 유자박 액상 발효물을 얻었다.
실시예 2: 세포외 다당의 분리 정제
(1) 잔존 단백질의 제거
실시예 1에서 얻어진 유자박 발효액 1L에 0℃ 냉각 메탄올을 첨가하여 결정성을 갖는 다당 분획을 분리하였다. 분리된 분획을 동결건조하여 -20℃에서 보관하면서 사용하였다. 건조 다당 분획에 Sevage method(참조문헌: Staub AM, 1965)를 사용하여 잔존하는 free protein을 제거하였다. 동결건조 메탄올 불용성 분말 10g을 증류수 100ml에 용해시키고, 3배 부피의 CHCl3 : n-BuOH (4:1 부피비) 용매로 분획 유기 용매층에 존재하는 잔존 단백질을 제거하였다.
(2) 활성탄 컬럼 크로마토그래피
충진 전 활성 charcoal(granular form, x 1.5 mm, Merck, Darmastadt, Germany) 200g을 200 ml 0.5% 아세트산 및 증류수로 세척하고 멸균 처리하였다. 멸균 처리된 활성 charcoal을 column glass(60cm x 5cm)에 충진하였다.
단백질을 제거한 methanol 불용성 분말 10g을 멸균 증류수 10 ml에 용해하고 활성 charcoal column 상부에 loading하고 용출 용매로 멸균 증류수를 사용하여 흡착시켰다. 활성 charcoal과 정제 시료의 흡착이 평형화될 때까지 이 과정을 반복하였다. 충진 활성 charcoal의 5배량의 Mili-Q 순수수를 회수(withdrawn)하여 비 흡착당 분획을 용출하였다(분획 1).
비 흡착당을 제거한 후 에탄올 농도를 10%, 20%, 30%, 50%로 순차적으로 상승시키면서 흡착된 당을 탈착 용출시켰다(분획 2 ~ 5). 용출된 1 ~ 5의 분획을 60℃에서 감압 농축하였다. 감압 농축된 각각의 분획 중 항산화 활성을 나타내는 분획 5를 분리하였다.
PPO 저해 활성을 갖는 활성 분획의 정제 수율 및 PPO 저해 활성을 표 1에 나타내었다.
Figure 112017089159396-pat00001
각 단계를 거쳐 50% ethanol desorption 분획의 최종 수율은 3.51%(w/w)였으며, PPO 활성을 60.26% 저해하여 발효액에 비해 현저히 증가하였다.
삭제
활성 charcoal과의 흡착 정도가 강한 분획에서 항산화 활성이 우수하였다. 통상적으로, 활성 charcoal과 당류의 흡착정도는 당류의 분자량과 직접적이 관련이 있다고 알려져 있다(참조문헌: Hung YT et al., 2005). Charcoal의 표면은 비극성 또는 소수성 성질을 갖고 있으므로 소수성이 높은 당류 일수록 흡착도가 증가한다. 당류의 소수성은 표면의 CH group의 정도와 관계가 있고 당류의 크기가 클수록 CH group의 수가 많아지고 이로 인해 소수성의 정도가 커진다(참조문헌: Sundari CS and Balasubramanian D. 1997). Whistler, R.L. and Durso(1950)은 단당류는 5~10% ethanol 농도에서 탈착이 일어나며, Morales등(2006)은 올리고당은 15~50% ethanol 농도에서 탈착이 일어난다는 보고에서와 같이 50% ethanol 농도에서 탈착이 이루어진 활성당류는 올리고당 이상의 분자량을 가진 당류로 판단하고 G-1이라 명명하였다. 또한, 다당의 항산화 활성은 구조와 분자량과 직접적인 관련이 있다는 Yang 등(2008)의 보고와 유사하였다. 반면, pigment, flavone, protein, phenol이 복합되지 않은 정제 다당의 경우 항산화 활성이 감소한다는 Wang 등의 review와는 대치되는 결과를 보였다.
실시예 3: 활성분획의 분자량의 결정
활성 분획 5(G-1 분획이라고도 함)의 분자량은 glycosaminoglycans의 분석에 적용된 Hallenbeck(1987)의 방법을 사용하여 SDS PAGE-electrophoresis를 행하여 결정하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1은 SDS-PAGE에 의해 계산된 G-1 분획의 분자량을 나타내는 사진이다. (A) Lanes: Marker, 분자량 마커; 1, 정제 다당 분획 G-1.
정제 G-1은 단일 성분임을 확인하였고, 분자량은 15,000Da이였다.
실시예 4: 활성 분획의 성분 분석
용액 (1 mg/ml) 1 mL와 5% phenol 1 mL가 든 시험관에 5 mL의 c-H2SO4를 가하고 30분간 교반 후 490 nm에서 흡광도를 측정하여 표준곡선으로부터 당의 양을 측정하였다.
시료 1g에 차게 냉각시킨 77.0 % sulfuric acid 10 ml을 얼음 수조에서 천천히 첨가하고 -5℃에서 14시간 동안 팽윤시킨 후 25% 황산 10 ml을 첨가하고 55℃에서 2시간 동안 가수분해한 후 barium hydroxide 30 mg를 첨가하여 중화시킨 후 여과하고, 여과물을 cellulose 투석막 이용하여 24시간 동안 잔존 산과 염기를 제거하였다.
분해물의 분석은 TLC(acetonitrile: ethylacetate:1-propanol:water = 85: 20: 60: 50, v/v/v)를 사용하여 분석하였다.
실시예 5: 구성 당의 구조 결정
정제 다당(G-1)을 구성하는 단당류의 구조는 glycosidic 결합의 패턴을 아이오딘 산화법(periodate oxidation)에 의해 조사하여 결정하였다.
정제 다당 100mg을 10 mM sodium metaperiodate 100 mL에 첨가하고 25℃ 냉암소에서 7일간 반응시켰다. 일정 간격으로 시료를 취하여 1ml 0.1M barium acetate를 첨가하고 침전물을 여과를 통하여 제거하였다. 여과액의 periodate(IO4 -)의 감소를 분광학적 방법으로 225nm에서 측정하였다. 동시에 0.5% phenolphthalein이 포함된 1 mM NaOH 용액으로 적정하면서 formic acid의 생성을 측정하였다(참조문헌: Park YS and Chang HG. (2007)
0.1g sodium borohydride와 12시간 반응 후 과량의 regent는 0.1 N HCl로 중화 후 24시간 투석 후 생성된 formic acid를 아래의 식에 의해 환산하였다.
포름산 생성(Mole)= (A x B x C)/(D x 1,000)(여기서, A: The amount of consumed alkali (mL), B: The concentration of alkali used (N), C: Total amount of sample (mL), D: The amount of sample used (mL)]
실시예 6: Polyphenol Oxidase ( PPO ) 활성 측정
PPO의 활성 측정은 50 mM phosphate buffer(pH 6.5) 1.7 ㎖와 PPO (500 units/㎎) 0.2 ㎖를 혼합한 후 0.5% 농도의 각각의 시료를 0.1 ㎖를 첨가하여 25℃로 조절된 항온 수조에서 15분간 방치하고 기질로서 4 mM catechin 용액 1 ㎖를 각각 첨가하고, UV/Vis spectrometer를 이용하여 420nm에서 5분간의 변화를 측정하였다. 효소 저해활성은 흡광도 감소량을 %로 나타내었다(참조문헌: Dennis & Miller, 1998).
PPO 활성의 억제(%)=[1－(A/B)]×100(A: sample의 흡광도, B: blank solution의 흡광도)
c-H2SO4으로 산 분해 후 TLC를 사용하여 분석한 결과를 도 2에 나타냈다. 도 2는 정제 단계에 의해 얻어진 다당분획 G-1의 박층 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 사진이다. 점들은 당류 검출을 위하여 아니스알데하이드 설페이트를 사용하여 가시화하였다. (A)line: Methanol precipitation, (B) line: active carbon column chromatography 50% desorption, (C) line: acid hydrolysis. (a), (b), (c) 및 (d)는 표준 단당류, 글루코오스, 푸락토오스, 갈락토오스이다. G-1을 구성하는 단당은 glucose임을 확인하였다. 이 결과로부터 83~84개의 포도당이 결합된 glucan임을 확인하였다.
정제 다당(G-1)을 구성하는 단당류의 구조는 glycosidic 결합의 패턴을 아이오딘 산화법(periodate oxidation)에 의하여 측정한 결과 도 3에 나타낸 바와 같이 G-1은 periodate(IO4 -) 감소와 formic acid 생성을 같은 양상으로 나타났으며, 반응 2일 후에 일정한 값에 도달하였다. 도 3은 정제된 다당 분획 G-1의 아이오딘 산화 결과를 나타내는 그라프도이다. (-●-) : 포름산 생성, (-■-):periodate(IO4 -) 감소.
periodate(IO-4) 감소량과 formic acid 생성량을 몰비로 환산한 결과, 몰비는 약 3.5 : 1이었다. 이 결과는 1→6 분지를 가지는 1→4 glucan으로 판명되었다. 산화물이 1,4-glucan이고 1→5 분지일 경우에는 IO4 - 소비량과 formic acid의 생성량의 몰 비가 2:1이고, 직쇄상의 1→4-glucan 및 1→3의 분지를 가지는 glucan의 경우 5:3 및 3:2의 몰비를 가진다(Ryu et al.,2004, Lee et al.,1997).
이상의 결과로부터 Lactobacillus plantarum GAVOL-07 유산균을 이용한 유자박 액상화 발효액으로부터 분리한 갈변억제 효과를 가지는 다당 G-1은 1→6 분지를 가지는 β-1,4 glucan(분자량: 15,000)인 것으로 판단되었다.
실시예 7: 색도 및 갈변도 측정
색도는 표준 백색판으로 보정된 colorimeter(CR-200,Minolta Co., Osaka, Japan)를 이용하여 측정하였으며, 색차를 Hunter scale에 의한 L 값(명도), a 값(적-녹도), b 값(황-청도) 및 색도를 측정하였으며, 갈변도는 표준백판(L=97.40, a=－0.49, b=1.96)으로 보정된 색차계(CR-200, Minolta Co.)를 사용하여 L값을 측정한 후 다음 식으로 계산하여 나타내었다.
△E = (△L2 + △a2 + △b2)1/2
실시예 8: 유자박 발효액 첨가 유자 농축액의 제조
G-1이 포함된 발효 유자박이 실제 제품에서 갈변억제 작용 여부를 판단하기 위하여 유자박 발효액이 첨가된 유자 농축액의 제조하고 60일간 35℃에서 보관하여 갈변 억제 활성을 확인하였다. 유자박 발효액이 첨가된 유자 농축액은 G-1의 양을 환산하여 유자박 발효물을 0, 5, 10, 15, 20, 25%(이하, 부피%를 의미함) 첨가하여 제조하였다.
실시예 9: 유자박 발효액 첨가 유자 농축액의 갈변도 변화
실시예 8에 따라 다양한 농도로 유자박 발효액이 첨가된 유자 농축액을 원광대학교 식품전공 학생 15명을 대상으로 색과 냄새, 전반적인 맛의 기호도를 사전 조사하여 평가가 가장 우수한 20% 첨가 유자농축액의 색변화를 측정하였다. 보다 정확한 평가를 위하여 유자청(A), 유자박 발효물 20% + 유자청(B), 유자박 발효물 20% + 유자청 + cystein+ ascorbic acid(C), 유자청 + cystein + ascorbic acid(D) 4개 군으로 나누어 측정하였다.
G-1이 포함된 발효 유자박이 실제 제품에서 갈변억제 작용 여부를 판단하기 위하여 유자박 발효액이 첨가된(20%) 유자청을 제조하고 60일간 35℃에서 보관는 갈변 억제 활성을 확인하였다.
보다 정확한 평가를 위하여 유자청, 유자박 발효물 20%+유자청, 유자박 발효물 20% +유자청 + ascorbic acid, 유자청+cystein+ ascorbic acid 4개 군으로 나누어 측정한 결과 도 4에 나타내었다. 도 4는 장기간 저장 동안 갈변의 변화를 나타내는 사진이다.
갈변의 정도는 ΔE 값으로 나타낼 수 있으며, 이 값이 클수록 색의 변화가 크게 일어난 것으로 판단할 수 있다. 첨가물 없이 유자청만을 저장시 저장 30일 후 급격한 색의 변화를 유발한 반면, 유자박 발효물 20%를 첨가한 유자청의 경우 저장 60일까지 색의 변화가 천천히 일어났다.
4개군 모두 저장 15일에 급격한 색변화가 1차 일어났다. 이는 유자청의 제조를 위해 첨가된 과량의 당에 의한 현상으로 판단된다. 설탕의 첨가량이 증가할수록 갈변도가 높아진다는 Jin 등(2008)의 보고와 유사함을 알 수 있었으며, 식품 산업에서 통상적으로 사용되는 Ascorbic acid(1%) 및 cystein(0.05%)의 첨가시 무첨가 군에 비해 33.26% 저하에 그친 반면, 유자박 발효물 20% 첨가군은 68.46% 저하를 보여 2.06배 갈변 억제 효과가 있음을 확인하였다. 반면, Ascorbic acid(1%), cystein(0.05%) 및 유자박 발효물 20%를 모두 첨가한 군에서는 유자박 발효물 20%만을 첨가한 군에 비해 갈변 저해 효과가 낮은 것으로 나타났다.
Ascorbic acid는 1.5% 이상 고농도에서 quinone을 형성하고, cystein은 colorless의 quinon을 형성한다는 Hussein 등의 보고를 기준으로 Ascorbic acid 및 cystein의 적정 농도의 선정이 필요할 것으로 판단된다.
이상의 결과로부터 항산화 활성을 갖는 다당을 포함하고 있는 젖산 발효 유자박의 산업적, 환경적으로 유용한 소재로의 전환 가능성을 확인하였다.
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본 특허 출원은 중소벤처기업부와 한국산업기술진흥원의 “지역특화산업육성사업(R&D 과제번호:R0004131)”으로 수행된 연구결과 입니다.
한국미생물보존센터 KCCM11852P 20160629

Claims (4)

  1. 유자박 젖산 발효액에서 분리한 다당 분획을 주성분으로 포함하고,
    상기 다당 분획은 분자량이 15,000 Da이고, 83~84개의 포도당으로 이루어지고, 1→6 분지를 가지는 β-1,4 glucan이며,
    상기 젖산 발효액은 Lactobacillus plantrum GAVOL-07(KCCM 11852P)을 MRS 액체 배지에 1 백금이를 접종하고 30℃에서 48시간 배양한 후 유자박 액상화 발효를 위한 스타터(starter)로 사용하고, 유자 박 1Kg에 정제수 300g를 첨가한 후 75℃에서 10분간 가열 살균을 시행하여 유자박 용액을 준비한 후, 스타터로 사용된 Lactobacillus plantrum GAVOL-07을 생리 식염수에 희석하여 8.0 log cfu/㎖를 상기 유자박 용액에 접종하고 35℃에서 48시간 배양하고, 배양이 완료된 배양물을 프레스 여과에 의해 잔사를 제거한 후 액상으로 얻은 것을 특징으로 하는 갈변 현상이 억제된 유자박 음료.
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