KR101764287B1 - 효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재 및 그 제조방법 - Google Patents

효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재의 제조방법이 개시된다. 본 발명에 따른 효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재의 제조방법은, a) 건조감자유세포를 개별 감자유세포로 분산시키는 단계; b) 감자유세포 분산물을 반응용액과 알파글루칸합성효소를 혼합하여 효소반응시키는 단계; c) 알파글루칸합성효소 처리된 효소반응 혼합물로부터 알파글루칸으로 코팅된 감자유세포를 회수하는 단계; 및 d) 상기 c) 단계에 의해 얻어진 코팅된 감자유세포들을 건조하여 난소화성 건조감자유세포 소제를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 의하면, 생전분 또는 노화전분을 함유하는 건조감자유세포를 알파글루칸합성효소 처리함으로써, 건조감자유세포의 소화특성을 저하시킬 수 있어 기존 건조감자유세포의 대한 소비자들의 저항감을 낮추고 식품산업적 활용도를 높일 수 있을 뿐만 아니라, 건조감자유세포의 추가적인 호화처리를 수반하지 않아 에너지가 절약될 수 있으며 높은 생산량을 얻을 수 있는 효과를 제공할 수 있게 된다.

Description

효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재 및 그 제조방법{NON-DIGESTIBLE DEHYDRATED POTATO PARENCHYMA CELLS BY ENZYMATIC ALPHA-GLUCAN COATING AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}
본 발명은 효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 생전분과 노화전분을 포함하는 건조감자유세포들을 추가적인 호화처리 없이 알파글루칸합성효소를 처리하여 건조감자유세포 표면에 새로운 알파글루칸 분자들을 형성시키고, 이들 사이의 자가조립에 의한 건조감자유세포의 자발적 코팅을 통해 건조감자유세포들의 높은 소화특성을 억제할 수 있는 효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재 및 그 제조방법에 관한 것이다.
감자로부터 제조되는 건조감자소재들인 감자전분, 감자가루, 감자후레이크, 감자다이스, 감자과립은 가공식품 등(스낵류, 프리믹스류 등)의 원료로 널리 활용되고 있다. 그러나 상대적으로 높은 수분함량과 고온, 고압의 가공공정을 수반하는 식품제조공정에 있어 이들 건조감자소재들은 체내의 소화효소들에 의한 높은 소화특성으로 급격한 혈당을 상승시켜 건조감자소재들을 주원료 및 부원료로 활용한 가공식품들은 고혈당반응 식품군으로 분류된다. 그래서 건조감자소재들이나 이들을 활용한 가공식품식품들은 최근 탄수화물 섭취를 조절하거나 제한하여 체중유지와 비만증상을 개선하려는 대중들과 혈당조절이 필수적인 제2형 당뇨병 환자들에게 외면 받고 있는 실정이다.
최근 기존의 건조감자소재들의 소화특성을 개선하기 위해 감자조직으로부터 개별 유세포를 분리하여 건조한 건조감자유세포의 제조방법과 그 소재들이 개발되었다.(대한민국공개특허 제10-2015-127475호 공개일 : 2015.11.17) 개발된 건조감자유세포 소재들은 저 수분 환경(수분함량 50%까지)에서 기존 건조감자소재들에 비해 낮은 소화특성를 나타내었으나, 고 수분 환경에서는 여전히 높은 소화특성을 나타내어 기존 건조감자소재들과 큰 차이를 보이지 않았다. 따라서 건조감자소재들의 산업적 활용성을 증대시키기 위해 이들의 소화특성을 제어할 수 있는 처리방법의 개발이 요구되고 있다.
건조감자소재들의 소화특성을 제어하는 방법으로는 전분분자들 사이에 인산화 가교결합이나 다중카르복시산에 의한 다중에스테르결합을 형성시키는 화학적 변성방법이 가장 대표적이다. 그러나 이러한 화학적 변성반응은 소화특성의 제어에 효과적인 것으로 알려져 있으나 건조감자소재들 중 감자전분에 한해서 적용되고, 다른 건조감자소재들(감자가루, 감자후레이크, 감자다이스, 감자과립)에는 적용되어 상업화된 사례를 찾아볼 수 없다. 또한 감자전분을 이용한 난소화성 가교전분들은 전분원료의 높은 가격으로 국내외서 상업적으로 활용되지 않고 있다.
한편 감자전분과 감자가루를 습열처리(heat-moisture treatment)하여 지소화성 전분(slowly-digestible starch)의 함량을 증대시키는 물리적 변성방법이 있다. 그러나 습열처리된 감자전분과 감자가루들을 호화하지 않을 경우에는 지소화성 전분 함량의 증가가 관찰되지만 호화시킬 경우 기존의 건조감자소재들의 높은 소화특성과 다르지 않거나 더욱 신속한 소화특성을 나타내는 문제점을 가지고 있다.
또한 알파글루칸합성효소를 활용하여 감자전분의 아밀로펙틴 분자의 구조적 변형을 통해 지소화성 및 난소화성 전분 함량을 향상시키는 효소적 변성방법이 최근에 보고되었다. 그러나 알파글루칸합성효소에 의한 감자전분의 효소적 변성을 위해서는 감자전분의 호화가 필수적이기 때문에 효소반응 전 감자전분의 열처리 공정이 추가되고, 호화된 감자전분 페이스트의 높은 점도로 인해 감자전분을 고농도로 사용하기 어려워 반응효율과 생산수율이 낮은 문제점을 보유하고 있다.
. 대한민국공개특허 제10-2015-127475호 공개일 : 2015.11.17
본 발명의 목적은, 생전분 또는 노화전분을 포함하고 있는 건조감자유세포들을 알파글루칸합성효소를 처리하여 건조감자유세포 세포벽 위에 새로운 알파글루칸을 형성시키고, 이들 사이의 자가조립에 의한 건조감자유세포의 자발적 코팅을 통해 건조감자유세포의 소화특성을 제어할 수 있는 처리방법을 제공하고, 이를 활용한 난소화성 건조감자유세포 소재를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적은, 본 발명에 따라, a) 건조감자유세포를 개별 감자유세포로 분산시키는 단계; b) 감자유세포 분산물을 반응용액과 알파글루칸합성효소를 혼합하여 효소반응시키는 단계; c) 알파글루칸합성효소 처리된 효소반응 혼합물로부터 알파글루칸으로 코팅된 감자유세포를 회수하는 단계; 및 d) 상기 c) 단계에 의해 얻어진 코팅된 감자유세포들을 건조하여 난소화성 건조감자유세포 소제를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재의 제조방법에 의해 달성된다.
상기 a) 단계는, a-1) 건조감자유세포에 정제수를 가하여 수화시키는 단계; 및 a-2) 상기 a-1) 단계에서 수화시킨 건조감자유세포를 진탕 또는 교반하여 개발 감자유세포로 분리하는 단개를 더 포함할 수 있다.
상기 a-1) 단계는, 건조감자유세포의 중량대비 5 - 15배의 정제수를 가하여 상온에서 10 - 30분간 수화시키고, 상기 a-2) 단계는, 상기 a-1) 단계에서 수화시킨 건조감자유세포를 효소반응온도에서 10 - 60분 동안 100 - 200 stroke/min으로 진탕하거나, 50-150rpm의 속도로 교반하여 개별 감자유세포로 분리할 수 있다.
상기 b) 단계는, b-1) 자당 용액을 제조하여 개별 감자유세포 분산물에 자당 용액을 가하는 단계; b-2) pH 7.0의 500mM 트리스-염산 완충용액을 제조하여 개별 감자유세포 분산물에 첨가하는 단계; b-3) 상기 b-2) 단계에서 제조된 개별 감자유세포 반응혼합물에 추가로 정제수를 가하여 개별 감자유세포 반응혼합물 내의 감자유세포 농도를 조정하는 단계; 및 b-4) 상기 b-3) 단계에서 제조된 개별 감자유세포 반응혼합물에 알파글루칸효소 용액을 가하여 효소반응하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 b-1) 단계는, 2M의 자당 용액을 제조하여, 상기 a) 단계에서 제조된 개별 감자유세포 분산물에 0.3-1.0M의 농도가 되도록 자당 용액을 첨가할 수 있다.
상기 b-2) 단계는,
500mM 트리스-염산 완충용액을 제조하여 pH 7.0으로 조정하고, 이를 상기 b-1) 단계에서 제조된 개별 감자유세포-자당 혼합물에 10 - 100mM의 농도가 되도록 트리스-염산 완충용액을 가할 수 있다.
상기 b-3) 단계는, 상기 b-2) 단계에서 제조된 개별 감자유세포, 자당 용액과 트리스-염산 완충용액의 혼합물 내의 감자유세포의 농도가 2.5 - 10%(w/v)가 되도록 정제수를 가하여 반응혼합물을 완성할 수 있다.
상기 b-4) 단계는, 상기 b-3) 단계에서 제조된 반응혼합물을 알파글루칸합성효소의 최적 반응온도 33 - 37℃로 가열한 후 나이세리아 폴리사카리아의 배양액으로부터 얻은 알파글루칸합성효소 용액을 반응혼합물에 알파글루칸합성효소가 30 - 3,000U이 되도록 가한 후 33 - 37℃에서 50 - 150rpm으로 교반하면서 24 - 72시간 동안 효소반응을 시킬 수 있다.
상기 c) 단계는, c-1) 상기 b-4) 단계에서 알파글루칸합성효소 처리된 감자유세포 혼합물들을 140메쉬 표준체망을 통과시켜 알파글루칸으로 코팅된 감자유세포를 회수하는 단계; 및 c-2) 상기 c-1) 단계에서 회수된 알파글루칸 코팅 감자유세포를 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 c-2) 단계는, 상기 c-1) 단계에서 140메쉬 표준체망을 이용하여 회수한 알파글루칸 코팅 감자유세포를 표준체망 위에서 흐르는 물을 이용하여 10분 동안 세척하여 깨진 감자유세포 세포막 파편들, 감자전분, 알파글루칸을 제거하여 알파글루칸 코팅 감자유세포를 얻는 1차 세척단계; 및 상기 세척 단계에서 얻은 알파글루칸 코팅 감자유세포를 비이커로 옮겨 알파글루칸 코팅 감자유세포의 중량대비 5배의 정제수를 가하고, 10분간 교반한 후 5분간 정치시켜 상등액을 제거하는 2차 세척단계를 더 포함할 수 있다.
상기 c-2) 단계는, 1차 세척단계와 2차 세척단계를 2-5회 반복하여 알파글루칸합성효소반응의 부산물인 올리고당, 과당 및 포도당 잔류물을 제거할 수 있다.
상기 d) 단계는, 상기 c) 단계로부터 얻어진 알파글루칸 코팅 감자유세포들의 중량대비 3배의 무수에탄올에서 10분간 탈수한 후 140메쉬 표준체망으로 회수하여 45℃의 열풍건조기에서 수분함량 8 - 12%로 건조할 수 있다.
상기 목적은, 본 발명에 따라, 효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재의 제조방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재에 의해 달성된다.
본 발명에 의하면, 생전분 또는 노화전분을 함유하는 건조감자유세포를 알파글루칸합성효소 처리함으로써, 건조감자유세포의 소화특성을 저하시킬 수 있어 기존 건조감자유세포의 대한 소비자들의 저항감을 낮추고 식품산업적 활용도를 높일 수 있을 뿐만 아니라, 건조감자유세포의 추가적인 호화처리를 수반하지 않아 에너지가 절약될 수 있으며 높은 생산량을 얻을 수 있는 효과를 제공할 수 있게 된다.
또한, 전술한 제조방법에 의해 난소화성이 향상된 건조감자유세포 소재를 제공할 수 있는 효과를 제공할 수 있게 된다.
도 1은 본 발명에 따른 알파글루칸합성효소 처리에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재의 제조방법을 설명하기 위한 개략적 순서도이다.
도 2는 본 발명의 비교예에서 제조된 생전분을 함유한 건조감자유세포의 콩고레드(Congo red) 용액 염색을 통한 편광필터가 장착된 광학현미경 관찰을 도시한 사진이다.
도 3는 본 발명의 실시예 1에서 제조된 생전분을 함유한 난소화성 건조감자유세포들의 콩고레드(Congo red) 용액 염색을 통한 편광필터가 장착된 광학현미경 관찰을 도시한 사진이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예들을 상세하게 설명하면 다음과 같다. 다만, 본 발명을 설명함에 있어서, 이미 공지된 기능 혹은 구성에 대한 설명은, 본 발명의 요지를 명료하게 하기 위하여 생략하기로 한다.
첨부된 도면 중에서, 도 1은 본 발명에 따른 알파글루칸합성효소 처리에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재의 제조방법을 설명하기 위한 개략적 순서도이다.
도 1을 토대로 효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 제조방법을 설명하기로 한다.
a) 단계 : 건조감자유세포의 분산물 제조(S1)
건조감자유세포의 중량대비 5 - 15배의 정제수와 혼합하여 상온에서 10 - 30분간 수화시킨다. 정제수의 사용량은 건조감자유세포가 내포하고 있는 전분의 상태에 따라 달리할 수 있다. 생전분을 내포하는 건조감자유세포를 사용할 경우 건조감자유세포의 중량대비 5 - 10배의 정제수를 첨가할 수 있으나, 노화전분을 내포하고 있는 건조감자유세포를 사용할 경우 10 - 15배의 정제수를 첨가해야 건조감자유세포가 개별 감자유세포로 분리되는데 적합하다. 따라서 건조감자유세포가 내포하는 전분의 상태에 관계없이 첨가하는 정제수는 건조감자유세포의 중량대비 10배가 가장 바람직하다. 예를 들어, 건조감자유세포 15g을 사용한다면 150g의 정제수와 혼합한다.
건조감자유세포의 중량대비 10배의 정제수를 혼합한 후 상온에서 10 - 30분간 정치하여 수화시킬 수 있다. 건조감자유세포의 수화가 30분을 초과할 경우 미생물 증식이 일어날 수 있으며, 10분 미만에서 건조감자유세포의 수화를 완료할 경우 건조감자유세포의 충분한 수화를 달성할 수 없다. 따라서 건조감자유세포를 충분히 수화시키기 위해서는 정제수와 혼합한 후 상온에서 25분간 정치시키는 것이 가장 바람직하다. (a-1 단계)
이어서, a-1) 단계에서 건조감자유세포와 정제수를 혼합하여 건조감자유세포를 충분히 수화시킨 후 감자유세포를 개별적으로 분산시키기 위해 35℃의 효소반응온도에서 진탕배양기를 이용하여 100 - 200 stroke/min으로 또는 기계적 교반기를 이용하여 50 - 150 rpm의 속도로 10 - 60분간 교반한다. 감자유세포는 세포막이 약하기 때문에 200 stroke/min을 초과하여 진탕하거나 150rpm을 초과하여 교반할 경우 감자유세포의 세포막이 파괴되어 감자유세포 내의 전분들이 외부로 노출될 수 있으며, 이는 알파글루칸합성효소의 반응효율을 저하키고 최종 생산물의 수율을 낮추게 된다. 반면 100 stroke/min 미만으로 진탕하거나 50rpm 미만으로 교반할 경우 감자유세포들이 개별적으로 분리되지 않아 분말상의 최종 생산물을 얻을 수 없다. 따라서 수화시킨 건조감자유세포를 개별 감자유세포로 분리할 때 진탕배양기를 사용하는 경우는 150 stroke/min이, 기계적 교반기를 사용할 경우에는 120rpm으로 진탕하거나 교반하는 것이 가장 바람직하다. 한편, 수화시킨 건조감자유세포를 10분 이상 60분을 초과하지 않는 범위에서 진탕하거나 교반하도록 한다. 10분미만으로 진탕하거나 교반할 때 건조감자유세포가 개별 감자유세포로 충분히 분리되지 않으며, 60분을 초과할 경우 개별적으로 분리된 감자유세포의 세포막이 감자유세포들 사이의 충돌로 파괴될 수 있다. 따라서 수화시킨 건조감자유세포를 진탕하거나 교반하는 것은 45분이 가장 바람직하다. (a-2 단계)
b) 단계 : 알파글루칸합성효소 처리(S2)
자당(sucrose) 136.8g을 60mL의 정제수와 혼합하고 80℃에서 가온하면서 교반하여 용해시키고 정제수를 가하여 최종부피를 200mL로 조정하여 2M(몰) 자당 용액을 제조한다. 제조된 자당 용액은 전술한 a) 단계에서 제조된 건조감자유세포 분산물에 0.3-1.0M의 농도가 되도록 첨가한다. 건조감자유세포 분산물과 2M 자당 용액을 혼합할 때 자당 용액의 최종 농도가 0.3M 미만일 경우 알파글루칸합성효소에 의한 알파글루칸의 형성이 충분하지 않아 감자유세포의 코팅 효율이 감소하며, 1.0M을 초과할 때 감자유세포의 세포벽 위에서 새롭게 합성되는 알파글루칸보다 독립적으로 합성되는 알파글루칸 분자들이 다량 존재하여 감자유세포의 코팅 효율을 낮추고 알파글루칸 코팅 감자유세포의 소화도를 충분히 낮추지 못하게 된다. 따라서 건조감자유세포 분산물에 2M 자당 용액을 가하여 자당 용액의 최종 농도가 0.7M이 되도록 하는 것이 가장 바람직하다. 예를 들어, 알파글루칸합성효소 처리를 위한 반응혼합물의 총 부피를 300mL로 하고 감자유세포의 농도를 5%(w/v)로 한다면, 전술한 a) 단계에서 제조된 건조감자유세포 분산물에 2M 자당 용액을 105mL를 첨가하여 반응혼합물 내의 자당의 농도를 0.7M로 만들 수 있다. (b-1 단계)
이어서, 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판다이올(2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) 6.1g을 정제수 80mL에 용해시킨 후 5N(노르말 농도) 염산을 이용하여 알파글루칸합성효소의 최적 pH 7.0으로 조종한 후 정제수를 가하여 최종부피를 100mL로 하여 500mM 트리스-염산 완충용액을 제조한다. 제조된 트리스-염산 완충용액은 전술한 b-1) 단계에서 제조된 반응혼합물에 트리스-염산 완충용액의 최종농도가 10-100mM이 되도록 첨가한다. 트리스-염산 완충용액의 농도는 제시된 농도 범위로 하였을 때 알파글루칸합성효소의 효소반응 동안 pH 7.0으로 일정하게 유지할 수 있다. 단 트리스-염산 완충용액의 농도가 100mM을 초과할 경우 알파글루칸합성효소의 활성을 낮출 수 있다. 따라서 트리스-염산 완충용액의 최종 농도는 50mM이 되도록 반응혼합물에 500mM 트리스-염산 완충용액을 첨가하는 것이 가장 바람직하다. 예를 들어, 알파글루칸합성효소 처리를 위한 반응혼합물의 총 부피를 300mL로 하고 감자유세포의 농도를 5%(w/v)로 한다면, 전술한 a) 단계에서 제조된 건조감자유세포 분산물에 500mM 트리스-염산 완충용액을 30mL를 첨가하여 반응혼합물 내의 트리스-염산 완충용액의 농도를 50mM로 만들 수 있다. (b-2 단계)
계속해서, 전술한 a) 단계 및 b-1) 단계, b-2) 단계들을 거쳐서 제조된 반응혼합물에 추가적으로 정제수를 가하여 반응혼합물 내의 건조감자유세포를 2.5-10%의 농도가 되도록 조정한다. 반응혼합물 내의 건조감자유세포의 농도가 2.5% 미만일 경우 알파글루칸합성효소에 의한 감자유세포의 코팅효율과 최종 생산물의 수율이 낮아지며, 10%를 초과할 경우 반응혼합물의 점성이 증가하여 일정한 진탕이나 교반이 불가능하여 균일한 효소반응을 달성할 수 없다. 따라서 원활한 진탕이나 교반하에서 균일한 효소반응을 위해 반응혼합물의 건조감자유세포의 농도는 5%로 하는 것이 가장 바람직하다. 예를 들어, 알파글루칸합성효소 처리를 위한 반응혼합물의 총 부피를 300mL로 하고 감자유세포의 농도를 5%(w/v)로 한다면, 건조감자유세포 15g, 정제수 150g, 2M 자당 용액 105mL, 500mM 트리스-염산 완충용액 30mL를 혼합하여 반응혼합물을 완성할 수 있다. (b-3 단계)
마지막으로, 전술한 b-3) 단계에서 제조된 반응혼합물은 알파글루칸합성효소를 첨가하기 전에 알파글루칸합성효소의 반응온도인 33 - 37℃, 바람직하게는 알파글루칸합성효소에 의해 형성된 알파클루칸의 사슬의 길이를 최대한 연장시킬 수 있고, 감자유세포 세포막 위에서 새롭게 형성된 알파글루칸들 사이의 자가조립을 용이하게 하는 알파클루칸합성효소의 최적 반응온도인 35℃로 가온하여 알파글루칸합성효소 첨가 시 온도차이에 의한 알파글루칸합성효소의 효소활성의 저하를 방지한다. 이후 나이세리아 폴리사카리아(Neisseria polysaccarea )의 배양액으로부터 얻은 알파글루칸합성효소 용액을 반응혼합물에 알파글루칸합성효소가 30 - 3,000 U이 되도록 가한다. 알파글루칸합성효소가 반응혼합물에 30U 미만으로 첨가될 때 긴 반응시간을 되어 경제성이 낮으며, 3,000U을 초과하여 첨가할 때 알파글루칸합성효소의 생산에 소요되는 시간이 길고 감자유세포 세포막 위에서 알파글루칸을 형성하여 코팅하는 반응 이외의 부반응(side reaction)이 일어나 생산수율과 감자유세포의 코팅효율이 낮아지는 문제점을 가진다. 따라서 반응시간, 감자유세포의 코팅효율과 최종 생산물의 생산수율을 고려할 때 알파글루칸합성효소 용액은 300mL의 반응혼합물에 대해 알파글루칸합성효소가 1,800U이 되도록 첨가하는 것이 가장 바람직하다. 한편 알파글루칸합성효소 용액을 반응혼합물에 첨가한 후 알파글루칸합성효소의 최적 반응온도(35℃)에서 24 - 72시간 동안 효소반응을 수행한다. 효소반응 시간이 24시간 미만일 경우 감자유세포의 코팅 효율이 낮아 바람직한 난소화성을 감자유세포에 부여할 수 없으며, 72시간을 초과할 경우 알파글루칸합성효소의 효소활성의 저하와 부반응으로 감자유세포의 코팅효율과 최종 생산물의 생산수율을 낮출 수 있다. 따라서 이러한 사항들을 고려할 때 알파글루칸합성효소의 효소반응은 48시간이 가장 바람직하다. 또한 효소반응 시 반응혼합물은 전술한 a-2) 단계에서 설명한 바와 같이 120rpm으로 교반하는 것이 가장 바람직하다. (b-4 단계)
c) 단계 : 알파글루칸 코팅 감자유세포의 선별 및 세척(S3)
전술한 b-4) 단계에서 효소반응이 완료된 후 반응혼합물은 140메쉬 표준체망(체눈크기 106㎛)을 이용하여 알파글루칸 코팅 감자유세포를 회수한다. 이때 140메쉬보다 큰 메쉬의 표준체망을 사용할 경우 효소반응 시 파괴된 유세포로부터 유출된 감자전분과 알파글루칸합성효소의 부반응에 의해 형성된 반응부산물들이 모두 회수되기 때문에 순도가 높은 알파글루칸 코팅 감자유세포를 얻을 수 없으며 140메쉬 보다 작은 메쉬의 표준체망을 사용할 경우에는 최종 생산물의 생산수율이 낮을 수 있다. 따라서 알파글루칸 코팅 감자유세포를 회수하기 위해서는 140메쉬 표준체망을 사용하는 것이 가장 바람직하다. (c-1 단계)
전술한 c-1) 단계에서 회수된 표준체망 위의 알파글루칸 코팅 감자유세포들은 흐르는 정제수를 이용하여 10분 간 표준체망 위에서 알파글루칸 코팅 감자유세포를 세척한다.(1차 세척단계) 알파글루칸 코팅 감자유세포들 사이에는 여전히 파괴된 유세포 잔류물, 감자전분, 알파글루칸합성효소의 반응부산물들이 존재하기 때문에 이들을 제거하기 위해서는 흐르는 정제수를 이용하는 것이 가장 바람직하다. 게다가 흐르는 정제수로 세척이 완료된 알파글루칸 코팅 감자유세포들에 포함되어 있을 수 있는 올리고당, 과당, 포도당 잔류물을 제거하기 위해 알파글루칸 코팅 감자유세포들은 비이커로 옮기고, 중량대비 5배의 정제수를 가하여 10분간 교반한 후 5분간 정치시켜 알파글루칸 코팅 감자유세포들을 침전시키고 상등액을 제거한다.(2차 세척단계) 이와 같이 1차 세척단계 및 1차 세척단계는 2-5번 반복할 수 있다. 이와 같이 본 발명에 따라 2차 세척 및 2차 세척을 2회 수행을 통해 알파글루칸 코팅 감자유세포들 내의 올리고당, 과당, 포도당 잔류물들은 모두 제거될 수 있었다. (c-2 단계)
d) 단계 : 건조(S4)
전술한 c) 단계에서 얻어진 알파글루칸 코팅 감자유세포는 중량대비 3배의 무수에탄올과 혼합하여 10분간 탈수하고 140메쉬 표준체망을 이용하여 회수한다. 무수에탄올을 이용하여 알파글루칸 코팅 감자유세포의 부분적인 탈수 없이 직접 건조할 수 있으나, 이 경우 알파글루칸 코팅 감자유세포들 사이에 응집체를 형성할 수 있어 균일한 입도의 알파글루칸 코팅 감자유세포 소재를 얻을 수 없고 건조시간을 단축하는 효과가 있다. 따라서 열풍건조기를 이용하여 건조하기 전 무수에탄올을 이용하여 탈수과정을 거치는 것이 바람직하다. 한편 무수에탄올에 의해 탈수된 알파글루칸 코팅 감자유세포들은 45℃의 열풍건조기를 이용하여 수분함량이 15% 이하가 되도록 건조하여 효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 감자유세포 소재를 얻을 수 있다. 이때, 수분함량은 15% 이하이면 만족하나, 바람직하게는 8 - 12%, 더욱 바람직하기로는 10%로 하는 것이 바람직하다.
[시험방법]
. 현미경 관찰
생전분을 함유한 건조감자유세포와 전술한 바와 같이 제조된 알파글루칸 코팅 건조감자유세포들 100mg을 15mL 원심분리관에 넣고 증류수 2mL를 가하여 분산시키고 1.0%(w/v) 콩고레드(Congo red) 수용액 1mL를 추가로 가한다. 상온에서 10분 동안 방치하여 감자유세포 막을 염색한 후 증류수를 이용하여 과량의 콩고레드 용액을 제거한다. 염색된 시료는 편광필터가 장착된 정상광학현미경(Biological Microscope model CX31, Olympus Co., Tokyo, Japan)을 이용하여 100 배의 배율로 관찰하였다. 그 결과는 첨부된 도 2와 도 4의 사진에 나타내었다.
. 난소화성 저항전분 정량
건조감자유세포와 알파글루칸 코팅 건조감자유세포 내의 효소저항전분 함량은 AACC approved method 32 - 40에 따라 Megazyme 사의 Resistant starch assay kit를 이용하여 측정하였다. Pancreatic α-amylase(1g)을 100mM sodium maleate buffer(pH 6.0)와 혼합하여 100mL로 정용한 후 5분간 교반하였다. 여기에 희석된 amyloglucosidase 용액(300 U/mL) 1mL를 가하여 혼합하고 3,000rpm에서 10분간 원심분리여 상등액을 취해 전분소화효소액으로 하였다. 시료 100mg (d.b)과 전분소화효소액 4mL을 혼합하여 37℃에서 16시간 동안 항온진탕배양기(200 strokes/min) 안에서 효소반응시킨 후 99% 무수에탄올 4mL를 가하여 혼합하고 3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 100-mL 정용플라스크로 옮기고, 침전물에 50% 에탄올 수용액 8mL을 넣어 분산시킨 후 원심분리하여 3,000rpm에서 10분간 원심분리하고 상등액을 100-mL 정용플라스크에 취합하고 100mM sodium acetate(pH 4.5) 용액을 가하여 100mL로 정용하고 이를 가용성 전분 시료로 하였다. 불용성 효소저항전분 시료는 원심분리한 후 잔류물은 2M KOH(수산화칼륨) 2.0mL과 혼합하여 20분간 얼음물 수욕조에서 용해시키고 1.2M sodium acetate(아세트산나트륨)(pH 3.8) 용액 8mL과 혼합한 후 amyloglucosidase(아밀로글루코시다아제) 용액(3300U/mL) 0.1mL을 가하여 50℃ 항온수욕조에서 30분간 효소반응 시키 100-mL 정용플라스크로 옮기고 탈이온수로 정용하여 제조하였다. 가용성 전분과 불용성 효소저항전분 시료들 각각 0.1mL과 GOPOD 반응시약 3mL을 혼합하여 50℃에서 30분간 발색시켜 510nm에서 흡광도를 측정하여 메가자임(Megazyme) 사에서 제공된 효소저항전분 함량 계산 프로그램을 이용하여 효소저항전분 함량을 산출하였다.
[비교예]
출원된 특허(10-2014-0054378; 공개일 : 2015년 11월 17일)에서 설명하는 방법에 따라 생전분을 포함하는 건조감자유세포 소재를 제조하였다. 또한 노화전분을 내포하는 건조감자유세포는 Kim & Kim(Food Chemistry, 167: 425-432 (2015))의 방법에 따라 제조하였다.
비교예에서 제조된 생전분을 포함하는 건조감자유세포와 노화전분을 포함하는 건조감자유세포는 본 발명에서 설명한 방법에 따라 난소화성 건조감자유세포로 제조하였다. 간략히 설명하면, 건조감자유세포 15g은 150g의 정제수와 혼합하여 25분간 상온에서 수화시킨 후 기계적 교반기를 이용하여 120rpm에서 45분간 교반하여 개별 감자유세포 분산물을 제조하였다. 여기에 2M 자당 용액 105mL와 500mM 트리스-염산 완충용액(pH 7.0)을 순차적으로 가하여 반응혼합물을 제조하였다. 반응혼합물에 알파글루칸합성효소가 1,800U이 되도록 알파글루칸합성효소 용액을 혼합하여 35℃에서 48시간 동안 120rpm으로 교반하면서 효소반응시켰다. 48시간 후에 반응혼합물은 140메쉬 표준체망을 이용하여 알파글루칸 코팅 감자유세포를 회수하고 표준체망 위에서 흐르는 정제수를 이용하여 10분간 세척하였다. 세척된 알파글루칸 코팅 감자유세포는 중량대비 3배가량의 정제수와 비이커에 혼합하여 10분간 교반한 후 5분간 정치하고 상등액을 제거하였다. 이 세척조작(1차 세척 및 2차 세척)은 2회 반복하였다. 마지막으로 세척된 알파글루칸 코팅 감자유세포는 무수에탄올로 탈수하고 45℃의 열풍건조기에서 수분함량이 10% 내외가 되도록 건조하여 난소화성 건조감자유세포 소재를 제조하였다.
비교예와 실시예 1에서 제조된 소재들 중 생전분을 내포한 건조감자유세포와 난소화성 건조감자유세포의 형태학적 특성을 전술한 방법에 따라 광학현미경을 이용하여 관찰하였다.
도 2의 사진은 비교예에 따라 제조된 생전분을 내포한 건조감자유세포를 전술한 바와 같이 처리하여 관찰한 사진이다. 도 3의 사진은 실시예 1에 따라 제조된 생전분을 내포한 난소화성 건조감자유세포를 전술한 바와 같이 처리하여 관찰한 사진이다.
도 2의 사진에 도시된 바와 같이, 생전분들은 감자유세포 내에 존재하였고 감자유세포의 외곽부분은 명확한 경계를 나타내었다. 그러나 실시예 1에 따라 제조된 난소화성 건조감자유세포의 경우 비교예의 건조감자유세포와 마찬가지로 생전분을 내포하고 있었으나 유세포의 세포막이 두꺼워진 것을 알 수 있었다. 이는 알파글루칸합성효소에 의해 감자유세포 세포막 위에서 새롭게 형성된 알파글루칸 분자들 사이의 자가조립에 의해 감자유세포의 자발적인 코팅에 의한 결과이다.
비교예와 실시예 1에서 제조된 건조감자유세포와 난소화성 건조감자유세로 소재들 내의 저항전분 함량을 호화처리 없이 전술한 시험방법에 따라 정량하여 표 1에 나타내었다.
호화처리하지 않은 생전분과 노화전분을 내포한 건조감자유세포(비교예)와 난소화성 건조감자유세포(실시예 1)의 저항전분 함량
전분상태 건조감자유세포 총 저항전분 함량 (%, db)

생전분		 비교예 76.06±0.12
실시예 1 88.18±0.16

노화전분
 비교예 11.07±0.41
실시예 1 55.57±0.33
호화처리를 하지 않았을 경우 비교예에서 제조된 생전분을 내포한 건조감자유세포보다 본 발명에 따라 제조된 생전분을 내포한 난소화성 건조감자유세포의 저항전분 함량이 높았다. 특히 노화전분을 내포하는 소재의 경우에 있어 비교예의 경우보다 실시예 1의 경우가 약 5배 더 높은 저항전분 함량을 나타내었다.
비교예와 실시예 1에서 제조된 건조감자유세포와 난소화성 건조감자유세로 소재들 내의 저항전분 함량을 호화처리한 후 전술한 시험방법에 따라 정량하여 표 2에 나타내었다.
호화처리한 생전분과 노화전분을 내포한 건조감자유세포(비교예)와 난소화성 건조감자유세포(실시예 1)의 저항전분 함량
전분상태 건조감자유세포 총 저항전분 함량 (%, db)

생전분		 비교예 12.19±0.10
실시예 1 23.04±0.35

노화전분
 비교예 13.49±0.47
실시예 1 48.39±0.73
호화처리를 하지 않았을 경우 비교예에서 제조된 생전분을 내포한 건조감자유세포보다 본 발명에 따라 제조된 생전분을 내포한 난소화성 건조감자유세포의 저항전분 함량이 높았다. 특히 노화전분을 내포하는 소재의 경우에 있어 비교예의 경우보다 실시예 1의 경우가 약 3.5배 더 높은 저항전분 함량을 나타내었다.
앞에서, 본 발명의 특정한 실시예가 설명되고 도시되었지만 본 발명은 기재된 실시예에 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양하게 수정 및 변형할 수 있음은 이 기술의 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 일이다. 따라서, 그러한 수정예 또는 변형예들은 본 발명의 기술적 사상이나 관점으로부터 개별적으로 이해되어서는 안되며, 변형된 실시예들은 본 발명의 특허청구범위에 속한다 하여야 할 것이다.
S1 : 건조감자유세포의 분산물 제조
S2 : 알파클루칸합성효소 처리
S3 : 알파글루칸 코팅 감자유세포의 선별 및 세척
S4 : 건조

Claims (13)

  1. a) 건조감자유세포를 개별 감자유세포로 분산시키는 단계;
    b) 감자유세포 분산물을 반응용액과 알파글루칸합성효소를 혼합하여 효소반응시키는 단계;
    c) 알파글루칸합성효소 처리된 효소반응 혼합물로부터 알파글루칸으로 코팅된 감자유세포를 회수하는 단계; 및
    d) 상기 c) 단계에 의해 얻어진 코팅된 감자유세포들을 건조하여 난소화성 건조감자유세포 소재를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 a) 단계는,
    a-1) 건조감자유세포에 정제수를 가하여 수화시키는 단계; 및
    a-2) 상기 a-1) 단계에서 수화시킨 건조감자유세포를 진탕 또는 교반하여 개발 감자유세포로 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는,
    효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 a-1) 단계는, 건조감자유세포의 중량대비 5 - 15배의 정제수를 가하여 상온에서 10 - 30분간 수화시키고,
    상기 a-2) 단계는, 상기 a-1) 단계에서 수화시킨 건조감자유세포를 효소반응온도에서 10 - 60분 동안 100 - 200 stroke/min으로 진탕하거나, 50-150rpm의 속도로 교반하여 개별 감자유세포로 분리하는 것을 특징으로 하는,
    효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 b) 단계는,
    b-1) 자당 용액을 제조하여 개별 감자유세포 분산물에 자당 용액을 가하는 단계;
    b-2) pH 7.0의 500mM 트리스-염산 완충용액을 제조하여 개별 감자유세포 분산물에 첨가하는 단계;
    b-3) 상기 b-2) 단계에서 제조된 개별 감자유세포 반응혼합물에 추가로 정제수를 가하여 개별 감자유세포 반응혼합물 내의 감자유세포 농도를 조정하는 단계; 및
    b-4) 상기 b-3) 단계에서 제조된 개별 감자유세포 반응혼합물에 알파글루칸효소 용액을 가하여 효소반응하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 b-1) 단계는,
    2M의 자당 용액을 제조하여, 상기 a) 단계에서 제조된 개별 감자유세포 분산물에 0.3-1.0M의 농도가 되도록 자당 용액을 첨가하는 것을 특징으로 하는,
    효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재의 제조방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 b-2) 단계는,
    500mM 트리스-염산 완충용액을 제조하여 pH 7.0으로 조정하고, 이를 상기 b-1) 단계에서 제조된 개별 감자유세포-자당 혼합물에 10 - 100mM의 농도가 되도록 트리스-염산 완충용액을 가하는 것을 특징으로 하는,
    효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재의 제조방법.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 b-3) 단계는,
    상기 b-2) 단계에서 제조된 개별 감자유세포, 자당 용액과 트리스-염산 완충용액의 혼합물 내의 감자유세포의 농도가 2.5 - 10%(w/v)가 되도록 정제수를 가하여 반응혼합물을 완성하는 것을 특징으로 하는,
    효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재의 제조방법.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 b-4) 단계는,
    상기 b-3) 단계에서 제조된 반응혼합물을 알파글루칸합성효소의 최적 반응온도 33 - 37℃로 가열한 후 나이세리아 폴리사카리아의 배양액으로부터 얻은 알파글루칸합성효소 용액을 반응혼합물에 알파글루칸합성효소가 30 - 3,000U이 되도록 가한 후 33 - 37℃에서 50 - 150rpm으로 교반하면서 24 - 72시간 동안 효소반응을 시키는 것을 특징으로 하는,
    효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 c) 단계는,
    c-1) 상기 b-4) 단계에서 알파글루칸합성효소 처리된 감자유세포 혼합물들을 140메쉬 표준체망을 통과시켜 알파글루칸으로 코팅된 감자유세포를 회수하는 단계; 및
    c-2) 상기 c-1) 단계에서 회수된 알파글루칸 코팅 감자유세포를 세척하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는,
    효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 c-2) 단계는,
    상기 c-1) 단계에서 140메쉬 표준체망을 이용하여 회수한 알파글루칸 코팅 감자유세포를 표준체망 위에서 흐르는 물을 이용하여 10분 동안 세척하여 깨진 감자유세포 세포막 파편들, 감자전분, 알파글루칸을 제거하여 알파글루칸 코팅 감자유세포를 얻는 1차 세척단계; 및
    상기 세척 단계에서 얻은 알파글루칸 코팅 감자유세포를 비이커로 옮겨 알파글루칸 코팅 감자유세포의 중량대비 5배의 정제수를 가하고, 10분간 교반한 후 5분간 정치시켜 상등액을 제거하는 2차 세척단계를 더 포함하는 것을 특징으로 ㅎ하는,
    효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 c-2) 단계는,
    1차 세척단계와 2차 세척단계를 2-5회 반복하여 알파글루칸합성효소반응의 부산물인 올리고당, 과당 및 포도당 잔류물을 제거하는 것을 특징으로 하는,
    효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 d) 단계는,
    상기 c) 단계로부터 얻어진 알파글루칸 코팅 감자유세포들의 중량대비 3배의 무수에탄올에서 10분간 탈수한 후 140메쉬 표준체망으로 회수하여 45℃의 열풍건조기에서 수분함량 8 - 12%로 건조하는 것을 특징으로 하는,
    효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재의 제조방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재의 제조방법으로 제조된 것을 특징으로 하는,
    효소적 알파글루칸 코팅에 의한 난소화성 건조감자유세포 소재.


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