KR101750407B1 - Phosphorylated Peptide-Specific RNA Aptamer - Google Patents
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Abstract
본 발명은 프로틴 카이네이즈 A(PKA)에 의하여 인산화된 펩타이드 기질에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머에 관한 것입니다. 본 발명의 앱타머 및 방법을 사용함으로써 효과적으로 인산화펩타이드를 검출하고, 단백질 인산화효소 A 활성을 실시간으로 측정할 수 있다. The present invention relates to a nucleic acid aptamer capable of specifically binding to a peptide substrate phosphorylated by Protein Kinase A (PKA). By using the aptamer and the method of the present invention, the phosphorylated peptide can be effectively detected and the protein kinase A activity can be measured in real time.
Description
본 발명은 프로틴 카이네이즈 A(PKA)에 의하여 인산화된 펩타이드 기질에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머에 관한 것입니다.
The present invention relates to a nucleic acid aptamer capable of specifically binding to a peptide substrate phosphorylated by Protein Kinase A (PKA).
단백질 인산화는 세포 내 신호전달 경로의 주요한 조절형태이다. 단백질 인산화는 증식, 분화, 세포자연사와 같은 생물학적 과정을 엄격하게 통제하는 단백질 인산화 효소와 단백질 탈인산화 효소의 복잡한 상호작용과 같은 세포 내 현상에 대부분 관여한다. 신호전달 경로가 바뀌거나 결함이 있는 경우 다양한 질병이 발생하게 된다. 이는 단백질 인산화를 이해하는 것이 얼마나 중요한 것인지를 말해준다. Protein phosphorylation is a major regulatory mode of intracellular signaling pathways. Protein phosphorylation is largely involved in intracellular phenomena such as the complex interactions of protein kinases with protein kinases that strictly control biological processes such as proliferation, differentiation and cellular apoptosis. If the signal pathway is changed or defective, various diseases will occur. This tells how important it is to understand protein phosphorylation.
인산화 펩타이드를 인식하는 종래 기술로는 US08/0064608 "Method of Detecting Phosphorylation by Spr Using Zinc chelating Reagent", Jie Bai 등, Dual-Readout Fluorescent Assay of Protein Kinase Activity by Use of TiO2-Coated Magnetic Microspheres, Anal. chem. 85(9):4813-4821(2013) 등이 있다. 또한, 종래 인산화 펩타이드를 인식하는 항체 기술 및 phos-taq이라는 상표로 일본에서 개발된 인산화 아미노산 특이적 구조체 등이 존재한다. 다만, 인산화 펩타이드를 인식하는 항체의 경우 매우 고가이며, 펩타이드 기질의 인산화와 탈인산화 과정을 실시간으로 관찰하는 것이 어렵고, 상술한 Phos-taq의 경우에는 합성과정이 복잡하고 사용자가 원하는 표지(labeling)를 하기에는 제한이 있으며, 고가인 단점이 있다.
US Pat. No. 8 / 0064,608 entitled "Method of Detecting Phosphorylation by Spin Using Zinc Chelating Reagent", Jie Bai et al., Dual-Readout Fluorescent Assay of Protein Kinase Activity by Use of TiO 2 -coated Magnetic Microspheres, Anal. chem. 85 (9): 4813-4821 (2013). In addition, antibody technology recognizing conventional phosphorylated peptides and phosphorylated amino acid-specific structures developed in Japan under the trademark phos-taq exist. However, it is difficult to observe the phosphorylation and dephosphorylation process of the peptide substrate in real time. In the case of the above-mentioned Phos-taq, the synthesis process is complicated and the labeling desired by the user is difficult. And there is a disadvantage that it is expensive.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.
본 발명자들은 단백질 인산화효소 A(PKA)에 의해 인산화된 펩타이드 기질을 특이적으로 검출할 수 있는 이미징 프로브를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 단백질 인산화효소 A(PKA)에 의해 인산화된 펩타이드에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머들을 이용하여 상기 목적을 달성할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다. The present inventors sought to develop an imaging probe capable of specifically detecting a peptide substrate phosphorylated by protein kinase A (PKA). As a result, the present invention has been accomplished by confirming that the above object can be achieved by using nucleic acid aptamers that specifically bind to the phosphorylated peptide by protein kinase A (PKA).
따라서, 본 발명의 목적은 인산화 펩타이드에 결합하는 핵산 앱타머를 제공하는데 있다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a nucleic acid aptamer which binds to a phosphorylated peptide.
본 발명의 다른 목적은 인산화 펩타이드를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.It is another object of the present invention to provide a method for detecting a phosphorylated peptide.
본 발명의 또 다른 목적은 단백질 인산화효소 A 활성 측정 방법을 제공하는데 있다. It is still another object of the present invention to provide a method for measuring protein kinase A activity.
본 발명의 또 다른 목적은 단백질 인산화효소 A 활성 검출 키트를 제공하는 데 있다.
It is another object of the present invention to provide a kit for detecting protein kinase A activity.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 인산화 펩타이드에 결합하는 서열목록 제1서열 내지 제6서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 핵산 앱타머를 제공한다.
According to one aspect of the present invention, there is provided a nucleic acid aptamer comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 6, which binds to a phosphorylated peptide.
본 발명자들은 단백질 인산화효소 A(PKA)에 의해 인산화된 펩타이드 기질을 특이적으로 검출할 수 있는 이미징 프로브를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 단백질 인산화효소 A(PKA)에 의해 인산화된 펩타이드에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머들을 이용하여 상기 목적을 달성할 수 있음을 규명하였다.The present inventors sought to develop an imaging probe capable of specifically detecting a peptide substrate phosphorylated by protein kinase A (PKA). As a result, it has been found that the above objects can be achieved by using nucleic acid aptamers that specifically bind to phosphorylated peptides by protein kinase A (PKA).
본 발명에서 "핵산 앱타머"는 특정 분자에 고친화성 및 특이성을 갖고 결합할 수 있는 핵산 분자를 의미하며, 상기 핵산은 DNA, RNA 또는 핵산 변형체를 의미하고, 일반적으로 약 200개 미만의 뉴클레오타이드로 이루어진 뉴클레오타이드 중합체를 의미하는 "올리고뉴클레오타이드"와 혼용하여 사용한다. "뉴클레오타이드"는 데옥시리보 뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 모든 기질일 수 있다. 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 올리고뉴클레오타이드 중합체의 합성 전에 또는 후에 추가될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 합성 후에, 예를 들어 표지와의 결합에 의해 추가로 변형시킬 수 있다."Nucleic acid aptamer" in the present invention means a nucleic acid molecule capable of binding with specificity and specificity to a specific molecule, and the nucleic acid means DNA, RNA or nucleic acid variant and generally has less than about 200 nucleotides Quot; oligonucleotide "which means a nucleotide polymer to be made. A "nucleotide" can be any substrate that can be introduced into a polymer by deoxyribonucleotides, ribonucleotides, modified nucleotides or bases and / or their analogs, or by DNA or RNA polymerases or by synthetic reactions. If a modification to the nucleotide structure is present, such modification may be added before or after the synthesis of the oligonucleotide polymer. The nucleotide sequence may be terminated by a non-nucleotide component. The oligonucleotides can be further modified after synthesis, for example by binding with a label.
본 발명의 핵산 앱타머는 전형적으로는 타겟 분자의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 당 분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 폴리펩타이드, 세포 표면상의 마커분자, 이온, 금속, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 분리하는 적절한 타겟 분자가 될 수 있다. 앱타머의 선별은 SELEX(Systematic Evolution of Ligand by Exponential Enrichment) 방법으로 공지된 생체내 또는 시험관내 선택 기술을 이용할 수 있다(Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 앱타머의 선별 및 제조에 대한 구체적인 방법은 미국특허 5,582,981, WO 00/20040, 미국특허 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33:973(1994), Mannironi et al.,Biochemistry 36:9726 (1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610 (1999), Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34:656-665 (1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 및 미국특허 5,756,291에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.The nucleic acid aptamers of the present invention are typically obtained by in vitro selection for binding of the target molecule. Methods for selecting an aptamer that specifically binds to a target molecule are known in the art. For example, organic molecules, nucleotides, amino acids, polypeptides, marker molecules on the cell surface, ions, metals, salts, polysaccharides can be suitable target molecules for separating aptamers that can specifically bind to each ligand . Selection of the aptamer can utilize in vivo or in vitro selection techniques known as SELEX (Systematic Evolution of Ligand by Exponential Enrichment) method (Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; and Tuerk et al. , Science 249, 505-10, 1990). Specific methods for screening and manufacturing the aptamer are described in U.S. Patent 5,582,981, WO 00/20040, U.S. Patent 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33: 973 (1994), Mannironi et al., Biochemistry 36: 9726 Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 3606-3610 (1999), Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34: 656-665 (1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 and U.S. Patent 5,756,291, Are incorporated herein by reference.
SELEX는 무작위 서열(randomized sequences)로 구성된 단일가닥 올리고뉴클레오타이드 풀(pool) 또는 라이브러리를 필요로 한다. 올리고뉴클레오타이드는 변형 또는 변형되지 않은 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 혼성체일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오타이드 풀은 100% 무작위 또는 부분적 무작위 올리고뉴클레오타이드이고, 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드 풀은 적어도 하나의 고정된 서열 및/또는 보존 서열이 무작위 서열 부위에 포함된 무작위 또는 부분적 무작위 올리고뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 보다 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드 풀은 5' 및/또는 3'말단이 올리고뉴클레오타이드 풀의 모든 분자에서 공유되는 서열로 구성될 수 있는 적어도 하나의 고정된 서열 및/또는 보존 서열을 포함하는 무작위 또는 부분적 무작위 올리고뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 올리고뉴클레이타이드 풀은 바람직하게는 무작위 서열 부분뿐 만 아니라 효과적인 복제를 위해 필수적인 고정된 서열(fixed sequences)을 포함한다. 초기 풀의 올리고뉴클레오타이드는 고정된 5'및 3' 말단 서열을 포함하는데 그 내부에 35-100개의 무작위 뉴클레오타이드가 삽입된다. 무작위 뉴클레오타이드는 화학적 합성 및 무작위로 절단된 세포 내 핵산으로부터 선택함으로써 생산할 수 있다. SELEX requires a single-stranded oligonucleotide pool or library consisting of randomized sequences. Oligonucleotides can be DNA, RNA or DNA / RNA hybrids that are not modified or modified. The oligonucleotide pool is a 100% random or partially random oligonucleotide, preferably the oligonucleotide pool can be composed of random or partially random oligonucleotides in which at least one fixed sequence and / or conserved sequence is included in the random sequence region have. More preferably, the oligonucleotide pool is a random or partially randomized sequence comprising at least one fixed and / or conserved sequence at which the 5 ' and / or 3 ' termini can consist of sequences shared in all molecules of the oligonucleotide pool Lt; / RTI > oligonucleotides. Oligonucleotide pools preferably contain not only random sequences but also fixed sequences that are essential for efficient replication. The oligonucleotide of the initial pool contains a fixed 5 'and 3' end sequence in which 35-100 random nucleotides are inserted. Random nucleotides can be produced by chemical synthesis and selection from randomly truncated intracellular nucleic acids.
올리고뉴클레오타이드의 무작위 서열 부분은 어떠한 길이일 수 있고, 리보뉴클레오타이드 및/또는 디옥시리보뉴클레오타이드로 구성될 수 있으며, 변형 또는 변형되지 않은 자연형 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 아날로그일 수 있다(U.S. Patent No. 5,958,691; U. S. Patent No. 5,660,985; U.S. Patent No. 5,958,691; U.S. Patent No. 5,698, 687; U.S. Patent No. 5,817, 635; U.S. Patent No. 5,672,695, 및 PCT Publication WO 92/07065). 무작위 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 잘 알려진 고체상 올리고뉴클레오타이드 합성 기술을 이용하여 포스포디에스테르-연결 뉴클레오타이드로부터 합성할 수 있다(Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14:5399-5467(1986), Froehler et al., Tet. Lett. 27:5575-5578(1986)). 또한, 무작위 올리고뉴클레오타이드는 트리에스테르 합성 방법과 같은 액체상 방법을 이용하여 합성할 수 있다(Sood et al., Nucl. Acid Res. 4:2557(1977), Hirose et al., Tet. Lett., 28:2449(1978)).The random sequence portion of the oligonucleotide can be any length and can be composed of a ribonucleotide and / or a deoxyribonucleotide, and can be a naturally occurring nucleotide or a nucleotide analogue that has not been modified or modified (US Patent No. 5,958,691; 5,660,985, US Patent No. 5,958,691, US Patent No. 5,698, 687, US Patent No. 5,817, 635, US Patent No. 5,672,695, and PCT Publication WO 92/07065). Random oligonucleotides can be synthesized from phosphodiester-linked nucleotides using solid state oligonucleotide synthesis techniques well known in the art (Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14: 5399-5467 (1986), Froehler et al., Tet. Lett., 27: 5575-5578 (1986)). Random oligonucleotides can also be synthesized using liquid phase methods such as the triester synthesis method (Sood et al., Nucl. Acid Res. 4: 2557 (1977), Hirose et al., Tet. Lett. , 28 : 2449 (1978)).
올리고뉴클레오타이드 초기 라이브러리는 RNA 또는 DNA일 수 있다. 예컨대, 초기 라이브러리로서 RNA 라이브러리가 이용될 경우, 상기 RNA 라이브러리는 T7 RNA 중합효소 또는 변형된 T7 RNA 중합효소를 이용하여 DNA 라이브러리를 인 비트로상에서 전사시킴으로써 생산한다. RNA 또는 DNA 라이브러리는 적절한 결합 조건하에서 타겟과 혼합하고, 결합 친화성 및 선별성 기준을 달성하기 위해 일반적인 선별 과정에 따라 결합, 분리 및 증폭 과정을 반복한다.The oligonucleotide initial library may be RNA or DNA. For example, when an RNA library is used as an initial library, the RNA library is produced by transcribing a DNA library on an in vitro using a T7 RNA polymerase or a modified T7 RNA polymerase. The RNA or DNA library is mixed with the target under appropriate binding conditions and the binding, separation and amplification steps are repeated according to the usual screening procedures to achieve binding affinity and selectivity criteria.
본 발명의 일 실시예에서는 먼저 구조적 다양성을 갖고 있는 핵산 라이브러리를 얻기 위하여 다음과 같이 내부에 무작위적인 염기서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드를 준비하였다 [5'-GGGAATTCGAGCTCCTGACA (N: 90) ATTCGAAGACGTCCAGCTGA-3']. 이를 주물로 이용해서, 이중나선 DNA를 얻었고, 얻어진 DNA 상태의 라이브러리는 T7 RNA 폴리머레이즈를 이용한 전사반응(in vitro transcription)을 통해 RNA 라이브러리로 만들었다. In one embodiment of the present invention, an oligonucleotide composed of a random base sequence was prepared in order to obtain a nucleic acid library having structural diversity as follows [5'-GGGAATTCGAGCTCCTGACA (N: 90) ATTCGAAGACGTCCAGCTGA-3 ']. Using this as a casting, double stranded DNA was obtained, and the obtained DNA state library was made into an RNA library through in vitro transcription using T7 RNA polymerase.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 핵산 앱타머는 DNA 또는 RNA이며, 상기 핵산 앱타머가 RNA인 경우 상기 서열목록 제1서열 내지 제6서열에 기재된 티미딘은 우라실로 대체될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the nucleic acid aptamer of the present invention is DNA or RNA, and when the nucleic acid aptamer is RNA, thymidine described in Sequence Listing Nos. 1 to 6 may be replaced with uracil.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 인산화 펩타이드는 단백질 인산화효소 A에 의해 인산화된 것이다. 단백질 인산화효소 A(Pretein kinase A, PKA)는 cAMP(cyclic AMP)의 세포수준에 의존하는 활성을 보이는 인산화 효소이다. 글리코겐, 당, 및 지질 대사를 포함하는 기능을 담당한다. PKA는 노출된 아르기닌-아르기닌-X-세린 모티프를 갖는 단백질을 인산화 시킨다. 본 발명의 일실시예에서는 PKA를 이용한 펩타이드 인산화를 위해 G-L-R-R-A-S-L-G의 아미노산 서열을 포함하는 기질 올리고펩타이드를 이용하였다. 상기 올리고펩타이드의 인산화 형태는 G-L-R-R-A-S(p)-L-G 이다. In one embodiment of the present invention, the phosphorylated peptide of the present invention is phosphorylated by protein kinase A. Protein kinase A (PKA) is a phosphorylation enzyme that has activity dependent on the cellular level of cAMP (cyclic AMP). Glycogen, sugar, and lipid metabolism. PKA phosphorylates proteins with exposed arginine-arginine-X-serine motifs. In one embodiment of the present invention, a substrate oligopeptide comprising the amino acid sequence of G-L-R-R-A-S-L-G was used for peptide phosphorylation using PKA. The phosphorylation form of the oligopeptide is G-L-R-R-A-S (p) -LG.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 앱타머는 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것이다. 상기 검출가능한 표지는 당업계에 알려진 검출 방법에 의하여 검출될 수 있는 모이어티일 수 있다.In one embodiment of the invention, the aptamer of the invention is attached with a detectable label. The detectable label may be a moiety that can be detected by a detection method known in the art.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 검출가능한 표지는 광학적 표지, 전기화학적 표지, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 표지는 앱타머의 특정 염기, 특정 구조 예를 들면, 헤어핀-루프(hairpin-loop) 구조의 특정 부위 또는 앱타머의 3' 말단 또는 5' 말단에 부착될 수 있다.In one embodiment of the invention, the detectable label may be an optical label, an electrochemical label, a radioisotope, or a combination thereof. The label may be attached to a specific base of an aptamer, a specific site of a specific structure, for example, a hairpin-loop structure, or a 3 'or 5' end of an aptamer.
본 발명의 광학적 표지는 예를 들면, 형광물질일 수 있다. 상기 형광물질은 플로레세인(fluorescein), 6-FAM, 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민, 카르복시로다민, 카르복시로타민6G, 카르복시로돌, 카르복시로다민110, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 캐스케이트 옐로우(Cascade Yellow), 코마린, Cy2(cyanine 2), Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy-크롬, 피코에리트린, PerCP(페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE(6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신), NED, ROX(5-(및-6)-카르복시-X-로다민), HEX, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 마리나 블루(Marina Blue), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 알렉사 플로어, 7-아미노-4-메틸코마린-3-아세트산, 보디피(BODIPY) FL, 보디피 FL-Br 2, 보디피 530/550, 이의 콘쥬게이트화물 및 이들의 배합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.The optical label of the present invention may be, for example, a fluorescent substance. The fluorescent material may be selected from the group consisting of fluorescein, 6-FAM, rhodamine, Texas red, tetramethylrhodamine, carboxydodamine, carboxyrotamine 6G, carboxyrodone, carboxydodamine 110, cascade blue Cascade Blue), Cascade Yellow, Comarine, Cy2 (cyanine 2), Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy-chrome, Picoeritrin, PerCP (Peridinin chlorophyll- , PerCP-Cy5.5, JOE (6-carboxy-4 ', 5'-dichloro-2', 7'-dimethoxyfluorescein), NED, ROX (5- Hex, Lucifer Yellow, Marina Blue, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Alexa Floor, 7-amino-4-methylcomarine- -Acetic acid, BODIPY FL, BODIPY FL-
또한, 본 발명의 광학적 표지는, 적절한 거리에 의하여 이격되어 있는 형광 도너 발색소 및 형광 수용자 발색소를 포함하고 도너의 형광 발광이 수용자에 의하여 억제되어 있는 형광공명에너지전달 (fluorescence resonance energy transfer: FRET) 쌍일 수 있다. 도너 발색소는 FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5 및 Texas Red를 포함할 수 있다. 수용자 발색소는 그의 여기 스펙트럼이 도너의 발광 스펙트럼과 겹치도록 선택될 수 있다. 또한, 상기 수용자는 넓은 범위의 도너를 켄칭 (quenching)하는 비형광 수용자일 수 있다. 도너-수용자 FRET 쌍의 다른 예는 당업계에 알려져 있다.The optical label of the present invention also includes a fluorescent donor dye and a fluorescent acceptor dye separated by an appropriate distance and having a fluorescence resonance energy transfer (FRET) in which the fluorescence of the donor is suppressed by the acceptor ) Pair. The donor pigments may include FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5 and Texas Red. The acceptor dye can be selected such that its excitation spectrum overlaps the donor emission spectrum. The receiver can also be a non-fluorescent receiver that quenches a wide range of donors. Other examples of donor-acceptor FRET pairs are known in the art.
본 발명의 전기화학적 표지는 당업계에 알려진 전기화학적 표지를 포함한다. 예를 들면, 상기 전기화학적 표지는 메틸렌 블루일 수 있다.The electrochemical labels of the present invention include electrochemical labels known in the art. For example, the electrochemical label may be methylene blue.
본 발명의 방사성 동위원소는 방사능동위원소는 종래 당업계에 잘 알려진 방사선 동위원소를 이용할 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 14C, 125I, 32P 또는 35S을 이용할 수 있다. The radioactive isotope of the present invention may be a radioactive isotope known in the art. Specifically, for example, 14 C, 125 I, 32 P or 35 S can be used.
구체적인 다양한 표지 및 표지화 방법은 Ed. Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.A variety of specific labeling and labeling methods are described in Ed. Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.
본 발명의 핵산 앱타머는 지지체상에 고정화 될 수 있다. 상기 지지체는 특별하게 한정되지 않으며, 예를 들어 레진(resin)일 수 있고, 구체적으로 이온교환수지가 사용될 수 있다.
The nucleic acid aptamer of the present invention can be immobilized on a support. The support is not particularly limited and may be, for example, a resin, and specifically, an ion exchange resin may be used.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 인산화 펩타이드를 검출하는 방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for detecting a phosphorylated peptide comprising the steps of:
(a) 서열목록 제1서열 내지 제6서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 앱타머를 대상 시료에 접촉(contacting)하는 단계; 및(a) contacting a nucleic acid aptamer comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 6 to a sample of interest; And
(b) 상기 단계 (a)의 결과물에서 핵산 앱타머-인산화 펩타이드 결합을 검출하는 단계.(b) detecting a nucleic acid aptamer-phosphorylated peptide bond in the result of step (a).
본 발명에서 "대상 시료"는 단백질 인산화 효소가 포함된 시료로서 인산화 펩타이드의 정성 또는 정량 분석을 측정할 수 있는 시료를 의미하며, 구체적으로 예를 들면 암세포에서 추출된 세포 lysate를 사용할 수 있으며 이 경우 과발현된 단백질 인산화효소에 의하여 생성된 인산화 펩타이드의 변화를 손쉽게 분석할 수 있다. 즉, 대상 시료는 인산화 반응이 종료된 상태의 시료이거나 또는 단백질 인산화효소를 함께 포함하여 인산화 반응이 진행 중인 시료일 수 있다. 인산화 반응이 진행 중인 시료에 대하여 본 발명인 방법을 이용하는 경우에는 기질 펩타이드의 인산화를 실시간 검출하는데 이용할 수 있다. In the present invention, "target sample" means a sample containing protein kinase, which is capable of measuring qualitative or quantitative analysis of a phosphorylated peptide. Specifically, for example, a cell lysate extracted from a cancer cell can be used. The changes in the phosphorylated peptides produced by over-expressed protein kinases can be easily analyzed. That is, the target sample may be a sample in which the phosphorylation reaction is terminated or a sample in which a phosphorylation reaction is in progress including a protein kinase. If the method of the present invention is used for a sample undergoing phosphorylation reaction, it can be used for real-time detection of phosphorylation of substrate peptide.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 인산화 펩타이드는 단백질 인산화효소 A에 의해 인산화된 것이다. 본 발명의 핵산 앱타머는 인산화 되지 않은 펩타이드와 결합을 형성하지 않으며, 단백질 인산화효소 A에 의해 인산화 된 펩타이드와 결합을 형성한다. 단백질 인산화효소 A에 의해 인산화되는 펩타이드는 R-R-X-S 아미노산 서열을 포함하며, 인산화되는 경우에는 R-R-X-S(p)의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 S(p)는 인산화된 세린을 의미한다. In one embodiment of the present invention, the phosphorylated peptide of the present invention is phosphorylated by protein kinase A. The nucleic acid aptamer of the present invention does not form a bond with a non-phosphorylated peptide and forms a bond with a peptide phosphorylated by protein phosphorylase A. Peptides that are phosphorylated by protein kinase A include the R-R-X-S amino acid sequence and, when phosphorylated, include the amino acid sequence of R-R-X-S (p). S (p) means phosphorylated serine.
본 발명에 있어서의 핵산 앱타머-인산화 펩타이드 결합을 검출하는 단계는 이용된 표지에 따라 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널 검출은 본 발명의 핵산 앱타머의 정성적 또는 정량적 분석을 가능케 한다. The step of detecting the nucleic acid aptamer-phosphorylated peptide bond in the present invention may be carried out according to various methods known in the art depending on the label used. Such signal detection enables qualitative or quantitative analysis of the nucleic acid aptamers of the present invention.
본 발명의 인산화 펩타이드를 검출하는 방법은 상술한 본 발명의 다른 일 양태인 핵산 앱타머를 이용하므로, 중복되는 내용에 관하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
Since the method for detecting the phosphorylated peptide of the present invention uses a nucleic acid aptamer as another embodiment of the present invention described above, redundant contents are omitted in order to avoid the excessive complexity described in the present specification.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 단백질 인산화효소 A 활성 측정 방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for measuring protein kinase A activity comprising the steps of:
(a) 서열목록 제1서열 내지 제6서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 앱타머 및 비-인산화 기질 펩타이드 또는 단백질 인산화효소 A와 혼합하는 단계;(a) mixing a nucleic acid aptamer comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 6 and a non-phosphorylated substrate peptide or protein kinase A;
(b) 단계 (a)에서 준비한 혼합물에 대하여 상기 혼합물에 포함되지 않은 단백질 인산화효소 A 또는 비-인산화 기질 펩타이드를 접촉(contacting)하는 단계; 및(b) contacting protein phosphorylase A or non-phosphorylated substrate peptide not included in the mixture to the mixture prepared in step (a); And
(c) 상기 단계 (b)의 결과물에서 핵산 앱타머-인산화 펩타이드 결합을 검출하여 인산화효소 활성을 측정하는 단계. (c) measuring the phosphorylase activity by detecting the nucleic acid aptamer-phosphorylated peptide bond in the result of step (b).
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 기질 펩타이드는 R-R-X-S의 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드이다. 상기 "R"은 아르기닌을 의미하고, S는 세린을 의미하며, X는 정해지지 않은 임의의 아미노산을 의미한다. In one embodiment of the present invention, the substrate peptide of the present invention is an oligopeptide comprising the amino acid sequence of R-R-X-S. Said "R" means arginine, S means serine, and X means any undetermined amino acid.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 기질 펩타이드는 서열목록 제7서열의 아미노산 서열로 이루어진 올리고펩타이드이다. 본 발명의 올리고펩타이드는 종래 공지된 지지체 상에 고정된 형태일 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 비오틴에 결합되어 올리고펩타이드-비오틴 복합체를 형성할 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서는 GLRRASLGK-비오틴 복합체를 이용하였으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 GLRRASLGK-비오틴 복합체에 있어서, 라이신은 GLRRASLG 올리고펩타이드와 비오틴을 결합시키기 위한 일종의 링커로서 이용되었다. In one embodiment of the invention, the substrate peptide of the invention is an oligopeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. The oligopeptides of the present invention may be in a form fixed on a conventionally known support. Specifically, for example, the oligonucleotide may be bound to biotin to form an oligopeptide-biotin complex. In one embodiment of the present invention, GLRRASLGK-biotin complex is used, but the present invention is not limited thereto. In the GLRRASLGK-biotin complex, lysine was used as a kind of linker for binding biotin with GLRRASLG oligopeptide.
본 발명의 단백질 인산화효소 A 활성 측정 방법은 먼저 본 발명의 핵산 앱타머를 단백질 인산화효소 A 또는 기질 펩타이드와 혼합하고, 그 후에 혼합에 참여하지 않은 나머지 기질 펩타이드 또는 단백질 인산화효소 A를 혼합물에 접촉시킨다. 이는 단백질 인산화효소 A와 기질 펩타이드를 미리 혼합 시키는 경우, 핵산 앱타머에 의한 활성 측정 전에 미리 인산화 반응이 시작, 진행 또는 종료되는 것을 방지하기 위함이며, 이와 같이 함으로써 단백질 인산화효소 A 활성을 실시간으로 측정할 수 있게 된다. In the method for measuring protein kinase A activity of the present invention, the nucleic acid aptamer of the present invention is first mixed with protein kinase A or a substrate peptide, and then the remaining substrate peptide or protein phosphorylase A is contacted with the mixture . This is to prevent initiation, progression or termination of the phosphorylation reaction before measuring the activity by the nucleic acid aptamer when the protein kinase A and the substrate peptide are mixed in advance. By doing so, the protein kinase A activity is measured in real time .
종래 인산화 펩타이드 검출을 위해 이용되어 온 항체 등이 펩타이드 기질의 인산화와 탈인산화 과정을 실시간으로 관찰하는 것이 어려워 주로 반응산물의 인산화 여부를 판별하는데 이용된 반면에, 본 발명의 활성 측정 방법을 이용하면, 기질 펩타이드의 실시간 인산화 관찰이 가능하다. 또한, 본 발명의 앱타머의 합성과정이 간편하고, 사용자가 원하는 표지를 하는 것이 수월하며, 경제적인 면에서도 큰 장점을 갖는다. It has been difficult to observe the phosphorylation and dephosphorylation process of the peptide substrate in real time because the antibody or the like which has been used for the detection of the conventional phosphorylated peptide is mainly used for determining the phosphorylation of the reaction product, , Real-time phosphorylation of substrate peptide is possible. Also, the process of synthesizing the aptamer of the present invention is simple, and it is easy for the user to perform the desired marking, and it is also advantageous in terms of economy.
본 발명의 단계 (c)에 있어서의 핵산 앱타머-인산화 펩타이드 결합을 검출하여 인산화효소 활성을 측정하는 방법은 표지의 종류에 따라 종래 공지된 다양한 방법을 제한없이 이용 가능한다. The method of detecting the nucleic acid aptamer-phosphorylated peptide bond and measuring the phosphorylase activity in the step (c) of the present invention can be used various methods known in the art depending on the kind of the label.
본 발명의 단백질 인산화효소 A 활성 측정 방법은 상술한 본 발명의 다른 일 양태인 핵산 앱타머를 이용하므로, 중복되는 내용에 관하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
The protein kinase A activity measuring method of the present invention uses a nucleic acid aptamer, which is another embodiment of the present invention described above. Therefore, redundant contents are omitted in order to avoid the excessive complexity described in the present specification.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 핵산 앱타머를 포함하는 단백질 인산화효소 A 활성 검출 키트를 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a kit for detecting a protein kinase A activity comprising the above-described nucleic acid aptamer.
본 발명의 검출 키트는 추가로 검출에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성할 수 있다. 또한, 표적 분자 검출 반응이 일어날 수 있는 구획이 나누어진 투명용기를 추가로 포함할 수 있다. The detection kit of the present invention may further comprise a composition, solution or device having one or more other components suitable for detection. In addition, it may further comprise a transparent container in which the compartment in which the target molecule detection reaction can take place is divided.
상기 키트에서 핵산 앱타머는 상술한 다양한 표지들로 표지화된 형태일 수 있고, 사용된 표지에 따라 당업계의 공지된 방법을 이용하여 효소 활성의 측정이 가능하다.
The nucleic acid aptamer in the kit may be in the form labeled with the various labels described above, and it is possible to measure the enzyme activity using known methods in the art according to the label used.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
(a) 본 발명은 인산화 펩타이드에 결합하는 핵산 앱타머를 제공한다. (a) The present invention provides a nucleic acid aptamer which binds to a phosphorylated peptide.
(b) 본 발명은 인산화 펩타이드를 검출하는 방법을 제공한다.(b) The present invention provides a method for detecting a phosphorylated peptide.
(c) 본 발명은 단백질 인산화효소 A 활성 측정 방법을 제공한다. (c) The present invention provides a method for measuring protein kinase A activity.
(d) 본 발명은 단백질 인산화효소 A 활성 검출 키트를 제공한다. (d) The present invention provides a protein kinase A activity detection kit.
(b) 본 발명의 핵산 앱타머를 이용하는 경우, 단백질 인산화효소 A에 의해 인산화된 펩타이드를 효과적으로 검출할 수 있다. (b) When the nucleic acid aptamer of the present invention is used, the peptide phosphorylated by protein kinase A can be effectively detected.
(e) 본 발명의 핵산 앱타머 및 방법을 이용하면, 펩타이드 인산화를 실시간으로 검출 가능하다. (e) Using the nucleic acid aptamer and method of the present invention, peptide phosphorylation can be detected in real time.
(f) 본 발명의 핵산 앱타머는 저렴한 비용으로 간편하게 합성이 가능하다.
(f) The nucleic acid aptamer of the present invention can be easily synthesized at low cost.
도 1은 비오틴이 결합된 비-인산화 펩타이드 및 인산화 펩타이드의 구조를 나타낸다.
도 2는 SELEX 방법의 절차에 대한 모식도를 나타낸다.
도 3은 1 사이클, 3 사이클, 6 사이클의 SELEX 후에 PCR를 통해 증폭된 DNA 산물의 전기영동 이미지를 나타낸다. PCR 산물을 2% 아가로스 겔에 전기영동 하였으며, "M"은 2-log DNA 마커(200 ng)을 나타내고, "PCR"은 PCR 산물을 나타낸다.
도 4는 6 사이클의 SELEX가 수행된 RNA 분자들의 인산화 펩타이드 특이적 결합 양상을 나타낸다. "10%"는 각 반응에 사용된 RNA의 10%에 해당하는 양의 RNA를 나타내고, "NP"는 비-인산화펩타이드-아비딘-아가로스를 나타내며, "P"는 인산화펩타이드-아비딘-아가로스를 나타낸다.
도 5는 RNA 앱타머 클론들의 결합 특이성 테스트 결과를 나타낸다. "10%"는 주입 RNA의 10%를 나타내고, "NP"는 비-인산화펩타이드-아비딘-아가로스를 나타내며, "P"는 인산화펩타이드-아비딘-아가로스를 나타낸다.
도 6은 RNA 앱타머들의 예측된 가장 안정한 2차 구조를 나타낸다. (a)는 표 1의 #1, (b)는 #2, (c)는 #9, (d)는 #21을 나타낸다.
그림 7은 선택된 RNA 앱타머 #9의 결합 친화도를 나타낸다. Figure 1 shows the structure of biotin-coupled non-phosphorylated peptides and phosphorylated peptides.
Figure 2 shows a schematic diagram of the procedure of the SELEX method.
Figure 3 shows electrophoretic images of DNA products amplified by PCR after 1 cycle, 3 cycles, 6 cycles of SELEX. The PCR product was electrophoresed on a 2% agarose gel, where "M" represents the 2-log DNA marker (200 ng) and "PCR" represents the PCR product.
FIG. 4 shows the phosphorylated peptide-specific binding pattern of 6 cycles of SELEX-performed RNA molecules. "10%" represents RNA in an amount corresponding to 10% of the RNA used in each reaction, "NP " represents non-phosphorylated peptide- avidin- agarose," P " represents phosphorylated peptide- avidin- .
Figure 5 shows the binding specificity test results of RNA aptamer clones. "10%" represents 10% of the injected RNA, "NP" represents the non-phosphorylated peptide-avidin-agarose and "P" represents the phosphorylated peptide-avidin-agarose.
Figure 6 shows the predicted most stable secondary structure of RNA aptamers. (a) shows # 1 in Table 1, (b) shows # 2, (c) shows # 9, and (d) shows # 21.
Figure 7 shows the binding affinity of the selected
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .
실시예Example
실시예 1: SELEX 방법에 의한 앱타머 발굴Example 1: Detection of aptamer by SELEX method
1014개 이상의 구조적 다양성을 갖고 있는 무작위 염기 서열의 핵산 라이브러리로부터 특이적으로 목표분자에 결합하는 핵산 압타머를 발굴해 내는 기법인 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)를 이용하여 인산화된 펩타이드에 결합하는 앱타머를 발굴하였다(참조: 도 2). 펩타이드 기질은 GLRRASLG 서열을 이용하였으며, 인산화 형태는 GLRRAS(p)LG이고, 비오틴과 결합시키는 경우 라이신을 이용하여 GLRRASLGK-비오틴 복합체를 형성시켰으며, 이의 인산화된 형태는 GLRRAS(p)LG-비오틴 복합체 형태였다(참조: 도 1). 먼저 구조적 다양성을 갖고 있는 핵산 라이브러리를 얻기 위하여 다음과 같이 내부에 무작위적인 염기서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드를 준비하였다 [5'-GGGAATTCGAGCTCCTGACA (N: 90) ATTCGAAGACGTCCAGCTGA-3']. 이를 주물로 이용해서, EcoRI, SacI 제한효소에 의해 인지되는 염기서열 및 시험관 내 전사반응에 이용할 T7 프로모터를 갖고 있는 정방향 프라이머 [5'-TTCTAATACGACTCACTATAGGGAATTCGAGCTCCTGACA-3']와 PvuII, AatII 제한효소 서열을 갖고 있는 역방향 프라이머 [5'-TCAGCTGGACGTCTTCGAAT-3']를 사용하여 PCR를 수행하여 이중나선 DNA를 얻었다. 얻어진 DNA 상태의 라이브러리는 T7 RNA 폴리머레이즈를 이용한 전사반응(in vitro transcription)을 통해 RNA 라이브러리로 만들었다. 비특이적으로 포스페이트(인)와 선택과정에 이용되는 아비딘-아가로스(avidin-agarose)에 결합하는 RNA들을 배제 시키기 위하여 10 μM 농도의 ATP (adenosine tri-phosphate)가 첨가된 완충용액(0.01 M PBS pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2)에서 아비딘-아가로스에 대해 음성 선택(negative selection)을 수행하였다. 아비딘-아가로스에 결합하지 않은 RNA 만을 취해 인산화되어 있는 10 μM 농도의 포스포펩타이드-비오틴 기질과 반응시켰다. 특이적으로 결합하지 않은 RNA들은 3회에 걸쳐 씻어 내었다. 포스포펩타이드-비오틴-아비딘-아가로스 구조에 특이적으로 결합되어 있는 RNA들은 1 M NaCl, 10 mM NaOH 용액에 상온에서 5분간 섞어주며 반응시킨 후 페놀:클로로포름:아이소아밀알콜 용액이 25:24:1의 비율로 구성된 용액을 1:1의 비율로 넣어 균일하게 잘 섞어준 다음 원심분리를 이용하여 RNA가 포함된 상층액만 얻어내었다. 얻어진 RNA는 에탄올 침전법(2 배 부피의 100% 에탄올, 1/10 부피의 NaOAc, 1 μg 글리코겐 첨가)과 원심분리를 이용하여 정제한 다음 RT-PCR을 이용하여 증폭해 DNA로 전환시켰다. RT-PCR 조건 및 과정을 간단히 설명하면, M-MLV 역 전사효소(reverse transcriptase)와 각각의 역방향 프라이머를 이용하여 단일 가닥 DNA(single strand DNA)를 만든 다음 Go taqㄾgreenmastermix(Promega)를 이용하여 (95℃ 5분, [95℃ 30초, 54℃ 30초, 72℃ 30초] 20 사이클, 72℃ 8분 30초)조건으로 PCR을 수행하여 결론적으로 RNA 앱타머들을 DNA 형태로 증폭하였다. 증폭된 DNA는 in vitro 전사를 통해 다시 한번 RNA로 만들었으며 이는 다음 SELEX 사이클에 이용하였고 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머가 증폭될 때까지 이러한 사이클을 반복하였다.10 Systematic Evolution of Ligands by Exonential Enrichment (SELEX), a technique for identifying nucleic acid abstamators that bind specifically to a target molecule from a nucleic acid library of randomized nucleotide sequences with more than 14 structural variants, (Fig. 2). The peptide substrate used GLRRASLG sequence, the phosphorylated form was GLRRAS (p) LG, and when coupled with biotin, the GLRRASLGK-biotin complex was formed using lysine. Its phosphorylated form was GLRRAS (p) LG-biotin complex (Fig. 1). First, to obtain a nucleic acid library having structural diversity, an oligonucleotide composed of a random base sequence was prepared as follows [5'-GGGAATTCGAGCTCCTGACA (N: 90) ATTCGAAGACGTCCAGCTGA-3 ']. Using this as a casting, the primers [5'-TTCTAATACGACTCACTATAGGGAATTCGAGCTCCTGACA-3 '] having the nucleotide sequence recognized by EcoRI and SacI restriction enzymes and the T7 promoter used for in vitro transcription reaction and the PvuII and AatII restriction enzyme sequences PCR was performed using the reverse primer [5'-TCAGCTGGACGTCTTCGAAT-3 '] to obtain double helix DNA. The obtained DNA state library was made into an RNA library through in vitro transcription using T7 RNA polymerase. In order to exclude RNAs that bind to phosphate (phosphorus) and the avidin-agarose used in the selection process, a buffer solution (0.01 M PBS pH from 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM MgCl 2) avidin-agarose was carried out for the negative selection (negative selection). Only the RNA not bound to the avidin-agarose was taken and reacted with a 10 μM phosphopeptide-biotin substrate which was phosphorylated. Unspecifically unbound RNAs were washed three times. The RNAs specifically bound to the phosphopeptide-biotin-avidin-agarose structure were mixed in 1 M NaCl, 10 mM NaOH solution for 5 minutes at room temperature. After the reaction, phenol: chloroform: isoamyl alcohol solution was added at 25:24 : 1 was added at a ratio of 1: 1 and homogeneously mixed well. Then, only supernatant containing RNA was obtained by centrifugation. The obtained RNA was purified by ethanol precipitation (2 × volume of 100% ethanol, 1/10 volume of NaOAc, 1 μg of glycogen) and centrifugation, and amplified by RT-PCR to convert to DNA. To simplify the RT-PCR conditions and procedures, a single strand DNA was prepared using M-MLV reverse transcriptase and each reverse primer and then amplified using Go tau ㄾ greenmastermix (Promega) PCR was carried out under conditions of 95 ° C for 5 minutes, [95 ° C for 30 seconds, 54 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds] and 20 cycles at 72 ° C for 8 minutes and 30 seconds). As a result, RNA aptamers were amplified in DNA form. The amplified DNA was again made into RNA through in vitro transcription, which was used for the next SELEX cycle and this cycle was repeated until the specifically binding RNA aptamer was amplified.
6회의 반복적인 SELEX 사이클을 수행하였다. 도 3에서 보는 바와 같이 사이클이 진행됨에 따라 초기의 지저분하던 PCR 밴드가 6 사이클 후에 한 밴드로 뚜렷하게 증폭되었음을 확인할 수가 있었으며, 이는 음성(negative) 및 양성(positive) 선택(selection)에도 쉽게 살아남을 수 있는 특이적인 RNA들이 증폭되었음을 시사한다.
Six repetitive SELEX cycles were performed. As shown in FIG. 3, as the cycle progressed, it was confirmed that the initial dirty PCR band was amplified clearly in one band after 6 cycles. It can be easily survived in negative and positive selection Suggesting that specific RNAs were amplified.
실시예 2: 아비딘-아가로스 복합체를 이용한 결합 분석 Example 2: Binding analysis using avidin-agarose complex
6 사이클의 SELEX를 수행한 RNA 분자들을(SE-6) 32P 동위원소로 5' 말단에 표지하여 200 nM의 RNA와 10 μM의 비-포스포펩타이드-비오틴(Non-phosphopeptide-biotin) 혹은 포스포펩타이드-비오틴 아비딘-아가로스 복합체에 반응시켜 보았다. 풀-다운(Pull-down) 실험은 SELEX 사이클에서의 양성 선택과 동일하게 수행하였으며, 특이적으로 결합된 RNA들은 6% 폴리아크릴아마이드-8 M 유레아 겔(urea gel)에 전기영동 하였고 X-ray 필름을 이용하여 결과를 확인하였다. 결과로서, 비-포스포펩타이드-비오틴-아비딘-아가로스 복합체에는 결합하지 않고 포스포펩타이드-비오틴-아비딘-아가로스 구조에 특이적으로 결합함을 확인할 수 있었다(참조: 도 4).
Six cycles of SELEX-treated RNA molecules were labeled at the 5 'end with (SE-6) 32 P isotope and incubated with 200 nM RNA and 10 μM non-phosphopeptide-biotin or force Peptide-biotin-avidin-agarose complex. Pull-down experiments were performed in the same manner as the positive selection in the SELEX cycle, specifically bound RNAs were electrophoresed on a 6% polyacrylamide-8 M urea gel and X-ray The film was used to confirm the results. As a result, it was confirmed that it specifically binds to the phosphopeptide-biotin-avidin-agarose structure without binding to the non-phosphopeptide-biotin-avidin-agarose complex (see FIG.
실시예 3: 발굴된 핵산 앱타머의 특성Example 3: Characterization of the extracted nucleic acid aptamer
6번의 SELEX 사이클을 수행하여 증폭된 RNA 들로부터 특이적으로 결합하는 앱타머들을 추려내기 위해서 클로닝(cloning)을 한 후 각각의 클론(clone)들에 대해서 pGEM-T easy vector 시스템(Promega 사)을 이용하여 염기서열 분석을 수행하였다. 증폭된 앱타머들의 염기서열들은 표 1에 나타내었다. 표 1에서 5' 말단의 고정된 염기서열은 5'-GGGAATTCGA GCTCCTGACA-3'이고, 3' 말단의 고정된 염기서열은 5'- ATTCGAAGACGTCCAGCTGA-3'이며, 괄호 안의 숫자는 중복되어 나타난 동일한 염기서열을 가진 클론 들의 개수를 나타낸다.Six SELEX cycles were performed to clone the aptamers that specifically bind to the amplified RNAs, followed by pGEM-T easy vector system (Promega) for each clone Were used for sequencing. The nucleotide sequences of the amplified aptamers are shown in Table 1. In Table 1, the fixed base sequence at the 5 'end is 5'-GGGAATTCGA GCTCCTGACA-3', the fixed base sequence at the 3 'end is 5'-ATTCGAAGACGTCCAGCTGA-3', and the numbers in parentheses indicate the same base sequence Lt; / RTI >
얻어진 각 클론들 중에서 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머들을 구별해 내기 위해 각각의 RNA들을 in vitro 전사를 통해 얻어낸 후, 위에서 설명한 풀-다운 실험과 동일한 방법으로 동위원소를 이용하여 결합 양상을 테스트 하였다(참조: 도 5). 실험 조건은 다음과 같았다. 32P 동위원소로 5' 말단에 표지하여 100 nM의 RNA와 10 mM의 비-포스포펩타이드-비오틴 또는 포스포펩타이드-비오틴과 아비딘-아가로스 복합체에 반응시켜 보았다. 몇몇 클론들은(#16, 20, 24) SELEX 과정 중에 비특이적으로 증폭된 RNA들이었다. #1, 2, 5, 9, 21 23은 비-포스포펩타이드-아비딘 아가로스 복합체에 결합하지 않고 특이적으로 포스포펩타이드-비오틴-아비딘-아가로스 복합체에 결합하였다. 도 5에서 "10%"는 주입 RNA의 10%, "NP"는 비-포스포펩타이드-아비딘-아가로스, "P"는 포스포펩타이드-아비딘-아가로스를 나타낸다. #1, #2, #5, #9, #21, #23 클론들은 포스포펩타이드-아비딘-아가로스에 특이적 결합을 보여준 클론들을 나타낸다.To distinguish between specifically cloned RNA aptamers from each clone obtained, the individual RNAs were obtained in vitro by transcription and then tested for binding patterns using isotopes in the same manner as the pull-down experiments described above (See FIG. 5). The experimental conditions were as follows. Were labeled at the 5 'end with 32 P isotope and reacted with 100 nM of RNA and 10 mM of non-phosphopeptide-biotin or phosphopeptide-biotin and avidin-agarose complexes. Some clones (# 16, 20, 24) were nonspecifically amplified RNAs during the SELEX process. # 1, 2, 5, 9, and 21 23 bound specifically to the phosphopeptide-biotin-avidin-agarose complex without binding to the non-phosphopeptide-avidin agarose complex. In Fig. 5, "10%" represents 10% of the injected RNA, "NP" represents non-phosphopeptide-avidin-agarose and "P" represents phosphopeptide-avidin-agarose.
이 가운데 클론 #1, 2, 9, 21이 상대적으로 강한 결합 양상을 보였으며 RNA structure program(Mathews lab, Version 5.1)을 이용해 도출해낸 예상된 2차 구조들 중 가장 안정한 구조를 도 6에 나타내었다. 프로그램에 의해 여러 가능한 구조들이 예측되었으며 이 가운데 가장 안정한 구조들은 모두 기다란 선형 구조를 보여주었다.
Among these,
실시예 4: 발굴된 핵산 앱타머의 인산화 기질에 대한 특이적인 결합도 측정Example 4: Measurement of specific binding to the phosphorylated substrate of an extracted nucleic acid aptamer
RNA 앱타머 클론 가운데 비-포스포펩타이드-아비딘-아가로스에 대한 결합이 가장 약하고 상대적으로 포스포펩타이드-아비딘-아가로스 복합체에 강하게 결합하는 클론 #9을 이용하여 결합도를 측정하였다(참조: 도 7). 증가되는 농도의 FITC-표지된 RNA 앱타머 #9와 10 μM의 비오티닐화 포스포펩타이드(biotinylated phosphopeptide)를 이용하였다. 결합 RNA들의 형광 강도를 형광광도계(HORIBA Japan)를 이용하여 측정하였다. 여기(excitation) 및 방출(emission) 파장은 각각 494 nm 및 520 nm 였다. 계산된 결합 친화도(Kd)는 1.5±0.8 μM 이었다.
The degree of binding was measured using
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Phosphorylated Peptide-Specific Nucleic Acid Aptamer <130> PN140423 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phosphorylated Peptide-Specific Nucleic Acid Aptamer #1 <400> 1 cggccttggg aggggcttgg gacactgggt agtgtcttac aaggccaggg cctgtttgga 60 atgctcattg ttcgtggtct gtgcgggtgc g 91 <210> 2 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phosphorylated Peptide-Specific Nucleic Acid Aptamer #5 <400> 2 acgtaagcga gacacctttg ggtcaagagg gtctaggctt tatgcgctag gttgacccgt 60 tggacgcgct acactctttg ttaacggggc 90 <210> 3 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phosphorylated Peptide-Specific Nucleic Acid Aptamer #9 <400> 3 ttgttagagg gtcatggtaa cgacgtgccg tccgtgctga taagctagtt gttacgcatg 60 gtaacagtct cgggccgaac gctgggtgcg 90 <210> 4 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phosphorylated Peptide-Specific Nucleic Acid Aptamer #21 <400> 4 tttggatttc gaaaggttgc aaggttgagt tcgtagcagg aagctcggcg agagtggtat 60 gtgttggcga gcttgagggg gtcttggcc 89 <210> 5 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phosphorylated Peptide-Specific Nucleic Acid Aptamer #2 <400> 5 cgagagtggg tcctggactg ctagctcgta gctgcgaggg aatgcgcagt ttgcagggtt 60 tcgtttagga gtatcgtgtc agcattgggg 90 <210> 6 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phosphorylated Peptide-Specific Nucleic Acid Aptamer #23 <400> 6 gcgtagctcg gcgctgagtc acaactacaa ctagcaagtg tctagaactg gtctgtgagt 60 gggatcaggc tggagttcac gtgaagggca 90 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> substrate peptide for protein kinase A <400> 7 Gly Leu Arg Arg Ala Ser Leu Gly 1 5 <110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Phosphorylated Peptide-Specific Nucleic Acid Aptamer <130> PN140423 <160> 7 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phosphorylated Peptide-Specific Nucleic Acid Aptamer # 1 <400> 1 cggccttggg aggggcttgg gacactgggt agtgtcttac aaggccaggg cctgtttgga 60 atgctcattg ttcgtggtct gtgcgggtgc g 91 <210> 2 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phosphorylated Peptide-Specific Nucleic Acid Aptamer # 5 <400> 2 acgtaagcga gacacctttg ggtcaagagg gtctaggctt tatgcgctag gttgacccgt 60 tggacgcgct acactctttg ttaacggggc 90 <210> 3 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phosphorylated Peptide-Specific Nucleic Acid Aptamer # 9 <400> 3 ttgttagagg gtcatggtaa cgacgtgccg tccgtgctga taagctagtt gttacgcatg 60 gtaacagtct cgggccgaac gctgggtgcg 90 <210> 4 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phosphorylated Peptide-Specific Nucleic Acid Aptamer # 21 <400> 4 tttggatttc gaaaggttgc aaggttgagt tcgtagcagg aagctcggcg agagtggtat 60 gtgttggcga gcttgagggg gtcttggcc 89 <210> 5 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phosphorylated Peptide-Specific Nucleic Acid Aptamer # 2 <400> 5 cgagagtggg tcctggactg ctagctcgta gctgcgaggg aatgcgcagt ttgcagggtt 60 tcgtttagga gtatcgtgtc agcattgggg 90 <210> 6 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phosphorylated Peptide-Specific Nucleic Acid Aptamer # 23 <400> 6 gcgtagctcg gcgctgagtc acaactacaa ctagcaagtg tctagaactg gtctgtgagt 60 gggatcaggc tggagttcac gtgaagggca 90 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> substrate peptide for protein kinase A <400> 7 Gly Leu Arg Arg Ala Ser Leu Gly 1 5
Claims (11)
A nucleic acid aptamer consisting of a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 6 that bind to a phosphorylated peptide phosphorylated by protein kinase A;
The nucleic acid aptamer according to claim 1, wherein the nucleic acid aptamer is DNA or RNA, and the nucleic acid aptamer is RNA. The nucleic acid aptamer according to any one of claims 1 to 6, wherein the thymidine is uracil.
The nucleic acid aptamer according to claim 1, wherein the aptamer has a detectable label attached thereto.
5. The nucleic acid aptamer of claim 4, wherein the detectable label is an optical label, an electrochemical label, a radioisotope, or a combination thereof.
(a) 서열목록 제1서열 내지 제6서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 핵산 앱타머를 서열목록 제7서열의 아미노산 서열로 이루어진 올리고펩타이드인 비-인산화 기질 펩타이드 또는 단백질 인산화효소 A와 혼합하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 준비한 혼합물에 대하여 상기 혼합물에 포함되지 않은 단백질 인산화효소 A 또는 서열목록 제7서열의 아미노산 서열로 이루어진 올리고펩타이드인 비-인산화 기질 펩타이드를 접촉(contacting)하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 결과물에서 핵산 앱타머-인산화 펩타이드 결합을 검출하여 인산화효소 활성을 측정하는 단계.
A method for measuring protein kinase A activity comprising the steps of:
(a) a nucleic acid aptamer consisting of a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 6, with a non-phosphorylated substrate peptide or protein phosphorylase A, an oligopeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: Mixing;
(b) contacting the mixture prepared in step (a) with a non-phosphorylated substrate peptide which is an oligopeptide consisting of the amino acid sequence of protein kinase A or SEQ ID NO: 7 which is not included in the mixture; And
(c) measuring the phosphorylase activity by detecting the nucleic acid aptamer-phosphorylated peptide bond in the result of step (b).
A kit for detecting protein kinase A activity comprising the nucleic acid aptamer of any one of claims 1, 2, 4, and 5.
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