KR101702571B1 - 오크라톡신과 푸모니신을 생산하지 않는 균주의 선별 방법 및 이를 이용하여 선별된 균주로 발효하여 제조된 무독소 된장 - Google Patents

오크라톡신과 푸모니신을 생산하지 않는 균주의 선별 방법 및 이를 이용하여 선별된 균주로 발효하여 제조된 무독소 된장 Download PDF

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Abstract

본 발명은 오크라톡신과 푸모니신을 생산하지 않는 균주의 선별 방법 및 이를 이용하여 선별된 균주로 발효하여 제조된 무독소 된장에 관한 것으로, 오크라톡신과 푸모니신 생성 여부를 비교적 간단한 방법을 통해 신속하게 선별할 수 있다. 또한, 선별된 균주를 실제 식품에 적용시켜 본 결과, 실험과 동일하게 무독소임이 확인되었다.

Description

오크라톡신과 푸모니신을 생산하지 않는 균주의 선별 방법 및 이를 이용하여 선별된 균주로 발효하여 제조된 무독소 된장 {Screening method of strain not to produce ochratoxin and fumonisin and mycotoxin free soybean paste therefrom}
본 발명은 오크라톡신과 푸모니신을 생산하지 않는 균주의 선별 방법 및 이를 이용하여 선별된 균주로 발효하여 제조된 무독소 된장에 관한 것이다.
현대 사회에서는 식품의 안전 관리에 대한 중요성이 증대되고 있으며, 식품 안정성에 대한 소비자의 요구도 증대하고 있다.
미생물을 이용하는 발효 식품의 경우, 미생물이 분비하는 독소들로 인해 식품 안정성에 대한 검증이 새롭게 요구되고 있는데, 장류를 이용한 음식을 빈번히 섭취하는 식문화를 갖는 우리나라에서 발효 장류의 안전성에 대한 체계적인 연구는 식품 안전성 측면에서 매우 시급한 문제이다.
실제로, 한국 전통 발효 식품인 된장의 제조에 오랜 기간 사용되어 안전하다고 여겨져 온 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)에서, 다양한 곰팡이독소 (mycotoxin)의 생성능이 보고된 바가 있기도 하다.
유럽식품안전청은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger, 흑국균)를 안전하다고 여겨지는 기준인 QPS의 현황에 포함시키지 않고 있으며, 이 균에 대한 안전성 평가 연구를 수행하고 있다.
하지만, 2009년 QPS에 등재되었을 때부터 시작하여 가장 최근에 보고된 2013년 보고서에서도 QPS 현황에 이 균을 포함시키지 않고 있다 (Aspergillus niger: Potential for mycotoxin production, therefore not suitable for QPS status). 또한, 이 균을 발효식품에 빈번히 이용하는 한국을 비롯한 아시아에서도 이 균들의 이용을 재평가해야 한다는 주장들이 제기되고 있기도 하다.
더욱이, 우리나라에서는 메주, 된장, 고추장 등의 발효식품에서 곰팡이독소인 오크라톡신 A가 검출된 사례가 있어, 전통 발효식품에 대한 안전성을 확보하기 위해서는, 오크라톡신, 아플라톡신, 푸모니신을 포함하는 곰팡이독소에 대한 연구가 더욱 필요하다 할 것이다.
대한민국 특허공개번호 제10-2013-0054477호 (공개일자: 2013년 05월 27일)에는, 옥수수에서 발생하는 F. verticillioides 균주를 다른 푸모니신 생성 추정 G. fujikuroi 종 복합체 소속 균주들과 구별할 수 있는 신규한 종 특이 올리고뉴클레오티드(프라이머) 조합 및 이를 포함하는 키트가 기재되어 있다. 또한, 대한민국 특허공개번호 제10-2014-0034004호 (공개일자: 2014년 03월 19일)에는, 신규한 아플라톡신 B1 검출용 표지물질 및 이를 포함한 아플라톡신 B1 검출용 키트가 기재되어 있다.
본 발명에서는 곰팡이독소로 말미암은 발효 식품의 안정성 문제를 해결하고자, 다중복합 PCR 분석법과 HPLC 분석법을 이용하여, 곰팡이독소인 오크라톡신과 푸모니신을 생산하지 않는 균주를 선별할 수 있는 방법을 제공하고, 이를 통해 선별된 균주를 된장 제조를 위한 스타터로 이용함으로써, 발효 식품의 안전성을 확보하고자 한다.
본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 곰팡이독소 생성 균주 검출용 프라이머 세트를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하는 것을 특징으로 하는 곰팡이독소 비생성 균주의 선별 방법을 제공한다. 상기 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행할 경우, 곰팡이독소로 오크라톡신과 푸모니신을 생성하지 않는 균주를 효과적으로 선별할 수 있다.
한편, 본 발명의 곰팡이독소 비생성 균주 선별 방법은 본 발명의 프라이머 세트를 사용함에 특징이 있고, 균주 선별시 사용하는 PCR 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 PCR 방법을 이용할 수 있으므로, PCR에 대한 구체적인 기재는 생략하기로 한다.
한편, 상기 본 발명의 프라이머 세트 또는 곰팡이독소 비생성 균주의 선별 방법에 있어서, 상기 곰팡이독소는 일 예로 오크라톡신 A, 푸모니신 B1, 푸모니신 B2 중 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
한편, 상기 본 발명의 곰팡이독소 비생성 균주의 선별 방법에 있어서, 상기 균주는 일 예로 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger aggregates)일 수 있다.
본 발명에서 개발한 프라미어 세트를 이용할 경우, 오크라톡신/푸모니신 비생성 균주를 경제적이고, 간단한 방법을 통해 신속하게 선별할 수 있다. 또한, 이와 같은 방법을 통해 선별한 균주를 실제 적용 모델인 된장에 적용시켜 본 결과, 예측한 결과와 동일하게 나와, 실제 제품에도 충분히 적용 가능한 것으로 판단되었다.
도 1은 본 발명의 프라이머 세트를 적용하여 오크라톡신, 푸모니신 유전자의 발현 여부를 확인한 PCR 분석 결과이다. 도 1에서 A는 본 발명의 프라이머 세트를 적용하여 오크라톡신 유전자 2종, 푸모니신 유전자 2종의 발현 여부를 확인한 PCR 결과이고, 도 1에서 B는 PCR의 인터날 컨트롤 (internal control)로서, 베타-투불린(β- tubulin ) 대한 PCR 결과이다.
도 2는 오크라톡신 A에 대한 스탠다드 유효화 분석 결과이다.
도 3는 푸모니신에 대한 스탠다드 유효화 분석 결과이다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 실시예 1: 본 발명에서 개발한 프라이머를 이용한 오크라톡신 / 푸모니신 비생산 균주의 선별]
아스퍼질러스 나이거 (A. niger aggregates) 38 종에 대해, 본 발명에서 개발한 프라이머 세트를 적용하여, 다중 복합 유전자 분석 기법과 HPLC 분석법을 통해, 오크라톡신과 푸모니신의 비생성 균주를 선별하고자 하였다.
오크라톡신/푸모니신 각각 2개, 총 4개의 유전자 (PKS15KS / PKS15C - MeT / fum1/ fum19 ) 에 대해 특이적인 프라이머 세트를 제작하고, 다중 복합 PCR 분석 기법을 이용하는 1차 스크리닝을 통해, 오크라톡신 및 푸모니신의 생성 여부를 확인하였다. 다중 복합 PCR 분석법에 사용된 본 발명의 프라이머 세트는 하기 표 1에 나타내었다.
본 발명의 프라이머 세트
프라이머 시퀀스 (5′>3′) Amplicon
(bp)		 유전자 서열목록
PKS15KS-f CAATGCCGTCCAACCGTATG 776 PKS15KS
서열번호 1
PKS15KS-r CCTTCGCCTCGCCCGTAG 서열번호 2
PKS15C-MeT-f GCTTTCATGGACTGGATG 998 PKS15CMeT
서열번호 3
PKS15C-MeT-r CATTTCGTTGATCCCATCG 서열번호 4
fum1.2f CCATCGTGGGATCTCAGAGATG 557 fum1
서열번호 5
fum1.2r CGCCAATGTCAAGCATATGGTC 서열번호 6
fum19.2f CCACGCTGTTGGGACTGAACTA 536 fum19
서열번호 7
fum19.2r GCGTTGCGAAGTGTTCAATAGC 서열번호 8
* 증폭 조건은 4분 동안 95℃; 1분 동안 95℃의 35 사이클, 1분 동안 60℃, 1분 동안 72℃; 7분 동안 72℃. 4쌍의 프라이머 세트를 사용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하면, 두 종의 오크라톡신 생합성 유전자와 두 종의 푸모니신 생합성 유전자가 증폭됨.
실험 결과, 오크라톡신 생합성에 관여하는 2개의 유전자 중, 1개 유전자의 PCR 밴드가 없는 종은 HPLC 분석 결과에서도 오크라톡신이 검출되지 않았고, 푸모니신 생합성에 관여하는 2개의 유전자 중, 1개 유전자의 PCR 밴드가 없는 종은 HPLC 분석 결과에서 푸모니신이 검출되지 않았다. 이들 유전자 분석 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1은 상기 표 1에 기재된 본 발명의 프라이머 세트를 적용하여 오크라톡신 및 푸모니신의 발현 여부를 확인한 PCR 분석 결과이다. 도 1에서 A는 본 발명의 프라이머 세트를 적용하여 오크라톡신 유전자 2종 (PKS15KS , PKS15C - MeT), 푸모니신 유전자 2종 (fum1 , and fum19)의 발현 여부를 확인한 PCR 결과이고, 도 1에서 B는 PCR의 인터날 컨트롤 (internal control)로서 베타-투불린(β- tubulin ) 대한 PCR 결과이다. 도 1에서, M은 100 bp DNA ladder; C는 주형(template) 없이 수행한 PCR 대조군을 의미함. 1, FMB S993; 2, FMB S610; 3, FMB S1025; 4, FMB S984; 5, FMB S856; 6, FMB S1000; 7, FMB S994; 8, FMB S987; 9, FMB S983; 10, FMB S900; 11, FMB S901; 12, FMB S907; 13, FMB S1004; 14, FMB S982; 15, FMB S40280; 16, FMB S46497; 17, FMB S42589; 18, FMB S358; 19, FMB S980; 20, FMB S991; 21, FMB S1001; 22, FMB S990; 23, FMB S623; 24, FMB S999; 25, FMB S988; 26, FMB S6906; 27, FMB S1002; 28, FMB S37; 29, FMB S986; 30, FMB S613; 31, FMB S1003; 32, FMB S612.
한편, 유전자 분석 결과에서 모든 유전자에 대해 밴드 패턴을 보였을지라도 HPLC 분석 결과에서는 독소가 검출되지 않은 다수의 균주도 존재하였다. 그 비율은 오크라톡신의 경우가 3.1%, 푸모니신의 경우가 72%이었다.
한편, 상기의 유전자 분석 결과와 HPLC 분석 결과를 요약해서 하기 표 2에 나타냈다.
아스퍼질러스 나이거(A. niger aggregates) 균주의 오크라톡신, 푸모니신의 생성 여부 검출을 위한 PCR 결과 및 HPLC 분석 결과 정리
균주 PKS15KS PKS15C - MeT fum1 fum19 종합적인 멀티플렉스 PCR 패턴 HPLC
(OTA)		 HPLC
(FB1, FB2)
FMB S993 - + + + ONFP - + (FB2)
FMB S610 - - - - ONFN - -
FMB S1025 - + + + ONFP - -
FMB S984 + + + + OPFP + -
FMB S856 - + + + ONFP - -
FMB S1000 + + + + OPFP + -
FMB S994 - - + + ONFP - -
FMB S987 - - - + ONFN - -
FMB S983 + + + + OPFP + -
FMB S900 - - - - ONFN - -
FMB S901 - - - - ONFN - -
FMB S907 - - + + ONFP - -
FMB S1004 + + + + OPFP + -
FMB S982 + + + + OPFP + -
FMB S40280 - - - - ONFN - -
FMB S46497 - - + + ONFP - -
FMB S42589 - - + + ONFP - -
FMB S358 - - + + ONFP - -
FMB S980 + + + + OPFP + -
FMB S991 - - + + ONFP - -
FMB S1001 + + + + OPFP + -
FMB S990 - - + + ONFP - -
FMB S623 - - - - ONFN - -
FMB S999 + + + + OPFP + + (FB1)
FMB S988 - - + + ONFP - -
FMB S6906 + + + + OPFP + -
FMB S1002 + + + + OPFP - -
FMB S37 + + + + OPFP + -
FMB S986 + + + + OPFP + -
FMB S613 - - + + ONFP - -
FMB S1003 + + + + OPFP + -
FMB S612 - - + + ONFP - + (FB2)
* ONFN는 'PKS15KS 또는 PKS15C - MeT'와 'fum1 또는 fum19'에 대해 PCR 밴드를 보이지 않은 균주를 나타냄; ONFP는 'PKS15KS 또는 PKS15C - MeT'에 대해서는 PCR 밴드를 보이지 않으나, fum1 및 fum19에 대해서는 모두 밴드를 보이는 균주를 나타냄; OPFP는 PKS15KS, PKS15C - MeT, fum1 및 fum19에 대해 밴드를 모두 보이는 균주를 나타냄; OTA, FB1 또는 FB2의 검출에 대해 '+'는 양성(positive), '-'는 음성(negative)을 의미함. 이때, OTA는 오크라톡신 A를 의미하고, FB1는 푸모니신 B1를 의미하며, FB2는 푸모니신 B2를 의미함.
이상의 결과로부터, 본 발명의 프라이머 세트를 사용할 경우, 오크라톡신 A, 푸모니신 B1 또는 B2를 생산하지 않는 균주를 효과적으로 선별할 수 있음을 최종 확인할 수 있었다.
한편, 오크라톡신의 스탠다드 유효화 분석 결과와 검출 수준은 도 2 및 표 3에 나타내었다. 도 2는 오크라톡신 A에 대한 스탠다드 유효화 분석 결과이고, 표 3은 HPLC의 종합적인 결과로 반복 횟수(repeat)에 따른 오크라톡신 A의 검출 수준을 수치로 보여준다 (OTA 검출에 대해 '+'는 양성, '-'는 음성을 의미함. 이때, OTA는 오크라톡신 A를 의미함).
오크라톡신 A (OTA)에 대한 검출 수준 및 HPLC의 종합적 결과
균주 Repeat 1 Repeat 2 Repeat 3 Repeat 4 HPLC의 종합적인 결과
검출 수준 (ppb)
FMB S993 - - - - -
FMB S610 - -
FMB S1025 - -
FMB S984 0.17 0.24 0.62 0.67 +
FMB S856 - - - -
FMB S1000 0.67 0.08 +
FMB S994 - -
FMB S987 - -
FMB S983 5.79 +
FMB S900 - -
FMB S901 - -
FMB S907 - - - -
FMB S1004 0.04 0.32 +
FMB S982 3.27 3.67 3.73 4.08 +
FMB S40280 - - - -
FMB S46497 - -
FMB S42589 - - - - -
FMB S358 - - - -
FMB S980 31.32 +
FMB S991 - - -
FMB S1001 0.05 0.35 0.02 +
FMB S990 - - - - -
FMB S623 - - - -
FMB S999 0.19 0.04 +
FMB S988 - -
FMB S6906 82.65 +
FMB S1002 - - - -
FMB S37 0.27 +
FMB S986 0.02 0.08 +
FMB S613 - - - - -
FMB S1003 0.27 +
FMB S612 - - - -
실험 결과, 도 2 및 표 3에서 보는 바와 같이, 신뢰도 높게 오크라톡신의 생성 여부를 확인할 수 있었다.
한편, 푸모니신의 스탠다드 유효화 분석 결과와 검출 수준은 도 3 및 표 4에 나타내었다. 도 3는 푸모니신에 대한 스탠다드 유효화 분석 결과이고, 표 4는 HPLC의 종합적인 결과로 반복 횟수 (repeat)에 따른 푸모니신의 검출 수준을 수치로 보여준다 (FB1, FB2 검출에 대해 '+'는 양성, '-'는 음성을 의미함. 이때, FB1은 푸모니신 B1을 의미하고, FB2는 푸모니신 B2를 의미함).
균주 Repeat 1 Repeat 2 Repeat 3 HPLC의 종합적인 결과
검출 수준 (ppb)
FMB S993 752.58 +(FB2)
FMB S610 - - - -
FMB S1025 - - -
FMB S984 - - -
FMB S856 - - -
FMB S1000 - - - -
FMB S994 - - -
FMB S987 - - -
FMB S983 - - -
FMB S900 - - - -
FMB S901 - -
FMB S907 - - -
FMB S1004 - - -
FMB S982 - - -
FMB S40280 - - - -
FMB S46497 - - -
FMB S42589 - - -
FMB S358 - -
FMB S980 - - -
FMB S991 - - -
FMB S1001 - -
FMB S990 - - - -
FMB S623 - - - -
FMB S999 704.96 +(FB1)
FMB S988 - - -
FMB S6906 - - -
FMB S1002 - -
FMB S37 - - -
FMB S986 - - -
FMB S613 - - -
FMB S1003 - - -
FMB S612 443.17 +(FB2)
실험 결과, 도 2 및 표 3에서 보는 바와 같이, 신뢰도 높게 오크라톡신의 생성 여부를 확인할 수 있었다.
상기의 1차 선별을 통해, 오크라톡신/푸모니신 동시 비생산인 18종의 아스퍼질러스 나이거(A. niger aggregates) 균주 라이브러리를 확보하였다.
한편, 추가적으로 확보된 6종의 아스퍼질러스 나이거(A. niger)에 대해서도 HPLC 분석을 통해, 오크라톡신/푸모니신 동시 비생성능을 보인 5종의 균주를 더 확보하였다. 추가 6종에 대한 HPLC 분석 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
추가 6종에서 대한 오크라톡신/푸모니신 생성 여부 확인
균주 ID HPLC
(Ochratoxin A and Fumonisins )
Aspergillus niger FMB S41018 -
Aspergillus niger FMB S43547 -
Aspergillus niger FMB S46494 -
Aspergillus niger FMB S44993 -
Aspergillus niger FMB S44333 -
Aspergillus niger FMB S46495 FB2
* 오크라톡신 A 및 푸모니신의 검출에 대해 '-'는 음성을 의미함.
이상의 실험으로부터, 총 23종의 오크라톡신/푸모니신 비생성 아스퍼질러스 나이거(A. niger aggregates) 균주 라이브러리를 확보할 수 있었다.
[ 실시예 2: 선별된 오크라톡신 / 푸모니신 비생성 아스퍼질러스 나이거 ( A. niger ) 균주를 이용한 된장의 제조 및 오크라톡신 / 푸모니신 생성 여부 확인]
상기에서 선별된 곰팡이독소 비생산 균주들을 실제 식품에 적용하여 발효할 경우, 곰팡이독소가 생성되는지 여부를 확인하고자 하였다.
오크라톡신/푸모니신 동시 비생산 균주 FMB S40280과 FMB S610를 삶은 콩 (30 g)에 접종하여 10일간 15℃, 30℃, 40℃에서 발효시킨 후, 곰팡이독소 검출 여부를 HPLC 분석법으로 확인하였다.
실험 결과, 곰팡이독소 (오크라톡신 A)는 검출되지 않았다 (표 6).
FMB S40280 및 FMB S610로 발효한 된장에서 오크라톡신의 검출 여부 확인 결과
샘플 오크라톡신 A
FMB S40280 15℃ N.D.
30℃ N.D.
40℃ N.D.
FMB S610 15℃ N.D.
30℃ N.D.
40℃ N.D.
이상의 실험을 통해 본 발명이 실제 적용 모델인 식품에서도 동일하게 재현될 수 있음을 확인할 수 있었다.
<110> BIFIDO CO., LTD. <120> Screening method of strain not to produce ochratoxin and fumonisin and mycotoxin free soybean paste therefrom <130> AP-2014-0194 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of PKS15KS <400> 1 caatgccgtc caaccgtatg 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of PKS15KS <400> 2 ccttcgcctc gcccgtag 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of PKS15CMeT <400> 3 gctttcatgg actggatg 18 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of PKS15CMeT <400> 4 catttcgttg atcccatcg 19 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of fum1 <400> 5 ccatcgtggg atctcagaga tg 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of fum1 <400> 6 cgccaatgtc aagcatatgg tc 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of fum19 <400> 7 ccacgctgtt gggactgaac ta 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of fum19 <400> 8 gcgttgcgaa gtgttcaata gc 22

Claims (5)

  1. '서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머 세트', '서열번호 3 및 4로 구성되는 프라이머 세트', '서열번호 5 및 6으로 구성되는 프라이머 세트', '서열번호 7 및 8로 구성되는 프라이머 세트'로 구성되며,
    아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) 균주에서 오크라톡신 A, 푸모니신 B1, 푸모니신 B2 중 선택되는 어느 하나 이상의 곰팡이 독소의 검출이 가능한 것을 특징으로 하는 곰팡이 독소 생성 균주 검출용 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 제1항의 프라이머 세트를 사용해 PCR을 수행하여,
    아스퍼질러스 나이거 균주 (Aspergillus niger)에서 오크라톡신 A, 푸모니신 B1, 푸모니신 B2 중 선택되는 어느 하나 이상의 곰팡이 독소의 검출 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 곰팡이독소 비생성 균주의 선별 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
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