KR101688322B1

KR101688322B1 - 치주인대 세포/스캐폴드 복합체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101688322B1
Application number: KR1020150095878A
Authority: KR
Inventors: 김해원; 김중현
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2015-07-06
Filing date: 2015-07-06
Publication date: 2016-12-21

Abstract

본 발명은 치주인대 세포/스캐폴드 복합체에 관한 것으로, 구체적으로 단방향으로 정렬된 나노섬유 스캐폴드를 제조한 뒤, 상기 스캐폴드에서 치주인대 (periodontal ligament) 세포를 신장 스트레스를 주며 배양한 것을 특징으로 하는 치주인대 세포/스캐폴드 복합체, 상기 치주인대 세포/스캐폴드 복합체의 제조방법, 상기 치주인대 세포/스캐폴드 복합체를 포함하는 치주 조직 재생용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 제조방법으로 제조된 치주인대 세포/스캐폴드 복합체는 생체 내 이식시 생적합성을 가지며, 치주 조직 결함 모델 래트에 이식된 경우 골 부피, 골 표면적, 및 골 표면 밀도를 증가시키는 우수한 효과가 있으므로, 치주 조직 재생용 조성물로 이용될 수 있다.

Description

치주인대 세포/스캐폴드 복합체 및 이의 용도{A periodontal ligament cells/scaffold complex and use thereof}

본 발명은 치주인대 세포/스캐폴드 복합체에 관한 것으로, 구체적으로 단방향으로 정렬된 나노섬유 스캐폴드를 제조한 뒤, 상기 스캐폴드에서 치주인대 (periodontal ligament) 세포를 신장 스트레스를 주며 배양한 것을 특징으로 하는 치주인대 세포/스캐폴드 복합체, 상기 치주인대 세포/스캐폴드 복합체의 제조방법, 상기 치주인대 세포/스캐폴드 복합체를 포함하는 치주 조직 재생용 약학 조성물에 관한 것이다.

치주 질환 및 치주 결함은 치조골, 치주인대 (PDL) 및 치아 조직을 둘러싸고 지지하는 기타 조직들의 비가역적 파괴를 야기하고, 결과적으로 치아의 상실을 가져온다 (Edwards PC etc., Head Face Med 2006; 2:16). 이러한 치주 질환 및 치주 결함에 대한 전통적인 임상 치료는 감염된 부위를 제거하는 것이었으나, 최근의 치주 치료는 치주 조직에 손상된 부위를 재생시키는 것을 목적으로 한다.

상기 재생 과정은 복잡한 치주 조직 구조를 이루는 세포, 즉 치조골, 치근 시멘트질 (root cementum) 및 치주인대 사이의 일련의 상호작용과 관련이 있다. 따라서, 이와 같이 여러 영역을 가지는 조직 구조를 완전히 재생시키는 것은 어려운 일이며, 특히 치주인대와 치근 시멘트질의 천연 구조를 회복시키는 것은 아직까지 성공한 사례가 없다.

상기 조직 중, 치주인대는 치주낭 (periodontal pocket)의 재생 과정에 핵심적인 역할을 한다 (Cho etc., Calcif Tissue Int, 1992; 50:459-67). 치주인대는 치근 시멘트질과 치조골 사이에 밀집한 결합 조직으로, 치근과 주위 치조골에 고정된 변형 가능한 섬유 현탁 시스템이다. 상기 치주인대에는, 다분화능을 가지는 줄기세포가 존재하며, 상기 줄기세포는 필요 또는 상태에 따라 시멘트질모세포 (cementoblast) 또는 골아세포 (osteoblast)로 분화함으로써 골 리모델링 및 인대 형성을 조절하여 치주 조직의 재생 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 치주인대에서 분리된 줄기세포는 통상적인 골 분화 조건에서 골 분화가 가능한 것으로 보고되었다.

치주인대 조직에서 한 가지 중요하게 고려해야할 점은 치주인대 세포는 교합력 (occlusal force)에 의해 계속적으로 기계적 스트레스에 노출되어 있으며, 상기 스트레스에 대하여 치주인대와 주변 치조골의 리모델링이 일어나게 된다는 것이다. 최근 연구 결과에서는 치주인대 세포가 증식과 분화에 있어서 기계적 스트레스에 민감하게 반응한다는 보고가 있었다 (Oortgiesen DA etc., Tissue Eng Part C Methods, 2012; 18:81-9).

이러한 관점을 기초로 본 발명자들은 치주 조직 재생용 조성물을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 기계적 스트레스 및 위상적인 기질 조건이 적용된 치주인대 세포/스캐폴드 복합체를 제조하여 본 발명을 완성하였다. 상기 기계적 스트레스와 위상적인 조건은 천연 조직 환경을 모방하는 것으로, 치주인대 세포가 외부 환경을 인식하여 생체 내 치주인대 조직에서와 같은 반응을 보이도록 할 수 있으며, 이에 따라 본 발명의 치주인대 세포/스캐폴드 복합체는 치주 조직 재생용 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 하나의 목적은 (a) 단방향으로 정렬된 나노섬유 스캐폴드를 제조하는 단계; (b) 상기 스캐폴드에 치주인대 (periodontal ligament) 세포를 접종하는 단계; (c) 상기 스캐폴드에 신장 스트레스를 주며 치주인대 세포를 배양하는 단계; 및 (d) 상기 배양된 치주인대 세포/스캐폴드 복합체를 회수하는 단계를 포함하는, 치주인대 세포/스캐폴드 복합체 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 제조방법으로 제조된 치주인대 세포/스캐폴드 복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 치주인대 세포/스캐폴드 복합체를 포함하는 치주 조직 재생용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 (a) 단방향으로 정렬된 나노섬유 스캐폴드를 제조하는 단계; (b) 상기 스캐폴드에 치주인대 (periodontal ligament) 세포를 접종하는 단계; (c) 상기 스캐폴드에 신장 스트레스를 주며 치주인대 세포를 배양하는 단계; 및 (d) 상기 배양된 치주인대 세포/스캐폴드 복합체를 회수하는 단계를 포함하는, 치주인대 세포/스캐폴드 복합체 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, “치주인대 세포/스캐폴드 복합체”는 스캐폴드에 치주인대 세포를 부착시킨 형태를 의미하는 것으로, 구체적으로 스캐폴드에 치주인대 세포를 접종하고 배양시킨 것이다.

본 발명에서 용어, “치주인대 세포”는 치주인대 조직에 존재하는 세포를 의미하는 것으로, 본 발명의 목적상 치주인대 조직으로부터 분리된 세포일 수 있다. 치주인대 조직은 치근 시멘트질과 치조골 사이에 밀집한 결합 조직이다.

상기 치주인대 세포는 본 발명의 스캐폴드에 접종, 배양하여 스캐폴드에 부착된 상태로 치주인대 세포/스캐폴드 복합체를 구성하고, 동물의 치주인대로부터 직접 분리한 것, 상업적으로 판매하는 것, 또는 유전적으로 조작이 가해진 것 등을 모두 포함할 수 있고 치주인대 조직으로부터 분리된 것이라면 그 유래나 종류에 특별히 제한되지 않는다. 치주인대 세포에는 분화능을 가지는 줄기세포 및/또는 전구세포가 존재할 수 있는데, 상기 줄기세포 및/또는 전구세포는 시멘트질모세포 (cementoblast) 또는 골아세포 (osteoblast) 등으로 분화하여 직접적으로 치주 조직의 재생에 직접적으로 관여하거나 또는 상기 치주인대 세포에서 분비/방출하는 특정 인자에 의해 간접적으로 치주 조직을 재생시킬 수 있다.

상기 치주인대 세포는 구체적으로는 중간엽줄기세포의 특성을 가지는 것일 수 있고, 더욱 구체적으로는 CD44, CD73, CD106, CD146 및 TGF-βR1으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 단백질을 발현하거나, CD31 및 CD34로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 단백질을 발현하지 않는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 일실시예에서는 Sprague-Dawley 래트의 치주인대 조직으로부터 치주인대 세포를 분리하였으며, 상기 분리된 세포는 다능성 중간엽줄기세포의 양성 마커인 CD44, CD73, CD106, CD146 및 TGF-βR1을 높은 수준으로 발현하고, 음성 마커인 CD31 및 CD34를 낮은 수준으로 발현하여 다능성 중간엽줄기세포의 특성을 가지는 것을 확인하였다 (도 3).

본 발명에서 용어 “스캐폴드”는 생체 내에서 손상된 장기나 조직의 일부를 대체하며 이들의 기능을 보완 또는 대체할 수 있는 구조체를 의미하며, 이에 제한되는 것은 아니나 구체적으로 치주 조직을 재생시킬 수 있는 구조체 일 수 있다. 본 발명에서는 특히 나노섬유 형태로 구성된 스캐폴드를 제조하여 사용하였다.

상기 스캐폴드는 기능과 역할을 충분히 수행할 때까지 유지된 후 생체 내에서 완전히 분해되어 없어질 수 있는 생분해성 고분자 소재로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로 이에 제한되지는 않으나 상기 스캐폴드는 예를 들어, 폴리카프로락톤 (polycaprolactone), 폴리입실론카프로락톤 (poly(ε-caprolactone)), 폴리락틱산 (polylactic acid), 폴리글리콜릭산 (polyglycolic acid), PEO (polyethylene oxide), PVA (poly(vinyl alcohol)), 키토산 (chitosan), 젤라틴 (gelatin), 플루란 (pullulan), γ-PGA (poly(γ-glutamic acid), 알지네이트 (alginate), 실크피브로인 (silk fibroin), 셀룰로오스 (cellulose), 알긴산 (alginic acid), 및 히알루론산 (hyaluronic acid)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 폴리카프로락톤 및/또는 젤라틴을 포함하는 것일 수 있다.

이하, 치주인대 세포/스캐폴드 복합체의 제조방법을 구체적으로 설명한다.

(a) 단계는 단방향으로 정렬된 나노섬유 스캐폴드를 제조하는 단계이다.

나노섬유 스캐폴드에 대하여는 상기 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어 “단방향으로 정렬”이란, “무작위로 정렬”과 대응되는 의미로 사용되었다. 즉, 본 발명에서 제조된 나노섬유 스캐폴드를 구성하는 각각의 나노섬유들이 일정한 배향 (orientation)을 가지지 않은 상태를 “무작위로 정렬” 되었다 또는 “정렬되지 않은”이라고 하고, 이와는 달리 나노섬유들의 배향이 일정한 경향성, 특히 단방향으로 배향된 나노섬유의 비중이 상당한 경우에는 “단방향으로 정렬” 되었다고 정의할 수 있다. “배향”은 나노섬유 한 가닥을 선으로 보았을 때 그 선이 놓여진 방향으로 이해될 수 있으며, “배향각”은 임의의 축을 기준으로 그 축과 나노섬유가 교차하며 생성되는 각 중에서 90 ° 이하의 각을 의미한다. 본 발명에서는 상기 스캐폴드를 구성하고 있는 대부분의 나노섬유들의 배향각이 적어도 20 ° 이내인 경우를 “단방향”으로 보았다. 즉, 스캐폴드를 구성하는 나노섬유 중 대다수가 특정 배향을 향하고 있는 것으로, “무작위로 정렬”된 나노섬유와 명확히 구별 가능한 경우 “단방향으로 정렬”된 것으로 볼 수 있다. 이는 모든 나노섬유의 배향각이 반드시 20 ° 이내인 것을 요구하는 것은 아니나, 적어도 현미경 사진 등을 통하여 육안으로 명확하게 구별이 가능한 정도는 되어야 한다. 예를 들어 나노섬유가 무작위로 정렬된 것과 단방향으로 정렬된 것은 도 1의 나노섬유의 SEM 사진에서 확인할 수 있는 것처럼 명확하게 구별 가능하다. 상단의 사진은 나노섬유가 특별한 배향을 가지고 있지 않으나, 하단의 사진에서는 대부분의 나노섬유들이 가로축으로 배향되어 단방향으로 정렬되어 있음을 확인할 수 있다.

구체적으로, 스캐폴드를 구성하는 각각의 나노섬유의 배향을 분석하였을 때, 상기 나노섬유 중 50 % 이상, 더욱 구체적으로 55 % 이상, 보다 더 구체적으로 60 % 이상, 가장 구체적으로는 65 %, 70 %, 또는 80 % 이상의 나노섬유의 배향이 상호 10 °, 15 °, 20 °, 또는 25 ° 이내의 차이로 정렬된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단방향으로 정렬된 나노섬유 스캐폴드는 이에 제한되는 것은 아니나, 전기방사 (electrospinning) 기술을 이용하여 제조되는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 “전기방사”란, 고분자의 용액이나 용융물에 높은 전압을 인가함으로써 분자 쇄간에 조성된 정전기적 반발력과 음극과 양극 사이에 발생되는 전기장을 이용하여 직경이 수십 내지 수백 nm인 나노섬유를 제조하는 방법이다.

전기방사를 실시하기 위한 장치는 크게 3 개의 부분으로 나뉜다: 고압 전력 공급기, 스피네릿 (spinneret, 금속성 바늘) 및 콜렉터 (접지 도체). 전력 공급기는 직류 또는 교류 전력 공급기가 사용될 수 있다. 스피네릿은 실린지와 연결되어 있고, 실린지에는 제조되는 나노섬유의 구성 성분이 주입된다. 실린지 펌프를 이용하여, 상기 성분을 스피네릿을 통과하도록 하되, 일정한 유속으로 통과하도록 한다.

구체적으로 상기 전기방사에서 사용된 스피네릿의 직경은 0.1 mm 내지 1 mm인 것일 수 있고, 전기방사의 유속은 0.1 ㎖/h 내지 2 ㎖/h일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 전기방사 과정에서는 나노섬유를 단방향으로 정렬시키기 위하여 회전 원통형 금속 콜렉터를 사용할 수 있고, 상기 금속 콜렉터는 100 내지 2000 rpm의 속도로 회전하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 일실시예에서는 폴리카프로락톤과 젤라틴의 1 : 1 혼합물을 0.4 mm 스피네릿 직경을 가지는 주사기에서 1 ㎖/h 유속으로 전기방사하였고, 900 rpm의 속도로 회전하는 회전 원통형 금속 콜렉터로 수집한 뒤 건조시켜 단방향으로 정렬된 나노섬유 스캐폴드를 제조하였다 (도 1 및 도 2).

(b) 단계는 상기 (a) 단계에서 제조한 스캐폴드에 치주인대 (periodontal ligament) 세포를 접종하는 단계이다.

스캐폴드 및 치주인대 세포에 대하여는 상기 설명한 바와 같다.

상기 접종은 스캐폴드 1 mm² 당 100 개 내지 10000 개의 세포 밀도로 치주인대 세포를 접종하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 치주인대 세포/스캐폴드 복합체를 사용하고자 하는 목적, 세포 배양 기간, 세포의 상태, 세포 분화 조건 등에 따라서 당업자가 적절히 선택할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일실시예에서는 스캐폴드 당 치주인대 세포를 1 × 10⁵ 내지 5 × 10⁵개의 세포 밀도로 접종하여 사용하였다.

(c) 단계는 상기 스캐폴드에 신장 스트레스를 주며 치주인대 세포를 배양하는 단계이고, (d) 단계는 상기 (c) 단계에서 배양된 치주인대 세포/스캐폴드 복합체를 회수하는 단계이다.

치주인대 세포는 치주인대 조직의 위치적 특성상 생체 내에서 교합력 (occlusal force)에 지속적으로 노출되어 있어 기계적 스트레스가 존재하는 환경에서 존재하는 세포이며, 이러한 자극에 따라 세포 증식 및 분화에 민감하게 반응하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명자들은 치주인대 세포를 스캐폴드에 접종한 뒤, 치주인대 세포의 조직재생 능력을 더욱 향상시키기 위하여 스캐폴드에 신장 스트레스를 주며 치주인대 세포를 배양하였다. 본 발명에서 “기계적 스트레스”는 “신장 스트레스”와 혼용하여 사용되었으며, 장력, 즉 스캐폴드를 양쪽에서 끌어당기는 변형력의 의미로 사용되었다.

구체적으로 상기 신장 스트레스는 플렉셀 시스템 (Flexcell system)을 이용하여 0.5 내지 2 Hz 진동수로 제공되는 것일 수 있고, 스캐폴드를 1 내지 10 % 신장시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 “배양”은 생체 외에서 세포에 양분을 공급하여 세포를 유지시키거나 증식 또는 분화시키는 모든 행위를 의미하며, 본 발명의 특성상 상기 배양은 스캐폴드에 접종한 세포에 대하여 수행되는 것이다. 배양 배지, 온도, 습도 등의 조건은 당업계에서 일반적으로 사용되는 방법으로 수행될 수 있으며, 특히 치주인대 세포의 배양에 사용되는 조건이라면 어떠한 조건을 사용하더라도 무방하고 당업자는 이를 적절하게 선택할 수 있다.

본 발명에서 용어 “정적 배양”은 상기 신장 스트레스를 주지 않은 스캐폴드에서 세포를 배양하는 것을 의미하고, “동적 배양”은 신장 스트레스를 주는 환경에서 세포를 배양하는 것을 의미한다.

상기 배양은 치주인대 세포를 상기 스캐폴드에 접종한 후 1 내지 5일 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 치주인대 세포/스캐폴드 복합체의 적용 용도, 세포의 상태 등을 기준으로 배양 기간을 당업자가 적절하게 결정할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일실시예에서는 실험 그룹을 다음의 네 가지로 나누었다; 'DA (dynamic cell culture on aligned nanofiber)': 정렬된 나노섬유에서 동적 배양, 'SA (static cell culture on aligned nanofiber)': 정렬된 나노섬유에서 정적 배양, 'DR (dynamic cell culture on random nanofiber)': 정렬되지 않은 나노섬유에서 동적 배양, 'SR (static cell culture on random nanofiber)': 정렬되지 않은 나노섬유에서 정적 배양. 이때, 동적 배양으로 플렉셀 시스템을 이용하여 세포/스캐폴드 복합체에 1 Hz 진동수에서 6 % 신장의 동적 스트레스 변화를 적용한 상태로 세포를 3 일 동안 배양하였으며 (도 5), 각 그룹에서 배양된 세포의 특성을 분석하였다.

그 결과, 단방향으로 정렬된 나노섬유 스캐폴드에서 신장 스트레스 하에 배양된 세포는 대부분의 세포가 단방향으로 배향되었고, 이극성 (~ 96 %)을 띄며, 다른 그룹의 세포에 비하여 상당히 긴 돌출 길이를 가지는 것을 확인하였다 (도 6).

본 발명의 다른 구체적인 일실시예에서는 상기 네 개의 실험 그룹에 대하여 생체 외 분화 능력을 평가한 결과, 단방향으로 정렬된 나노섬유 스캐폴드에서 신장스트레스 하에 배양된 세포는 치주인대 마커인 페리오스틴 (periostin) 및 테나신 (tenacin)의 발현이 현저히 증가되는 것을 확인하였다 (도 7 및 도 8). 따라서 본 발명의 단방향으로 정렬된 나노섬유 스캐폴드에서 신장 스트레스를 주며 치주인대 세포를 배양하는 경우 치주인대 세포의 치주인대 조직 분화 능력이 향상될 수 있다는 것을 알 수 있다.

본 발명은 다른 하나의 양태로서, 상기 제조방법으로 제조된 치주인대 세포/스캐폴드 복합체를 제공한다.

치주인대 세포/스캐폴드 복합체 및 이의 제조방법에 대하여는 상기 설명한 바와 같다.

본 발명은 또 다른 양태로서, 상기 치주인대 세포/스캐폴드 복합체를 포함하는 치주 조직 재생용 약학 조성물을 제공한다.

치주인대 세포/스캐폴드 복합체에 대하여는 상기 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어 “치주 조직”은 치아를 둘러싸고 있는 치조골과 치은 (잇몸), 치주인대 및 시멘트질을 포함하는 조직을 말하는데, 치주 결함 또는 치주 질환에 의해 상기 조직을 둘러싸고 지지하는 기타 조직들의 비가역적 파괴를 가져올 수 있다.

본 발명에서 용어 “재생”은 일반적으로 생물체에서 조직의 일부가 손상되거나 또는 그 기능을 상실하였을 때, 그 부분의 조직이나 기관을 다시 만들어 원래 상태로 복구시키거나 그 기능을 회복시키는 작용을 일컫는다. 본 발명의 특성상 상기 재생은 치주 조직이 손상되거나 그 기능을 상실하였을 때, 치주 조직을 원래 상태로 복구시키거나 기능을 회복시키는 모든 과정을 포함할 수 있다.

본 발명의 치주인대 세포/스캐폴드 복합체는 이식시 생적합성을 가지며, 치주 조직 결함 모델에 이식된 경우 골 부피, 골 표면적, 및 골 표면 밀도를 증가시키는 우수한 효과가 있어 치주 조직 재생용 약학 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 단일제제로도 사용할 수 있고, 공인된 치주 조직 재생 효과를 가진다고 알려진 약물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여할 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용을 유발하지 않으면서 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나 본 발명의 특성상 비경구 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로는 손상되거나 기능을 상실한 치주 조직 부위 또는 그 근처에 직접 투여되는 것일 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 세포의 수, 치주인대 세포/스캐폴드 복합체의 크기, 치주 조직 손상 정도에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1 회 투여하거나 경과에 따라 추가로 투여할 수 있으며, 또는 용량을 분할하여 수 회 투여할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일실시예에서는 상기 치주인대 세포/스캐폴드 복합체를 래트 치주결함 모델에 이식하여 치주 조직 재생 효과를 확인하였다. 먼저 피하조직에 이식하여 생체 내 조직 적합성이 있는 것을 확인하였고 (도 10), 치주인대 세포/스캐폴드 복합체가 이식된 결함부위가 회복되는 것을 확인하였다 (도 11 내지 13). 구체적으로 골 부피, 골 표면적 및 골 표면 밀도의 모든 지표가 높은 값으로 증가한 것을 확인하였고, 결함 부위에서 신생 골 조직을 명확하게 관찰할 수 있었다.

이와 같은 결과를 종합하면, 본 발명의 치주인대 세포/스캐폴드 복합체는 치주 조직 재생용 조성물로 우수한 효과가 있음을 알 수 있다.

본 발명의 제조방법으로 제조된 치주인대 세포/스캐폴드 복합체는 생체 내 이식시 생적합성을 가지며, 치주 조직 결함 모델 래트에 이식된 경우 골 부피, 골 표면적, 및 골 표면 밀도를 증가시키는 우수한 효과가 있으므로, 치주 조직 재생용 조성물로 이용될 수 있다.

도 1은 치주인대 세포에 다양한 정렬 형태를 제공하기 위하여 무작위 (Random) 또는 정렬된 (Aligned) 전기방사 스캐폴드를 제조하였으며, 상단은 무작위, 하단은 정렬된 나노섬유의 SEM 사진이다.
도 2는 무작위 (Random) 또는 정렬된 (Aligned) 전기방사 스캐폴드의 배향성에 대한 그래프이다.
도 3은 치주인대 세포에서 중간엽줄기세포 마커의 발현을 확인한 것이다.
도 4는 UniFlex 배양 용기와 결합한 나노섬유 스캐폴드를 나타낸 것이다. 셀프-레벨링 실리콘 접착제를 이용하여 넓이 32 mm x 길이 15 mm의 얇은 전기방사 나노섬유 스캐폴드를 부착시켰다.
도 5는 치주인대 세포/스캐폴드 복합체를 장착한 Flexcell 시스템을 개략적으로 나타낸 것이며, 동적인 기계적 장력이 진공 조건에 의해 세포/기질 스캐폴드에 적용된다.
도 6은 기계적 스트레스를 주거나 주지 않은 조건에서 나노 섬유 배열을 달리하여 배양 3 일째에 세포 모양을 확인한 것이다. F-액틴은 로다민-팔로이딘 (rhodamine-phalloidin, red)으로 확인하였고 핵은 DAPI (cyan)로 염색하였다. 화살표는 신장 방향을 나타낸다.
도 7은 ELISA로 분석한 치주인대 세포의 인대 생성과 관련된 단백질인 페리오스틴 (periostin) 발현에 관한 것이다. 결과는 무작위 나노섬유, 정적 조건으로 표준화하여 나타냈다 (평균 ± SD, a: DA 대비 p < 0.05, b: SA 대비 p < 0.05).
도 8은 ELISA로 분석한 치주인대 세포의 인대 생성과 관련된 단백질인 테나신-C (tenacin-C) 발현에 관한 것이다. 결과는 무작위 나노섬유, 정적 조건으로 표준화하여 나타냈다 (평균 ± SD, a: DA 대비 p < 0.05, b: SA 대비 p < 0.05).
도 9는 ELISA로 분석한 치주인대 세포의 인대 생성과 관련된 단백질인 TGF-β 발현에 관한 것이다. 결과는 무작위 나노섬유, 정적 조건으로 표준화하여 나타냈다 (평균 ± SD, a: DA 대비 p < 0.05, b: SA 대비 p < 0.05).
도 10은 H&E 및 MT 염색으로 나타낸 조직 사진으로, 치주인대 세포/스캐폴드 복합체를 래트 피하조직에 이식하고 4 주 후에 조직 적합성을 확인한 것이다. 무작위로 분포된 옥시탈란 (oxytalan) 섬유 (화살표 머리; OX)를 가지는 치주인대 섬유의 방향을 표시하였다. 양쪽 화살표는 배열된 조직 방향을 표시한 것이다.
도 11은 래트 상악전구 수술 부위에서 회수한 검체의 사진이다.
도 12는 μCT 사진을 분석하여 골 부피 %를 평가한 것이다. 평균 ± SD, a: DA (removed) 대비 p < 0.05; b: SA (removed) 대비 p < 0.05; c: DA (sound) 대비 p < 0.05.
도 13은 μCT 사진을 분석하여 골 표면적을 평가한 것이다. 평균 ± SD, a: DA (removed) 대비 p < 0.05; b: SA (removed) 대비 p < 0.05; c: DA (sound) 대비 p < 0.05.
도 14는 μCT 사진을 분석하여 골 표면밀도를 평가한 것이다. 평균 ± SD, a: DA (removed) 대비 p < 0.05; b: SA (removed) 대비 p < 0.05; c: DA (sound) 대비 p < 0.05.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. 나노섬유 스캐폴드의 제조

폴리카프로락톤 (PCL)/젤라틴 (Gel) 나노섬유는 전기방사 기술을 이용하여 제조하였으며, 나노섬유 스캐폴드의 위상적인 기질 조건을 평가하기 위해 정렬된 나노섬유 (Aligned) 또는 무작위 나노섬유 (Random)를 각각 제조하였다. 폴리카프로락톤 (Mw 80,000), Gel (type B, 송아지 피부) 및 테트라플루오로에탄올 (tetrafluoroethanol, TFE)는 모두 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 폴리카프로락톤과 젤라틴을 각각 TFE에 50 ℃에서 24 시간 동안 용해시키고, 이들을 혼합한 뒤 2 시간 동안 교반하여 1 : 1 혼합물을 제조하였다. 상기 혼합물 5 ㎖을 0.4 mm 스피네릿 직경을 가지는 주사기에서 1 ㎖/h 유속으로 전기방사하였다. 유체분사 (fluid jet)가 방출될 때 주사기에 부착된 스피네릿 끝에 고전압 (11.5 kV)을 적용하였다. 나노 섬유를 단방향으로 정렬하기 위해, 900 rpm의 속도로 회전하는 회전 원통형 금속 콜렉터를 사용하여 제조하였다 (각 스피네릿 끝으로부터 15 cm 거리). 그 다음 전기방사 나노섬유를 완전히 건조시켰다. 고해상도 주사전자현미경 (SEM; JEOL-JSM 6510)으로 전기방사 나노섬유의 표면 형태를 관찰하고, 임의의 위치에서 얻은 SEM 사진으로 나노섬유 직경 및 나노섬유 각 분포의 평균 값을 계산하였다.

그 결과, 정렬된 나노섬유 (Aligned)에서는 잘 정렬된 섬유가 관찰되나 (도 1 하단), 무작위 나노섬유 (Random)에서는 섬유가 무작위로 정렬되어 있는 것을 관찰할 수 있었다(도 1 상단). 상기 두 종류의 섬유 스캐폴드의 배향 분포를 그래프로 나타내었으며 (도 2), 현미경으로 관찰된 것과 마찬가지로 정렬된 나노 섬유에서는 배향각이 대부분 평행 (20 ° 이하의 배향각을 가지는 나노섬유가 65 % 이상)한 것으로 나타났으나, 무작위 나노섬유에서는 배향각이 다양하게 분포하여 섬유가 무작위로 정렬되어 있다는 것을 확인하였다.

실시예 2. 치주인대 (PDL) 세포의 분리 및 특성 확인

(1) 래트 유래 치주인대 세포의 초대 배양

본 발명의 치주인대 세포/스캐폴드 복합체를 제조하는데 사용된 치주인대 (periodontal ligament, PDL) 세포는 5 주령 수컷 Sprague-Dawley (SD) 래트로부터 분리하였다. 구체적으로, SD 래트의 네 앞니를 뽑아 치주인대 조직을 긁어내었다. HBSS (Hank's buffered saline solution)로 세척한 뒤, 5 % CO₂, 37 ℃ 조건의 인큐베이터에서 2 시간 동안 0.05 % 콜라게나제 타입 I 용액으로 조직을 분해시켰다. 10 % FBS, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 mg/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 α-MEM(α-modified minimal essential medium)으로 24 시간 배양한 뒤, 0.05 % 트립신을 처리하여 세포를 회수하고, 재현탁하여 배양용기가 가득 찰 때까지 추가적으로 4 일을 더 배양하였다. 2 내지 3 일 간격으로 배지를 교체하며 세포를 계대배양하였고, 3 내지 4 계대의 세포를 실험에 사용하였다.

(2) 세포 표현형 분석

형광활성 세포 분석기 (flourescence-activated cell sorter, FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA)를 이용하여 3 계대의 치주인대 세포의 유세포 분석을 수행하였다. 다능성 중간엽줄기세포의 양성 마커로서 CD44, CD73, CD106, CD146 및 TGF-βR1을, 음성마커로서 CD31, CD34를 이용하여 치주인대 세포를 분석하였다. 구체적으로, 치주인대 세포를 3 계대에서 회수하고 유세포 분석을 위해 Karnovsky's 고정액으로 4 ℃에서 30 분 동안 고정시켰다. 그 다음 표본을 원심분리하고 세척한 뒤, 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하고, FITC-표지된 이차 항체를 첨가한 뒤 4 ℃에서 30 분 동안 추가 인큐베이션하였다. 실험은 3 회 반복 수행하였다.

(3) 분석 결과

FACS 분석을 통해 치주인대 줄기세포에 대한 다능성 중간엽줄기세포의 대표적 마커를 확인하였다. 그 결과 치주인대 줄기세포는 CD44 (74.71 %), CD73 (66.68 %), CD106 (92.12 %), CD146 (91.76 %) 및 TFGβR1 (90.23 %)를 매우 높은 수준으로 발현하였으며, CD31 (0.63 %) 및 CD34 (0.75 %)를 매우 낮은 수준으로 발현하여, 다능성 중간엽줄기세포의 특성을 가지는 것을 확인하였다 (도 3).

실시예 3. 세포 배향 및 돌출에 대한 기계적 스트레스 및 나노섬유 정렬의 효과

(1) 세포/스캐폴드 복합체에 기계적 스트레스 적용

플렉셀 시스템 (Flexcell system)은 스트레칭 장치로, 세포 변형을 위해 주기적 장력 또는 압축을 강도와 빈도를 조절하여 재현성있게 적용할 수 있도록 고안된 것이다. 상기 장치를 이용하여 치주인대 세포가 생체 내에서 계속적으로 받는 교합력 (occlusal force)과 같은 기계적 스트레스를 인공적으로 모방하기 위해, UniFlex 배양 용기를 나노섬유 스캐폴드로 변형하였다. 32 mm x 15 mm의 직사각형 모양으로 제조한 나노 섬유를 6-웰 배양 용기 각 웰의 가장자리에 접착 (각 가장자리의 2 mm 거리)시켜 고정시켰다 (도 4). 상기 나노섬유는 두 종류의 나노섬유 스캐폴드 (정렬된 것 또는 무작위)를 사용하였다. 배양 용기는 사용 전 에틸렌 옥사이드로 멸균하였고, 각 표본은 세포를 접종하기 전 무혈청 배지로 미리 적셨다. 형태학적 분석을 위해 치주인대 줄기세포를 스캐폴드 당 1 x 10⁵ 세포 밀도로 나노섬유가 장착된 배양 용기에 접종하였고, 다른 생체 외 및 생체 내 테스트를 위해서는 스캐폴드 당 5 x 10⁵ 세포 밀도로 접종하여 사용하였다.

이틀 동안 세포를 배양한 뒤, 실험 그룹을 네 개로 나누었다; 'DA (dynamic cell culture on aligned nanofiber)': 정렬된 나노섬유에서 동적 세포 배양, 'SA (static cell culture on aligned nanofiber)': 정렬된 나노섬유에서 정적 세포 배양, 'DR (dynamic cell culture on random nanofiber)': 정렬되지 않은 나노섬유에서 동적 세포 배양, 'SR (static cell culture on random nanofiber)': 정렬되지 않은 나노섬유에서 정적 세포 배양. 동적 세포 배양은 양 쪽의 기계적 장력을 동적으로 제공하기 위해 플렉셀 시스템을 이용하여 세포/스캐폴드 복합체에 1 Hz 진동수에서 6 % 신장의 동적 스트레스 변화를 적용한 것이고 (도 5), 정적 세포 배양은 이러한 스트레스를 적용하지 않은 것이다. 동적 또는 정적 배양은 배지 교체 없이 3 일 동안 지속되었다. 정렬된 나노섬유는, 스트레스 방향에 평행하게 나노섬유 배향을 둔 것이다.

(2) 세포 형태학적 분석

스캐폴드에서 세포 분포 및 배향을 관찰하기 위해, 컨포컬 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM; LSM 510, Carl Zeiss)을 사용하였고, 각 시험은 세 번 반복하여 수행하였다 (n = 3). 각 스캐폴드에서 배양한 세포를 4 % 파라포름알데히드로 고정하고, 0.2 % 트리톤 X-100을 처리하였다. 비특이적 단백질 결합을 막기 위해 1 % BSA (Bovine serum albumin) 용액을 처리하고 F-액틴 및 핵을 염색하기 위해 Alexa Fluor 546 phalloidin 및 DAPI를 각각 처리하였다.

(3) 분석 결과

상기 결과를 기초로, 다음으로 기계적 스트레스에 대한 나노섬유에서의 세포 거동을 관찰하였다. 구체적으로 정적 배양 조건 또는 동적 배양 조건에서 정렬된 또는 무작위 나노섬유에서 3 일 동안 배양한 뒤 치주인대 세포의 배향을 SEM 및 형광현미경으로 관찰하였다 (도 6).

정적 배양 조건에서, 무작위 나노섬유에서 세포는 무작위적으로 퍼져있었으나, 정렬된 나노섬유에서는 세포가 잘 정렬되어 있었다. 동적 배양 조건에서, 무작위 나노 섬유 위의 세포는 스트레스 축과 수직으로 정렬하였으나 (화살표는 스트레스 방향을 의미함), 정렬된 나노섬유 위의 세포는 스트레스 축 방향으로 정렬되었으며, 또한 이는 나노섬유의 배향과 평행한 것이었다. 상기 동적 배양 조건에서 정렬된 나노섬유 위의 세포의 형태는 상당한 이극 (bi-polar)성을 띄고 다른 배양 조건에 비하여 더욱 길게 신장되어 있었다.

실시예 4. 세포 분화 확인

(1) 표본 제조

치주인대 세포를 정적 또는 동적 배양 조건 (DA, SA, DR 및 SR)에서 3 일 동안 배양한 뒤, 각 표본의 세포 용해물을 3 회 동결-융해 (-80 ℃에서 20 분 동안 동결시킨 직후 37 ℃에서 10 분 동안 융해)하고, 세포 용해 완충액 (0.2 % 트리톤 X-100)을 추가하였다. 상기 표본을 혼합한 뒤 12,000 rpm으로 4 ℃에서 15 분 동안 원심분리하고, 세포 용해물을 회수하여 측정에 사용하였다.

(2) 치주인대 관련 단백질 발현

다양한 배양 조건 (DA, SA, DR 및 SR)에 따른 치주인대 줄기세포에서의 테나신 (tenacin), 페리오스틴 (periostin) 및 TGF-β 생산을 ELISA로 측정하였다. 상기 프로토콜로 제조한 표본을 ELISA 표본 완충액에 첨가하고 교반하였다. 상기 세포 용해물 100 ㎕를 96-웰 플레이트에 두고, 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 상기 표본을 200 ㎕ PBS로 2 회 세척한 후, 코딩된 웰에 남아있는 단백질 결합 부위를 막기 위해 200 ㎕ 블록킹 완충액 (5 % 탈지방 건조 우유를 함유하는 PBS)을 첨가하였다. 상기 플레이트를 상온에서 2 시간 동안 인큐베이션하고 PBS로 2 회 세척하였다. 테나신, 페리오스틴 또는 TGF-β 일차 항체 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. PBS로 4 회 세척하고, 블록킹 완충액에 1 : 2000으로 희석한 이차 항체 100 ㎕를 첨가한 뒤 상온에서 1 내지 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 세척한 뒤, 웰에 TMB 용액 100 ㎕를 첨가하고 상온에서 30 분 동안 인큐베이션 하였다. 그 다음 정지 용액 (2 M H₂SO₄) 100 ㎕를 첨가하였다. 흡광도는 450 nm에서 측정하였다.

(3) 분석 결과

세포 분화에 있어서 나노섬유 정렬 및 기계적 스트레스의 효과를 확인하였다. 구체적으로, 페리오스틴 (periostin), 테나신 (tenacin) 및 TGF-β와 같은 치주인대 마커의 발현 수준을 ELISA 분석으로 단백질을 검출하여 확인하였다. 각 그룹의 단백질 발현은 SR 그룹의 값으로 표준화하였다. 페리오스틴 및 테나신 단백질 발현은 각 그룹간에 현저한 차이를 보였으며 명확한 경향을 보였다; DA > SA > DR > SR (도 7 및 도 8). 반면에 TGFβ 발현은 나노섬유의 배열과는 관계없이 기계적인 스트레스에 의해 현저히 향상되는 것을 확인하였다; DA ~ DR > SA ~ SR (도 9).

실시예 5. 치주 결함 모델에서 조직 재생 효과 확인

(1) 동물 및 생체 내 실험 설계

총 18 마리의 11 주령, 350 내지 400 g의 건강한 수컷 Sprague-Dawley 래트 (SD rat) (Daehan Biolink Co., Ltd, Chungbuk, Korea)가 본 발명에 사용되었다. 동물 모델로서, 먼저 피하이식 모델은 세포/스캐폴드 복합체 표본 (DA, SA, DR 및 SR 그룹, 치주인대 세포를 3 일 동안 배양한 것)의 조직 반응을 확인하기 위해 사용하였다. 다음으로, 양쪽 치주 결함 모델 (직경 4 mm)은 상기 세포/스캐폴드 복합체를 이식하여 치주인대 및 주변 조직의 재생을 조사하기 위해 설계하였다. 특히, 두 가지 다른 조건의 치주인대 조직에 이식하였다; 정상 또는 제거. 따라서, 상기 치주인대 생체 내 모델에 대한 실험 그룹은 정상 치주인대 조직에 DA를 이식 'DA (sound)', 정상 치주인대조직에 SA를 이식 'SA (sound)', 제거된 치주인대조직에 DA를 이식 'DA (remov)', 및 제거된 치주인대조직에 SA를 이식 'SA (remov)', 그리고 두 대조 그룹 (제거된 치주인대에 정렬된 나노섬유만 이식 및 제거된 치주인대)을 포함한다.

(2) 피하 조직에서 생체 내 실험

래트 피하조직에서 실험 표본의 조직 반응을 조사하였다. 80 mg/kg Zoletil 및 10 mg/kg Rompun을 우측 대퇴사두근 (quadriceps muscle)에 근내 주사하여 11 주령 수컷 SD 래트를 마취하였다. 래트의 등 피부의 털을 밀고, 포비돈 아이오딘 (povidone iodine) 및 70 % 에탄올로 멸균하였다. 시험 표본을 이식하기에 충분한 크기로 피부를 절개하였다. 각 래트의 척추 측면에 지혈 겸자 (hemostatic forcep)로 비절개 박리 (blunt dissection)하여 네 개의 작은 피하 주머니를 만들었다. 이식하기 전에, 세포/섬유 스캐폴드 4 그룹을 제조하였다. 그 다음 시험 표본을 이식하고, 4-0 비흡수성 단일필라멘트 봉합 물질 (Prolene, Ethicon)로 절개 부위를 봉합하였다. 수술 4 주 후 상기 래트를 희생시켰다.

(3) 상악 (maxillary) 치주 결함에서 생체 내 실험

수술 과정에서, 80 mg/kg Zoletil 및 10 mg/kg Rompun을 우측 대퇴사두근에 근내 주사하여 래트를 마취시켰다. 수술 과정에서 통증 및 출혈을 감소시키기 위해 에피네프린 (epinephrine) 및 0.5 % 리도카인 (lidocaine)을 상악전구골 (premaxilla)의 잇몸 조직으로 국소 주사하였다. 수술 부위를 10 % 포비돈 아이오딘 및 70 % 에탄올을 이용해 멸균시켰다. 그 다음 입천장 잇몸 상피조직을 절개하여 상악전구골의 상악 치조골을 노출시키고 각 래트 당 두 개의 결함을 만들었다. 결함 모델은 먼저 치아를 발거하고, 치주인대 및 주변 조직을 완전히 제거하거나 ('removed' 모델) 또는 남겨두어 ('sound' 모델) 제조하였다. 상기 과정에서, 추출된 앞니는 추출 발치와로 재식립하였다. 각 상악전구골의 후면부에 표준 전-두께 (full-thickness)의 원형 결함을 만들기 위해 4-mm 직경의 관상톱을 사용하였다. 결함을 생성하는 과정에서, 수술 부위는 열 손상을 감소시키기 위해 차가운 멸균 등장성 식염수로 계속적으로 세척하였다. 그 다음, 결함의 가장자리에서 바깥쪽으로 약 2 mm 정도까지 덮을 수 있도록 표본을 잘라 결함 부위를 덮었다. 대조군은 상기 결함을 비어있는 채로 두었다. 표본을 이식한 후, 점막 피판을 상악 바깥쪽으로 위치시키고 4-0 흡수성 봉합 물질 (Vicryl, Ethicon)을 이용해 봉합하였다. 상기 래트는 수술 4 주 후에 표본 및 주변 조직을 회수하기 위해 희생시켰다.

(4) 마이크로 컴퓨터 토모그래피 분석

수술 4 주 후에, 래트를 희생시키고, 마이크로 컴퓨터 토모그래피 (μCT) 촬영 및 조직학적 분석을 위해 이식 부위를 포함한 주변 조직을 회수하였다. 상기 검체를 10 % 중성 완충 포름알데히드 용액에서 최소 24 내지 48 시간 동안 고정시켰다. 조직 회복 및 골 재생을 평가하기 위해 생체 내 고해상도 μCT 시스템 (Skyscan 1176, Skyscan, Aartselaar, belgium)을 이용하여 표본의 사진을 촬영하였다. 픽셀 크기는 12.56 ㎛로 하고, 1 mm 알루미늄 필터를 이용하였으며, 0.5 ° 회전 단계, 180 ° 회전 각으로 하였다. 관전압은 65 kV, 관전류는 385 μA로 하고, 노출 시간은 279 ms로 하였다. 촬영된 사진은 NRecon CT Skyscan reconstruction software를 이용하여 재건하였다. 상기 재건된 사진을 이용하여 골 형성을 분석하고 3D 사진을 만들었다. 각 그룹에서 세 개의 사진을 임의로 선택하여 이식 부위 및 골 형성을 측정하였고, 회복 수준은 신생 골 부피 (%), 골 면적 (mm²), 및 골 표면 밀도 (1/mm)로 나타내었다.

(5) 분석 결과

먼저, 래트 피하조직에서 치주인대 세포/스캐폴드 복합체의 생체 내 조직 적합성을 평가하였다. 4 주 이상의 기간 동안 이식된 그룹 모두 생적합성이 있는 것을 확인하였다 (도 10). 모든 표본에서 면역 반응이나 조직 거부반응은 확인되지 않았다. 많은 섬유 세포들이 종래 나노섬유에 접종된 세포를 대체하여 콜라겐성 조직 네트워크 안에서 발견되었다. 모든 그룹에서 이식된 영역 내에 적절한 혈관 신생이 관찰되었다.

한편, 콜라겐성 섬유 기질의 배향에서 주목할만한 차이가 관찰되었다. 즉, 정렬된 나노섬유 (DA 및 SA)에서는 콜라겐 섬유가 잘 배향되어 있었으나 (양쪽 화살표), 무작위 나노섬유 (DR 및 SR)에서는 배향성이 약했다. 특히, 치주인대의 특이적 섬유 구조인 옥시탈란 (oxytalan)의 존재 (화살표 머리)는 나노섬유 기질로 제작한 치주인대 세포/스캐폴드 복합체가 더 잘 기능한다는 것을 시사하며, DA 및 SA 그룹에서 많은 양의 치주인대 유사 옥시탈란 및 콜라겐 섬유가 관찰되었다.

상기 조직 적합성 결과를 기초로, 치주인대 결함 치료 및 재생에 대한 치주인대 세포/스캐폴드 복합체의 생체 내 치주조직 재생 효과를 확인하였다. 본 실험에서는 정렬된 나노섬유에서 배양한 세포만 (DA 및 SA 그룹)을 사용하였다. 상악전구골에 제작된 4 mm 직경의 결함에 스캐폴드를 이식하고 관찰한 결과, 4 주 경과 후에 조직이 회복되는 것을 확인하였다. 그 다음, 상기 표본을 조직학적 분석을 위해 회수하고, μCT로 촬영하고 분석하였다.

상악 앞니의 성장은 몇몇 치수조직을 제거한 래트를 제외하고 실험 기간 동안에는 특별히 방해를 받지 않았다. 모든 래트는 수술 후 하루 이내에 정상적인 활성을 보였으며, 부작용이 나타나지는 않았다. 이식 부위는 안정적이었고 회수된 조직에서 눈에 띄는 섬유 침투나 내부 염증이 발견되지 않았다 (도 11).

μCT 사진의 형태학적 분석으로 골 부피, 골 표면적, 및 골 표면 밀도 %를 정량화하였다 (도 12 내지 도 14). 음성 대조군으로 사용된 치주인대-제거 결함 그룹에서 상기 지표가 낮은 수준으로 관찰된 것과 비교하여, 정렬된 나노섬유만을 이식한 그룹에서는 모든 지표가 높은 값으로 증가한 것으로 확인하였다. 치주인대-제거 결함에 DA 또는 SA 그룹을 이식하였을 때, 상기 값은 더욱 현저하게 증가하였다. DA와 SA 그룹을 비교하면, DA 그룹이 더욱 높은 값을 보였다. 정상 치주인대 모델에 스캐폴드를 이식하였을 때, 상기 골 지표 값은 더욱 높았으며, DA를 이식하였을 때 더욱 증가된 값을 확인하였다. 각 그룹 간의 상기 세 가지 지표의 경향은 유사하였다; DA (sound) > SA (sound) ~ DA (removed) > SA(removed) > 나노섬유만 > 제거 결함.

상기 결과를 종합하면, 본 발명의 치주인대 세포/스캐폴드 복합체는 이식시 생적합성을 가지며, 치주 결함 모델에 이식된 경우 골 부피, 골 표면적, 및 골 표면 밀도를 증가시키는 우수한 효과가 있어 치주 조직 재생용 조성물로 이용될 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 다른 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

(a) 단방향으로 정렬된 나노섬유 스캐폴드를 제조하는 단계;
(b) 상기 스캐폴드에 치주인대 (periodontal ligament) 세포를 접종하는 단계;
(c) 상기 스캐폴드에 플렉셀 시스템 (Flexcell system)을 이용하여 0.5 내지 2 Hz 진동수로 신장 스트레스를 주며 치주인대 세포를 배양하는 단계; 및
(d) 상기 배양된 치주인대 세포/스캐폴드 복합체를 회수하는 단계를 포함하는, 치주인대 세포/스캐폴드 복합체 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 나노섬유 스캐폴드는 폴리카프로락톤 (polycaprolactone), 폴리입실론카프로락톤 (poly(ε-caprolactone)), 폴리락틱산 (polylactic acid), 폴리글리콜릭산 (polyglycolic acid), PEO (polyethylene oxide), PVA (poly(vinyl alcohol)), 키토산 (chitosan), 젤라틴 (gelatin), 플루란 (pullulan), γ-PGA (poly(γ-glutamic acid), 알지네이트 (alginate), 실크피브로인 (silk fibroin), 셀룰로오스 (cellulose), 알긴산 (alginic acid), 및 히알루론산 (hyaluronic acid)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상인 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (a)는 전기방사 기술을 이용하여 제조하는 것인, 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 전기방사에서 사용된 스피네릿의 직경은 0.1 mm 내지 1 mm 인 것인, 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 전기방사의 유속은 0.1 ㎖/h 내지 2 ㎖/h인 것인, 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 나노섬유의 단방향 정렬은 회전 원통형 금속 콜렉터를 사용하여 수행한 것인, 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 회전 원통형 금속 콜렉터는 100 내지 2000 rpm의 속도로 회전하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 나노섬유 중 65 % 이상의 나노 섬유의 배향이 상호 20 °이내의 차이로 정렬된 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 치주인대 세포는 중간엽 줄기세포의 특성을 가지는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 치주인대 세포는 CD44, CD73, CD106, CD146 및 TGF-βR1으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 단백질을 발현하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 치주인대 세포는 CD31 및 CD34로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 단백질을 발현하지 않는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 스캐폴드 1 mm² 당 100 개 내지 10000 개의 세포 밀도로 치주인대 세포를 접종한 것인, 제조방법.
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제1항에 있어서, 상기 신장 스트레스는 스캐폴드를 1 내지 10 % 신장시키는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 배양은 치주인대 세포를 1 내지 5일 동안 배양하는 것인, 제조방법.
제1항 내지 제12항, 제15항, 및 제16항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된, 치주인대 세포/스캐폴드 복합체.
제17항의 치주인대 세포/스캐폴드 복합체를 포함하는, 치주 조직 재생용 약학 조성물.