KR101609235B1 - Improved vaccines and methods for using the same - Google Patents

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Abstract

개선된 항-HIV 면역원 및 이를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 기재되어 있다. 본원에 기재된 면역원에는 HIV 아형 A 외막 단백질에 대한 컨센서스 서열을 갖는 것, HIV 아형 B 외막 단백질에 대한 컨센서스 서열을 갖는 것, HIV 아형 C 외막 단백질에 대한 컨센서스 서열을 갖는 것, HIV 아형 D 외막 단백질에 대한 컨센서스 서열을 갖는 것, HIV 아형 B 컨센서스 Nef-Rev 단백질에 대한 컨센서스 서열을 갖는 것, 및 HIV Gag 단백질 아형 A, B, C 및 D에 대한 컨센서스 서열을 갖는 것이 포함된다. 개선된 항-HPV 면역원 및 이를 암호화하는 핵산 분자; 개선된 항-HCV 면역원 및 이를 암호화하는 핵산 분자; 개선된 hTERT 면역원 및 이를 암호화하는 핵산 분자; 및 개선된 항-인플루엔자 면역원 및 이를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 기재되어 있다. 제약 조성물, 재조합 백신 및 생 약독화 병원체 뿐만 아니라 HIV, HPV, HCV, hTERT 및 인플루엔자에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법이 기재되어 있다.Improved anti-HIV immunogens and nucleic acid molecules encoding them are described herein. The immunogens described herein have a consensus sequence for HIV subtype A outer membrane protein, consensus sequence for HIV subtype B outer membrane protein, consensus sequence for HIV subtype C outer membrane protein, HIV subtype D outer membrane protein Having a consensus sequence for HIV subtype B consensus Nef-Rev protein, and having consensus sequence for HIV Gag protein subtypes A, B, C and D. An improved anti-HPV immunogen and a nucleic acid molecule encoding it; An improved anti-HCV immunogen and a nucleic acid molecule encoding it; An improved hTERT immunogen and a nucleic acid molecule encoding it; And improved anti-influenza immunogens and nucleic acid molecules encoding the same are described herein. Methods for inducing an immune response in an individual against HIV, HPV, HCV, hTERT and influenza as well as pharmaceutical compositions, recombinant vaccines and live attenuated pathogens are described.

Description

개선된 백신 및 이의 사용 방법 {IMPROVED VACCINES AND METHODS FOR USING THE SAME}Improved vaccines and methods of use thereof {IMPROVED VACCINES AND METHODS FOR USING THE SAME}

본 발명은 개선된 HIV, HPV, HCV, 인플루엔자 및 암 백신;면역 반응을 유도시키기 위한 개선된 방법; 및 HIV, HPV, HCV, 인플루엔자 및 암에 대하여 개체를 예방적 및/또는 치료적으로 면역시키기 위한 개선된 방법에 관한 것이다.The present invention provides improved HIV, HPV, HCV, influenza and cancer vaccines; improved methods for inducing an immune response; And to improved methods for prophylactic and/or therapeutic immunization of individuals against HIV, HPV, HCV, influenza and cancer.

HIV 게놈은 높은 돌연변이율과 기능적 보상으로 인해 고도로 가소성이다. 이러한 높은 돌연변이율은 하기하는 두 가지 이상의 기전에 의해 구동된다: 복제 주기당 한 가지 이상의 돌연변이를 유발시키는 바이러스성 역전사효소 (RT)의 낮은 충실도, 및 항레트로바이러스성 세포성 인자 APOBEC3G 유전자와 바이러스성 감염력 인자 Vif 보조 유전자의 이중 효과. 가능한 모든 돌연변이와 많은 이중 돌연변이를 수반한 게놈이 매 복제 주기 동안 발생하여, 엄청난 항원 다양성을 유발시킨다. 따라서, 개별 단리물로부터 유래된 후보 백신이 다양한 순환성 HIV 바이러스에 대하여 보호시켜 주기에 충분한 교차 반응성을 유도시킬 수 없다고 주장되어 왔다. 최근의 연구는 컨센서스 면역원 [참고: Gao. F., et al. 2005. Antigenicity and immunogenicity of a synthetic human immunodeficiency virus type 1 group m consensus envelope glycoprotein. J Virol 79:1154-63.; Scriba, T. J., et al. 2005. Functionally-inactive and immunogenic Tat, Rev and Nef DNA vaccines derived from sub-Saharan subtype C human immunodeficiency virus type 1 consensus sequences. Vaccine 23:1158-69] 또는 선조 면역원 [참고: Doria-Rose, N. A., et al. 2005. Human Immunodeficiency Virus Type 1 subtype B Ancestral Envelope Protein Is Functional and Elicits Neutralizing Antibodies in Rabbits Similar to Those Elicited by a Circulating Subtype B Envelope. J. Virol. 79:11214-11224; Gao, F., et al. 2004. Centralized immunogens as a vaccine strategy to overcome HIV-1 diversity. Expert Rev. Vaccines 3:S161-S168; Mullins, J.I., et al. 2004, Immunogen sequence: the fourth tier of AIDS vaccine design. Expert Rev. Vaccines 3:S151-S159; Nickle, D. C., et al. 2003. Consensus and ancestral state HIV vaccines. Science 299: 1515-1517]이 이와 관련하여 유용할 수 있다고 제안하였다. 그러나, 이러한 접근 방식에 대한 초기의 연구 결과는 이들 면역원에 의해 비교적 중간 수준의 세포성 면역 증강이 유도되었다고 제시하였다.The HIV genome is highly plastic due to its high mutation rate and functional reward. This high mutation rate is driven by two or more mechanisms: the low fidelity of viral reverse transcriptase (RT), which causes more than one mutation per replication cycle, and viral infectivity with the antiretroviral cellular factor APOBEC3G gene. The double effect of the factor Vif helper gene. A genome with all possible mutations and as many double mutations occurs during every replication cycle, leading to enormous antigenic diversity. Thus, it has been argued that candidate vaccines derived from individual isolates cannot induce sufficient cross-reactivity to protect against various circulating HIV viruses. A recent study is a consensus immunogen [Reference: Gao. F., et al. 2005. Antigenicity and immunogenicity of a synthetic human immunodeficiency virus type 1 group m consensus envelope glycoprotein. J Virol 79:1154-63.; Scriba, T. J., et al. 2005. Functionally-inactive and immunogenic Tat, Rev and Nef DNA vaccines derived from sub-Saharan subtype C human immunodeficiency virus type 1 consensus sequences. Vaccine 23:1158-69] or progenitor immunogen [Ref: Doria-Rose, N. A., et al. 2005. Human Immunodeficiency Virus Type 1 subtype B Ancestral Envelope Protein Is Functional and Elicits Neutralizing Antibodies in Rabbits Similar to Those Elicited by a Circulating Subtype B Envelope. J. Virol. 79:11214-11224; Gao, F., et al. 2004. Centralized immunogens as a vaccine strategy to overcome HIV-1 diversity. Expert Rev. Vaccines 3: S161-S168; Mullins, J.I., et al. 2004, Immunogen sequence: the fourth tier of AIDS vaccine design. Expert Rev. Vaccines 3: S151-S159; Nickle, D. C., et al. 2003. Consensus and ancestral state HIV vaccines. Science 299: 1515-1517] may be useful in this regard. However, early findings on this approach suggested that relatively moderate levels of cellular immunity enhancement were induced by these immunogens.

최근에 다음 문헌의 저자는 8쌍의 아프리카 이성애자간 병전염에서 HIV-1 아형 C 외막 당단백질 서열을 분석한 결과, 보다 짧은 V1, V2 및 V4 길이와 보다 적은 글리칸이 초기 전달자로부터 수득한 서열이 공유하고 있는 공통적인 특징인 것으로 밝혀졌다 [참고: Derdeyn, C, A., et al. 2004. Envelope-constrained neutralization-sensitive HIV-1 after heterosexual transmission. Science 303:2019-2022.]. 이러한 데이터는 상기 바이러스를 모방하는 항원이 초기 전염된 바이러스와 관련이 있을 수도 있다는 것을 제안하고 있다. 그러나, 이러한 초기 전달자 구조가 모든 아형에서 관찰되지는 않았다 [참고: Chohan, B., et al. 2005. Selection for Human Immunodeficiency Virus Type 1 envelope glycosylation variants with shorter V1-V2 loop sequences occurs during transmission of certain genetic subtypes and may impact viral RNA levels. J. Virol. 79:6528-6531]. 그러나, 보다 짧은 V 루프를 외막 면역원에 혼입하는 것은 다른 이점을 지닐 수도 있는데, 예를 들어 가용성 CD4에 대한 민감도가 증강되므로 [참고: Pickora, C., et al. 2005. Identification of two N-linked glycosylation sites within the core of the Simian Immunodificiency virus glycoprotein whose removal enhances sensitivity to soluble CD4. J. Virol. 79:12575-12583], 고려되어야 한다.Recently, the authors of the following literature analyzed the sequence of the HIV-1 subtype C outer membrane glycoprotein in 8 pairs of African heterosexual infections, and found that shorter V1, V2, and V4 lengths and fewer glycans were obtained from the initial messenger. It has been found to be a common trait that is shared [see: Derdeyn, C, A., et al. 2004. Envelope-constrained neutralization-sensitive HIV-1 after heterosexual transmission. Science 303:2019-2022.]. These data suggest that antigens that mimic the virus may be associated with early transmitted viruses. However, this early transporter structure was not observed in all subtypes [Ref: Chohan, B., et al. 2005. Selection for Human Immunodeficiency Virus Type 1 envelope glycosylation variants with shorter V1-V2 loop sequences occurs during transmission of certain genetic subtypes and may impact viral RNA levels. J. Virol. 79:6528-6531]. However, incorporation of shorter V loops into the adventitial immunogen may have other advantages, for example, as sensitivity to soluble CD4 is enhanced [Ref: Pickora, C., et al. 2005. Identification of two N-linked glycosylation sites within the core of the Simian Immunodificiency virus glycoprotein whose removal enhances sensitivity to soluble CD4. J. Virol. 79:12575-12583], should be considered.

연구 결과, 급성 및 무증후성 감염과 AIDS 발병 동안 바이러스성 부하를 제어하는 데에 있어서 HIV-1 특이적 CTL 반응이 중요한 것으로 밝혀졌다. 그러나, 현재 외막에 의거한 DNA 백신이 필요한 만큼 강력한지 어떤지는 명확치 않다. HIV-1 면역원의 발현 수준을 증가시키기 위한 몇 가지 방법이 사용되어 왔는데, 예를 들어 코돈 최적화 [참고: Andre, S., et al. 1998, Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gpl20 sequence with optimized codon usage. J Virol 72:1497-503; Deml, L., et al. A. 2001. Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 gag protein. J. Virol. 75: 10991-13001], RNA 최적화 [참고: Muthumani, K., et al. 2003. Novel engineered HIV-1 East African Clade-A gp160 plasmid construct induces strong humoral and cell-mediated immune responses in vivo. Virology 314:134-46; Schneider, R., M. et al. 1997. Inactivation of the human immunodeficiency virus type 1 inhibitory elements allows Rev-independent expression of Gag and Gag/protease and particle formation. J. Virol 71:4892-4903] 및 RNA 이차 구조가 약한 면역글로빈 리더 서열의 부가 [참고: Yang, J. S., et al., 2001. Induction of potent Th1-Type immune responses from a novel DNA vaccine for West Nile Virus New York Isolate (WNV-NY1999). J. Infect Diseases 184:809-816] 방법이 있다.Studies have shown that HIV-1 specific CTL responses are important in controlling viral load during acute and asymptomatic infections and AIDS outbreaks. However, it is currently unclear whether adventitia-based DNA vaccines are as powerful as necessary. Several methods have been used to increase the level of expression of the HIV-1 immunogen, eg codon optimization [See: Andre, S., et al. 1998, Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gpl20 sequence with optimized codon usage. J Virol 72:1497-503; Deml, L., et al. A. 2001. Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 gag protein. J. Virol. 75: 10991-13001], RNA optimization [See: Muthumani, K., et al. 2003. Novel engineered HIV-1 East African Clade-A gp160 plasmid construct induces strong humoral and cell-mediated immune responses in vivo. Virology 314:134-46; Schneider, R., M. et al. 1997. Inactivation of the human immunodeficiency virus type 1 inhibitory elements allows Rev-independent expression of Gag and Gag/protease and particle formation. J. Virol 71:4892-4903] and the addition of an immunoglobin leader sequence with a weak RNA secondary structure [Reference: Yang, JS, et al., 2001. Induction of potent Th1-Type immune responses from a novel DNA vaccine for West Nile Virus New York Isolate (WNV-NY1999). J. Infect Diseases 184:809-816].

인간 유두종 바이러스 (HPV)는 환상 dsDNA 게놈 (7,000 내지 8,000 염기쌍)을 갖고 있다. 200개 이하의 상이한 유전형이 있다. 계통발생학적으로, HPV는 고도로 보존된다. 점막 HPV는 "고 위험" 또는 "저 위험"으로 분류된다. 저 위험 군에는 유형 6, 11, 42 등이 포함된다. 관련 질병에는 생식기 사마귀; 저 악성도 자궁경부, 항문, 외음부, 질 형성이상; 및 재발성 호흡 유두종증이 포함된다. 고 위험 군에는 유형 16, 18, 31, 33, 45, 52, 58 등이 포함된다. 관련 질환에는 자궁경부암, 전암성 형성이상의 주요 원인; 항문, 외음부, 질, 편도선 암의 주 원인; 및 기타 기도소화관의 암에 대한 조인자가 포함된다. 매일, 800명의 여성이 자궁경부암으로 인해 사망하고 있다.Human papilloma virus (HPV) has a circular dsDNA genome (7,000 to 8,000 base pairs). There are no more than 200 different genotypes. Phylogenetic, HPV is highly conserved. Mucosal HPV is classified as “high risk” or “low risk”. Low-risk groups include types 6, 11, and 42. Related diseases include genital warts; Low malignancy cervix, anus, vulva, vaginal dysplasia; And recurrent respiratory papillomatosis. The high-risk groups included types 16, 18, 31, 33, 45, 52 and 58. Related diseases include cervical cancer, a major cause of precancerous dysplasia; The main cause of cancer of the anus, vulva, vagina and tonsils; And other contributors to cancer of the airway tract. Every day, 800 women die from cervical cancer.

HPV E6 및 E7 단백질은 종양형성과 종양 상태 유지를 위해 필요한 종양 특이적 항원이다. 자궁경부암 환자에게서는 E7-특이적 면역 반응이 결실된다. E6 단백질과 E7 단백질 둘 다는 세포성 인간 종양 억제인자 유전자 생성물과 특이적으로 상호 작용하는데, E6은 p53과 상호 작용하고 E7은 Rb (망막모세포종 종양 억제인자 유전자)와 상호 작용한다. E6과 E7은 이상적인 면역치료적 표적이다.HPV E6 and E7 proteins are tumor-specific antigens required for tumorigenesis and maintenance of tumor status. In patients with cervical cancer, the E7-specific immune response is deleted. Both the E6 and E7 proteins interact specifically with the cellular human tumor suppressor gene product, E6 interacts with p53 and E7 interacts with Rb (retinal blastoma tumor suppressor gene). E6 and E7 are ideal immunotherapeutic targets.

hTERT는 염색체 단축으로 인한 세포 사멸을 방지하기 위해 텔로미어 (telomere)의 말단 상에 TTAGGG 태그를 합성하는 인간 텔로머라제 역전사효소이다. 배아 세포와 몇몇 생식세포계 세포는 정상적으로 hTERT를 발현하여 세포 집단의 생체 항상성을 조절한다. 그러나 암 세포는 세포 집단의 생체 항상성을 붕괴시키기 위해 이러한 조절 기전을 이용하고 있다. 예를 들어, hTERT 과발현이 인간 암 세포의 85％ 이상에서 일어난다. 따라서, hTERT는 이상적인 면역치료적 표적이다.hTERT is a human telomerase reverse transcriptase that synthesizes a TTAGGG tag on the end of a telomere to prevent cell death due to chromosomal shortening. Embryonic cells and some germline cells normally express hTERT to regulate the biohomeostasis of the cell population. However, cancer cells are using this regulatory mechanism to disrupt the biohomeostasis of the cell population. For example, hTERT overexpression occurs in more than 85% of human cancer cells. Therefore, hTERT is an ideal immunotherapeutic target.

hTERT는 HCV 또는 HPV 감염으로 인해 hTERT를 발현하는 과증식성 세포에 대한 면역치료를 증강시킬 수도 있다. 고 위험 HPV 유형으로부터의 E6 종양단백질은 인간 각질세포에서 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT) 전사를 활성화시킨다. 간 내에서의 초기 종양성 병변과 형성이상 병변은 hTERT를 비정상적으로 높은 수준으로 발현하기도 한다. 따라서, HPV 및 HCV에 대한 면역요법은 hTERT를 비정상적 수준으로 발현하는 세포를 표적으로 함으로써 증강시킬 수 있다. hTERT와 HPV 또는 HCV 단백질 또는 이러한 단백질을 암호화하는 핵산 둘 다를 사용하는 복합 면역요법이 관심을 끄는 면역요법이다.hTERT may also enhance immunotherapy against hyperproliferative cells expressing hTERT due to HCV or HPV infection. The E6 oncoprotein from the high risk HPV type activates human telomerase reverse transcriptase (hTERT) transcription in human keratinocytes. Early neoplastic and dysplasia lesions in the liver may express abnormally high levels of hTERT. Thus, immunotherapy against HPV and HCV can be augmented by targeting cells expressing hTERT at abnormal levels. Combination immunotherapy using both hTERT and HPV or HCV proteins or nucleic acids encoding these proteins is an immunotherapy of interest.

인플루엔자 적혈구응집소 (HA)는 인플루엔자 바이러스성 입자의 표면 상에서 발현되고 이러한 바이러스와 그의 숙주 세포 간의 초기 접촉에 대해 책임이 있다. HA는 널리 공지된 면역원이다. 조류 인플루엔자 균주인 인플루엔자 A 균주 H1N5는 특히 인간 집단에 위협이 되는데, 이는 그의 HA 단백질이 천연 돌연변이에 의해 약간 유전적으로 재편성되는 경우, 이는 기타 바이러스 균주와 비교해서 인간 세포의 감염성을 상당히 증가시켰기 때문이다. 유아 및 노인 또는 면역저하된 성인 인간을 바이러스성 H1N5 균주로 감염시키면, 이는 열악한 임상적 결과와 종종 상관이 있다. 따라서, HA 및 H1N5 인플루엔자 균주의 기타 인플루엔자 분자는 이상적인 면역치료적 표적이다.Influenza hemagglutinin (HA) is expressed on the surface of influenza viral particles and is responsible for the initial contact between this virus and its host cells. HA is a well-known immunogen. Influenza A strain H1N5, a strain of avian influenza, poses a particularly threat to the human population, because when its HA protein is slightly genetically rearranged by natural mutations, it significantly increases the infectivity of human cells compared to other viral strains. . Infecting infants and the elderly or immunocompromised adult humans with the viral H1N5 strain is often correlated with poor clinical outcomes. Thus, HA and other influenza molecules of the H1N5 influenza strain are ideal immunotherapeutic targets.

발명의 요약Summary of the invention

본 발명은 그에 대하여 항-HIV 면역 반응을 생성시킬 수 있는 개선된 면역원성 표적을 제공하는 핵산 구조물 및 이에 의해 암호화된 단백질에 관한 것이다.The present invention relates to nucleic acid constructs and proteins encoded thereby providing improved immunogenic targets capable of generating an anti-HIV immune response thereto.

본 발명은 HIV 아형 A 외막 단백질에 대한 컨센서스 서열, HIV 아형 B 외막 단백질에 대한 컨센서스 서열, HIV 아형 C 외막 단백질에 대한 컨센서스 서열, HIV 아형 D 외막 단백질에 대한 컨센서스 서열, HIV 아형 B 컨센서스 Nef-Rev 단백질에 대한 컨센서스 서열, 및 HIV Gag 단백질 아형 A, B, C 및 D에 대한 컨센서스 서열을 제공한다.The present invention relates to a consensus sequence for an HIV subtype A outer membrane protein, a consensus sequence for an HIV subtype B outer membrane protein, a consensus sequence for an HIV subtype C outer membrane protein, a consensus sequence for an HIV subtype D outer membrane protein, and an HIV subtype B consensus Nef-Rev. Consensus sequences for proteins, and consensus sequences for HIV Gag protein subtypes A, B, C and D are provided.

본 발명은 이러한 단백질 서열을 암호화하는 구조물, 상기 단백질 및/또는 이러한 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 백신, 및 항-HIV 면역 반응의 유도 방법을 제공한다.The present invention provides a construct encoding such a protein sequence, a vaccine comprising the protein and/or a nucleic acid molecule encoding the protein, and a method of inducing an anti-HIV immune response.

본 발명은 서열 1; 서열 1의 단편; 서열 1과의 상동성이 90％ 이상인 서열; 서열 1과의 상동성이 90％ 이상인 서열의 단편; 서열 3; 서열 3의 단편; 서열 3과의 상동성이 90％ 이상인 서열; 서열 3과의 상동성이 90％ 이상인 서열의 단편; 서열 5; 서열 5의 단편; 서열 5와의 상동성이 90％ 이상인 서열; 서열 5와의 상동성이 90％ 이상인 서열의 단편; 서열 7; 서열 7의 단편; 서열 7과의 상동성이 90％ 이상인 서열; 서열 7과의 상동성이 90％ 이상인 서열의 단편; 서열 9; 서열 9의 단편; 서열 9와의 상동성이 90％ 이상인 서열; 서열 9와의 상동성이 90％ 이상인 서열의 단편; 서열 11; 서열 11의 단편; 서열 11과의 상동성이 90％ 이상인 서열; 및 서열 11과의 상동성이 90％ 이상인 서열의 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.The present invention is SEQ ID NO: 1; Fragment of SEQ ID NO: 1; A sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 1; A fragment of a sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; Fragment of SEQ ID NO: 3; A sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 3; A fragment of a sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO:3; SEQ ID NO: 5; Fragment of SEQ ID NO: 5; A sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 5; A fragment of a sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; A fragment of SEQ ID NO: 7; A sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 7; A fragment of a sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO:9; A fragment of SEQ ID NO:9; A sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO:9; A fragment of a sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO:9; SEQ ID NO: 11; A fragment of SEQ ID NO:11; A sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 11; And it relates to a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a fragment of a sequence having a homology of at least 90% with SEQ ID NO: 11.

본 발명은 서열 16; 서열 17; 서열 18; 서열 19; 서열 20 및 서열 21로 이루어진 군 중에서 선택된 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다.The present invention is SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; It relates to a nucleic acid molecule encoding a protein selected from the group consisting of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21.

본 발명은 서열 2를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 서열 2와의 상동성이 90％ 이상인 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 서열 2를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 단편; 서열 2와의 상동성이 90％ 이상인 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 단편; 서열 4를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 서열 4와의 상동성이 90％ 이상인 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 서열 4를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 단편; 서열 4와의 상동성이 90％ 이상인 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 단편; 서열 6을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 서열 6과의 상동성이 90％ 이상인 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 서열 6을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 단편; 서열 6과의 상동성이 90％ 이상인 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 단편; 서열 8을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 서열 8과의 상동성이 90％ 이상인 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 서열 8을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 단편; 서열 8과의 상동성이 90％ 이상인 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 단편; 서열 10을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 서열 10과의 상동성이 90％ 이상인 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 서열 10을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 단편; 서열 10과의 상동성이 90％ 이상인 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 단편; 서열 12를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 서열 12와의 상동성이 90％ 이상인 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 서열 12를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 단편; 및 서열 12와의 상동성이 90％ 이상인 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.The present invention provides a nucleotide sequence encoding SEQ ID NO: 2; A nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having 90% or more homology with SEQ ID NO: 2; A fragment of the nucleotide sequence encoding SEQ ID NO:2; A fragment of a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having 90% or more homology with SEQ ID NO: 2; A nucleotide sequence encoding SEQ ID NO:4; A nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having 90% or more homology with SEQ ID NO: 4; A fragment of the nucleotide sequence encoding SEQ ID NO:4; A fragment of a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having 90% or more homology with SEQ ID NO: 4; A nucleotide sequence encoding SEQ ID NO:6; A nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having 90% or more homology with SEQ ID NO: 6; A fragment of the nucleotide sequence encoding SEQ ID NO:6; A fragment of a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having 90% or more homology with SEQ ID NO: 6; A nucleotide sequence encoding SEQ ID NO:8; A nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having 90% or more homology with SEQ ID NO: 8; A fragment of the nucleotide sequence encoding SEQ ID NO:8; A fragment of a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having 90% or more homology with SEQ ID NO: 8; Nucleotide sequence encoding SEQ ID NO:10; A nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having 90% or more homology with SEQ ID NO: 10; A fragment of the nucleotide sequence encoding SEQ ID NO:10; A fragment of a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having 90% or more homology with SEQ ID NO: 10; Nucleotide sequence encoding SEQ ID NO:12; A nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having 90% or more homology with SEQ ID NO: 12; A fragment of the nucleotide sequence encoding SEQ ID NO: 12; And it relates to a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of fragments of a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having 90% or more homology with SEQ ID NO: 12.

본 발명은 추가로, 이러한 핵산 분자를 포함하는 제약 조성물, 및 상기 핵산 분자를 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HIV에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 있어서의 상기 제약 조성물의 용도를 제공한다.The present invention further provides a pharmaceutical composition comprising such a nucleic acid molecule, and a composition comprising the nucleic acid molecule of the pharmaceutical composition in a method of inducing an immune response in an individual against HIV, comprising administering to the individual. Provides a use.

본 발명은 추가로, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 백신, 및 이러한 재조합 백신을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HIV에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 있어서의 상기 재조합 백신의 용도를 제공한다.The present invention further provides a recombinant vaccine containing the nucleic acid molecule, and the use of the recombinant vaccine in a method for inducing an immune response in an individual against HIV, comprising administering the recombinant vaccine to the individual. .

본 발명은 추가로, 상기 핵산 분자를 포함하는 생 약독화 병원체, 및 이러한 생 약독화 병원체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HIV에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 있어서의 상기 생 약독화 병원체의 용도를 제공한다.The present invention further provides a live attenuated pathogen comprising the nucleic acid molecule, and the live attenuated in a method for inducing an immune response in an individual against HIV, comprising administering such a live attenuated pathogen to the individual. Provides the use of pathogens.

생 약독화 병원체Live attenuated pathogen

본 발명은 추가로, 서열 2; 서열 2와의 상동성이 90％ 이상인 서열; 서열 2의 단편; 서열 2와의 상동성이 90％ 이상인 서열의 단편; 서열 4; 서열 4와의 상동성이 90％ 이상인 서열; 서열 4의 단편; 서열 4와의 상동성이 90％ 이상인 서열의 단편; 서열 6; 서열 6과의 상동성이 90％ 이상인 서열; 서열 6의 단편; 서열 6과의 상동성이 90％ 이상인 서열의 단편; 서열 8; 서열 8과의 상동성이 90％ 이상인 서열; 서열 8의 단편; 서열 8과의 상동성이 90％ 이상인 서열의 단편; 서열 10; 서열 10과의 상동성이 90％ 이상인 서열; 서열 10의 단편; 서열 10과의 상동성이 90％ 이상인 서열의 단편; 서열 12; 서열 12와의 상동성이 90％ 이상인 서열; 서열 12의 단편; 및 서열 12와의 상동성이 90％ 이상인 서열의 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 제공한다.The present invention further comprises: SEQ ID NO: 2; A sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 2; Fragment of SEQ ID NO: 2; A fragment of a sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; A sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 4; Fragment of SEQ ID NO: 4; A fragment of a sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; A sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO:6; A fragment of SEQ ID NO: 6; A fragment of a sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO:6; SEQ ID NO: 8; A sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 8; A fragment of SEQ ID NO: 8; A fragment of a sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO:10; A sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO:10; A fragment of SEQ ID NO:10; A fragment of a sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO:10; SEQ ID NO: 12; A sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 12; A fragment of SEQ ID NO: 12; And it provides a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of a fragment of a sequence having a homology of at least 90% with SEQ ID NO: 12.

본 발명은 추가로, 서열 16; 서열 17; 서열 18; 서열 19; 서열 20 및 서열 21로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 제공한다.The present invention further comprises: SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; It provides a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21.

본 발명은 추가로, 이러한 단백질을 포함하는 제약 조성물, 및 상기 단백질을 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HIV에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 있어서의 상기 제약 조성물의 용도를 제공한다.The present invention further relates to the use of the pharmaceutical composition in a method of inducing an immune response in an individual against HIV, comprising administering to the individual a pharmaceutical composition comprising such a protein, and a composition comprising the protein. to provide.

본 발명은 추가로, 상기 단백질을 포함하는 재조합 백신, 및 이러한 재조합 백신을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HIV에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 있어서의 상기 재조합 백신의 용도를 제공한다.The present invention further provides a recombinant vaccine comprising the protein and the use of the recombinant vaccine in a method for inducing an immune response in an individual against HIV, comprising administering the recombinant vaccine to the individual.

본 발명은 추가로, 상기 단백질을 포함하는 생 약독화 병원체, 및 이러한 생 약독화 병원체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HIV에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 있어서의 상기 생 약독화 병원체의 용도를 제공한다.The present invention further provides a live attenuated pathogen comprising the protein, and the live attenuated pathogen in a method for inducing an immune response in an individual against HIV, comprising administering the live attenuated pathogen to the individual. Provides the use of.

컨센서스 HPV 유전자형 16 E6-E7 아미노산 서열을 포함하는 단백질 및 이러한 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다.A protein comprising the consensus HPV genotype 16 E6-E7 amino acid sequence and a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding such a protein are provided.

본 발명은 서열 22; 그의 단편; 서열 22와의 상동성이 90％ 이상인 뉴클레오티드 서열; 및 그의 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.The present invention is SEQ ID NO: 22; His short story; A nucleotide sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 22; And a nucleotide sequence selected from the group consisting of fragments thereof.

본 발명은 또한, 서열 23을 암호화하는 핵산 서열; 서열 24를 암호화하는 핵산 서열; 서열 25를 암호화하는 핵산 서열; 서열 26을 암호화하는 핵산 서열; 및 서열 27을 암호화하는 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.The present invention also provides a nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO:23; Nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO:24; A nucleic acid sequence that encodes SEQ ID NO:25; A nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO:26; And it relates to a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO: 27.

본 발명은 또한, 이러한 핵산 분자를 포함하는 제약 조성물, 및 상기 핵산 분자를 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HPV에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The invention also relates to a pharmaceutical composition comprising such a nucleic acid molecule, and a method of inducing an immune response in a subject against HPV, comprising administering to the subject a composition comprising the nucleic acid molecule.

본 발명은 추가로, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 백신, 및 이러한 재조합 백신을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HPV에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The present invention further relates to a recombinant vaccine comprising the nucleic acid molecule, and a method of inducing an immune response in an individual against HPV, comprising administering the recombinant vaccine to the individual.

본 발명은 추가로, 상기 핵산 분자를 포함하는 생 약독화 병원체, 및 이러한 생 약독화 병원체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HPV에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The present invention further relates to a live attenuated pathogen comprising the nucleic acid molecule, and a method of inducing an immune response in a subject against HPV, comprising administering to the subject such a live attenuated pathogen.

본 발명은 또한, 서열 23; 그의 단편; 서열 23과의 상동성이 90％ 이상인 서열; 및 그의 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 관한 것이다.The present invention also includes SEQ ID NO: 23; His short story; A sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 23; And it relates to a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of fragments thereof.

본 발명은 또한, 서열 23; 서열 24; 서열 25; 서열 26; 및 서열 27로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 관한 것이다.The present invention also includes SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; And it relates to a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 27.

본 발명은 또한, 이러한 단백질을 포함하는 제약 조성물, 및 상기 단백질을 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HPV에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising such a protein, and a method of inducing an immune response in a subject against HPV, comprising administering to the subject a composition comprising the protein.

본 발명은 또한, 상기 단백질을 포함하는 재조합 백신, 및 이러한 재조합 백신을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HPV에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a recombinant vaccine comprising the protein, and a method of inducing an immune response in a subject against HPV, comprising administering the recombinant vaccine to the subject.

본 발명은 또한, 상기 단백질을 포함하는 생 약독화 병원체, 및 이러한 생 약독화 병원체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HPV에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a live attenuated pathogen comprising the protein, and a method of inducing an immune response in a subject against HPV, comprising administering the live attenuated pathogen to the subject.

컨센서스 HCV 유전자형 1a 및 1b E1-E2 아미노산 서열을 포함하는 단백질 및 이러한 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다.Proteins comprising consensus HCV genotypes 1a and 1b E1-E2 amino acid sequences and nucleic acid molecules comprising nucleotide sequences encoding such proteins are provided.

본 발명은 서열 30; 그의 단편; 서열 30과의 상동성이 90％ 이상인 뉴클레오티드 서열; 및 그의 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.The present invention is SEQ ID NO: 30; His short story; A nucleotide sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 30; And a nucleotide sequence selected from the group consisting of fragments thereof.

본 발명은 또한, 서열 31을 암호화하는 핵산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.The present invention also relates to a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of nucleic acid sequences encoding SEQ ID NO: 31.

본 발명은 또한, 이러한 핵산 분자를 포함하는 제약 조성물, 및 상기 핵산 분자를 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HCV에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The invention also relates to a pharmaceutical composition comprising such a nucleic acid molecule, and a method of inducing an immune response in a subject against HCV, comprising administering to the subject a composition comprising the nucleic acid molecule.

본 발명은 추가로, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 백신, 및 이러한 재조합 백신을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HCV에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The present invention further relates to a recombinant vaccine comprising the nucleic acid molecule, and a method of inducing an immune response in an individual against HCV, comprising administering the recombinant vaccine to the individual.

본 발명은 추가로, 상기 핵산 분자를 포함하는 생 약독화 병원체, 및 이러한 생 약독화 병원체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HCV에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The invention further relates to a live attenuated pathogen comprising the nucleic acid molecule, and a method of inducing an immune response in a subject against HCV, comprising administering to the subject such a live attenuated pathogen.

본 발명은 또한, 서열 31; 그의 단편; 서열 31과의 상동성이 90％ 이상인 서열; 및 그의 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 관한 것이다.The present invention also includes SEQ ID NO: 31; His short story; A sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 31; And it relates to a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of fragments thereof.

본 발명은 또한, 이러한 단백질을 포함하는 제약 조성물, 및 상기 단백질을 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HCV에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The invention also relates to a pharmaceutical composition comprising such a protein, and a method of inducing an immune response in a subject against HCV, comprising administering to the subject a composition comprising the protein.

본 발명은 또한, 상기 단백질을 포함하는 재조합 백신, 및 이러한 재조합 백신을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HCV에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a recombinant vaccine comprising the protein and a method of inducing an immune response in a subject against HCV, comprising administering the recombinant vaccine to the subject.

본 발명은 또한, 상기 단백질을 포함하는 생 약독화 병원체, 및 이러한 생 약독화 병원체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HCV에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a live attenuated pathogen comprising the protein, and a method of inducing an immune response in a subject against HCV, comprising administering the live attenuated pathogen to the subject.

컨센서스 hTERT 아미노산 서열을 포함하는 단백질 및 이러한 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다.Proteins comprising a consensus hTERT amino acid sequence and nucleic acid molecules comprising a nucleotide sequence encoding such a protein are provided.

본 발명은 추가로, 서열 34; 그의 단편; 서열 34와의 상동성이 90％ 이상인 뉴클레오티드 서열; 및 그의 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.The present invention further comprises: SEQ ID NO: 34; His short story; A nucleotide sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO:34; And a nucleotide sequence selected from the group consisting of fragments thereof.

본 발명은 또한, 이러한 핵산 분자를 포함하는 제약 조성물, 및 상기 핵산 분자를 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, hTERT를 발현하는 과증식성 세포에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising such a nucleic acid molecule, and a method of inducing an immune response in a subject against hTERT-expressing hyperproliferative cells comprising administering to the subject a composition comprising the nucleic acid molecule. will be.

본 발명은 추가로, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 백신, 및 이러한 재조합 백신을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, hTERT를 발현하는 과증식성 세포에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The present invention further relates to a recombinant vaccine comprising the nucleic acid molecule, and a method of inducing an immune response in an individual against hyperproliferative cells expressing hTERT, comprising administering the recombinant vaccine to the individual.

본 발명은 추가로, 상기 핵산 분자를 포함하는 생 약독화 병원체, 및 이러한 생 약독화 병원체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, hTERT를 발현하는 과증식성 세포에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The present invention further provides a method for inducing an immune response in a subject against hyperproliferative cells expressing hTERT, comprising administering to the subject a live attenuated pathogen comprising the nucleic acid molecule, and About.

본 발명은 또한, 서열 35; 그의 단편; 서열 35와의 상동성이 90％ 이상인 서열; 및 그의 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 관한 것이다.The present invention also includes SEQ ID NO:35; His short story; A sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 35; And it relates to a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of fragments thereof.

본 발명은 또한, 이러한 단백질을 포함하는 제약 조성물, 및 상기 단백질을 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, hTERT를 발현하는 과증식성 세포에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The invention also relates to a pharmaceutical composition comprising such a protein, and a method of inducing an immune response in a subject against hyperproliferative cells expressing hTERT comprising administering to the subject a composition comprising the protein.

본 발명은 또한, 상기 단백질을 포함하는 재조합 백신, 및 이러한 재조합 백신을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, hTERT를 발현하는 과증식성 세포에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a recombinant vaccine comprising the protein and a method of inducing an immune response in a subject against hyperproliferative cells expressing hTERT, comprising administering the recombinant vaccine to the subject.

본 발명은 또한, 상기 단백질을 포함하는 생 약독화 병원체, 및 이러한 생 약독화 병원체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, hTERT를 발현하는 과증식성 세포에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a live attenuated pathogen comprising the protein, and a method of inducing an immune response in a subject against hyperproliferative cells expressing hTERT, comprising administering the live attenuated pathogen to the subject. .

인플루엔자 H5N1 컨센서스 HA 아미노산 서열, 인플루엔자 H1N1 및 H5N1 컨센서스 NA 아미노산 서열, 인플루엔자 H1N1 및 H5N1 컨센서스 M1 아미노산 서열, 및 인플루엔자 H5N1 컨센서스 M2E-NP 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및 이러한 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다.A protein comprising an influenza H5N1 consensus HA amino acid sequence, an influenza H1N1 and H5N1 consensus NA amino acid sequence, an influenza H1N1 and H5N1 consensus M1 amino acid sequence, and an influenza H5N1 consensus M2E-NP amino acid sequence; And a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding such a protein.

본 발명은 추가로, 서열 36; 그의 단편; 서열 36과의 상동성이 90％ 이상인 뉴클레오티드 서열; 및 그의 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.The present invention further comprises: SEQ ID NO:36; His short story; A nucleotide sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO:36; And a nucleotide sequence selected from the group consisting of fragments thereof.

본 발명은 추가로, 서열 38; 그의 단편; 서열 38과의 상동성이 90％ 이상인 뉴클레오티드 서열; 및 그의 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.The present invention further comprises: SEQ ID NO:38; His short story; A nucleotide sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO:38; And a nucleotide sequence selected from the group consisting of fragments thereof.

본 발명은 추가로, 서열 40; 그의 단편; 서열 40과의 상동성이 90％ 이상인 뉴클레오티드 서열; 및 그의 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.The present invention further comprises: SEQ ID NO: 40; His short story; A nucleotide sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO:40; And a nucleotide sequence selected from the group consisting of fragments thereof.

본 발명은 추가로, 서열 42; 그의 단편; 서열 42와의 상동성이 90％ 이상인 뉴클레오티드 서열; 및 그의 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.The present invention further comprises: SEQ ID NO:42; His short story; A nucleotide sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO:42; And a nucleotide sequence selected from the group consisting of fragments thereof.

본 발명은 또한, 이러한 핵산 분자를 포함하는 제약 조성물, 및 상기 핵산 분자를 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HPV, HCV 및 인플루엔자 바이러스에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The invention also relates to a pharmaceutical composition comprising such a nucleic acid molecule, and a method of inducing an immune response in an individual against HPV, HCV and influenza viruses comprising administering to the individual a composition comprising the nucleic acid molecule. .

본 발명은 추가로, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 백신, 및 이러한 재조합 백신을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HPV, HCV 및 인플루엔자 바이러스에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The present invention further relates to a recombinant vaccine comprising the nucleic acid molecule, and a method of inducing an immune response in a subject against HPV, HCV and influenza viruses, comprising administering the recombinant vaccine to the subject.

본 발명은 추가로, 상기 핵산 분자를 포함하는 생 약독화 병원체, 및 이러한 생 약독화 병원체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HPV, HCV 및 인플루엔자 바이러스에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The present invention further relates to a live attenuated pathogen comprising the nucleic acid molecule, and a method of inducing an immune response in a subject against HPV, HCV and influenza viruses, comprising administering the live attenuated pathogen to the subject. will be.

본 발명은 또한, 상기 핵산 분자를 포함하는 제약 조성물, 및 상기 핵산 분자를 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HPV, HCV 및 인플루엔자 바이러스에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a method of inducing an immune response in a subject against HPV, HCV and influenza viruses comprising administering to the subject a pharmaceutical composition comprising the nucleic acid molecule and a composition comprising the nucleic acid molecule. .

본 발명은 추가로, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 백신, 및 이러한 재조합 백신을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HPV, HCV 및 인플루엔자 바이러스에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The present invention further relates to a recombinant vaccine comprising the nucleic acid molecule, and a method of inducing an immune response in a subject against HPV, HCV and influenza viruses, comprising administering the recombinant vaccine to the subject.

본 발명은 추가로, 상기 핵산 분자를 포함하는 생 약독화 병원체, 및 이러한 생 약독화 병원체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, HPV, HCV 및 인플루엔자 바이러스에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The present invention further relates to a live attenuated pathogen comprising the nucleic acid molecule, and a method of inducing an immune response in a subject against HPV, HCV and influenza viruses, comprising administering the live attenuated pathogen to the subject. will be.

본 발명은 추가로, 서열 37; 그의 단편; 서열 37과의 상동성이 90％ 이상인 서열; 및 그의 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 분자에 관한 것이다.The present invention further comprises: SEQ ID NO: 37; His short story; A sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 37; And it relates to a protein molecule comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of fragments thereof.

본 발명은 추가로, 서열 39; 그의 단편; 서열 39과의 상동성이 90％ 이상인 서열; 및 그의 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 분자에 관한 것이다.The present invention further comprises: SEQ ID NO: 39; His short story; A sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 39; And it relates to a protein molecule comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of fragments thereof.

본 발명은 추가로, 서열 41; 그의 단편; 서열 41과의 상동성이 90％ 이상인 서열; 및 그의 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 분자에 관한 것이다.The present invention further comprises: SEQ ID NO: 41; His short story; A sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO: 41; And it relates to a protein molecule comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of fragments thereof.

본 발명은 추가로, 서열 43; 그의 단편; 서열 43과의 상동성이 90％ 이상인 서열; 및 그의 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 분자에 관한 것이다.The present invention further comprises: SEQ ID NO: 43; His short story; A sequence having at least 90% homology with SEQ ID NO:43; And it relates to a protein molecule comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of fragments thereof.

본 발명은 또한, 상기 단백질 분자를 포함하는 제약 조성물, 및 상기 단백질 분자를 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The invention also relates to a method of inducing an immune response in an individual against influenza virus, comprising administering to the individual a pharmaceutical composition comprising the protein molecule and a composition comprising the protein molecule.

본 발명은 추가로, 상기 단백질 분자를 포함하는 재조합 백신, 및 이러한 재조합 백신을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The present invention further relates to a recombinant vaccine comprising the protein molecule, and a method of inducing an immune response in an individual against influenza virus, comprising administering the recombinant vaccine to the individual.

본 발명은 추가로, 상기 단백질 분자를 포함하는 생 약독화 병원체, 및 이러한 생 약독화 병원체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The present invention further relates to a live attenuated pathogen comprising the protein molecule, and a method of inducing an immune response in an individual against an influenza virus, comprising administering the live attenuated pathogen to the individual.

본 발명은 또한, 상기 단백질 분자를 포함하는 제약 조성물, 및 상기 단백질 분자를 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The invention also relates to a method of inducing an immune response in an individual against influenza virus, comprising administering to the individual a pharmaceutical composition comprising the protein molecule and a composition comprising the protein molecule.

본 발명은 추가로, 상기 단백질 분자를 포함하는 재조합 백신, 및 이러한 재조합 백신을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The present invention further relates to a recombinant vaccine comprising the protein molecule, and a method of inducing an immune response in an individual against influenza virus, comprising administering the recombinant vaccine to the individual.

본 발명은 추가로, 상기 단백질 분자를 포함하는 생 약독화 병원체, 및 이러한 생 약독화 병원체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법에 관한 것이다.The present invention further relates to a live attenuated pathogen comprising the protein molecule, and a method of inducing an immune response in an individual against an influenza virus, comprising administering the live attenuated pathogen to the individual.

도 1은 EY2E1-B의 아미노산 서열과 EK2P-B의 아미노산 서열을 비교 도시한 것이다. 밑줄친 것은 IgE 리더 서열이다. 상자에 담은 영역은 가변 영역을 나타낸다. *는 CCR5 활용에 관여한 6개 중요한 잔기를 의미한다. 절단 부위는 화살표로 표시한다. 막관통 (transmembrane) 도메인은 점선으로 나타낸다.
도 2는 두 가지 HIV-1 아형 B 외막 서열의 계통발생학적 관계를 도시한 것이다. 42개 HIV-1 아형 B 외막 서열, EY2E1-B, EK2P-B, 2개 아형 D 및 2개 아형 C 서열 (외집단)이 계통발생학적 분석에 포함되었다. 광범위한 다양성 샘플을 나타내는 아형 B 외막 서열은 다음 11개 국가로부터 유래되었다: 아르헨티나 (1); 호주 (6); 중국 (1); 프랑스 (4); 독일 (1); 영국 (2); 이탈리아 (1); 일본 (1); 네덜란드 (4); 스페인 (1); 미국 (20). EY2E1-B 및 EK2P-B 서열은 검은색 상자 모양으로 도시하였다.
도 3은 외막 면역원의 발현을 도시한 것이다. 패널 A는 EY2E1-B 및 EK2P-B 유전자의 웨스턴 블롯팅 (Western blotting) 분석으로부터의 결과를 나타낸다. RD 세포를 상이한 플라스미드로 형질감염시켰다. 48시간 후에, 세포 용해물을 수집하였다. 샘플을 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하고, HIV-1 gp120 모노클로날 (2G12)로 프로빙하였다. 부하 대조군에 대해서는, 블롯을 스트립핑하고 모노클로날 항-액틴 항체로 재프로빙하였다. 패널 B는 EY2E1-B 및 EK2P-B 유전자의 면역형광 검정으로부터의 결과를 나타낸다. 외막 단백질을 발현하는 형질감염시킨 RD 세포는 특유의 적색 형광을 나타내었다. HIV-1 외막-특이적 모노클로날 항체 F105는 일차 항체의 공급원으로서 제공되었다.
도 4는 면역시킨 마우스의 혈청에서 총 IgG 항체 역가를 도시한 것이다. 패널 A는 아형 B 외막-특이적 항체 반응의 측정치를 나타낸다. 패널 B는 아형 A/E 외막-특이적 항체 반응의 측정치를 나타낸다. 패널 C는 아형 C 외막-특이적 항체 반응의 측정치를 나타낸다. DNA 구조물 pEY2El-B 및 pEK2P-B로 면역시킨 후 체액성 면역 반응이 효소 결합 면역흡착 검정 (ELlSA)에 의해 탐지되었다. 각 마우스를 DNA 각각 100 ㎍씩을 2주 간격으로 3회 근육내 주사함으로써 면역시켰다. 각 군 (n=3)으로부터의 마우스를 세 번째 면역시킨지 1주 후에 방혈시키고, 동등하게 풀링된 혈청을 차단 완충액에서 희석시킨 다음, 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 분석하였다. pVAX를 이용하여 면역시킨 마우스로부터 수집한 풀링된 혈청을 대조군으로서 사용하였다. 흡광도 (OD)를 450 nm 하에 측정하였다. 각 데이터 점은 각 군당 3마리 마우스 혈청으로부터 평균낸 3개의 OD 값을 나타내고, 값은 3가지 별개의 검정에서 수득된 ELlSA의 평균을 나타낸다.
도 5는 BalB/C 마우스와 HLA-A2 트랜스제닉 (transgenic) 마우스 둘 다에서 pEY2E1-B에 의한 세포-매개형 면역 반응의 유도를 도시한 것이다. pEY2E1-B 및 pEK2P-B를 이용하여 DNA 백신접종한 후 비장 세포 100만개 당 아형 B 컨센서스 외막-특이적 IFN-γ 스팟 형성 세포 (Spot Forming Cell, SFC)의 빈도를 BalB/C 마우스 (패널 A)와 트랜스제닉 마우스 (패널 C) 둘 다에서 ELISpot 검정에 의해 결정하였다. pEY2E1-B 및 pEK2P-B를 이용하여 DNA 백신접종한 후 비장 세포 100만개 당 CD8-고갈된, 아형 B 컨센서스 외막-특이적 IFN-γ 스팟 형성 세포의 빈도를 또한, BalB/C 마우스 (패널 B)와 트랜스제닉 마우스 (패널 D) 둘 다에서 결정하였다. 비장 세포를 개개의 면역시킨 마우스 (한 무리당 3마리 마우스)로부터 단리하고, 중복 컨센서스 아형 B 외막 펩티드 풀로 시험관내 자극하였다. 주쇄 pVAX 면역시킨 마우스를 음성 대조군으로서 포함시켰다. 그 값은 IFN-γ SFC의 평균 + 평균의 표준 편차이다. (패널 E) 아형 B 컨센서스 외막-특이적 우성 에피토프의 성상 확인. pEY2E1-B 및 pEK2P-B 백신접종한 BalB/C 마우스 각각으로부터 수집한 비장 세포를 24시간 동안 29개 HIV-1 아형 B 컨센서스 외막 펩티드 풀과 함께 배양하였다. IFN-γ 분비성 세포를 상기 언급된 바와 같이 ELISpot 검정에 의해 결정하였다.
도 6은 BalB/C 마우스와 HLA-A2 트랜스제닉 마우스 둘 다에서 pEY2E1-B에 의해 유도된 교차 반응성을 도시한 것이다. HIV-1 MN 외막 펩티드 (패널 A), HIV-1 군 M (패널 B), 아형 C 컨센서스 외막 펩티드 (패널 C) 및 2개의 아형 C 단리물 외막 펩티드 (패널 D 및 E)의 4개의 개별 펩티드 풀에 대하여 pEY2E1-B 및 pEK2P-B로 백신접종함으로써 유도된 BalB/C 마우스에서의 부가의 T-세포 면역 반응을 IFN-γ ELISpot 검정에 의해 측정하였다. HIV-1 MN 외막 펩티드 (패널 F), HIV-1 군 M (패널 G), 아형 C 컨센서스 외막 펩티드 (패널 H) 및 2개의 아형 C 단리물 외막 펩티드 (패널 I 및 J)의 4개의 개별 펩티드 풀에 대하여 pEY2E1-B 및 pEK2P-B로 백신접종함으로써 유도된 HLA-A2 트랜스제닉 마우스에서의 부가의 T-세포 면역 반응을 또한 측정하였다. 주쇄 pVAX 면역시킨 마우스를 음성 대조군으로서 포함시켰다.
도 7은 pEY2E1-B 및 pEK2P-B로 면역시킨 BalB/C 마우스 (패널 A)와 HLA-A2 트랜스제닉 마우스 (패널 B) 둘 다에서 아형 B MN 외막-특이적 우성 에피토프의 성상 확인을 도시한 것이다. pEY2E1-B 및 pEK2P-B 백신접종한 BalB/C 마우스 및 트랜스제닉 마우스 각각으로부터 수집한 비장 세포를 24시간 동안 29개 HIV-1 아형 B MN 외막 펩티드 풀과 함께 배양하였다. IFN-γ 분비성 세포를 상기 언급된 바와 같이 ELISpot 검정에 의해 결정하였다.
도 8은 E72E1-B의 기능성 도메인 (약 70O+ 아미노산)을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 9는 E72E1-B 구조물의 지도를 도시한 것이다.
도 10 패널 A 및 B는 강력한 세포성 면역 반응이 E72E1-B를 유도시킨다는 것을 도시한 것이다.
도 11 패널 A 및 B는 강력하고 광범위한 교차 반응성 세포성 면역 반응이 E72E1-B를 유도시킨다는 것을 도시한 것이다.
도 12 패널 A-D는 강력한 교차-분기군 (clade) 세포성 면역 반응이 E72E1-B를 유도시킨다는 것을 도시한 것이다.
도 13은 실시예 2에서의 연구를 위해 설계된 면역원을 도시한 것이다.
도 14는 계통발생학적 관계를 도시한 것이다: 36개 HIV-1 아형 C 외막 서열, EY3E1-C, EK3P-C, 2개의 아형 B, 1개의 아형 A 및 1개의 아형 D 서열 (외집단)을 계통발생학적 분석에 포함시켰다. 광범위한 다양성 샘플을 나타내는 아형 C 외막 서열은 12개 국가로부터 유래되었다.
도 15 패널 A 및 B는 pEY3E1-C에 의해 유도된 세포성 반응 연구로부터의 데이터를 도시한 것이다.
도 16은 pEY3E1-C에 의해 유도된 세포성 반응 연구로부터의 데이터를 도시한 것이다.
도 17 패널 A-D는 동일한 분기군 내에서 pEY3E1-C에 의해 유도된 교차-반응성 세포성 반응 연구로부터의 데이터를 도시한 것이다.
도 18 패널 A 및 B는 pEY3E1-C에 의해 유도된 교차-반응성 세포성 반응 연구로부터의 데이터를 도시한 것이다. 패널 A는 아형 C (우루과이) env-특이적 IFN-γ ELISpot으로부터의 데이터를 나타낸다. 패널 B는 아형 C (남아프리카) env-특이적 IFN-γ ELISpot으로부터의 데이터를 나타낸다.
도 19 패널 A-F는 분기군 사이에서 pEY3E1-C에 의해 유도된 교차-반응성 세포성 반응 연구로부터의 데이터를 도시한 것이다.
도 20 패널 A-X는 HIV-1 gag 컨센서스 구조물에 의해 유도된 면역 반응 연구로부터의 데이터를 도시한 것이다.
도 21은 생식관 상피에서 HPV 생활 주기를 예시한 것이다.
도 22는 HPV-16 게놈 구성 지도를 도시한 것이다.
도 23은 면역원 설계를 예시한 것이다: *는 p53 결합 및 분해에 있어 중요한 결실 또는 돌연변이를 지칭하고; △는 Rb 결합 부위 내에서의 돌연변이를 지칭한다.
도 24는 HPV E6 및 E7 단백질에 대한 암호화 서열을 포함하는 유전 구조물 p1667, 및 HPV 삽입물이 결여되고 음성 대조군으로서 사용되는 주쇄 플라스미드인 pVAX의 예시를 포함하고 있다.
도 25 패널 A-D는 DNA 면역원 p1667에 의해 유도된 세포성 면역 반응을 도시한 것이다.
도 26은 면역우성 에피토프 지도화 결과를 도시한 것이다.
도 27은 C57/BL6 마우스에서의 보호를 연구하기 위해 E6/E7 DNA 백신을 사용하는 예방적 실험 결과를 도시한 것이다.
도 28은 C57/BL6 마우스에서의 보호를 연구하기 위해 E6/E7 DNA 백신을 사용하는 종양 퇴행 실험 결과를 도시한 것이다.
도 29는 비장에서 E7 사량체 (Tetramer) 양성 림프구를 탐지하는 실험으로부터의 데이터를 도시한 것이다.
도 30은 종양에서 E7 사량체 양성 림프구를 탐지하는 실험으로부터의 데이터를 도시한 것이다.
도 31은 트랜스제닉 마우스에서 DNA 백신 보호 연구로부터의 데이터를 도시한 것이다.
도 32는 플라스미드 암호화된 IL-12를 근육내 (IM) 공동-주사한 다음 전기천공 (EP)시킨 HIV-1 컨센서스 면역원에 대한 증강된 세포성 면역 반응을 도시한 것이다. (a) 제1 면역, (b) 제2 면역, 및 (c) 제3 면역한지 2주 후에 IFNγ ELISpot을 수행하였다 (기타 세 가지와 비교하여 알 수 있는 바와 같다). env에 대한 반응을 검은색 막대로 도시하고, gag는 흰색 막대로 도시하였는데, 데이터는 적층 군 평균 반응 ± SEM으로서 제시된다.
도 33은 근육내 전기천공을 이용한 증강된 교차-반응성 세포성 면역 반응을 도시한 것이다. 3회 면역시킨 후, HIV-1 군 M 펩티드의 4가지 펩티드 풀에 대하여 pEY2E1-B 면역시킨 짧은 꼬리 원숭이 (macaque)에서 총 T-세포 면역 반응을 IFNγ ELISpot에 의해 결정하였다. 데이터는 적층 군 평균 ± SEM으로서 제시된다.
도 34는 IM 전기천공과 플라스미드 IL-12를 이용한 HIV-1 면역원에 대한 증강된 기억 반응을 도시한 것이다. 마지막으로 면역시킨지 5개월 후, ELISpot 검정을 수행하여, IL-12 플라스미드를 이용한 공동-면역을 수반하거나 수반하지 않으면서 IM 및 EP 면역시킨 군에서 gag 및 env에 대한 항원-특이적 기억 반응을 결정하였다. 데이터는 군 평균 반응 ± SEM으로서 제시된다.1 shows a comparison between the amino acid sequence of EY2E1-B and the amino acid sequence of EK2P-B. Underlined is the IgE leader sequence. The boxed area represents the variable area. * Means 6 important residues involved in CCR5 utilization. Cut sites are indicated by arrows. The transmembrane domain is indicated by a dotted line.
Figure 2 shows the phylogenetic relationship between the two HIV-1 subtype B outer membrane sequences. 42 HIV-1 subtype B outer membrane sequences, EY2E1-B, EK2P-B, 2 subtype D and 2 subtype C sequences (external population) were included in the phylogenetic analysis. Subtype B outer membrane sequences representing a wide variety of samples were derived from 11 countries: Argentina (1); Australia (6); China (1); France (4); Germany (1); UK (2); Italy (1); Japan (1); Netherlands (4); Spain (1); United States (20). The EY2E1-B and EK2P-B sequences are shown in the shape of a black box.
Figure 3 shows the expression of the adventitial immunogen. Panel A shows the results from Western blotting analysis of the EY2E1-B and EK2P-B genes. RD cells were transfected with different plasmids. After 48 hours, cell lysates were collected. Samples were analyzed by Western blotting and probed with HIV-1 gp120 monoclonal (2G12). For the load control, blots were stripped and reprobed with monoclonal anti-actin antibody. Panel B shows the results from immunofluorescence assays of the EY2E1-B and EK2P-B genes. Transfected RD cells expressing the outer membrane protein showed a characteristic red fluorescence. The HIV-1 outer membrane-specific monoclonal antibody F105 served as a source of primary antibodies.
Figure 4 shows the total IgG antibody titer in the serum of immunized mice. Panel A shows a measure of the subtype B outer membrane-specific antibody response. Panel B shows measurements of subtype A/E outer membrane-specific antibody responses. Panel C shows a measure of the subtype C outer membrane-specific antibody response. After immunization with the DNA constructs pEY2El-B and pEK2P-B, humoral immune responses were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELlSA). Each mouse was immunized by intramuscular injection of 100 µg each of DNA three times at intervals of two weeks. Mice from each group (n=3) were bled one week after the third immunization, and equally pooled sera were diluted in blocking buffer and then analyzed as described in Materials and Methods. Pooled serum collected from mice immunized with pVAX was used as a control. The absorbance (OD) was measured under 450 nm. Each data point represents three OD values averaged from the serum of three mice per group, and the values represent the mean of ELlSA obtained in three separate assays.
5 shows the induction of cell-mediated immune responses by pEY2E1-B in both BalB/C mice and HLA-A2 transgenic mice. After DNA vaccination using pEY2E1-B and pEK2P-B, the frequency of subtype B consensus outer membrane-specific IFN-γ spot forming cells (SFC) per million spleen cells was determined in BalB/C mice (Panel A). ) And transgenic mice (panel C) by ELISpot assay. The frequency of CD8-depleted, subtype B consensus outer membrane-specific IFN-γ spot-forming cells per million spleen cells after DNA vaccination with pEY2E1-B and pEK2P-B was also measured in BalB/C mice (Panel B ) And transgenic mice (Panel D). Splenocytes were isolated from individual immunized mice (3 mice per group) and stimulated in vitro with overlapping consensus subtype B outer membrane peptide pools. Mice immunized with the main chain pVAX were included as a negative control. Its value is the mean of IFN-γ SFC + standard deviation of the mean. (Panel E) Subtype B consensus outer membrane-specific dominant epitope constellation confirmation. Splenocytes collected from each of the pEY2E1-B and pEK2P-B vaccinated BalB/C mice were incubated with a pool of 29 HIV-1 subtype B consensus outer membrane peptides for 24 hours. IFN-γ secreting cells were determined by ELISpot assay as mentioned above.
Figure 6 shows the cross-reactivity induced by pEY2E1-B in both BalB/C mice and HLA-A2 transgenic mice. 4 individual peptides of HIV-1 MN outer membrane peptide (panel A), HIV-1 group M (panel B), subtype C consensus outer membrane peptide (panel C) and two subtype C isolate outer membrane peptides (panels D and E) Additional T-cell immune responses in BalB/C mice induced by vaccination with pEY2E1-B and pEK2P-B against the pool were measured by IFN-γ ELISpot assay. 4 individual peptides of HIV-1 MN outer membrane peptide (panel F), HIV-1 group M (panel G), subtype C consensus outer membrane peptide (panel H) and two subtype C isolate outer membrane peptides (panel I and J) Additional T-cell immune responses in HLA-A2 transgenic mice induced by vaccination with pEY2E1-B and pEK2P-B against the pool were also measured. Mice immunized with the main chain pVAX were included as a negative control.
Figure 7 shows the constellation of subtype B MN outer membrane-specific dominant epitopes in both BalB/C mice immunized with pEY2E1-B and pEK2P-B (Panel A) and HLA-A2 transgenic mice (Panel B). will be. Splenocytes collected from each of pEY2E1-B and pEK2P-B vaccinated BalB/C mice and transgenic mice were incubated with a pool of 29 HIV-1 subtype B MN outer membrane peptides for 24 hours. IFN-γ secreting cells were determined by ELISpot assay as mentioned above.
Figure 8 schematically shows the functional domain (about 70O+ amino acids) of E72E1-B.
9 shows a map of the E72E1-B structure.
Figure 10 Panels A and B show that a strong cellular immune response induces E72E1-B.
Figure 11 Panels A and B show that a strong and extensive cross-reactive cellular immune response induces E72E1-B.
Figure 12 Panel AD shows that a strong cross-clade cellular immune response induces E72E1-B.
13 depicts immunogens designed for the study in Example 2.
Figure 14 shows the phylogenetic relationship: lineage of 36 HIV-1 subtype C outer membrane sequences, EY3E1-C, EK3P-C, 2 subtype B, 1 subtype A and 1 subtype D sequence (external population). Included in embryological analysis. Subtype C outer membrane sequences representing a wide variety of samples were derived from 12 countries.
Figure 15 Panels A and B depict data from cellular response studies induced by pEY3E1-C.
16 depicts data from studies of cellular responses induced by pEY3E1-C.
Figure 17 Panel AD shows data from cross-reactive cellular response studies induced by pEY3E1-C within the same clade.
18 Panels A and B depict data from cross-reactive cellular response studies induced by pEY3E1-C. Panel A shows data from subtype C (Uruguay) env-specific IFN-γ ELISpot. Panel B shows data from subtype C (South Africa) env-specific IFN-γ ELISpot.
Figure 19 Panel AF shows data from cross-reactive cellular response studies induced by pEY3E1-C between clades.
Figure 20 Panel AX shows data from immune response studies induced by the HIV-1 gag consensus construct.
21 illustrates the HPV life cycle in the reproductive tract epithelium.
22 shows a map of HPV-16 genome construction.
23 illustrates immunogen design: * refers to deletions or mutations important in p53 binding and degradation; Δ refers to the mutation within the Rb binding site.
Figure 24 contains an illustration of the genetic construct p1667 containing the coding sequence for the HPV E6 and E7 proteins, and the backbone plasmid pVAX lacking the HPV insert and used as a negative control.
Figure 25 Panel AD shows the cellular immune response induced by the DNA immunogen p1667.
26 shows the results of immunodominant epitope mapping.
Figure 27 shows the results of a prophylactic experiment using the E6/E7 DNA vaccine to study protection in C57/BL6 mice.
Figure 28 shows the results of tumor regression experiments using E6/E7 DNA vaccine to study protection in C57/BL6 mice.
Figure 29 shows data from an experiment detecting E7 tetramer positive lymphocytes in the spleen.
FIG. 30 shows data from experiments detecting E7 tetramer positive lymphocytes in tumors.
31 depicts data from DNA vaccine protection studies in transgenic mice.
FIG. 32 depicts an enhanced cellular immune response against HIV-1 consensus immunogen after intramuscular (IM) co-injection of plasmid-encoded IL-12 followed by electroporation (EP). IFNγ ELISpot was performed 2 weeks after ( a ) first immunization, ( b ) second immunization, and ( c ) third immunization (as can be seen in comparison with the other three). Responses to env are plotted as black bars and gag are plotted as white bars, with data presented as stacked group mean response ± SEM.
33 depicts an enhanced cross-reactive cellular immune response using intramuscular electroporation. After three immunizations, the total T-cell immune response was determined by IFNγ ELISpot in macaques immunized with pEY2E1-B against four peptide pools of HIV-1 group M peptides. Data are presented as lamination group mean±SEM.
Figure 34 shows the enhanced memory response to HIV-1 immunogen using IM electroporation and plasmid IL-12. Five months after the last immunization, an ELISpot assay was performed to detect antigen-specific memory responses to gag and env in IM and EP immunized groups with or without co-immunity with IL-12 plasmid. I decided. Data are presented as group mean response ± SEM.

정의Justice

본원에 사용되는 바와 같은, "엄격한 혼성화 조건" 또는 "엄격한 조건"은 핵산 분자가 또 다른 핵산 분자와는 혼성화할 것이지만, 기타 서열과는 그렇치 않는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고 상이한 환경에서는 상이할 것이다. 보다 긴 서열은 보다 고온에서 특이적으로 혼성화한다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택한다. Tm은 표적 서열에 대해 상보적인 프로브의 50％가 평형상태에서 표적 서열과 혼성화되는 온도 (규정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하)이다. 표적 서열은 일반적으로 과량으로 존재하기 때문에, Tm에서 프로브의 50％가 평형상태를 차지한다. 전형적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3 하에 약 1.0 M 나트륨 이온, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M 나트륨 이온 (또는 기타 염)이고, 온도가 짧은 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드 (예: 10 내지 50개 뉴클레오티드)의 경우에는 약 30℃ 이상이고 보다 긴 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드의 경우에는 약 60℃ 이상이다. 엄격한 조건은 탈안정화제, 예를 들어 포름아미드를 부가하면서 달성할 수도 있다.As used herein, “stringent hybridization conditions” or “stringent conditions” refer to conditions in which a nucleic acid molecule will hybridize with another nucleic acid molecule, but not with other sequences. Stringent conditions are sequence-dependent and will be different in different circumstances. Longer sequences hybridize specifically at higher temperatures. In general, stringent conditions are chosen to be about 5° C. lower than the thermal melting point (Tm) for a specific sequence at a defined ionic strength and pH. Tm is the temperature (under defined ionic strength, pH and nucleic acid concentration) at which 50% of the probes complementary to the target sequence hybridize with the target sequence in equilibrium. Since the target sequence is generally present in excess, 50% of the probes at Tm occupy equilibrium. Typically, stringent conditions are about 1.0 M sodium ions, typically about 0.01 to 1.0 M sodium ions (or other salts) under a salt concentration of pH 7.0 to 8.3, and a short temperature probe, primer or oligonucleotide (e.g. 10 to 50 nucleotides) at least about 30°C and for longer probes, primers or oligonucleotides at least about 60°C. Stringent conditions can also be achieved with the addition of a destabilizing agent, for example formamide.

뉴클레오티드 및 아미노산에 대한 서열 상동성은 FASTA, BLAST 및 갭이 있는 BLAST [참고: Altschul et al., Nuc. Acids Res., 1997, 25, 3389; 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다] 및 PAUP* 4.0b10 소프트웨어 (공급처: D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)를 사용하여 결정할 수 있다. "유사율"은 PAUP* 4.0b10 소프트웨어 (공급처: D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)를 사용하여 계산한다. 컨센서스 서열의 평균 유사율은 계통발생학적 트리 내의 모든 서열과 비교해서 계산한다 (도 2 및 14 참고).Sequence homology to nucleotides and amino acids was determined by FASTA, BLAST and gapped BLAST [Altschul et al., Nuc. Acids Res., 1997, 25, 3389; Its entirety is incorporated herein by reference] and PAUP* 4.0b10 software (source: D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts). "Similarity" is calculated using PAUP* 4.0b10 software (source: D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts). The average similarity of the consensus sequence is calculated by comparison with all sequences in the phylogenetic tree (see Figs. 2 and 14).

간략하게 설명하면, 기본 국소 정렬 조사 도구 (Basic Local Alignment Search Tool)를 나타내는 BLAST 알고리즘은 서열 유사율을 결정하는 데에 적합하다 [참고: Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다]. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 다음 공급처로부터 공개적으로 입수 가능하다 [the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)]. 이러한 알고리즘은 먼저, 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 워드 (word)와 정렬되는 경우에 몇몇 양성 값을 가진 한계 스코어 T에 부합하거나 이를 충족시키는 조회 서열에서 길이 W의 짧은 워드를 확인함으로써 고 스코어링 서열 쌍 (HSP)을 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃하는 워드 스코어 한계치로서 지칭된다 [Altschul et al., 상기 참고]. 이들 초기의 이웃하는 워드 히트는 그를 함유하는 HSP를 발견하기 위한 조사를 개시하기 위한 시드로서 작용한다. 이러한 워드 히트는 누적 정렬 스코어가 증가할 수 있는 한은 각 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 워드 히트가 각 방향으로 연장되는 것은 1) 누적 정렬 스코어가 그의 최대 도달 값으로부터 양 X 정도 감소하는 경우; 2) 하나 이상의 음성-스코어링 잔기 정렬의 축적으로 인해, 누적 스코어가 제로 또는 그 이하로 되는 경우; 또는 3) 어느 한 서열의 말단에 도달하는 경우에 중지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬 민감도와 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 디폴트 (default)로서 워드 길이 (W) 11, BLOSUM62 스코어링 매트릭스 [참고: Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 10915-10919; 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다] 정렬 (B) 50, 기대치 (E) 10, M=S, N=4, 및 양 가닥의 비교를 사용한다. BLAST 알고리즘 [참고: Karlin et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1993, 90, 5873-5787; 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다] 및 갭이 있는 BLAST는 두 서열 간의 유사율을 통계적으로 분석한다. BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사율의 한 가지 측정치는 가장 적은 총액 확률 (P(N))인데, 이는 두 뉴클레오티드 서열 간의 매치가 우연히 일어날 수도 있다는 확률의 지표를 제공한다. 예를 들어, 시험 핵산을 다른 핵산과 비교하는 경우에 가장 적은 총액 확률이 약 1 미만, 바람직하게 약 0.1 미만, 보다 바람직하게 약 0.01 미만, 가장 바람직하게 약 0.001 미만인 경우에, 이러한 핵산은 또 다른 핵산과 유사한 것으로 간주된다.Briefly, the BLAST algorithm, which represents the Basic Local Alignment Search Tool, is suitable for determining sequence similarity [Reference: Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Its entirety is incorporated herein by reference]. Software for performing BLAST analysis is publicly available from the following sources [the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)]. These algorithms first match high-scoring sequence pairs by identifying short words of length W in the lookup sequence that meets or meets a threshold score T with several positive values when aligned with words of the same length in the database sequence. HSP). T is referred to as the neighboring word score threshold [Altschul et al., supra]. These initial neighboring word hits act as seeds to initiate investigations to find the HSPs containing them. These word hits extend in both directions along each sequence as long as the cumulative alignment score can increase. The word hits are extended in each direction when 1) the cumulative alignment score decreases by an amount X from its maximum reached value; 2) the cumulative score goes to zero or less due to the accumulation of one or more negative-scoring residue alignments; Or 3) stopped when reaching the end of either sequence. The BLAST algorithm parameters W, T and X determine the alignment sensitivity and speed. The BLAST program defaults to word length (W) 11, BLOSUM62 scoring matrix [Ref: Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 10915-10919; The entirety of which is incorporated herein by reference] Alignment (B) 50, expected value (E) 10, M=S, N=4, and a comparison of both strands are used. BLAST algorithm [Reference: Karlin et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1993, 90, 5873-5787; The entirety of which is incorporated herein by reference] and Gaped BLAST statistically analyzes the similarity between two sequences. One measure of the similarity provided by the BLAST algorithm is the smallest total probability (P(N)), which provides an indication of the probability that a match between two nucleotide sequences may occur by chance. For example, when the test nucleic acid is compared to another nucleic acid, the smallest total probability is less than about 1, preferably less than about 0.1, more preferably less than about 0.01, and most preferably less than about 0.001, then such nucleic acid is another nucleic acid. It is considered to be similar to nucleic acids.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "유전 구조물"은 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 지칭한다. 암호화 서열에는 프로모터를 포함한 조절성 요소와 작동적으로 연결된 개시 및 종결 신호, 및 핵산 분자를 투여한 개체의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 폴리아데닐화 신호가 포함된다.As used herein, the term “genetic construct” refers to a DNA or RNA molecule comprising a nucleotide sequence encoding a protein. Coding sequences include initiation and termination signals operably linked to regulatory elements, including promoters, and polyadenylation signals capable of directing expression in cells of an individual to which the nucleic acid molecule has been administered.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "발현 가능한 형태"는 개체의 세포에 존재하는 경우에 암호화 서열이 발현되도록 단백질을 암호화하는 암호화 서열과 작동적으로 연결된 필수 조절성 요소를 함유하는 유전자 구조물을 지칭한다.As used herein, the term “expressible form” refers to a genetic construct containing essential regulatory elements operatively linked to a coding sequence encoding a protein such that the coding sequence is expressed when present in a cell of an individual. .

개요summary

본 발명은 면역원에 의해 유도된 세포성 면역 반응을 증강시키기 위한 다상 (multi-phase) 전략을 활용함으로써 개선된 백신을 제공한다. 면역원에 대한 변형된 컨센서스 서열이 생성되었다. 코돈 최적화, RNA 최적화, 및 구조물의 면역원성을 증가시키기 위한 고 효율성 면역글로빈 리더 서열의 부가를 포함한 유전적 변형이 또한 기재된다. 상응하는 코돈 최적화 면역원보다 더 강력하고 광범위한 세포성 면역 반응을 유도시키는 신규한 면역원을 설계하였다.The present invention provides an improved vaccine by utilizing a multi-phase strategy to enhance the cellular immune response induced by the immunogen. A modified consensus sequence for the immunogen was generated. Genetic modifications including codon optimization, RNA optimization, and addition of high efficiency immunoglobin leader sequences to increase the immunogenicity of the construct are also described. A novel immunogen was designed that induces a more potent and broader cellular immune response than the corresponding codon optimized immunogen.

본 발명은 단백질 및 단백질을 암호화하는 유전 구조물에, 그에 대하여 항-HIV, 항-HPV, 항-HCV, 항-인플루엔자 및 항-hTert 면역 반응을 각각 유도시킬 수 있는 면역원으로서 특히 유효하도록 만드는 에피토프를 제공함으로써 개선된 HIV, HPV, HCV, 인플루엔자 및 암 백신을 제공한다. 따라서, 백신을 제공하여 치료적 또는 예방적 면역 반응을 유도시킬 수 있다. 몇몇 양태에서, 이러한 면역원을 전달하기 위한 수단은 DNA 백신, 재조합 백신, 단백질 소단위체 백신, 면역원을 포함하는 조성물, 약독화 백신 또는 사멸 백신이다. 몇몇 양태에서, 백신은 하나 이상의 DNA 백신, 하나 이상의 재조합 백신, 하나 이상의 단백질 소단위체 백신, 면역원을 포함하는 하나 이상의 조성물, 하나 이상의 약독화 백신 및 하나 이상의 사멸 백신으로 이루어진 군 중에서 선택된 복합물을 포함한다.The present invention provides an epitope that makes it particularly effective as an immunogen capable of inducing anti-HIV, anti-HPV, anti-HCV, anti-influenza and anti-hTert immune responses, respectively, to a protein and a genetic construct encoding the protein. By providing improved HIV, HPV, HCV, influenza and cancer vaccines. Thus, vaccines can be provided to elicit a therapeutic or prophylactic immune response. In some embodiments, the means for delivering such an immunogen is a DNA vaccine, a recombinant vaccine, a protein subunit vaccine, a composition comprising the immunogen, an attenuated vaccine or a killing vaccine. In some embodiments, the vaccine comprises a complex selected from the group consisting of one or more DNA vaccines, one or more recombinant vaccines, one or more protein subunit vaccines, one or more compositions comprising immunogens, one or more attenuated vaccines, and one or more killing vaccines. .

본 발명의 몇몇 양태에 따르면, 본 발명에 따르는 백신을 개체에게 전달하여 이러한 개체의 면역계의 활성을 조정함으로써 HIV, HPV, HCV, 인플루엔자 또는 hTERT에 대한 면역 반응을 증강시킨다. 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 개체의 세포에 의해 흡수되는 경우, 이러한 세포에서 뉴클레오티드 서열이 발현되고, 이로써 단백질이 개체에게 전달된다. 본 발명의 국면은 핵산 분자 (예: 플라스미드) 상의 단백질의 암호화 서열을 재조합 백신의 일부로서 및 약독화 백신의 일부로서, 벡터의 단리된 단백질 또는 단백질 일부로서 전달하는 방법을 제공한다.According to some embodiments of the invention, the vaccine according to the invention is delivered to a subject to modulate the activity of the subject's immune system, thereby enhancing the immune response to HIV, HPV, HCV, influenza or hTERT. When a nucleic acid molecule encoding a protein is taken up by a cell of an individual, the nucleotide sequence is expressed in such cells, whereby the protein is delivered to the individual. Aspects of the invention provide a method of delivering the coding sequence of a protein on a nucleic acid molecule (eg, a plasmid) as part of a recombinant vaccine and as part of an attenuated vaccine, as an isolated protein or protein part of a vector.

본 발명의 몇몇 국면에 따르면, HIV, HPV, HCV, 인플루엔자 및 암에 대하여 개체를 예방적 및/또는 치료적으로 면역시키는 조성물 및 방법이 제공된다.According to some aspects of the invention, compositions and methods are provided for prophylactically and/or therapeutically immunizing a subject against HIV, HPV, HCV, influenza and cancer.

본 발명은 조절성 요소와 작동적으로 연결된 본 발명의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 전달하기 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 국면은 본 발명의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 백신; 본 발명의 단백질을 암호화하고/하거나 본 발명의 단백질을 포함하는 생 약독화 병원체; 본 발명의 단백질을 포함하는 사멸 병원체; 또는 본 발명의 단백질을 포함하는 리포솜 또는 소단위체 백신과 같은 조성물을 전달하기 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 조성물을 포함하는 주사가능한 제약 조성물에 관한 것이다.The invention relates to a composition for delivering a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a protein of the invention operably linked to a regulatory element. An aspect of the present invention is a recombinant vaccine comprising a nucleotide sequence encoding a protein of the present invention; A live attenuated pathogen encoding the protein of the invention and/or comprising the protein of the invention; Killed pathogens comprising the protein of the present invention; Or it relates to a composition for delivering a composition such as a liposome or subunit vaccine comprising the protein of the present invention. The invention further relates to an injectable pharmaceutical composition comprising the composition.

HIVHIV

본 발명은 HIV 면역원에 의해 유도된 세포성 면역 반응을 증강시키기 위한 다상 전략을 활용함으로써 개선된 항-HIV 백신을 제공한다. 면역원에 대한 변형된 컨센서스 서열이 생성되었다. 코돈 최적화, RNA 최적화, 및 구조물의 면역원성을 증가시키기 위한 고 효율성 면역글로빈 리더 서열의 부가를 포함한 유전적 변형이 또한 기재된다. 상응하는 코돈 최적화 면역원보다 더 강력하고 광범위한 세포성 면역 반응을 유도시키는 신규한 면역원을 설계하였다.The present invention provides an improved anti-HIV vaccine by utilizing a multiphase strategy to enhance the cellular immune response induced by an HIV immunogen. A modified consensus sequence for the immunogen was generated. Genetic modifications including codon optimization, RNA optimization, and addition of high efficiency immunoglobin leader sequences to increase the immunogenicity of the construct are also described. A novel immunogen was designed that induces a more potent and broader cellular immune response than the corresponding codon optimized immunogen.

서열 1은 아형 A 컨센서스 외막 DNA 서열 구조물이다. 서열 1은 아형 A 외막 단백질에 대한 컨센서스 서열과 연결된 IgE 리더 서열을 포함하는 HIV 백신 서열에 대한 암호화 서열을 포함한다. 서열 2는 아형 A 외막 단백질에 대한 컨센서스 서열과 연결된 IgE 리더 서열을 포함하는 HIV 백신 서열 구조물에 대한 아미노산 서열을 포함한다. IgE 리더 서열은 서열 15이다. 서열 16은 아형 A 컨센서스 외막 단백질 서열이다.SEQ ID NO: 1 is the subtype A consensus outer membrane DNA sequence construct. SEQ ID NO: 1 contains the coding sequence for the HIV vaccine sequence comprising the IgE leader sequence linked to the consensus sequence for the subtype A outer membrane protein. SEQ ID NO: 2 contains the amino acid sequence for the HIV vaccine sequence construct comprising the IgE leader sequence linked to the consensus sequence for the subtype A outer membrane protein. The IgE leader sequence is SEQ ID NO:15. SEQ ID NO: 16 is the subtype A consensus outer membrane protein sequence.

몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 16, 그의 단편, 서열 16을 암호화하는 핵산 분자, 또는 그의 단편을 포함한다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 2 또는 이를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 1을 포함한다. 본 발명의 백신은 바람직하게, IgE 리더 서열인 서열 15 또는 이를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.In some embodiments, the vaccine of the invention preferably comprises SEQ ID NO: 16, a fragment thereof, a nucleic acid molecule encoding SEQ ID NO: 16, or a fragment thereof. In some embodiments, the vaccine of the invention preferably comprises SEQ ID NO: 2 or a nucleic acid molecule encoding it. In some embodiments, the vaccine of the invention preferably comprises SEQ ID NO:1. The vaccine of the present invention preferably comprises the IgE leader sequence, SEQ ID NO: 15 or a nucleic acid sequence encoding the same.

서열 1의 단편은 90개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 1의 단편은 180개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고; 몇몇 양태에서는 270개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 360개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 450개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 540개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 630개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 720개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 810개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 900개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 990개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1080개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1170개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1260개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1350개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1440개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1530개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1620개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1710개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1800개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1890개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1980개 이상의 뉴클레오티드; 및 몇몇 양태에서는 2070개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 1의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 1의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함하지 않는다. 단편은 180개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 몇몇 양태에서는 270개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 360개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 450개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 540개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 630개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 720개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 810개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 900개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 990개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1080개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1170개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1260개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1350개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1440개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1530개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1620개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1710개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1800개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1890개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1980개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1020개 미만의 뉴클레오티드; 및 몇몇 양태에서는 2070개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.Fragments of SEQ ID NO: 1 may comprise 90 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 1 may comprise 180 or more nucleotides; In some embodiments 270 or more nucleotides; In some embodiments, 360 or more nucleotides; In some embodiments 450 or more nucleotides; In some embodiments 540 or more nucleotides; 630 or more nucleotides in some embodiments; In some embodiments 720 or more nucleotides; In some embodiments 810 or more nucleotides; 900 or more nucleotides in some embodiments; In some embodiments 990 or more nucleotides; In some embodiments 1080 or more nucleotides; In some embodiments 1170 or more nucleotides; In some embodiments 1260 or more nucleotides; In some embodiments 1350 or more nucleotides; In some embodiments 1440 or more nucleotides; 1530 or more nucleotides in some embodiments; In some embodiments 1620 or more nucleotides; In some embodiments 1710 or more nucleotides; 1800 or more nucleotides in some embodiments; In some embodiments 1890 or more nucleotides; In some embodiments, 1980 or more nucleotides; And in some embodiments 2070 or more nucleotides. In some embodiments, a fragment of SEQ ID NO: 1 may comprise a coding sequence for an IgE leader sequence. In some embodiments, the fragment of SEQ ID NO: 1 does not comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. Fragments may comprise less than 180 nucleotides, and in some embodiments less than 270 nucleotides; Less than 360 nucleotides in some embodiments; Less than 450 nucleotides in some embodiments; Less than 540 nucleotides in some embodiments; Less than 630 nucleotides in some embodiments; Less than 720 nucleotides in some embodiments; Less than 810 nucleotides in some embodiments; Less than 900 nucleotides in some embodiments; Less than 990 nucleotides in some embodiments; Less than 1080 nucleotides in some embodiments; Less than 1170 nucleotides in some embodiments; Less than 1260 nucleotides in some embodiments; Less than 1350 nucleotides in some embodiments; Less than 1440 nucleotides in some embodiments; Less than 1530 nucleotides in some embodiments; Less than 1620 nucleotides in some embodiments; Less than 1710 nucleotides in some embodiments; Less than 1800 nucleotides in some embodiments; Less than 1890 nucleotides in some embodiments; Less than 1980 nucleotides in some embodiments; Less than 1020 nucleotides in some embodiments; And less than 2070 nucleotides in some embodiments.

서열 2의 단편은 30개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 2의 단편은 60개 이상의 아미노산을 포함할 수 있고; 몇몇 양태에서는 90개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 120개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 150개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 180개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 210개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 240개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 270개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 300개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 330개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 360개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 390개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 420개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 450개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 480개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 510개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 540개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 570개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 600개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 630개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 660개 이상의 아미노산; 및 몇몇 양태에서는 690개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 단편은 90개 미만의 아미노산을 포함할 수 있고; 몇몇 양태에서는 120개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 150개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 180개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 210개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 240개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 270개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 300개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 330개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 360개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 390개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 420개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 450개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 480개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 540개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 600개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 660개 미만의 아미노산; 및 몇몇 양태에서는 690개 미만의 아미노산을 포함할 수 있다.The fragment of SEQ ID NO: 2 may comprise 30 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 2 may comprise 60 or more amino acids; In some embodiments 90 or more amino acids; In some embodiments 120 or more amino acids; In some embodiments 150 or more amino acids; In some embodiments 180 or more amino acids; In some embodiments 210 or more amino acids; At least 240 amino acids in some embodiments; In some embodiments 270 or more amino acids; In some embodiments 300 or more amino acids; In some embodiments 330 or more amino acids; In some embodiments, at least 360 amino acids; In some embodiments 390 or more amino acids; 420 or more amino acids in some embodiments; In some embodiments 450 or more amino acids; In some embodiments 480 or more amino acids; In some embodiments 510 or more amino acids; In some embodiments 540 or more amino acids; In some embodiments 570 or more amino acids; 600 or more amino acids in some embodiments; In some embodiments 630 or more amino acids; In some embodiments 660 or more amino acids; And in some embodiments 690 or more amino acids. Fragments may contain less than 90 amino acids; Less than 120 amino acids in some embodiments; Less than 150 amino acids in some embodiments; Less than 180 amino acids in some embodiments; Less than 210 amino acids in some embodiments; Less than 240 amino acids in some embodiments; Less than 270 amino acids in some embodiments; Less than 300 amino acids in some embodiments; Less than 330 amino acids in some embodiments; Less than 360 amino acids in some embodiments; Less than 390 amino acids in some embodiments; Less than 420 amino acids in some embodiments; Less than 450 amino acids in some embodiments; Less than 480 amino acids in some embodiments; Less than 540 amino acids in some embodiments; Less than 600 amino acids in some embodiments; Less than 660 amino acids in some embodiments; And less than 690 amino acids in some embodiments.

서열 3은 아형 B 컨센서스 외막 DNA 서열 구조물이다. 서열 3은 아형 B 외막 단백질에 대한 컨센서스 서열과 연결된 IgE 리더 서열을 포함하는 HIV 백신 서열에 대한 암호화 서열을 포함한다. 서열 4는 아형 B 외막 단백질에 대한 컨센서스 서열과 연결된 IgE 리더 서열을 포함하는 HIV 백신 서열 구조물에 대한 아미노산 서열을 포함한다. IgE 리더 서열은 서열 15이다. 서열 17은 아형 B 컨센서스 외막 단백질 서열이다.SEQ ID NO: 3 is the subtype B consensus outer membrane DNA sequence construct. SEQ ID NO: 3 contains the coding sequence for the HIV vaccine sequence comprising the IgE leader sequence linked to the consensus sequence for the subtype B outer membrane protein. SEQ ID NO: 4 contains the amino acid sequence for the HIV vaccine sequence construct comprising the IgE leader sequence linked with the consensus sequence for the subtype B outer membrane protein. The IgE leader sequence is SEQ ID NO:15. SEQ ID NO: 17 is the subtype B consensus outer membrane protein sequence.

몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 17, 그의 단편, 서열 17을 암호화하는 핵산 분자, 또는 그의 단편을 포함한다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 4 또는 이를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 3을 포함한다. 본 발명의 백신은 바람직하게, IgE 리더 서열인 서열 15 또는 이를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.In some embodiments, the vaccine of the invention preferably comprises SEQ ID NO: 17, a fragment thereof, a nucleic acid molecule encoding SEQ ID NO: 17, or a fragment thereof. In some embodiments, the vaccine of the invention preferably comprises SEQ ID NO: 4 or a nucleic acid molecule encoding it. In some embodiments, the vaccine of the invention preferably comprises SEQ ID NO: 3. The vaccine of the present invention preferably comprises the IgE leader sequence, SEQ ID NO: 15 or a nucleic acid sequence encoding the same.

서열 3의 단편은 90개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 3의 단편은 180개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고; 몇몇 양태에서는 270개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 360개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 450개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 540개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 630개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 720개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 810개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 900개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 990개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1080개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1170개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1260개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1350개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1440개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1530개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1620개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1710개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1800개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1890개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1980개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2070개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2160개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2250개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2340개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2430개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2520개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2620개 이상의 뉴클레오티드; 및 몇몇 양태에서는 2700개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 3의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 3의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함하지 않는다. 단편은 180개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 몇몇 양태에서는 270개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 360개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 450개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 540개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 630개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 720개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 810개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 900개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 990개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1080개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1170개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1260개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1350개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1440개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1530개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1620개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1710개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1800개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1890개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1980개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1020개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2070개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2160개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2250개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2340개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2430개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2520개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2610개 미만의 뉴클레오티드; 및 몇몇 양태에서는 2700개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.Fragments of SEQ ID NO: 3 may comprise 90 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 3 may comprise 180 or more nucleotides; In some embodiments 270 or more nucleotides; In some embodiments, 360 or more nucleotides; In some embodiments 450 or more nucleotides; In some embodiments 540 or more nucleotides; 630 or more nucleotides in some embodiments; In some embodiments 720 or more nucleotides; In some embodiments 810 or more nucleotides; 900 or more nucleotides in some embodiments; In some embodiments 990 or more nucleotides; In some embodiments 1080 or more nucleotides; In some embodiments 1170 or more nucleotides; In some embodiments 1260 or more nucleotides; In some embodiments 1350 or more nucleotides; In some embodiments 1440 or more nucleotides; 1530 or more nucleotides in some embodiments; In some embodiments 1620 or more nucleotides; In some embodiments 1710 or more nucleotides; 1800 or more nucleotides in some embodiments; In some embodiments 1890 or more nucleotides; In some embodiments, 1980 or more nucleotides; In some embodiments 2070 or more nucleotides; In some embodiments 2160 or more nucleotides; In some embodiments 2250 or more nucleotides; In some embodiments 2340 or more nucleotides; In some embodiments 2430 or more nucleotides; In some embodiments 2520 or more nucleotides; In some embodiments 2620 or more nucleotides; And in some embodiments 2700 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 3 may comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. In some embodiments, the fragment of SEQ ID NO: 3 does not comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. Fragments may comprise less than 180 nucleotides, and in some embodiments less than 270 nucleotides; Less than 360 nucleotides in some embodiments; Less than 450 nucleotides in some embodiments; Less than 540 nucleotides in some embodiments; Less than 630 nucleotides in some embodiments; Less than 720 nucleotides in some embodiments; Less than 810 nucleotides in some embodiments; Less than 900 nucleotides in some embodiments; Less than 990 nucleotides in some embodiments; Less than 1080 nucleotides in some embodiments; Less than 1170 nucleotides in some embodiments; Less than 1260 nucleotides in some embodiments; Less than 1350 nucleotides in some embodiments; Less than 1440 nucleotides in some embodiments; Less than 1530 nucleotides in some embodiments; Less than 1620 nucleotides in some embodiments; Less than 1710 nucleotides in some embodiments; Less than 1800 nucleotides in some embodiments; Less than 1890 nucleotides in some embodiments; Less than 1980 nucleotides in some embodiments; Less than 1020 nucleotides in some embodiments; Less than 2070 nucleotides in some embodiments; Less than 2160 nucleotides in some embodiments; Less than 2250 nucleotides in some embodiments; Less than 2340 nucleotides in some embodiments; Less than 2430 nucleotides in some embodiments; Less than 2520 nucleotides in some embodiments; Less than 2610 nucleotides in some embodiments; And less than 2700 nucleotides in some embodiments.

서열 4의 단편은 30개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 4의 단편은 60개 이상의 아미노산을 포함할 수 있고; 몇몇 양태에서는 90개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 120개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 150개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 180개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 210개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 240개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 270개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 300개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 330개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 360개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 390개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 420개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 450개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 480개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 510개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 540개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 570개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 600개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 630개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 660개 이상의 아미노산; 및 몇몇 양태에서는 690개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 단편은 90개 미만의 아미노산을 포함할 수 있고; 몇몇 양태에서는 120개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 150개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 180개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 210개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 240개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 270개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 300개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 330개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 360개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 390개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 420개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 450개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 480개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 540개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 600개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 660개 미만의 아미노산; 및 몇몇 양태에서는 690개 미만의 아미노산을 포함할 수 있다.The fragment of SEQ ID NO: 4 may comprise 30 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 4 may comprise 60 or more amino acids; In some embodiments 90 or more amino acids; In some embodiments 120 or more amino acids; In some embodiments 150 or more amino acids; In some embodiments 180 or more amino acids; In some embodiments 210 or more amino acids; At least 240 amino acids in some embodiments; In some embodiments 270 or more amino acids; In some embodiments 300 or more amino acids; In some embodiments 330 or more amino acids; In some embodiments, at least 360 amino acids; In some embodiments 390 or more amino acids; 420 or more amino acids in some embodiments; In some embodiments 450 or more amino acids; In some embodiments 480 or more amino acids; In some embodiments 510 or more amino acids; In some embodiments 540 or more amino acids; In some embodiments 570 or more amino acids; 600 or more amino acids in some embodiments; In some embodiments 630 or more amino acids; In some embodiments 660 or more amino acids; And in some embodiments 690 or more amino acids. Fragments may contain less than 90 amino acids; Less than 120 amino acids in some embodiments; Less than 150 amino acids in some embodiments; Less than 180 amino acids in some embodiments; Less than 210 amino acids in some embodiments; Less than 240 amino acids in some embodiments; Less than 270 amino acids in some embodiments; Less than 300 amino acids in some embodiments; Less than 330 amino acids in some embodiments; Less than 360 amino acids in some embodiments; Less than 390 amino acids in some embodiments; Less than 420 amino acids in some embodiments; Less than 450 amino acids in some embodiments; Less than 480 amino acids in some embodiments; Less than 540 amino acids in some embodiments; Less than 600 amino acids in some embodiments; Less than 660 amino acids in some embodiments; And less than 690 amino acids in some embodiments.

서열 5는 아형 C 컨센서스 외막 DNA 서열 구조물이다. 서열 5는 아형 C 외막 단백질에 대한 컨센서스 서열과 연결된 IgE 리더 서열을 포함하는 HIV 백신 서열에 대한 암호화 서열을 포함한다. 서열 6은 아형 C 외막 단백질에 대한 컨센서스 서열과 연결된 IgE 리더 서열을 포함하는 HIV 백신 서열 구조물에 대한 아미노산 서열을 포함한다. IgE 리더 서열은 서열 15이다. 서열 18은 아형 C 컨센서스 외막 단백질 서열이다.SEQ ID NO: 5 is the subtype C consensus outer membrane DNA sequence construct. SEQ ID NO: 5 contains the coding sequence for the HIV vaccine sequence comprising the IgE leader sequence linked to the consensus sequence for the subtype C outer membrane protein. SEQ ID NO: 6 contains the amino acid sequence for the HIV vaccine sequence construct comprising the IgE leader sequence linked to the consensus sequence for the subtype C outer membrane protein. The IgE leader sequence is SEQ ID NO:15. SEQ ID NO: 18 is the subtype C consensus outer membrane protein sequence.

몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 18, 그의 단편, 서열 18을 암호화하는 핵산 분자, 또는 그의 단편을 포함한다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 6 또는 이를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 5를 포함한다. 본 발명의 백신은 바람직하게, IgE 리더 서열인 서열 15 또는 이를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.In some embodiments, the vaccine of the invention preferably comprises SEQ ID NO: 18, a fragment thereof, a nucleic acid molecule encoding SEQ ID NO: 18, or a fragment thereof. In some embodiments, the vaccine of the invention preferably comprises SEQ ID NO: 6 or a nucleic acid molecule encoding it. In some embodiments, the vaccine of the invention preferably comprises SEQ ID NO: 5. The vaccine of the present invention preferably comprises the IgE leader sequence, SEQ ID NO: 15 or a nucleic acid sequence encoding the same.

서열 5의 단편은 90개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 5의 단편은 180개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고; 몇몇 양태에서는 270개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 360개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 450개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 540개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 630개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 720개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 810개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 900개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 990개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1080개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1170개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1260개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1350개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1440개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1530개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1620개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1710개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1800개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1890개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1980개 이상의 뉴클레오티드; 및 몇몇 양태에서는 2070개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 5의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 5의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함하지 않는다. 단편은 180개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 몇몇 양태에서는 270개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 360개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 450개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 540개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 630개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 720개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 810개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 900개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 990개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1080개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1170개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1260개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1350개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1440개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1530개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1620개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1710개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1800개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1890개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1980개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1020개 미만의 뉴클레오티드; 및 몇몇 양태에서는 2070개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.Fragments of SEQ ID NO: 5 may comprise 90 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 5 may comprise 180 or more nucleotides; In some embodiments 270 or more nucleotides; In some embodiments, 360 or more nucleotides; In some embodiments 450 or more nucleotides; In some embodiments 540 or more nucleotides; 630 or more nucleotides in some embodiments; In some embodiments 720 or more nucleotides; In some embodiments 810 or more nucleotides; 900 or more nucleotides in some embodiments; In some embodiments 990 or more nucleotides; In some embodiments 1080 or more nucleotides; In some embodiments 1170 or more nucleotides; In some embodiments 1260 or more nucleotides; In some embodiments 1350 or more nucleotides; In some embodiments 1440 or more nucleotides; 1530 or more nucleotides in some embodiments; In some embodiments 1620 or more nucleotides; In some embodiments 1710 or more nucleotides; 1800 or more nucleotides in some embodiments; In some embodiments 1890 or more nucleotides; In some embodiments, 1980 or more nucleotides; And in some embodiments 2070 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 5 may comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. In some embodiments, the fragment of SEQ ID NO: 5 does not comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. Fragments may comprise less than 180 nucleotides, and in some embodiments less than 270 nucleotides; Less than 360 nucleotides in some embodiments; Less than 450 nucleotides in some embodiments; Less than 540 nucleotides in some embodiments; Less than 630 nucleotides in some embodiments; Less than 720 nucleotides in some embodiments; Less than 810 nucleotides in some embodiments; Less than 900 nucleotides in some embodiments; Less than 990 nucleotides in some embodiments; Less than 1080 nucleotides in some embodiments; Less than 1170 nucleotides in some embodiments; Less than 1260 nucleotides in some embodiments; Less than 1350 nucleotides in some embodiments; Less than 1440 nucleotides in some embodiments; Less than 1530 nucleotides in some embodiments; Less than 1620 nucleotides in some embodiments; Less than 1710 nucleotides in some embodiments; Less than 1800 nucleotides in some embodiments; Less than 1890 nucleotides in some embodiments; Less than 1980 nucleotides in some embodiments; Less than 1020 nucleotides in some embodiments; And less than 2070 nucleotides in some embodiments.

서열 6의 단편은 30개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 6의 단편은 60개 이상의 아미노산을 포함할 수 있고; 몇몇 양태에서는 90개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 120개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 150개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 180개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 210개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 240개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 270개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 300개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 330개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 360개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 390개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 420개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 450개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 480개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 510개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 540개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 570개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 600개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 630개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 660개 이상의 아미노산; 및 몇몇 양태에서는 690개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 단편은 90개 미만의 아미노산을 포함할 수 있고; 몇몇 양태에서는 120개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 150개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 180개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 210개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 240개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 270개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 300개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 330개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 360개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 390개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 420개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 450개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 480개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 540개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 600개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 660개 미만의 아미노산; 및 몇몇 양태에서는 690개 미만의 아미노산을 포함할 수 있다.The fragment of SEQ ID NO:6 may comprise 30 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 6 may comprise 60 or more amino acids; In some embodiments 90 or more amino acids; In some embodiments 120 or more amino acids; In some embodiments 150 or more amino acids; In some embodiments 180 or more amino acids; In some embodiments 210 or more amino acids; At least 240 amino acids in some embodiments; In some embodiments 270 or more amino acids; In some embodiments 300 or more amino acids; In some embodiments 330 or more amino acids; In some embodiments, at least 360 amino acids; In some embodiments 390 or more amino acids; 420 or more amino acids in some embodiments; In some embodiments 450 or more amino acids; In some embodiments 480 or more amino acids; In some embodiments 510 or more amino acids; In some embodiments 540 or more amino acids; In some embodiments 570 or more amino acids; 600 or more amino acids in some embodiments; In some embodiments 630 or more amino acids; In some embodiments 660 or more amino acids; And in some embodiments 690 or more amino acids. Fragments may contain less than 90 amino acids; Less than 120 amino acids in some embodiments; Less than 150 amino acids in some embodiments; Less than 180 amino acids in some embodiments; Less than 210 amino acids in some embodiments; Less than 240 amino acids in some embodiments; Less than 270 amino acids in some embodiments; Less than 300 amino acids in some embodiments; Less than 330 amino acids in some embodiments; Less than 360 amino acids in some embodiments; Less than 390 amino acids in some embodiments; Less than 420 amino acids in some embodiments; Less than 450 amino acids in some embodiments; Less than 480 amino acids in some embodiments; Less than 540 amino acids in some embodiments; Less than 600 amino acids in some embodiments; Less than 660 amino acids in some embodiments; And less than 690 amino acids in some embodiments.

서열 7은 아형 D 컨센서스 외막 DNA 서열 구조물이다. 서열 7은 아형 D 외막 단백질에 대한 컨센서스 서열과 연결된 IgE 리더 서열을 포함하는 HIV 백신 서열에 대한 암호화 서열을 포함한다. 서열 8은 아형 D 외막 단백질에 대한 컨센서스 서열과 연결된 IgE 리더 서열을 포함하는 HIV 백신 서열 구조물에 대한 아미노산 서열을 포함한다. IgE 리더 서열은 서열 15이다. 서열 19는 아형 D 컨센서스 외막 단백질 서열이다.SEQ ID NO: 7 is the subtype D consensus outer membrane DNA sequence construct. SEQ ID NO: 7 contains the coding sequence for the HIV vaccine sequence comprising the IgE leader sequence linked to the consensus sequence for the subtype D outer membrane protein. SEQ ID NO: 8 contains the amino acid sequence for the HIV vaccine sequence construct comprising the IgE leader sequence linked to the consensus sequence for the subtype D outer membrane protein. The IgE leader sequence is SEQ ID NO:15. SEQ ID NO: 19 is the subtype D consensus outer membrane protein sequence.

몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 19, 그의 단편, 서열 19을 암호화하는 핵산 분자, 또는 그의 단편을 포함한다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 8 또는 이를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 7을 포함한다. 본 발명의 백신은 바람직하게, IgE 리더 서열인 서열 15 또는 이를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.In some embodiments, the vaccine of the invention preferably comprises SEQ ID NO: 19, a fragment thereof, a nucleic acid molecule encoding SEQ ID NO: 19, or a fragment thereof. In some embodiments, the vaccine of the invention preferably comprises SEQ ID NO: 8 or a nucleic acid molecule encoding it. In some embodiments, the vaccine of the invention preferably comprises SEQ ID NO: 7. The vaccine of the present invention preferably comprises the IgE leader sequence, SEQ ID NO: 15 or a nucleic acid sequence encoding the same.

서열 7의 단편은 90개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 7의 단편은 180개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고; 몇몇 양태에서는 270개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 360개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 450개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 540개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 630개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 720개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 810개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 900개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 990개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1080개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1170개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1260개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1350개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1440개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1530개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1620개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1710개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1800개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1890개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1980개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2070개 이상의 뉴클레오티드; 및 몇몇 양태에서는 2140개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 7의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 7의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함하지 않는다. 단편은 180개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 몇몇 양태에서는 270개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 360개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 450개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 540개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 630개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 720개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 810개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 900개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 990개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1080개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1170개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1260개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1350개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1440개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1530개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1620개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1710개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1800개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1890개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1980개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1020개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2070개 미만의 뉴클레오티드; 및 몇몇 양태에서는 2140개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.Fragments of SEQ ID NO: 7 may comprise 90 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 7 may comprise 180 or more nucleotides; In some embodiments 270 or more nucleotides; In some embodiments, 360 or more nucleotides; In some embodiments 450 or more nucleotides; In some embodiments 540 or more nucleotides; 630 or more nucleotides in some embodiments; In some embodiments 720 or more nucleotides; In some embodiments 810 or more nucleotides; 900 or more nucleotides in some embodiments; In some embodiments 990 or more nucleotides; In some embodiments 1080 or more nucleotides; In some embodiments 1170 or more nucleotides; In some embodiments 1260 or more nucleotides; In some embodiments 1350 or more nucleotides; In some embodiments 1440 or more nucleotides; 1530 or more nucleotides in some embodiments; In some embodiments 1620 or more nucleotides; In some embodiments 1710 or more nucleotides; 1800 or more nucleotides in some embodiments; In some embodiments 1890 or more nucleotides; In some embodiments, 1980 or more nucleotides; In some embodiments 2070 or more nucleotides; And in some embodiments 2140 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 7 may comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. In some embodiments, the fragment of SEQ ID NO: 7 does not comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. Fragments may comprise less than 180 nucleotides, and in some embodiments less than 270 nucleotides; Less than 360 nucleotides in some embodiments; Less than 450 nucleotides in some embodiments; Less than 540 nucleotides in some embodiments; Less than 630 nucleotides in some embodiments; Less than 720 nucleotides in some embodiments; Less than 810 nucleotides in some embodiments; Less than 900 nucleotides in some embodiments; Less than 990 nucleotides in some embodiments; Less than 1080 nucleotides in some embodiments; Less than 1170 nucleotides in some embodiments; Less than 1260 nucleotides in some embodiments; Less than 1350 nucleotides in some embodiments; Less than 1440 nucleotides in some embodiments; Less than 1530 nucleotides in some embodiments; Less than 1620 nucleotides in some embodiments; Less than 1710 nucleotides in some embodiments; Less than 1800 nucleotides in some embodiments; Less than 1890 nucleotides in some embodiments; Less than 1980 nucleotides in some embodiments; Less than 1020 nucleotides in some embodiments; Less than 2070 nucleotides in some embodiments; And less than 2140 nucleotides in some embodiments.

서열 8의 단편은 30개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 8의 단편은 60개 이상의 아미노산을 포함할 수 있고; 몇몇 양태에서는 90개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 120개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 150개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 180개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 210개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 240개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 270개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 300개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 330개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 360개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 390개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 420개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 450개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 480개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 510개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 540개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 570개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 600개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 630개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 660개 이상의 아미노산; 및 몇몇 양태에서는 690개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 단편은 90개 미만의 아미노산을 포함할 수 있고; 몇몇 양태에서는 120개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 150개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 180개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 210개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 240개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 270개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 300개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 330개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 360개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 390개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 420개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 450개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 480개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 540개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 600개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 660개 미만의 아미노산; 및 몇몇 양태에서는 690개 미만의 아미노산을 포함할 수 있다.The fragment of SEQ ID NO: 8 may comprise 30 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 8 may comprise 60 or more amino acids; In some embodiments 90 or more amino acids; In some embodiments 120 or more amino acids; In some embodiments 150 or more amino acids; In some embodiments 180 or more amino acids; In some embodiments 210 or more amino acids; At least 240 amino acids in some embodiments; In some embodiments 270 or more amino acids; In some embodiments 300 or more amino acids; In some embodiments 330 or more amino acids; In some embodiments, at least 360 amino acids; In some embodiments 390 or more amino acids; 420 or more amino acids in some embodiments; In some embodiments 450 or more amino acids; In some embodiments 480 or more amino acids; In some embodiments 510 or more amino acids; In some embodiments 540 or more amino acids; In some embodiments 570 or more amino acids; 600 or more amino acids in some embodiments; In some embodiments 630 or more amino acids; In some embodiments 660 or more amino acids; And in some embodiments 690 or more amino acids. Fragments may contain less than 90 amino acids; Less than 120 amino acids in some embodiments; Less than 150 amino acids in some embodiments; Less than 180 amino acids in some embodiments; Less than 210 amino acids in some embodiments; Less than 240 amino acids in some embodiments; Less than 270 amino acids in some embodiments; Less than 300 amino acids in some embodiments; Less than 330 amino acids in some embodiments; Less than 360 amino acids in some embodiments; Less than 390 amino acids in some embodiments; Less than 420 amino acids in some embodiments; Less than 450 amino acids in some embodiments; Less than 480 amino acids in some embodiments; Less than 540 amino acids in some embodiments; Less than 600 amino acids in some embodiments; Less than 660 amino acids in some embodiments; And less than 690 amino acids in some embodiments.

서열 9는 아형 B Nef-Rev 컨센서스 외막 DNA 서열 구조물이다. 서열 9는 아형 B Nef-Rev 단백질에 대한 컨센서스 서열과 연결된 IgE 리더 서열을 포함하는 HIV 백신 서열에 대한 암호화 서열을 포함한다. 서열 10은 아형 B Nef-Rev 단백질에 대한 컨센서스 서열과 연결된 IgE 리더 서열을 포함하는 HIV 백신 서열 구조물에 대한 아미노산 서열을 포함한다. IgE 리더 서열은 서열 15이다. 서열 20은 아형 B Nef-Rev 컨센서스 단백질 서열이다.SEQ ID NO:9 is the subtype B Nef-Rev consensus outer membrane DNA sequence construct. SEQ ID NO: 9 contains the coding sequence for the HIV vaccine sequence comprising the IgE leader sequence linked to the consensus sequence for the subtype B Nef-Rev protein. SEQ ID NO: 10 contains the amino acid sequence for the HIV vaccine sequence construct comprising the IgE leader sequence linked to the consensus sequence for the subtype B Nef-Rev protein. The IgE leader sequence is SEQ ID NO:15. SEQ ID NO: 20 is the subtype B Nef-Rev consensus protein sequence.

몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 20, 그의 단편, 서열 20을 암호화하는 핵산 분자, 또는 그의 단편을 포함한다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 10 또는 이를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 9를 포함한다. 본 발명의 백신은 바람직하게, IgE 리더 서열인 서열 15 또는 이를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.In some embodiments, the vaccine of the invention preferably comprises SEQ ID NO: 20, a fragment thereof, a nucleic acid molecule encoding SEQ ID NO: 20, or a fragment thereof. In some embodiments, the vaccine of the invention preferably comprises SEQ ID NO: 10 or a nucleic acid molecule encoding it. In some embodiments, the vaccine of the invention preferably comprises SEQ ID NO:9. The vaccine of the present invention preferably comprises the IgE leader sequence, SEQ ID NO: 15 or a nucleic acid sequence encoding the same.

서열 9의 단편은 90개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 9의 단편은 180개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고; 몇몇 양태에서는 270개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 360개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 450개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 540개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 630개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 720개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 810개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 900개 이상의 뉴클레오티드; 및 몇몇 양태에서는 990개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 9의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 9의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함하지 않는다. 단편은 180개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 몇몇 양태에서는 270개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 360개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 450개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 540개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 630개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 720개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 810개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 900개 미만의 뉴클레오티드; 및 몇몇 양태에서는 990개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.Fragments of SEQ ID NO:9 may comprise 90 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:9 may comprise 180 or more nucleotides; In some embodiments 270 or more nucleotides; In some embodiments, 360 or more nucleotides; In some embodiments 450 or more nucleotides; In some embodiments 540 or more nucleotides; 630 or more nucleotides in some embodiments; In some embodiments 720 or more nucleotides; In some embodiments 810 or more nucleotides; 900 or more nucleotides in some embodiments; And in some embodiments 990 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 9 may comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. In some embodiments, the fragment of SEQ ID NO:9 does not comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. Fragments may comprise less than 180 nucleotides, and in some embodiments less than 270 nucleotides; Less than 360 nucleotides in some embodiments; Less than 450 nucleotides in some embodiments; Less than 540 nucleotides in some embodiments; Less than 630 nucleotides in some embodiments; Less than 720 nucleotides in some embodiments; Less than 810 nucleotides in some embodiments; Less than 900 nucleotides in some embodiments; And less than 990 nucleotides in some embodiments.

서열 10의 단편은 30개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 10의 단편은 60개 이상의 아미노산을 포함할 수 있고; 몇몇 양태에서는 90개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 120개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 150개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 180개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 210개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 240개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 270개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 300개 이상의 아미노산; 및 몇몇 양태에서는 330개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.The fragment of SEQ ID NO: 10 may comprise 30 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 10 may comprise 60 or more amino acids; In some embodiments 90 or more amino acids; In some embodiments 120 or more amino acids; In some embodiments 150 or more amino acids; In some embodiments 180 or more amino acids; In some embodiments 210 or more amino acids; At least 240 amino acids in some embodiments; In some embodiments 270 or more amino acids; In some embodiments 300 or more amino acids; And in some embodiments 330 or more amino acids.

서열 11은 아형 A, B, C 및 D DNA 서열 구조물의 Gag 컨센서스 DNA 서열이다. 서열 11은 Gag 컨센서스 아형 A, B, C 및 D 단백질에 대한 컨센서스 서열과 연결된 IgE 리더 서열을 포함하는 HIV 백신 서열에 대한 암호화 서열을 포함한다. 서열 12는 Gag 아형 A, B, C 및 D 단백질에 대한 컨센서스 서열과 연결된 IgE 리더 서열을 포함하는 HIV 백신 서열 구조물에 대한 아미노산 서열을 포함한다. IgE 리더 서열은 서열 15이다. 서열 21은 컨센서스 Gag 아형 A, B, C 및 D 단백질 서열이다.SEQ ID NO: 11 is the Gag consensus DNA sequence of the subtype A, B, C and D DNA sequence constructs. SEQ ID NO: 11 contains the coding sequence for an HIV vaccine sequence comprising an IgE leader sequence linked to a consensus sequence for Gag consensus subtypes A, B, C and D proteins. SEQ ID NO: 12 contains the amino acid sequence for the HIV vaccine sequence construct comprising the IgE leader sequence linked to the consensus sequence for Gag subtypes A, B, C and D proteins. The IgE leader sequence is SEQ ID NO:15. SEQ ID NO:21 is the consensus Gag subtype A, B, C and D protein sequence.

몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 21, 그의 단편, 서열 21을 암호화하는 핵산 분자, 또는 그의 단편을 포함한다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 12 또는 이를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 11을 포함한다. 본 발명의 백신은 바람직하게, IgE 리더 서열인 서열 15 또는 이를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.In some embodiments, the vaccine of the invention preferably comprises SEQ ID NO: 21, a fragment thereof, a nucleic acid molecule encoding SEQ ID NO: 21, or a fragment thereof. In some embodiments, the vaccine of the invention preferably comprises SEQ ID NO: 12 or a nucleic acid molecule encoding it. In some embodiments, the vaccine of the invention preferably comprises SEQ ID NO: 11. The vaccine of the present invention preferably comprises the IgE leader sequence, SEQ ID NO: 15 or a nucleic acid sequence encoding the same.

서열 11의 단편은 90개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 11의 단편은 180개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고; 몇몇 양태에서는 270개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 360개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 450개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 540개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 630개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 720개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 810개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 900개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 990개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1080개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1170개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1260개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1350개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1440개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1530개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1620개 이상의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1710개 이상의 뉴클레오티드; 및 몇몇 양태에서는 1800개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 11의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 11의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함하지 않는다. 단편은 180개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 몇몇 양태에서는 270개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 360개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 450개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 540개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 630개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 720개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 810개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 900개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 990개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1080개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1170개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1260개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1350개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1440개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1530개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1620개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1710개 미만의 뉴클레오티드; 및 몇몇 양태에서는 1800개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.The fragment of SEQ ID NO: 11 may comprise 90 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 11 may comprise 180 or more nucleotides; In some embodiments 270 or more nucleotides; In some embodiments, 360 or more nucleotides; In some embodiments 450 or more nucleotides; In some embodiments 540 or more nucleotides; 630 or more nucleotides in some embodiments; In some embodiments 720 or more nucleotides; In some embodiments 810 or more nucleotides; 900 or more nucleotides in some embodiments; In some embodiments 990 or more nucleotides; In some embodiments 1080 or more nucleotides; In some embodiments 1170 or more nucleotides; In some embodiments 1260 or more nucleotides; In some embodiments 1350 or more nucleotides; In some embodiments 1440 or more nucleotides; 1530 or more nucleotides in some embodiments; In some embodiments 1620 or more nucleotides; In some embodiments 1710 or more nucleotides; And in some embodiments 1800 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 11 may comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. In some embodiments, the fragment of SEQ ID NO: 11 does not comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. Fragments may comprise less than 180 nucleotides, and in some embodiments less than 270 nucleotides; Less than 360 nucleotides in some embodiments; Less than 450 nucleotides in some embodiments; Less than 540 nucleotides in some embodiments; Less than 630 nucleotides in some embodiments; Less than 720 nucleotides in some embodiments; Less than 810 nucleotides in some embodiments; Less than 900 nucleotides in some embodiments; Less than 990 nucleotides in some embodiments; Less than 1080 nucleotides in some embodiments; Less than 1170 nucleotides in some embodiments; Less than 1260 nucleotides in some embodiments; Less than 1350 nucleotides in some embodiments; Less than 1440 nucleotides in some embodiments; Less than 1530 nucleotides in some embodiments; Less than 1620 nucleotides in some embodiments; Less than 1710 nucleotides in some embodiments; And less than 1800 nucleotides in some embodiments.

서열 12의 단편은 30개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 12의 단편은 60개 이상의 아미노산을 포함할 수 있고; 몇몇 양태에서는 90개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 120개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 150개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 180개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 210개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 240개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 270개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 300개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 330개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 360개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 390개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 420개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 450개 이상의 아미노산; 몇몇 양태에서는 480개 이상의 아미노산; 및 몇몇 양태에서는 510개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 단편은 90개 미만의 아미노산을 포함할 수 있고; 몇몇 양태에서는 120개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 150개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 180개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 210개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 240개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 270개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 300개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 330개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 360개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 390개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 420개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 450개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 480개 미만의 아미노산; 및 몇몇 양태에서는 510개 미만의 아미노산을 포함할 수 있다.The fragment of SEQ ID NO: 12 may comprise 30 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 12 may comprise 60 or more amino acids; In some embodiments 90 or more amino acids; In some embodiments 120 or more amino acids; In some embodiments 150 or more amino acids; In some embodiments 180 or more amino acids; In some embodiments 210 or more amino acids; At least 240 amino acids in some embodiments; In some embodiments 270 or more amino acids; In some embodiments 300 or more amino acids; In some embodiments 330 or more amino acids; In some embodiments, at least 360 amino acids; In some embodiments 390 or more amino acids; 420 or more amino acids in some embodiments; In some embodiments 450 or more amino acids; In some embodiments 480 or more amino acids; And in some embodiments 510 or more amino acids. Fragments may contain less than 90 amino acids; Less than 120 amino acids in some embodiments; Less than 150 amino acids in some embodiments; Less than 180 amino acids in some embodiments; Less than 210 amino acids in some embodiments; Less than 240 amino acids in some embodiments; Less than 270 amino acids in some embodiments; Less than 300 amino acids in some embodiments; Less than 330 amino acids in some embodiments; Less than 360 amino acids in some embodiments; Less than 390 amino acids in some embodiments; Less than 420 amino acids in some embodiments; Less than 450 amino acids in some embodiments; Less than 480 amino acids in some embodiments; And fewer than 510 amino acids in some embodiments.

HPVHPV

서열 22는 단백질 분해적 절단 서열에 의해 HPV E7에 대한 컨센서스 서열과 연결된, HPV E6에 대한 컨센서스 서열인 IgE 리더 서열을 포함하는 HPV 백신 서열에 대한 암호화 서열을 포함한다. HPV E6에 대한 컨센서스 서열은 서열 24에 제시된 면역우성 에피토프를 포함한다. HPV E7에 대한 컨센서스 서열은 서열 25에 제시된 면역우성 에피토프를 포함한다. HPV E6에 대한 컨센서스 서열은 서열 26이다. HPV E6에 대한 컨센서스 서열은 서열 27이다. IgE 리더 서열은 서열 28이다. 2개의 컨센서스 서열을 연결시키는 데에 유용한 단백질 분해적 절단 서열은 서열 29이다.SEQ ID NO:22 contains the coding sequence for the HPV vaccine sequence comprising the IgE leader sequence, the consensus sequence for HPV E6, linked with the consensus sequence for HPV E7 by a proteolytic cleavage sequence. The consensus sequence for HPV E6 includes the immunodominant epitope set forth in SEQ ID NO: 24. The consensus sequence for HPV E7 includes the immunodominant epitope set forth in SEQ ID NO: 25. The consensus sequence for HPV E6 is SEQ ID NO: 26. The consensus sequence for HPV E6 is SEQ ID NO:27. The IgE leader sequence is SEQ ID NO:28. A proteolytic cleavage sequence useful for linking two consensus sequences is SEQ ID NO: 29.

몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 24 및/또는 서열 25, 또는 둘 중의 하나를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 27 및/또는 서열 28, 또는 둘 중의 하나를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 백신은 바람직하게, 단백질 분해적 절단 서열, 예를 들어 서열 29에 의해 서열 28과 연결된 서열 27, 또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 백신은 바람직하게, IgE 리더 서열인 서열 28, 또는 이를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 23 또는 서열 22 내의 핵산 서열을 포함한다.In some embodiments, the vaccine of the invention preferably comprises a nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO: 24 and/or SEQ ID NO: 25, or either. The vaccine of the present invention preferably comprises a nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO:27 and/or SEQ ID NO:28, or either. The vaccine of the invention preferably comprises a proteolytic cleavage sequence, for example SEQ ID NO:27 linked to SEQ ID NO:28 by SEQ ID NO:29, or a nucleic acid sequence encoding a fusion protein. The vaccine of the present invention preferably comprises SEQ ID NO: 28, which is an IgE leader sequence, or a nucleic acid sequence encoding the same. The vaccine of the present invention preferably comprises a nucleic acid sequence within SEQ ID NO:23 or SEQ ID NO:22.

몇몇 양태에서, 단백질은 서열 23의 단편을 포함한다. 몇몇 양태에서, 단백질은 서열 23의 단편으로 이루어진다. 몇몇 양태에서, 핵산은 서열 22의 단편을 포함한다. 몇몇 양태에서, 핵산은 서열 22의 단편으로 이루어진다.In some embodiments, the protein comprises a fragment of SEQ ID NO:23. In some embodiments, the protein consists of a fragment of SEQ ID NO:23. In some embodiments, the nucleic acid comprises a fragment of SEQ ID NO:22. In some embodiments, the nucleic acid consists of a fragment of SEQ ID NO:22.

서열 22의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 30개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 22의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 45개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 22의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 60개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 22의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 75개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 22의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 90개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 22의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 120개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 22의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 150개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 22의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 180개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 22의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 210개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 22의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 240개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 22의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 270개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 22의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 300개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 22의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 360개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 22의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 420개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 22의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 480개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 22의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 540개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 22의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 600개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 22의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 300개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 22의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 660개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 22의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 720개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 22의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 780개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 22의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 22의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함하지 않는다. 단편은 60개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 몇몇 양태에서는 75개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 90개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 120개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 150개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 180개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 210개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 240개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 270개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 300개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 360개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 420개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 480개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 540개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 600개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 660개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 720개 미만의 뉴클레오티드; 및 몇몇 양태에서는 780개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.The fragment of SEQ ID NO:22 may comprise 30 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 22 may comprise 45 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 22 may comprise 60 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 22 may comprise 75 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 22 may comprise 90 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 22 may comprise 120 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 22 may comprise 150 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 22 may comprise 180 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 22 may comprise 210 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 22 may comprise 240 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 22 may comprise 270 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 22 may comprise 300 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 22 may comprise 360 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 22 may comprise 420 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 22 may comprise 480 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 22 may comprise 540 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 22 may comprise 600 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 22 may comprise 300 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 22 may comprise 660 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 22 may comprise 720 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 22 may comprise 780 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 22 may comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. In some embodiments, the fragment of SEQ ID NO: 22 does not comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. Fragments may comprise less than 60 nucleotides, in some embodiments less than 75 nucleotides; Less than 90 nucleotides in some embodiments; Less than 120 nucleotides in some embodiments; Less than 150 nucleotides in some embodiments; Less than 180 nucleotides in some embodiments; Less than 210 nucleotides in some embodiments; Less than 240 nucleotides in some embodiments; Less than 270 nucleotides in some embodiments; Less than 300 nucleotides in some embodiments; Less than 360 nucleotides in some embodiments; Less than 420 nucleotides in some embodiments; Less than 480 nucleotides in some embodiments; Less than 540 nucleotides in some embodiments; Less than 600 nucleotides in some embodiments; Less than 660 nucleotides in some embodiments; Less than 720 nucleotides in some embodiments; And less than 780 nucleotides in some embodiments.

서열 23의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 15개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 23의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 18개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 23의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 21개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 23의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 24개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 23의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 30개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 23의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 36개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 23의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 42개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 23의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 48개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 23의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 54개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 23의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 60개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 23의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 18개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 23의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 72개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 23의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 90개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 23의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 120개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 23의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 150개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 23의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 180개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 23의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 210개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 23의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 240개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 23의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 260개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 23의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 23의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함하지 않는다. 단편은 24개 미만의 아미노산을 포함할 수 있고, 몇몇 양태에서는 30개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 36개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 42개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 48개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 54개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 60개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 72개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 90개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 120개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 150개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 180개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 210개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 240개 미만의 아미노산; 및 몇몇 양태에서는 260개 미만의 아미노산을 포함할 수 있다.The fragment of SEQ ID NO:23 may comprise 15 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 23 may comprise 18 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 23 may comprise 21 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 23 may comprise 24 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 23 may comprise 30 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 23 may comprise 36 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 23 may comprise 42 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 23 may comprise 48 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 23 may comprise 54 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 23 may comprise 60 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 23 may comprise 18 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 23 may comprise 72 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 23 may comprise 90 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 23 may comprise 120 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 23 may comprise 150 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 23 may comprise 180 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 23 may comprise 210 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 23 may comprise 240 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 23 may comprise 260 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:23 may comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. In some embodiments, the fragment of SEQ ID NO:23 does not comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. Fragments may comprise less than 24 amino acids, and in some embodiments less than 30 amino acids; Less than 36 amino acids in some embodiments; Less than 42 amino acids in some embodiments; Less than 48 amino acids in some embodiments; Less than 54 amino acids in some embodiments; Less than 60 amino acids in some embodiments; Less than 72 amino acids in some embodiments; Less than 90 amino acids in some embodiments; Less than 120 amino acids in some embodiments; Less than 150 amino acids in some embodiments; Less than 180 amino acids in some embodiments; Less than 210 amino acids in some embodiments; Less than 240 amino acids in some embodiments; And less than 260 amino acids in some embodiments.

HCVHCV

서열 30은 단백질 분해적 절단 서열에 의해 HCV E2에 대한 컨센서스 서열과 연결된, HCV E1에 대한 컨센서스 서열인 IgE 리더 서열을 포함하는 HCV 백신 서열에 대한 암호화 서열을 포함한다. HCV E1에 대한 컨센서스 서열은 서열 32이다. HCV E2에 대한 컨센서스 서열은 서열 33이다.SEQ ID NO: 30 comprises the coding sequence for an HCV vaccine sequence comprising an IgE leader sequence, a consensus sequence for HCV E1, linked with a consensus sequence for HCV E2 by a proteolytic cleavage sequence. The consensus sequence for HCV E1 is SEQ ID NO:32. The consensus sequence for HCV E2 is SEQ ID NO:33.

몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 32 및/또는 서열 33, 또는 둘 중의 하나를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 백신은 바람직하게, 단백질 분해적 절단 서열, 예를 들어 서열 29에 의해 서열 33과 연결된 서열 32, 또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 백신은 바람직하게, IgE 리더 서열인 서열 28, 또는 이를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 백신은 바람직하게, 서열 31 또는 서열 30 내의 핵산 서열을 포함한다.In some embodiments, the vaccine of the invention preferably comprises a nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO: 32 and/or SEQ ID NO: 33, or either. The vaccine of the invention preferably comprises a proteolytic cleavage sequence, for example SEQ ID NO: 32 linked to SEQ ID NO: 33 by SEQ ID NO: 29, or a nucleic acid sequence encoding a fusion protein. The vaccine of the present invention preferably comprises SEQ ID NO: 28, which is an IgE leader sequence, or a nucleic acid sequence encoding the same. The vaccine of the present invention preferably comprises a nucleic acid sequence within SEQ ID NO: 31 or SEQ ID NO: 30.

본 발명의 몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 서열 30, 및 다음 군 중에서 선택된 핵산 서열 또는 그의 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다: 서열 34, 서열 35 및 그의 모든 조합물.In some embodiments of the present invention, the vaccine of the present invention comprises SEQ ID NO: 30, and an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence selected from the following group: SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, and all combinations thereof.

서열 30의 단편은 30개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 45개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 60개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 75개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 90개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 120개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 150개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 180개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 210개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 240개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 270개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 300개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 360개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 420개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 480개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 540개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 600개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 660개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 720개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 780개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 840개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 900개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 960개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 1020개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 1080개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 1140개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 1200개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 1260개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 1320개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 1380개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 1440개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 1500개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 1560개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 1620개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 1680개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 1740개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 30의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함하지 않는다. 단편은 60개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 몇몇 양태에서는 75개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 90개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 120개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 150개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 180개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 210개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 240개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 270개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 300개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 360개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 420개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 480개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 540개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 600개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 660개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 720개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 780개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 840개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 900개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 960개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1020개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1080개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1140개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1200개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1260개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1320개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1380개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1440개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1500개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1560개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1620개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1680개 미만의 뉴클레오티드; 및 몇몇 양태에서는 1740개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.The fragment of SEQ ID NO:30 may comprise 30 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 45 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 60 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 75 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 90 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 120 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 150 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 180 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 210 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 240 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 270 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 300 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 360 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 420 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 480 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 540 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 600 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 660 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 720 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 780 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 840 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 900 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 960 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 1020 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 1080 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 1140 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 1200 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 1260 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 1320 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 1380 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 1440 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 1500 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 1560 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 1620 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 1680 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise 1740 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 30 may comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. In some embodiments, the fragment of SEQ ID NO: 30 does not comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. Fragments may comprise less than 60 nucleotides, in some embodiments less than 75 nucleotides; Less than 90 nucleotides in some embodiments; Less than 120 nucleotides in some embodiments; Less than 150 nucleotides in some embodiments; Less than 180 nucleotides in some embodiments; Less than 210 nucleotides in some embodiments; Less than 240 nucleotides in some embodiments; Less than 270 nucleotides in some embodiments; Less than 300 nucleotides in some embodiments; Less than 360 nucleotides in some embodiments; Less than 420 nucleotides in some embodiments; Less than 480 nucleotides in some embodiments; Less than 540 nucleotides in some embodiments; Less than 600 nucleotides in some embodiments; Less than 660 nucleotides in some embodiments; Less than 720 nucleotides in some embodiments; Less than 780 nucleotides in some embodiments; Less than 840 nucleotides in some embodiments; Less than 900 nucleotides in some embodiments; Less than 960 nucleotides in some embodiments; Less than 1020 nucleotides in some embodiments; Less than 1080 nucleotides in some embodiments; Less than 1140 nucleotides in some embodiments; Less than 1200 nucleotides in some embodiments; Less than 1260 nucleotides in some embodiments; Less than 1320 nucleotides in some embodiments; Less than 1380 nucleotides in some embodiments; Less than 1440 nucleotides in some embodiments; Less than 1500 nucleotides in some embodiments; Less than 1560 nucleotides in some embodiments; Less than 1620 nucleotides in some embodiments; Less than 1680 nucleotides in some embodiments; And less than 1740 nucleotides in some embodiments.

서열 31의 단편은 15개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 31의 단편은 30개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 31의 단편은 45개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 31의 단편은 60개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 31의 단편은 75개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 31의 단편은 90개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 31의 단편은 105개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 31의 단편은 120개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 31의 단편은 150개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 31의 단편은 180개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 31의 단편은 210개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 31의 단편은 240개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 31의 단편은 270개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 31의 단편은 300개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 31의 단편은 360개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 31의 단편은 420개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 31의 단편은 480개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 31의 단편은 540개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 31의 단편은 575개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 단편은 30개 미만의 아미노산을 포함할 수 있고, 몇몇 양태에서는 45개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 60개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 75개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 90개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 120개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 150개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 180개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 210개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 240개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 270개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 300개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 360개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 420개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 480개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 540개 미만의 아미노산; 및 몇몇 양태에서는 575개 미만의 아미노산을 포함할 수 있다.The fragment of SEQ ID NO: 31 may comprise 15 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 31 may comprise 30 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 31 may comprise 45 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 31 may comprise 60 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 31 may comprise 75 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 31 may comprise 90 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 31 may comprise 105 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 31 may comprise 120 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 31 may comprise 150 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 31 may comprise 180 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 31 may comprise 210 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 31 may comprise 240 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 31 may comprise 270 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 31 may comprise 300 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 31 may comprise 360 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 31 may comprise 420 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 31 may comprise 480 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 31 may comprise 540 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 31 may comprise 575 or more amino acids. Fragments may comprise less than 30 amino acids, and in some embodiments less than 45 amino acids; Less than 60 amino acids in some embodiments; Less than 75 amino acids in some embodiments; Less than 90 amino acids in some embodiments; Less than 120 amino acids in some embodiments; Less than 150 amino acids in some embodiments; Less than 180 amino acids in some embodiments; Less than 210 amino acids in some embodiments; Less than 240 amino acids in some embodiments; Less than 270 amino acids in some embodiments; Less than 300 amino acids in some embodiments; Less than 360 amino acids in some embodiments; Less than 420 amino acids in some embodiments; Less than 480 amino acids in some embodiments; Less than 540 amino acids in some embodiments; And fewer than 575 amino acids in some embodiments.

hTERThTERT

hTERT는 염색체 단축으로 인한 세포 사멸을 방지하기 위해 텔로미어의 말단 상에 TTAGGG 태그를 합성하는 인간 텔로머라제 역전사효소이다. hTERT를 비정상적으로 고 발현시키는 과증식성 세포가 면역요법에 의해 표적화될 수 있다. 최근의 연구는 또한, hTERT가 HCV 및 HPV에 감염된 과증식성 세포 상에서 비정상적으로 발현된다는 것을 뒷받침해준다. 따라서, HPV와 HCV 둘 다에 대한 면역요법은 hTERT를 비정상적 수준으로 발현하는 세포를 표적화함으로써 증강시킬 수 있다.hTERT is a human telomerase reverse transcriptase that synthesizes a TTAGGG tag on the end of telomere to prevent cell death due to chromosomal shortening. Hyperproliferative cells that express abnormally high hTERT can be targeted by immunotherapy. Recent studies also support that hTERT is abnormally expressed on hyperproliferative cells infected with HCV and HPV. Thus, immunotherapy against both HPV and HCV can be augmented by targeting cells that express hTERT at abnormal levels.

최근의 연구 결과, hTERT 유전자로 형질감염시킨 수지상 세포에서의 hTERT 발현은 CD8+ 세포독성 T 세포를 유도시킬 수 있고, CD4+ T 세포를 항원-특이적 방식으로 유도시킬 수 있는 것으로 입증되었다. 따라서, 선택되는 항원을 제시할 수 있는 능력을 유지시키고 노화를 지연시키기 위해 항원 제시 세포 (APC) 내에서의 hTERT 발현을 이용하는 것은 새로운 면역요법 방법을 개발하는 데에 있어서 매력적이다.Recent studies have demonstrated that hTERT expression in dendritic cells transfected with the hTERT gene can induce CD8+ cytotoxic T cells and can induce CD4+ T cells in an antigen-specific manner. Thus, the use of hTERT expression in antigen presenting cells (APCs) to maintain the ability to present the antigen of choice and to delay senescence is attractive for developing new immunotherapy methods.

본 발명의 몇몇 양태에 따라서, 면역원에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법은 이러한 개체에게 hTERT 단백질 및 그의 기능성 단편 또는 그의 발현 가능한 암호화 서열을, 본 발명의 단백질을 암호화하는 단리된 핵산 분자 및/또는 본 발명의 단백질을 암호화하는 재조합 백신 및/또는 본 발명의 단백질을 포함하는 소단위체 백신 및/또는 생 약독화 백신 및/또는 사멸 백신과 병용해서 투여하는 것을 포함한다.According to some embodiments of the present invention, a method of inducing an immune response in an individual against an immunogen comprises providing the individual an hTERT protein and a functional fragment thereof or an expressible coding sequence thereof, an isolated nucleic acid molecule encoding a protein of the present invention and/ Or a recombinant vaccine encoding the protein of the present invention and/or a subunit vaccine comprising the protein of the present invention and/or a live attenuated vaccine and/or a killed vaccine.

본 발명의 몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 서열 30, 및 다음 군 중에서 선택된 핵산 서열 또는 그의 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다: 서열 34, 서열 35 및 그의 모든 조합물. 본 발명의 몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 서열 34 또는 서열 35를 포함한다. 서열 34는 hTERT를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 서열 35는 hTERT에 대한 아미노산 서열을 포함한다. In some embodiments of the present invention, the vaccine of the present invention comprises SEQ ID NO: 30, and an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence selected from the following group: SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, and all combinations thereof. In some embodiments of the invention, the vaccine of the invention comprises SEQ ID NO:34 or SEQ ID NO:35. SEQ ID NO:34 includes a nucleic acid sequence encoding hTERT. SEQ ID NO:35 includes the amino acid sequence for hTERT.

본 발명의 몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 서열 22 및 서열 34 또는 서열 35를 포함한다. hTERT 및/또는 hTERT의 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 HPV 면역원과 병용해서 사용하는 것은 HPV-감염된 세포에 대한 세포-매개형 면역 반응을 증강시켜 준다.In some embodiments of the invention, the vaccine of the invention comprises SEQ ID NO:22 and SEQ ID NO:34 or SEQ ID NO:35. The use of a nucleic acid sequence encoding a protein of hTERT and/or hTERT in combination with an HPV immunogen enhances a cell-mediated immune response against HPV-infected cells.

서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 30개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 45개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 60개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 75개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 90개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 120개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 150개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 180개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 210개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 240개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 270개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 300개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 360개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 420개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 480개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 540개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 600개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 300개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 660개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 720개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 780개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 840개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 900개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 960개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1020개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1080개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1140개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1200개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1260개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1320개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1380개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1440개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1500개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1560개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1620개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1680개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1740개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1800개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1860개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1920개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1980개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 2040개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 2100개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 2160개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 2220개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 2280개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 2340개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 2400개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 2460개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 2520개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 2580개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 2640개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 2700개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 2760개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 2820개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 2880개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 2940개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 3000개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 3060개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 3120개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 3180개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 3240개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 3300개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 3360개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 3420개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 3480개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 34의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함하지 않는다. 단편은 60개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 몇몇 양태에서는 75개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 90개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 120개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 150개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 180개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 210개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 240개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 270개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 300개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 360개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 420개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 480개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 540개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 600개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 660개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 720개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 780개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 840개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 900개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 960개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1020개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1080개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1140개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1200개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1260개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1320개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1380개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1440개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1500개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1560개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1620개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1680개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1740개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1800개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1860개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1920개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1980개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2040개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2100개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2160개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2220개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2280개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2340개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2400개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2460개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2520개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2580개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2640개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2700개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2760개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2820개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2860개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 2940개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 3000개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 3060개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 3120개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 3180개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 3240개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 3300개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 3360개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 3420개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 3480개 미만의 뉴클레오티드; 및 몇몇 양태에서는 3510개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.The fragment of SEQ ID NO:34 may comprise 30 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 45 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 60 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 75 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 90 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 120 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 150 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 180 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 210 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 240 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 270 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 300 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 360 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 420 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 480 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 540 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 600 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 300 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 660 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 720 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 780 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 840 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 900 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 960 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 1020 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 1080 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 1140 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 1200 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 1260 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 1320 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 1380 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 1440 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 1500 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 1560 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 1620 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 1680 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 1740 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 1800 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 1860 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 1920 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 1980 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 2040 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 2100 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 2160 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 2220 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 2280 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 2340 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 2400 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 2460 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 2520 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 2580 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 2640 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 2700 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 2760 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 2820 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 2880 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 2940 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 3000 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 3060 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 3120 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 3180 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 34 may comprise 3240 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 3300 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 3360 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 3420 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise 3480 or more nucleotides, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:34 may comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. In some embodiments, the fragment of SEQ ID NO:34 does not comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. Fragments may comprise less than 60 nucleotides, in some embodiments less than 75 nucleotides; Less than 90 nucleotides in some embodiments; Less than 120 nucleotides in some embodiments; Less than 150 nucleotides in some embodiments; Less than 180 nucleotides in some embodiments; Less than 210 nucleotides in some embodiments; Less than 240 nucleotides in some embodiments; Less than 270 nucleotides in some embodiments; Less than 300 nucleotides in some embodiments; Less than 360 nucleotides in some embodiments; Less than 420 nucleotides in some embodiments; Less than 480 nucleotides in some embodiments; Less than 540 nucleotides in some embodiments; Less than 600 nucleotides in some embodiments; Less than 660 nucleotides in some embodiments; Less than 720 nucleotides in some embodiments; Less than 780 nucleotides in some embodiments; Less than 840 nucleotides in some embodiments; Less than 900 nucleotides in some embodiments; Less than 960 nucleotides in some embodiments; Less than 1020 nucleotides in some embodiments; Less than 1080 nucleotides in some embodiments; Less than 1140 nucleotides in some embodiments; Less than 1200 nucleotides in some embodiments; Less than 1260 nucleotides in some embodiments; Less than 1320 nucleotides in some embodiments; Less than 1380 nucleotides in some embodiments; Less than 1440 nucleotides in some embodiments; Less than 1500 nucleotides in some embodiments; Less than 1560 nucleotides in some embodiments; Less than 1620 nucleotides in some embodiments; Less than 1680 nucleotides in some embodiments; Less than 1740 nucleotides in some embodiments; Less than 1800 nucleotides in some embodiments; Less than 1860 nucleotides in some embodiments; Less than 1920 nucleotides in some embodiments; Less than 1980 nucleotides in some embodiments; Less than 2040 nucleotides in some embodiments; Less than 2100 nucleotides in some embodiments; Less than 2160 nucleotides in some embodiments; Less than 2220 nucleotides in some embodiments; Less than 2280 nucleotides in some embodiments; Less than 2340 nucleotides in some embodiments; Less than 2400 nucleotides in some embodiments; Less than 2460 nucleotides in some embodiments; Less than 2520 nucleotides in some embodiments; Less than 2580 nucleotides in some embodiments; Less than 2640 nucleotides in some embodiments; Less than 2700 nucleotides in some embodiments; Less than 2760 nucleotides in some embodiments; Less than 2820 nucleotides in some embodiments; Less than 2860 nucleotides in some embodiments; Less than 2940 nucleotides in some embodiments; Less than 3000 nucleotides in some embodiments; Less than 3060 nucleotides in some embodiments; Less than 3120 nucleotides in some embodiments; Less than 3180 nucleotides in some embodiments; Less than 3240 nucleotides in some embodiments; Less than 3300 nucleotides in some embodiments; Less than 3360 nucleotides in some embodiments; Less than 3420 nucleotides in some embodiments; Less than 3480 nucleotides in some embodiments; And less than 3510 nucleotides in some embodiments.

서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 15개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 18개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 21개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 24개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 30개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 36개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 42개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 48개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 54개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 60개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 66개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 72개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 90개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 120개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 150개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 180개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 210개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 240개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 270개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 300개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 330개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 360개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 390개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 420개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 450개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 480개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 510개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 540개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 570개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 600개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 630개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 660개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 690개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 720개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 750개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 780개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 810개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 840개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 870개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 900개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 930개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 960개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 990개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1020개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1050개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1080개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1110개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1140개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1170개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1200개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1230개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1260개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1290개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1320개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1350개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1380개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1410개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1440개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1470개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 면역우성 에피토프를 암호화하는 서열을 바람직하게 포함한, 1500개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 35의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함하지 않는다. 단편은 24개 미만의 아미노산을 포함할 수 있고, 몇몇 양태에서는 30개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 36개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 42개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 48개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 54개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 60개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 72개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 90개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 120개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 150개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 180개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 210개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 240개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 260개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 290개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 320개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 350개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 380개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 410개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 440개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 470개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 500개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 530개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 560개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 590개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 620개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 650개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 680개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 710개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 740개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 770개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 800개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 830개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 860개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 890개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 920개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 950개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 980개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 1010개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 1040개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 1070개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 1200개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 1230개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 1260개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 1290개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 1320개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 1350개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 1380개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 1410개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 1440개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 1470개 미만의 아미노산; 및 몇몇 양태에서는 1500개 미만의 아미노산을 포함할 수 있다.The fragment of SEQ ID NO:35 may comprise 15 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 18 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 21 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 24 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 30 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 36 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 42 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 48 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 54 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 60 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 66 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 72 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 90 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 120 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 150 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 180 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 210 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 240 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 270 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 300 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 330 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 360 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 390 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 420 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 450 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 480 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 510 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 540 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 570 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 600 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 630 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 660 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 690 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 720 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 750 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 780 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 810 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 840 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 870 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 900 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 930 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 960 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 990 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 1020 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 1050 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 1080 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 1110 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 1140 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 1170 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 1200 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 1230 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 1260 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 1290 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 1320 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 1350 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 1380 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 1410 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise 1440 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 1470 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO: 35 may comprise 1500 or more amino acids, preferably comprising a sequence encoding an immunodominant epitope. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 may comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:35 do not comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. Fragments may comprise less than 24 amino acids, and in some embodiments less than 30 amino acids; Less than 36 amino acids in some embodiments; Less than 42 amino acids in some embodiments; Less than 48 amino acids in some embodiments; Less than 54 amino acids in some embodiments; Less than 60 amino acids in some embodiments; Less than 72 amino acids in some embodiments; Less than 90 amino acids in some embodiments; Less than 120 amino acids in some embodiments; Less than 150 amino acids in some embodiments; Less than 180 amino acids in some embodiments; Less than 210 amino acids in some embodiments; Less than 240 amino acids in some embodiments; Less than 260 amino acids in some embodiments; Less than 290 amino acids in some embodiments; Less than 320 amino acids in some embodiments; Less than 350 amino acids in some embodiments; Less than 380 amino acids in some embodiments; Less than 410 amino acids in some embodiments; Less than 440 amino acids in some embodiments; Less than 470 amino acids in some embodiments; Less than 500 amino acids in some embodiments; Less than 530 amino acids in some embodiments; Less than 560 amino acids in some embodiments; Less than 590 amino acids in some embodiments; Less than 620 amino acids in some embodiments; Less than 650 amino acids in some embodiments; Less than 680 amino acids in some embodiments; Less than 710 amino acids in some embodiments; Less than 740 amino acids in some embodiments; Less than 770 amino acids in some embodiments; Less than 800 amino acids in some embodiments; Less than 830 amino acids in some embodiments; Less than 860 amino acids in some embodiments; Less than 890 amino acids in some embodiments; Less than 920 amino acids in some embodiments; Less than 950 amino acids in some embodiments; Less than 980 amino acids in some embodiments; Less than 1010 amino acids in some embodiments; Less than 1040 amino acids in some embodiments; Less than 1070 amino acids in some embodiments; Less than 1200 amino acids in some embodiments; Less than 1230 amino acids in some embodiments; Less than 1260 amino acids in some embodiments; Less than 1290 amino acids in some embodiments; Less than 1320 amino acids in some embodiments; Less than 1350 amino acids in some embodiments; Less than 1380 amino acids in some embodiments; Less than 1410 amino acids in some embodiments; Less than 1440 amino acids in some embodiments; Less than 1470 amino acids in some embodiments; And less than 1500 amino acids in some embodiments.

인플루엔자influenza

본 발명의 몇몇 양태에 따라서, 면역원에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법은 이러한 개체에게 인플루엔자 균주 H5N1 적혈구응집소 (HA) 단백질 및 그의 기능성 단편 또는 그의 발현 가능한 암호화 서열을, 본 발명의 단백질을 암호화하는 단리된 핵산 분자 및/또는 본 발명의 단백질을 암호화하는 재조합 백신 및/또는 본 발명의 단백질을 포함하는 소단위체 백신 및/또는 생 약독화 백신 및/또는 사멸 백신과 병용해서 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 양태에서, 인플루엔자 백신 조성물 및 방법은 인플루엔자 바이러스 종으로부터의 HA 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 사용을 포함한다. 몇몇 양태에서, 인플루엔자 백신 조성물 및 방법은 인플루엔자 바이러스 균주 H1N5로부터의 HA를 암호화하는 핵산 서열 및 서열 38, 서열 40 및 서열 42로 이루어진 군 중에서 선택된 인플루엔자 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 사용을 포함한다. 본 발명의 몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 서열 36 또는 서열 37을 포함한다. 서열 36은 인플루엔자 바이러스의 H1N5 HA를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 서열 37은 인플루엔자 바이러스의 H1N5 HA에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 서열 38 또는 서열 39를 포함한다. 서열 38은 인플루엔자 H1N1 및 H5N1 NA 컨센서스 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 서열 39는 인플루엔자 H1N1 및 H5N1 NA 컨센서스 서열에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 서열 40 또는 서열 41을 포함한다. 서열 40은 인플루엔자 H1N1 및 H5N1 M1 컨센서스 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 서열 41은 인플루엔자 H1N1 및 H5N1 M1 컨센서스 서열에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 서열 42 또는 서열 43을 포함한다. 서열 42는 인플루엔자 H5N1 M2E-NP 컨센서스 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 서열 43은 인플루엔자 H5N1 M2E-NP 컨센서스 서열에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 몇몇 양태에서, 본 발명의 백신은 서열 36, 및 다음 군 중에서 선택된 서열을 포함한다: 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 42, 서열 43, 및 그의 모든 조합물. 인플루엔자 바이러스 균주 H5N1 HA에 대한 컨센서스 서열은 서열 36에 제시된 면역우성 에피토프를 포함한다. 서열 36에 의해 암호화된 인플루엔자 바이러스 H5N1 HA 아미노산 서열은 서열 37이다. 인플루엔자 바이러스 H1N1/H5N1 NA에 대한 컨센서스 서열은 서열 38에 제시된 면역우성 에피토프를 포함한다. 서열 38에 의해 암호화된 인플루엔자 바이러스 균주 H1N1/H5N1 NA 아미노산 서열은 서열 39이다. 인플루엔자 바이러스 균주 H1N1/H5N1 M1에 대한 컨센서스 서열은 서열 40에 제시된 면역우성 에피토프를 포함한다. 서열 40에 의해 암호화된 인플루엔자 바이러스 H1N1/H5N1 M1 아미노산 서열은 서열 41이다. 인플루엔자 바이러스 H5N1 M2E-NP에 대한 컨센서스 서열은 서열 42에 제시된 면역우성 에피토프를 포함한다. 서열 42에 의해 암호화된 인플루엔자 바이러스 H5N1 M2E-NP 아미노산 서열은 서열 43이다. 본 발명의 백신은 상기 규정된 핵산 분자에 의해 암호화된 단백질 생성물 또는 단백질의 모든 단편을 포함할 수있다.According to some embodiments of the present invention, a method of inducing an immune response in an individual against an immunogen comprises influenza strain H5N1 hemagglutinin (HA) protein and a functional fragment thereof, or an expressible coding sequence thereof, to such an individual, encoding the protein of the present invention. And/or a recombinant vaccine encoding the protein of the present invention and/or a subunit vaccine comprising the protein of the present invention and/or a live attenuated vaccine and/or a killed vaccine. . In some embodiments, influenza vaccine compositions and methods include the use of a nucleic acid sequence encoding an HA protein from an influenza virus species. In some embodiments, influenza vaccine compositions and methods include the use of a nucleic acid sequence encoding HA from influenza virus strain H1N5 and a nucleic acid sequence encoding an influenza protein selected from the group consisting of SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, and SEQ ID NO:42. In some embodiments of the invention, the vaccine of the invention comprises SEQ ID NO:36 or SEQ ID NO:37. SEQ ID NO:36 comprises a nucleic acid sequence encoding H1N5 HA of an influenza virus. SEQ ID NO:37 comprises the amino acid sequence for H1N5 HA of Influenza Virus. In some embodiments of the invention, the vaccine of the invention comprises SEQ ID NO:38 or SEQ ID NO:39. SEQ ID NO:38 comprises a nucleic acid sequence encoding an Influenza H1N1 and H5N1 NA consensus sequence. SEQ ID NO:39 includes the amino acid sequence for Influenza H1N1 and H5N1 NA consensus sequences. In some embodiments of the invention, the vaccine of the invention comprises SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: 41. SEQ ID NO:40 comprises a nucleic acid sequence encoding an Influenza H1N1 and H5N1 M1 consensus sequence. SEQ ID NO:41 includes the amino acid sequence for Influenza H1N1 and H5N1 M1 consensus sequence. In some embodiments of the invention, the vaccine of the invention comprises SEQ ID NO:42 or SEQ ID NO:43. SEQ ID NO:42 comprises a nucleic acid sequence encoding an Influenza H5N1 M2E-NP consensus sequence. SEQ ID NO:43 includes the amino acid sequence for an Influenza H5N1 M2E-NP consensus sequence. In some embodiments of the invention, the vaccine of the invention comprises SEQ ID NO:36, and a sequence selected from the following group: SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, and all combinations thereof. water. The consensus sequence for influenza virus strain H5N1 HA comprises the immunodominant epitope set forth in SEQ ID NO:36. Influenza virus H5N1 HA amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 36 is SEQ ID NO: 37. The consensus sequence for influenza virus H1N1/H5N1 NA comprises the immunodominant epitope set forth in SEQ ID NO:38. Influenza virus strain H1N1/H5N1 NA amino acid sequence encoded by SEQ ID NO:38 is SEQ ID NO:39. The consensus sequence for the influenza virus strain H1N1/H5N1 M1 comprises the immunodominant epitope set forth in SEQ ID NO:40. The influenza virus H1N1/H5N1 M1 amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 40 is SEQ ID NO: 41. The consensus sequence for influenza virus H5N1 M2E-NP comprises the immunodominant epitope set forth in SEQ ID NO:42. Influenza virus H5N1 M2E-NP amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 42 is SEQ ID NO: 43. The vaccine of the present invention may contain a protein product or any fragment of a protein encoded by the nucleic acid molecule defined above.

서열 36의 단편은 30개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 45개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 60개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 75개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 90개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 120개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 150개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 180개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 210개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 240개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 270개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 300개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 360개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 420개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 480개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 540개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 600개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 660개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 720개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 780개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 840개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 900개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 960개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 1020개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 1080개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 1140개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 1200개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 1260개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 1320개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 1380개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 1440개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 1500개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 1560개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 1620개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 1680개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 1740개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 36의 단편은 IgE 리더 서열에 대한 암호화 서열을 포함하지 않는다. 서열 36의 단편은 60개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 몇몇 양태에서는 75개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 90개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 120개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 150개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 180개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 210개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 240개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 270개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 300개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 360개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 420개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 480개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 540개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 600개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 660개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 720개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 780개 미만; 몇몇 양태에서는 840개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 900개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 960개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1020개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1080개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1140개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1200개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1260개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1320개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1380개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1440개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1500개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1560개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1620개 미만의 뉴클레오티드; 몇몇 양태에서는 1680개 미만의 뉴클레오티드; 및 몇몇 양태에서는 1740개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.The fragment of SEQ ID NO:36 may comprise 30 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 45 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 60 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 75 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 90 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 120 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 150 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 180 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 210 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 240 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 270 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 300 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 360 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 420 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 480 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 540 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 600 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 660 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 720 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 780 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 840 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 900 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 960 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 1020 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 1080 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 1140 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 1200 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 1260 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 1320 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 1380 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 1440 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 1500 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 1560 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 1620 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 1680 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise 1740 or more nucleotides. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 may comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:36 do not comprise the coding sequence for the IgE leader sequence. The fragment of SEQ ID NO:36 may comprise less than 60 nucleotides, in some embodiments less than 75 nucleotides; Less than 90 nucleotides in some embodiments; Less than 120 nucleotides in some embodiments; Less than 150 nucleotides in some embodiments; Less than 180 nucleotides in some embodiments; Less than 210 nucleotides in some embodiments; Less than 240 nucleotides in some embodiments; Less than 270 nucleotides in some embodiments; Less than 300 nucleotides in some embodiments; Less than 360 nucleotides in some embodiments; Less than 420 nucleotides in some embodiments; Less than 480 nucleotides in some embodiments; Less than 540 nucleotides in some embodiments; Less than 600 nucleotides in some embodiments; Less than 660 nucleotides in some embodiments; Less than 720 nucleotides in some embodiments; Less than 780 in some embodiments; Less than 840 nucleotides in some embodiments; Less than 900 nucleotides in some embodiments; Less than 960 nucleotides in some embodiments; Less than 1020 nucleotides in some embodiments; Less than 1080 nucleotides in some embodiments; Less than 1140 nucleotides in some embodiments; Less than 1200 nucleotides in some embodiments; Less than 1260 nucleotides in some embodiments; Less than 1320 nucleotides in some embodiments; Less than 1380 nucleotides in some embodiments; Less than 1440 nucleotides in some embodiments; Less than 1500 nucleotides in some embodiments; Less than 1560 nucleotides in some embodiments; Less than 1620 nucleotides in some embodiments; Less than 1680 nucleotides in some embodiments; And less than 1740 nucleotides in some embodiments.

서열 37의 단편은 15개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 37의 단편은 30개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 37의 단편은 45개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 37의 단편은 60개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 37의 단편은 75개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 37의 단편은 90개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 37의 단편은 105개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 37의 단편은 120개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 37의 단편은 150개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 37의 단편은 180개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 37의 단편은 210개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 37의 단편은 240개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 37의 단편은 270개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 37의 단편은 300개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 37의 단편은 360개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 37의 단편은 420개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 37의 단편은 480개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 37의 단편은 540개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 서열 37의 단편은 565개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 서열 37의 단편은 30개 미만의 아미노산을 포함할 수 있고, 몇몇 양태에서는 45개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 60개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 75개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 90개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 120개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 150개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 180개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 210개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 240개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 270개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 300개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 360개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 420개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 480개 미만의 아미노산; 몇몇 양태에서는 540개 미만의 아미노산; 및 몇몇 양태에서는 565개 미만의 아미노산을 포함할 수 있다.The fragment of SEQ ID NO:37 may comprise 15 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:37 may comprise 30 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:37 may comprise 45 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:37 may comprise 60 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:37 may comprise 75 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:37 may comprise 90 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:37 may comprise 105 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:37 may comprise 120 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:37 may comprise 150 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:37 may comprise 180 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:37 may comprise 210 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:37 may comprise 240 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:37 may comprise 270 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:37 may comprise 300 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:37 may comprise 360 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:37 may comprise 420 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:37 may comprise 480 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:37 may comprise 540 or more amino acids. In some embodiments, fragments of SEQ ID NO:37 may comprise 565 or more amino acids. Fragment of SEQ ID NO:37 may comprise less than 30 amino acids, in some embodiments less than 45 amino acids; Less than 60 amino acids in some embodiments; Less than 75 amino acids in some embodiments; Less than 90 amino acids in some embodiments; Less than 120 amino acids in some embodiments; Less than 150 amino acids in some embodiments; Less than 180 amino acids in some embodiments; Less than 210 amino acids in some embodiments; Less than 240 amino acids in some embodiments; Less than 270 amino acids in some embodiments; Less than 300 amino acids in some embodiments; Less than 360 amino acids in some embodiments; Less than 420 amino acids in some embodiments; Less than 480 amino acids in some embodiments; Less than 540 amino acids in some embodiments; And less than 565 amino acids in some embodiments.

본 발명의 몇몇 양태에 따라서, 면역원에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법은 이러한 개체에게 인플루엔자 균주 H1N1 및 인플루엔자 균주 H5N1 NA 단백질 및 그의 기능성 단편 또는 그의 발현 가능한 암호화 서열을, 본 발명의 단백질을 암호화하는 단리된 핵산 분자 및/또는 본 발명의 단백질을 암호화하는 재조합 백신 및/또는 본 발명의 단백질을 포함하는 소단위체 백신 및/또는 생 약독화 백신 및/또는 사멸 백신과 병용해서 투여하는 것을 포함한다.According to some embodiments of the present invention, the method of inducing an immune response in an individual against an immunogen is to encode the protein of the present invention with the influenza strain H1N1 and the influenza strain H5N1 NA protein and its functional fragment or its expressible coding sequence. And/or a recombinant vaccine encoding the protein of the present invention and/or a subunit vaccine comprising the protein of the present invention and/or a live attenuated vaccine and/or a killed vaccine. .

본 발명의 몇몇 양태에 따라서, 면역원에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법은 이러한 개체에게 인플루엔자 균주 H1N1 및 인플루엔자 균주 H5N1 M1 단백질 및 그의 기능성 단편 또는 그의 발현 가능한 암호화 서열을, 본 발명의 단백질을 암호화하는 단리된 핵산 분자 및/또는 본 발명의 단백질을 암호화하는 재조합 백신 및/또는 본 발명의 단백질을 포함하는 소단위체 백신 및/또는 생 약독화 백신 및/또는 사멸 백신과 병용해서 투여하는 것을 포함한다.According to some embodiments of the present invention, the method of inducing an immune response in an individual against an immunogen is to encode the protein of the present invention with the influenza strain H1N1 and the influenza strain H5N1 M1 protein and its functional fragment or its expressible coding sequence, And/or a recombinant vaccine encoding the protein of the present invention and/or a subunit vaccine comprising the protein of the present invention and/or a live attenuated vaccine and/or a killed vaccine. .

본 발명의 몇몇 양태에 따라서, 면역원에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법은 이러한 개체에게 인플루엔자 균주 H5N1 M2E-NP 단백질 및 그의 기능성 단편 또는 그의 발현 가능한 암호화 서열을, 본 발명의 단백질을 암호화하는 단리된 핵산 분자 및/또는 본 발명의 단백질을 암호화하는 재조합 백신 및/또는 본 발명의 단백질을 포함하는 소단위체 백신 및/또는 생 약독화 백신 및/또는 사멸 백신과 병용해서 투여하는 것을 포함한다.According to some embodiments of the present invention, a method of inducing an immune response in an individual against an immunogen comprises isolating an influenza strain H5N1 M2E-NP protein and a functional fragment thereof or an expressible coding sequence thereof to such an individual, encoding the protein of the invention And/or a recombinant vaccine encoding a nucleic acid molecule of the present invention and/or a protein of the present invention and/or a subunit vaccine comprising the protein of the present invention and/or a live attenuated vaccine and/or a death vaccine.

백신vaccine

본 발명은 단백질 및 단백질을 암호화하는 유전 구조물에, 그에 대하여 면역 반응을 유도시킬 수 있는 면역원으로서 특히 유효하도록 만드는 에피토프를 제공함으로써 개선된 백신을 제공한다. 따라서, 백신을 제공하여 치료적 또는 예방적 면역 반응을 유도시킬 수 있다. 몇몇 양태에서, 이러한 면역원을 전달하기 위한 수단은 DNA 백신, 재조합 백신, 단백질 소단위체 백신, 면역원을 포함하는 조성물, 약독화 백신 또는 사멸 백신이다. 몇몇 양태에서, 백신은 하나 이상의 DNA 백신, 하나 이상의 재조합 백신, 하나 이상의 단백질 소단위체 백신, 면역원을 포함하는 하나 이상의 조성물, 하나 이상의 약독화 백신 및 하나 이상의 사멸 백신으로 이루어진 군 중에서 선택된 복합물을 포함한다.The present invention provides an improved vaccine by providing a protein and an epitope that makes it particularly effective as an immunogen capable of inducing an immune response against the protein and the genetic construct encoding the protein. Thus, vaccines can be provided to elicit a therapeutic or prophylactic immune response. In some embodiments, the means for delivering such an immunogen is a DNA vaccine, a recombinant vaccine, a protein subunit vaccine, a composition comprising the immunogen, an attenuated vaccine or a killing vaccine. In some embodiments, the vaccine comprises a complex selected from the group consisting of one or more DNA vaccines, one or more recombinant vaccines, one or more protein subunit vaccines, one or more compositions comprising immunogens, one or more attenuated vaccines, and one or more killing vaccines. .

본 발명의 몇몇 양태에 따르면, 본 발명에 따르는 백신을 개체에게 전달하여 이러한 개체의 면역계의 활성을 조정함으로써 면역 반응을 증강시킬 수 있다. 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 개체의 세포에 의해 흡수되는 경우, 이러한 세포에서 뉴클레오티드 서열이 발현되고, 이로써 단백질이 개체에게 전달된다. 본 발명의 국면은 핵산 분자 (예: 플라스미드) 상의 단백질의 암호화 서열을 재조합 백신의 일부로서 및 약독화 백신의 일부로서, 벡터의 단리된 단백질 또는 단백질 일부로서 전달하는 방법을 제공한다.According to some embodiments of the present invention, the vaccine according to the present invention can be delivered to a subject to enhance the immune response by modulating the activity of the subject's immune system. When a nucleic acid molecule encoding a protein is taken up by a cell of an individual, the nucleotide sequence is expressed in such cells, whereby the protein is delivered to the individual. Aspects of the invention provide a method of delivering the coding sequence of a protein on a nucleic acid molecule (eg, a plasmid) as part of a recombinant vaccine and as part of an attenuated vaccine, as an isolated protein or protein part of a vector.

본 발명의 몇몇 국면에 따르면, 개체를 예방적 및/또는 치료적으로 면역시키는 조성물 및 방법이 제공된다.According to some aspects of the invention, compositions and methods are provided for prophylactically and/or therapeutically immunizing a subject.

DNA 백신은 미국 특허 제5,593,972호, 제5,739,118호, 제5,817,637호, 제5,830,876호, 제5,962,428호, 제5,981,505호, 제5,580,859호, 제5,703,055호, 제5,676.594호, 및 이에 인용된 우선권 출원 (이들 각각이 본원에 참고로 도입된다)에 기재되어 있다. 이들 출원에 기재된 전달 프로토콜 이외에도, DNA를 전달하기 위한 대체 방법이 미국 특허 제4,945,050호 및 제5,036,006호 (이들 각각이 본원에 참고로 도입된다)에 기재되어 있다.DNA vaccines include U.S. Patent Nos. 5,593,972, 5,739,118, 5,817,637, 5,830,876, 5,962,428, 5,981,505, 5,580,859, 5,703,055, 5,676.594, and priority applications cited therein (each of which Is incorporated herein by reference). In addition to the delivery protocols described in these applications, alternative methods for delivering DNA are described in US Pat. Nos. 4,945,050 and 5,036,006, each of which is incorporated herein by reference.

본 발명은 항원을 암호화하는 외래 유전자를 전달하기 위해 재조합 벡터를 사용하는 개선된 백신, 개선된 약독화 생 백신 및 개선된 사멸 백신 뿐만 아니라 소단위체 및 당단백질 백신에 관한 것이다. 약독화 생 백신, 외래 항원을 전달하기 위해 재조합 벡터를 사용하는 백신, 소단위체 백신 및 당단백질 백신은 미국 특허 제4,510,245호; 제4,797,368호; 제4,722,848호; 제4,790,987호; 제4,920,209호; 제5,017,487호; 제5,077,044호; 제5,110,587호; 제5,112,749호; 제5,174,993호; 제5,223,424호; 제5,225,336호; 제5,240,703호; 제5,242,829호; 제5,294,441호; 제5,294,548호; 제5,310,668호; 제5,387,744호; 제5,389,368호; 제5,424,065호; 제5,451,499호; 제5,453,364호: 제5,462,734호; 제5,470,734호; 제5,474,935호; 제5,482,713호; 제5,591,439호; 제5,643,579호; 제5,650,309호; 제5,698,202호; 제5,955,088호; 제6,034,298호; 제6,042,836호; 제6,156,319호 및 제6,589,529호 (이들 각각이 본원에 참고로 도입된다)에 기재되어 있다.The present invention relates to improved vaccines, improved live attenuated vaccines and improved killing vaccines, as well as subunit and glycoprotein vaccines using recombinant vectors to deliver foreign genes encoding antigens. Live attenuated vaccines, vaccines using recombinant vectors to deliver foreign antigens, subunit vaccines and glycoprotein vaccines are described in US Pat. 4,797,368; 4,797,368; 4,722,848; 4,722,848; 4,790,987; 4,790,987; 4,920,209; 5,017,487; 5,017,487; 5,077,044; 5,077,044; 5,110,587; 5,110,587; 5,112,749; 5,174,993; 5,174,993; 5,223,424; 5,225,336; 5,225,336; 5,240,703; 5,240,703; 5,242,829; 5,242,829; 5,294,441; 5,294,441; 5,294,548; 5,294,548; 5,310,668; 5,310,668; 5,387,744; 5,387,744; 5,389,368; 5,389,368; 5,424,065; 5,451,499; 5,451,499; 5,453,364: 5,462,734; 5,470,734; 5,470,734; 5,474,935; 5,482,713; 5,591,439; 5,591,439; 5,643,579; 5,643,579; 5,650,309; 5,698,202; 5,955,088; 6,034,298; 6,034,298; 6,042,836; 6,156,319 and 6,589,529, each of which is incorporated herein by reference.

세포에 의해 흡수되는 경우, 유전 구조물(들)은 기능성 염색체외 분자로서 세포에 여전히 존재할 수도 있고/있거나 세포의 염색체성 DNA 내로 통합될 수 있다. DNA를 세포 내로 도입할 수 있는데, 여기서 플라스미드(들)의 형태로 별개의 유전 물질로서 존재한다. 또 다른 한편, 염색체 내로 통합될 수 있는 선형 DNA가 세포 내로 도입될 수 있다. DNA를 세포 내로 도입하는 경우, 염색체 내로의 DNA 통합을 증진시키는 시약을 가할 수 있다. 통합을 증진시키는 데에 유용한 DNA 서열을 DNA 분자에 포함시킬 수도 있다. 또 다른 한편, RNA를 세포에 투여할 수 있다. 중심절 (centromere), 텔로미어 및 복제 기점을 포함한 선형 미니염색체로서 유전 구조물을 제공하는 것이 또한 고려된다. 유전자 구조물은 세포에 살아있는 약독화 생 미생물 또는 재조합 미생물 벡터에서 유전 물질의 일부로서 존재할 수 있다. 유전자 구조물은 재조합 바이러스성 백신의 게놈의 일부일 수 있는데, 여기서 유전 물질은 세포의 염색체 내로 통합되거나 여전히 염색체외이다. 유전 구조물은 핵산 분자의 유전자 발현에 필요한 조절성 요소를 포함한다. 이러한 요소에는 프로모터, 개시 코돈, 정지 코돈 및 폴리아데닐화 신호가 포함된다. 또한, 표적 단백질 또는 면역조절성 단백질을 암호화하는 서열의 유전자 발현에 종종 증강인자가 요구된다. 이들 요소가 목적 단백질을 암호화하는 서열과 작동적으로 연결되는 것이 필요하고, 조절성 요소가 이들이 투여된 개체에서 작동적인 것이 필요하다.When taken up by a cell, the genetic construct(s) may still exist in the cell as a functional extrachromosomal molecule and/or may be incorporated into the cell's chromosomal DNA. DNA can be introduced into cells, where it exists as a separate genetic material in the form of plasmid(s). On the other hand, linear DNA, which can be integrated into the chromosome, can be introduced into the cell. When introducing DNA into cells, reagents that enhance DNA integration into chromosomes can be added. DNA sequences useful for enhancing integration may also be included in the DNA molecule. On the other hand, RNA can be administered to the cells. It is also contemplated to provide genetic constructs as linear minichromosomes including centromeres, telomere and origins of replication. The genetic construct can exist as part of the genetic material in a live attenuated microorganism or recombinant microbial vector that is alive in the cell. The genetic construct may be part of the genome of a recombinant viral vaccine, where the genetic material is integrated into the chromosome of the cell or is still extrachromosomal. The genetic construct contains the regulatory elements necessary for gene expression of the nucleic acid molecule. These elements include promoters, start codons, stop codons and polyadenylation signals. In addition, enhancers are often required for gene expression of sequences encoding target proteins or immunoregulatory proteins. It is necessary that these elements are operatively linked with the sequence encoding the protein of interest, and that the regulatory elements are operative in the individual to which they are administered.

개시 코돈 및 정지 코돈은 일반적으로, 목적 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부인 것으로 간주된다. 그러나, 이들 요소가 유전자 구조물이 투여되는 개체에서 기능성인 것이 필요하다. 개시 및 종결 코돈은 암호화 서열과 동일 프레임 내에 있어야만 한다.The start and stop codons are generally considered to be part of the nucleotide sequence encoding the protein of interest. However, it is necessary that these elements are functional in the individual to which the genetic construct is administered. The start and stop codons must be in the same frame as the coding sequence.

사용된 프로모터 및 폴리아데닐화 신호는 개체의 세포 내에서 기능성이어야만 한다.The promoter and polyadenylation signal used must be functional within the individual's cells.

특히 인간에 대한 유전자 백신을 생성시키는 데에 있어서, 본 발명을 실시하는 데에 유용한 프로모터의 예에는 원숭이 바이러스 40 (SV40)로부터의 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스 (MV), 예를 들어 BIV 장 말단 반복 서열 (LTR) 프로모터, 몰로니 (Moloney) 바이러스, ALV, 시토메갈로바이러스 (CMV), 예를 들어 CMV 즉발형 프로모터, 엡슈타인 바르 (Epstein Barr) 바이러스 (EBV), 라우스 (Rous) 육종 바이러스 (RSV) 뿐만 아니라 인간 유전자, 예를 들어 인간 액틴 (Actin), 인간 미오신 (Myosin), 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 및 인간 메탈로티오네인으로부터의 프로모터가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.Examples of promoters useful in practicing the present invention, particularly in generating genetic vaccines for humans, include promoters from monkey virus 40 (SV40), mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, human immunodeficiency virus (MV ), e.g. BIV long terminal repeat sequence (LTR) promoter, Moloney virus, ALV, cytomegalovirus (CMV), e.g. CMV immediate promoter, Epstein Barr virus (EBV) , Rous sarcoma virus (RSV) as well as promoters from human genes such as human Actin, human Myosin, human hemoglobin, human muscle creatine and human metallothionein, Not limited.

특히 인간에 대한 유전자 백신을 생성시키는 데 있어서, 본 발명을 실시하는 데에 유용한 폴리아데닐화 신호의 예에는 SV40 폴리아데닐화 신호 및 LTR 폴리아데닐화 신호가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 특히, SV40 폴리아데닐화 신호로서 지칭된, pCEP4 플라스미드 (공급처: Invitrogen, San Diego CA) 내에 있는 SV40 폴리아데닐화 신호를 사용한다.Examples of polyadenylation signals useful in practicing the present invention, particularly in generating genetic vaccines for humans, include, but are not limited to, SV40 polyadenylation signals and LTR polyadenylation signals. In particular, the SV40 polyadenylation signal in the pCEP4 plasmid (Invitrogen, San Diego CA), referred to as the SV40 polyadenylation signal, is used.

DNA 발현에 요구되는 조절성 요소 이외에도, 기타 요소가 DNA 분자에 포함될 수도 있다. 이러한 부가의 요소에는 증강인자가 포함된다. 증강인자는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 및 바이러스성 증강인자, 예를 들어 CMV. RSV 및 EBV로부터의 증강인자 중에서 선택될 수 있다.In addition to the regulatory elements required for DNA expression, other elements may also be included in the DNA molecule. These additional elements include enhancers. Enhancers are human actin, human myosin, human hemoglobin, human muscle creatine and viral enhancers such as CMV. It can be selected among enhancers from RSV and EBV.

구조물을 염색체외적으로 유지시키고 구조물의 다수 카피를 세포에서 생성시키기 위해 유전 구조물에 포유류 복제 기점을 제공할 수 있다. 플라스미드 pVAX1, pCEP4 및 pREP4 [공급처: Invltrogen (San Diego, CA)]는 통합없이 고 카피 에피솜성 복제를 생성시키는 엡슈타인 바르 바이러스 복제 기점 및 핵 항원 EBNA-1 암호화 영역을 함유한다.Genetic constructs can be provided with mammalian origins of replication to maintain the construct extrachromosomally and to generate multiple copies of the construct in cells. Plasmids pVAX1, pCEP4 and pREP4 [source: Invltrogen (San Diego, CA)] contain an Epstein Barr virus origin of replication and a nuclear antigen EBNA-1 coding region that produces high copy episomal replication without integration.

면역 적용 분야에 관련된 몇몇 바람직한 양태에서는, 본 발명의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 부가적으로 이러한 표적 단백질에 대한 면역 반응을 추가로 증강시키는 단백질에 대한 유전자를 포함하는 핵산 분자(들)를 전달한다. 이러한 유전자의 예는 기타 사이토킨 및 림포카인, 예를 들어 알파-인터페론, 감마-인터페론, 혈소판 유래된 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-1O, IL-12, IL-18, MHC, CD80, CD86 및 IL-15 (신호 서열이 결실된 IL-15를 포함하고, 임의로 IgE로부터의 신호 펩티드를 포함한다)를 암호화하는 것이다. 유용할 수 있는 기타 유전자에는 다음을 암호화하는 것이 포함된다: MCP-1, MIP-1α, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-셀렉틴 (selectin), P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1 , MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이체 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 (Caspase) ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRCS, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 그의 기능성 단편.In some preferred embodiments related to the field of immune applications, nucleic acid molecule(s) comprising a nucleotide sequence encoding a protein of the invention, and additionally comprising a gene for a protein that further enhances an immune response against such target protein. To deliver. Examples of such genes include other cytokines and lymphokines, such as alpha-interferon, gamma-interferon, platelet derived growth factor (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, epidermal growth factor (EGF), IL-1 , IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-1O, IL-12, IL-18, MHC, CD80, CD86 and IL-15 (including IL-15 with a deleted signal sequence, and , Optionally including a signal peptide from IgE). Other genes that may be useful include those that encode: MCP-1, MIP-1α, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-selectin, P-selectin, E-selectin, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G- CSF, IL-4, mutant form of IL-18, CD40, CD40L, vascular growth factor, IL-7, nerve growth factor, vascular endothelial growth factor, Fas, TNF receptor, Flt, Apo-1, p55, WSL- 1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1 , Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, inactive NIK, SAP K, SAP-1, JNK, interferon response gene, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRCS, TRAIL-R3, TRAIL-R4 , RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 and functional fragments thereof.

어떠한 이유로 인해 유전 구조물이 투여된 세포를 제거하는 것이 요망되는 경우에는 세포 붕괴를 위한 표적으로서 제공되는 부가의 요소를 가할 수 있다. 발현 가능한 형태의 헤르페스 티미딘 키나제 (tk) 유전자를 유전 구조물에 포함시킬 수 있다. 약물 강시클로비르 (gangcyclovir)를 개체에게 투여할 수 있고, 이러한 약물은 모든 세포 생성성 tk를 선택적으로 사멸시키므로, 유전 구조물을 이용하여 세포를 선택적으로 붕괴시키기 위한 수단을 제공할 것이다.If for some reason it is desired to remove the cells to which the genetic construct has been administered, an additional factor can be added that serves as a target for cell disruption. The herpes thymidine kinase (tk) gene in an expressible form can be included in the genetic construct. The drug gangcyclovir can be administered to an individual, and since this drug selectively kills all cytogenic tk, it will provide a means to selectively disrupt cells using genetic constructs.

단백질 생성을 최대화하기 위해, 구조물을 투여한 세포 내에서의 유전자 발현에 매우 적합한 조절성 서열을 선별할 수 있다. 더우기, 세포에서 가장 효율적으로 전사되는 코돈을 선별할 수 있다. 당업자는 세포에서 기능성인 DNA 구조물을 생성시킬 수 있다.In order to maximize protein production, a highly suitable regulatory sequence for gene expression in cells to which the construct has been administered can be selected. Moreover, it is possible to select the codons that are most efficiently transcribed in cells. One of skill in the art can create DNA constructs that are functional in cells.

몇몇 양태에서는, 본원에 기재된 단백질에 대한 암호화 서열을 IgE 신호 펩티드와 연결시킨 유전자 구조물을 제공할 수 있다. 몇몇 양태에서는, 본원에 기재된 단백질을 IgE 신호 펩티드와 연결시킨다.In some embodiments, a genetic construct can be provided in which the coding sequence for a protein described herein is linked with an IgE signal peptide. In some embodiments, the proteins described herein are linked with an IgE signal peptide.

예를 들어, 단백질을 사용하는 몇몇 양태에서는, 당업자가 널리 공지된 기술을 사용하여 본 발명의 단백질을 생성 및 단리시킬 수 있다. 예를 들어, 단백질을 사용하는 몇몇 양태에서는, 당업자가 널리 공지된 기술을 사용하여 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA 분자를, 널리 공지된 발현 시스템에서 사용하기 위한 시판용 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다. 예를 들어, 시판용 플라스미드 pSE420 (공급처: Invitrogen, San Diego, Calif.)는 이. 콜라이 (E. coli)에서 단백질을 생성시키기 위해 사용할 수 있다. 시판용 플라스미드 pYES2 (공급처: Invitrogen, San Diego, Calif.)는, 예를 들어 효모의 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae) 균주에서의 생성을 위해 사용할 수 있다. 시판용 플라스미드 MAXBAC™ 완전 바쿨로바이러스 (baculovirus) 발현 시스템 (공급처: Invitrogen. San Diego, Calif.)은, 예를 들어 곤충 세포에서의 생성을 위해 사용할 수 있다. 시판용 플라스미드 pcDNA1 또는 pcDNA3 (공급처: Invitrogen, San Diego, Calif.)은, 예를 들어 포유류 세포, 예를 들면 중국산 햄스터 난소 세포에서의 생성을 위해 사용할 수 있다. 당업자는 이들 시판용 발현 벡터 및 시스템 등을 사용하여, 통상적인 기술 및 용이하게 입수 가능한 출발 물질에 의해 단백질을 생성시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989); 본원에 참고로 도입된다]. 따라서, 목적하는 단백질은 원핵 시스템과 진핵 시스템 둘 다에서 제조하여, 특정 스펙트럼의 프로세싱된 형태의 단백질을 생성시킬 수 있다.For example, in some embodiments using proteins, one of skill in the art can generate and isolate the proteins of the invention using well-known techniques. For example, in some embodiments using proteins, those skilled in the art can insert DNA molecules encoding the proteins of the invention into commercially available expression vectors for use in well known expression systems using well known techniques. For example, the commercially available plasmid pSE420 (supplier: Invitrogen, San Diego, Calif.) is E. It can be used to produce proteins in E. coli. Commercially available plasmid pYES2 (supplier: Invitrogen, San Diego, Calif.) is, for example, S. It can be used for production in S. cerevisiae strains. The commercially available plasmid MAXBAC™ complete baculovirus expression system (Invitrogen. San Diego, Calif.) can be used, for example, for production in insect cells. Commercially available plasmids pcDNA1 or pcDNA3 (supplier: Invitrogen, San Diego, Calif.) can be used, for example, for production in mammalian cells, such as Chinese hamster ovary cells. Those skilled in the art can use these commercially available expression vectors and systems and the like to produce proteins by conventional techniques and readily available starting materials [See, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Secondary Ed. Cold Spring Harbor Press (1989); Incorporated herein by reference]. Thus, the protein of interest can be produced in both prokaryotic and eukaryotic systems, resulting in a specific spectrum of processed forms of the protein.

당업자는 기타 시판용 발현 벡터 및 시스템을 사용할 수 있거나 또는 널리 공지된 방법 및 용이하게 입수 가능한 출발 물질을 사용하여 벡터를 생성시킬 수 있다. 필수 제어 서열, 예를 들어 프로모터 및 폴리아데닐화 신호, 및 바람직하게는 증강인자를 함유하는 발현 시스템은 각종 숙주에 대해 용이하게 입수 가능하고 당해 분야에 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)]. 유전 구조물은 이러한 구조물로 형질감염시킨 세포주에서 기능성인 프로모터와 작동적으로 연결된 단백질 암호화 서열을 포함한다. 구성성 프로모터의 예에는 시토메갈로바이러스 또는 SV40으로부터의 프로모터가 포함된다. 유도성 프로모터의 예에는 마우스 유방 백혈병 바이러스 또는 메탈로티오네인 프로모터가 포함된다. 당업자는 용이하게 입수 가능한 출발 물질로부터 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA를 수반한 세포로 형질감염시키는 데에 유용한 유전 구조물을 용이하게 생성시킬 수 있다. 상기 단백질을 암호화하는 DNA를 포함한 발현 벡터를 사용하여 화합성 숙주를 형질전환시킨 다음, 이를 외래 DNA의 발현이 일어나는 조건 하에 배양 및 유지시킨다.One of skill in the art may use other commercially available expression vectors and systems, or may generate vectors using well known methods and readily available starting materials. Expression systems containing essential control sequences, such as promoters and polyadenylation signals, and preferably enhancers, are readily available and known in the art for a variety of hosts. See, for example, Sambrook et al. al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)]. The genetic construct contains a protein coding sequence operably linked to a promoter that is functional in cell lines transfected with such constructs. Examples of constitutive promoters include promoters from cytomegalovirus or SV40. Examples of inducible promoters include mouse mammary leukemia virus or metallothionein promoters. One of skill in the art can readily generate genetic constructs useful for transfecting cells with DNA encoding the proteins of the invention from readily available starting materials. A compatible host is transformed using an expression vector containing DNA encoding the protein, and then cultured and maintained under conditions in which foreign DNA expression occurs.

이로써 생성된 단백질은 세포를 용해시킴으로써 배양물로부터 회수하거나 또는 당해 분야에 공지되고 적당한 바 대로 배양 배지로부터 회수한다. 당업자는 널리 공지된 기술을 사용하여 상기 발현 시스템을 사용하여 생성되는 단백질을 단리시킬 수 있다. 상기 언급된 바와 같은 특이적 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 천연 공급원으로부터 단백질을 정제하는 방법은 재조합 DNA 방법론에 의해 생성된 단백질을 정제하는 데에도 동등하게 적용할 수 있다.The protein thus produced is recovered from the culture by lysing the cells or from the culture medium as known and appropriate in the art. One of skill in the art can use well known techniques to isolate the protein produced using the expression system. The method of purifying a protein from a natural source using an antibody that specifically binds to a specific protein as mentioned above is equally applicable to purifying a protein produced by recombinant DNA methodology.

재조합 기술에 의해 단백질을 생성시키는 것 이외에도, 자동화 펩티드 합성기를 또한 이용하여 단리되고 본질적으로 순수한 단백질을 생성시킬 수 있다. 이러한 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 치환이 있는 유도체가 DNA-암호화된 단백질 생성에서 제공되지 않는 경우에 유용하다.In addition to producing proteins by recombinant techniques, automated peptide synthesizers can also be used to produce isolated and essentially pure proteins. Such techniques are well known to those of skill in the art and are useful where derivatives with substitutions are not provided in the production of DNA-encoded proteins.

핵산 분자를 널리 공지된 몇 가지 기술, 예를 들어 DNA 주사 (DNA 백신접종으로서 지칭되기도 함), 재조합 벡터, 예를 들어 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노바이러스 관련 바이러스 및 재조합 백시니아를 사용하여 전달할 수 있다.Nucleic acid molecules can be delivered using several well-known techniques, such as DNA injection (also referred to as DNA vaccination), recombinant vectors, such as recombinant adenovirus, recombinant adenovirus related virus and recombinant vaccinia. .

투여 경로에는 근육내, 비내, 복강내, 피내, 피하, 정맥내, 동맥내, 안내 및 경구 뿐만 아니라 국부, 경피, 흡입 또는 좌제 또는 점막 조직, 예를 들어 질, 직장, 요도, 볼 및 설하 조직에 대한 세정에 의한 경로가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 바람직한 투여 경로에는 근육내, 복강내, 피내 및 피하 주사가 포함된다. 유전 구조물은 전통적인 주사기, 바늘이 없는 주사 장치, 또는 "미소발사체 충격 유전자 총"을 포함하지만, 그에 제한되지 않는 수단에 의해 투여할 수 있다.Routes of administration include intramuscular, intranasal, intraperitoneal, intradermal, subcutaneous, intravenous, intraarterial, intraocular and oral, as well as local, transdermal, inhaled or suppository or mucosal tissues such as vaginal, rectal, urethral, buccal and sublingual tissue The route by washing for is included, but is not limited thereto. Preferred routes of administration include intramuscular, intraperitoneal, intradermal and subcutaneous injection. Genetic constructs can be administered by means including, but not limited to, traditional syringes, needleless injection devices, or “microprojectile impact gene guns”.

몇몇 양태에서, 핵산 분자는 폴리뉴클레오티드 기능 증강인자 또는 유전자 백신 촉진제의 투여와 연계해서 세포에 전달한다. 폴리뉴클레오티드 기능 증강인자는 미국 특허 제5,593,972호, 제5,962,428호 및 국제특허출원 PCT/US94/00899 (1994년 1월 26일자로 출원됨) (이들 각각이 본원에 참고로 도입된다)에 기재되어 있다. 유전자 백신 촉진제는 미국 특허원 제021,579호 (1994년 4월 1일자로 출원됨) (본원에 참고로 도입된다)에 기재되어 있다. 핵산 분자와 연계해서 투여되는 공동-작용제는 핵산 분자와의 혼합물로서 투여할 수 있거나, 또는 핵산 분자를 투여하는 것과 동시에, 투여하기 전 또는 후에 별개로 투여할 수 있다. 또한, 형질감염제 및/또는 복제성 작용제 및/또는 염증제로서 기능할 수 있고 GVF와 공동 투여될 수 있는 기타 작용제에는 성장 인자, 사이토킨 및 림포카인, 예를 들어 α-인터페론, 감마-인터페론, GM-CSF, 혈소판 유래된 성장 인자 (PDGF), TNF, 표피 성장 인자 (EGF), IL-1 IL-2, IL-4, IL-6, IL-1O, IL-12 및 IL-15 뿐만 아니라 섬유아세포 성장 인자, 표면 활성제, 예를 들어 면역-자극성 복합체 (ISCOMS), 프로인트 (Freunds) 완전 아주반트, LPS 유사체 [모노포스포릴 지질 A (WL) 포함], 무라밀 펩티드, 퀴논 유사체 및 소포체, 예를 들어 스쿠알렌이 포함되고, 히알루론산을 유전 구조물과 연계해서 투여할 수도 있다. 몇몇 양태에서, 면역조정성 단백질을 GVF로서 사용할 수 있다. 몇몇 양태에서는, 핵산 분자를 PLG와 연합해서 제공하여 전달/흡수를 증강시킨다.In some embodiments, the nucleic acid molecule is delivered to the cell in connection with the administration of a polynucleotide enhancer or gene vaccine promoter. Polynucleotide function enhancers are described in U.S. Patent Nos. 5,593,972, 5,962,428 and International Patent Application PCT/US94/00899 (filed Jan. 26, 1994), each of which is incorporated herein by reference. . Genetic vaccine promoters are described in U.S. Patent Application No. 021,579, filed April 1, 1994, incorporated herein by reference. Co-agents administered in association with the nucleic acid molecule may be administered as a mixture with the nucleic acid molecule, or may be administered separately at the same time as, before or after administration of the nucleic acid molecule. In addition, other agents that may function as transfectants and/or replication agents and/or inflammatory agents and that may be co-administered with GVF include growth factors, cytokines and lymphokines, such as α-interferon, gamma-interferon, GM-CSF, platelet derived growth factor (PDGF), TNF, epidermal growth factor (EGF), IL-1 IL-2, IL-4, IL-6, IL-1O, IL-12 and IL-15, as well as Fibroblast growth factor, surface active agents, such as immuno-stimulatory complexes (ISCOMS), Freunds complete adjuvant, LPS analogs [including monophosphoryl lipid A (WL)], muramyl peptides, quinone analogs and endoplasmic reticulum , For example, squalene is included, and hyaluronic acid can also be administered in association with genetic constructs. In some embodiments, immunomodulatory proteins can be used as GVF. In some embodiments, nucleic acid molecules are provided in association with PLG to enhance delivery/uptake.

본 발명에 따르는 제약 조성물은 약 1 나노그램 내지 약 2000 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 몇몇 바람직한 양태에서, 본 발명에 따르는 제약 조성물은 약 5 나노그램 내지 약 1000 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 몇몇 바람직한 양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 약 10 나노그램 내지 약 800 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 몇몇 바람직한 양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 약 0.1 내지 약 500 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 몇몇 바람직한 양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 약 1 내지 약 350 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 몇몇 바람직한 양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 약 25 내지 약 250 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 몇몇 바람직한 양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 약 100 내지 약 200 마이크로그램의 DNA를 포함한다.Pharmaceutical compositions according to the invention comprise from about 1 nanogram to about 2000 micrograms of DNA. In some preferred embodiments, pharmaceutical compositions according to the invention comprise from about 5 nanograms to about 1000 micrograms of DNA. In some preferred embodiments, the pharmaceutical compositions of the invention comprise from about 10 nanograms to about 800 micrograms of DNA. In some preferred embodiments, the pharmaceutical composition of the present invention comprises about 0.1 to about 500 micrograms of DNA. In some preferred embodiments, the pharmaceutical composition of the present invention comprises about 1 to about 350 micrograms of DNA. In some preferred embodiments, the pharmaceutical composition of the present invention comprises about 25 to about 250 micrograms of DNA. In some preferred embodiments, the pharmaceutical composition of the present invention comprises about 100 to about 200 micrograms of DNA.

본 발명에 따르는 제약 조성물은 사용될 투여 방식에 따라서 제형화한다. 제약 조성물이 주사가능한 제약 조성물인 경우, 이는 멸균성이고, 발열원을 함유하지 않고 미립자를 함유하지 않는다. 등장성 제형을 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 등장성을 위한 첨가제에는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 솔비톨 및 락토스가 포함될 수 있다. 몇몇 경우에, 등장성 용액, 예를 들어 인산염 완충 식염수가 바람직하다. 안정화제에는 젤라틴 및 알부민이 포함된다. 몇몇 양태에서는, 혈관 수축제를 제형에 가한다.The pharmaceutical composition according to the present invention is formulated according to the mode of administration to be used. When the pharmaceutical composition is an injectable pharmaceutical composition, it is sterile, contains no pyrogen and contains no particulates. It is preferred to use an isotonic formulation. In general, additives for isotonicity may include sodium chloride, dextrose, mannitol, sorbitol and lactose. In some cases, isotonic solutions, such as phosphate buffered saline, are preferred. Stabilizing agents include gelatin and albumin. In some embodiments, a vasoconstrictor is added to the formulation.

본 발명의 몇몇 양태에 따르면, 면역 반응의 유도 방법이 제공된다. 백신은 단백질에 의거한 생 약독화 백신, 세포 백신, 재조합 백신 또는 핵산 또는 DNA 백신일 수 있다. 몇몇 양태에서, 면역원에 대해 개체에서 면역 반응을 유도시키는 방법 (이에는 점막 면역 반응을 유도시키는 방법이 포함된다)은 개체에게 CTACK 단백질, TECK 단백질, MEC 단백질 및 그의 기능성 단편 또는 그의 발현 가능한 암호화 서열 중의 하나 이상을, 본 발명의 단백질을 암호화하는 단리된 핵산 분자 및/또는 본 발명의 단백질을 암호화하는 재조합 백신 및/또는 본 발명의 단백질을 포함하는 소단위체 백신 및/또는 생 약독화 백신 및/또는 사멸 백신과 병용해서 투여하는 것을 포함한다. CTACK 단백질, TECK 단백질, MEC 단백질 및 그의 기능성 단편 중의 하나 이상은 면역원을 암호화하는 단리된 핵산 분자 및/또는 면역원을 암호화하는 재조합 백신 및/또는 면역원을 포함하는 소단위체 백신 및/또는 생 약독화 백신 및/또는 사멸 백신을 투여하기 전에, 동시에 또는 후에 투여할 수 있다. 몇몇 양태에서, CTACK, TECK, MEC 및 그의 기능성 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 단백질을 암호화하는 단리된 핵산 분자를 개체에게 투여한다.According to some aspects of the present invention, a method of inducing an immune response is provided. The vaccine may be a protein-based live attenuated vaccine, a cellular vaccine, a recombinant vaccine or a nucleic acid or DNA vaccine. In some embodiments, a method of inducing an immune response in an individual against an immunogen (which includes a method of inducing a mucosal immune response) is a CTACK protein, a TECK protein, a MEC protein and a functional fragment thereof, or an expressible coding sequence thereof. At least one of, an isolated nucleic acid molecule encoding a protein of the present invention and/or a recombinant vaccine encoding a protein of the present invention and/or a subunit vaccine comprising a protein of the present invention and/or a live attenuated vaccine and/or Or it includes administering it in combination with a death vaccine. At least one of CTACK protein, TECK protein, MEC protein and functional fragments thereof is an isolated nucleic acid molecule encoding an immunogen and/or a recombinant vaccine encoding an immunogen and/or a subunit vaccine comprising an immunogen and/or a live attenuated vaccine. And/or the killing vaccine may be administered before, simultaneously or after administration. In some embodiments, an isolated nucleic acid molecule encoding one or more proteins selected from the group consisting of CTACK, TECK, MEC, and functional fragments thereof is administered to the subject.

[[ 실시예Example ]]

실시예 1Example 1

재료 및 방법Materials and methods

HIV-1 아형 B 외막 서열. HIV-1 아형 B 컨센서스 외막 서열을 생성시키기 위해, 11개 국가로부터 수집한 42개 아형 B 외막 유전자 서열을 유전자은행으로부터 선별하여 샘플링 바이어스 (sampling bias)를 피하였다. 각 서열은 상이한 환자를 나타낸다. 사용된 모든 서열은 비-재조합이다.HIV-1 subtype B outer membrane sequence. To generate the HIV-1 subtype B consensus outer membrane sequence, 42 subtype B outer membrane gene sequences collected from 11 countries were selected from the Genbank to avoid sampling bias. Each sequence represents a different patient. All sequences used are non-recombinant.

다중 정렬. 계통발생학적 연구에 적용된 정렬 과정은 클러스탈 (Clustal) X (버전 1.81) [참고: Thompson, J. D., et al. 1997. The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research 25:4876-4882]의 적용을 포함하였다. 갭 개구 페널티로서 10을 사용하고 갭 연장 페널티로서 0.1을 사용하여, 쌍을 이룬 정렬 파라미터를 동적 "저속-정밀" 프로그래밍에 설정하였다. 다중 정렬 파라미터는 0.2의 갭 연장 페널티를 포함하였다.Multiple sort. The alignment process applied to the phylogenetic study is Cluster X (version 1.81) [Reference: Thompson, J. D., et al. 1997. The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research 25:4876-4882]. Using 10 as the gap opening penalty and 0.1 as the gap extension penalty, the paired alignment parameters were set in dynamic "slow-precision" programming. Multiple alignment parameters included a gap extension penalty of 0.2.

HIV-1 아형 B 외막 컨센서스 서열의 구축. HIV-1 아형 B 외막 컨센서스 뉴클레오티드 서열은 다중 정렬과 소수의 (minor) 최종 수동 조정을 수행한 후에 수득하였다. 추론된 아미노산 서열을 사용하여 정렬 갭의 도입을 안내하여 이들이 코돈 사이에 삽입되도록 하였다. 컨센서스 뉴클레오티드 서열을 해독함으로써, 컨센서스 아미노산 서열을 수득하였다.Construction of the HIV-1 subtype B outer membrane consensus sequence. The HIV-1 subtype B outer membrane consensus nucleotide sequence was obtained after performing multiple alignments and minor final manual adjustments. The inferred amino acid sequence was used to guide the introduction of alignment gaps so that they were inserted between codons. By decoding the consensus nucleotide sequence, a consensus amino acid sequence was obtained.

계통발생학적 트리. 아미노산 계통발생학적 트리 구축을 위해, 프로그램 PAUP* 4.Ob1O [Swofford, D. L. 1999. PAUP* 4.0: 단순성을 이용한 계통발생학적 분석 (* 및 기타 방법), 버전 4.0b2a. Sinauer Associates, Inc., Sunderiand, Mass.]을 사용하여 이웃 결합법 (NJ)을 이용하였다. 아형 D로부터의 2개의 부가 서열 (K03454 및 AAA44873) 및 아형 C로부터의 2개 서열 (AAD12103 및 AAD12112)은 발근 (rooting)을 위한 외집단으로서 사용하였다 [참고: Kuiken, C., B. T. Korber, and R. W. Shafer. 2003. HIV sequence databases. AIDS Rev. 5:52-61].Phylogenetic tree. For constructing amino acid phylogenetic trees, the program PAUP* 4.Ob10 [Swofford, D. L. 1999. PAUP* 4.0: Phylogenetic analysis using simplicity (* and other methods), version 4.0b2a. Sinauer Associates, Inc., Sunderiand, Mass.] was used to use the neighbor bonding method (NJ). Two additional sequences from subtype D (K03454 and AAA44873) and two sequences from subtype C (AAD12103 and AAD12112) were used as subpopulations for rooting (see Kuiken, C., BT Korber, and RW). Shafer. 2003. HIV sequence databases. AIDS Rev. 5:52-61].

HIV-1 아형 B 외막 컨센서스 서열의 변형. HIV-1 아형 B 컨센서스 외막 서열을 수득한 후에 몇 가지 변형을 수행하였다: 고도로 가변적인 V1 및 V2 영역을 단축시키고, CCR5 활용을 위해 V3 루프를 설계하며, 세포질성 미부 영역을 C-말단으로부터 제거하고, 리더 서열 및 상류 코작 (Kozak) 서열을 N-말단에 가하며, 유전자최적화기 [GeneOptimizer™ (GENEART, Germany)]를 사용함으로써 코돈 최적화 및 RNA 최적화를 수행하였다.Modification of the HIV-1 subtype B outer membrane consensus sequence. Several modifications were made after obtaining the HIV-1 subtype B consensus outer membrane sequence: shorten the highly variable V1 and V2 regions, design the V3 loop for CCR5 utilization, and remove the cytoplasmic tail region from the C-terminus. Then, a leader sequence and an upstream Kozak sequence were added to the N-terminus, and codon optimization and RNA optimization were performed by using a gene optimizer [GeneOptimizer™ (GENEART, Germany)].

외막 면역원. 변형된 HIV-1 아형 B 초기 전달자 컨센서스 외막 당단백질을 암호화하는 유전자 (EY2E1-B)를 합성하고 GENEART에 의해 서열 검증하였다. 이와 같이 합성된 EY2E1-B를 BamHI 및 NotI로 분해시키고, 시토메갈로바이러스 즉발형 프로모터의 제어 하에 발현 벡터 pVAX (공급처: Invitrogen) 내로 클로닝하고, 이 구조물을 pEY2E1-B로서 명명하였다.Adventitial immunogen. A gene encoding a modified HIV-1 subtype B early transducer consensus outer membrane glycoprotein (EY2E1-B) was synthesized and sequence verified by GENEART. The thus synthesized EY2E1-B was digested with BamHI and NotI, and cloned into the expression vector pVAX (Supplier: Invitrogen) under the control of a cytomegalovirus immediate promoter, and this construct was named pEY2E1-B.

인간 코돈 바이어스된 일차 아형 B 단리물 6101 gp140 외막 유전자 [증정자: M. Sidhm (Wyeth)]로부터 일차 아형 B 면역원 (EK2P-B)을 생성시켰다. 기본적으로, 최적화시킨 6101 외막 유전자는 천연 리더 서열과 세포질성 미부를 제거함으로써 돌연변이시켰다. 이어서, 다음 정배향 및 역배향 특이적-프라이머를 설계함으로써 IgE-리더 서열 및 코작 서열을 도입하였다:

Figure 112014122239615-pat00001
정제된 PCR 생성물을 pVAX 플라스미드 벡터 내로 클로닝하고, 이를 또한 EcoRI 및 XbaI로 선형화하였다. 이 구조물은 pEK2P-B로서 명명되었다.The primary subtype B immunogen (EK2P-B) was generated from the human codon biased primary subtype B isolate 6101 gp140 outer membrane gene [donor: M. Sidhm (Wyeth)]. Basically, the optimized 6101 outer membrane gene was mutated by removing the native leader sequence and cytoplasmic tail. The IgE-leader sequence and Kozak sequence were then introduced by designing the following forward and reverse specific-primers:
Figure 112014122239615-pat00001
The purified PCR product was cloned into the pVAX plasmid vector, which was also linearized with EcoRI and XbaI. This construct was named pEK2P-B.

EY2E1-B의 생체내 발현 및 EY2E1-B와 모노클로날 항체와의 반응성. 인간 횡문근육종 (RD) 세포 (2 X 106개)는 FuGENE 6 형질감염 시약 (공급처: Roche, Germany)를 사용하여 각각 3 □g의 pEY2E1-B 및 pEK2P-B 플라스미드로 60 mm 디쉬에서 형질감염시켰다. 형질감염시킨지 48시간 후, 세포를 1 x PBS로 3회 세척하고, 150 ㎕의 용해 완충액 (공급처: Cell Signaling Technology)에서 용해시켰다. 총 단백질 용해물 (50 ㎍)을 SDS-PAGE 겔 상에서 분획하고, PVDF 막 (공급처: Amersham)으로 옮겼다. 외막-특이적 모노클로날 항체 2G12 (공급처: NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Rockville, MD, USA) 및 모노클로날 항-액틴 항체 (공급처: Sigma-Aldrich)를 이용하여 면역블롯 분석을 수행하고, ECLTM 웨스턴 블롯 분석 시스템 (공급처: Amersham)을 사용하여 HRP-접합된 염소 항-인간 IgG (공급처: Sigma-Aldrich)로 가시화하였다. 액틴을 웨스턴 블롯에 대한 부하 대조군으로서 사용하였다.In vivo expression of EY2E1-B and reactivity of EY2E1-B with monoclonal antibodies. Human rhabdomyosarcoma (RD) cells (2 X 10 6 ) were transfected in 60 mm dishes with 3 g of pEY2E1-B and pEK2P-B plasmids, respectively, using FuGENE 6 transfection reagent (source: Roche, Germany). Made it. 48 hours after transfection, the cells were washed 3 times with 1×PBS and lysed in 150 μl of lysis buffer (Source: Cell Signaling Technology). Total protein lysate (50 μg) was fractionated on an SDS-PAGE gel and transferred to a PVDF membrane (Amersham). Immunoblot analysis was performed using an outer membrane-specific monoclonal antibody 2G12 (supplier: NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Rockville, MD, USA) and a monoclonal anti-actin antibody (Sigma-Aldrich). , Visualization with HRP-conjugated goat anti-human IgG (Sigma-Aldrich) using the ECLTM Western Blot Analysis System (Amersham). Actin was used as a load control for Western blot.

EY2E1-B와 모노클로날 항체와의 반응성을 탐지하기 위하여, 형질감염으로부터의 총 단백질 용해물 (100 ㎍)을, 2G12, 4G10 및 ID6 (공급처: NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Rockville, MD, USA)을 포함한 5 ㎍ 외막-특이적 모노클로날 항체로 면역침전시켰다. 빈 (empty) 벡터 pVAX로 형질감염시킨 세포로부터의 동일한 양의 총 단백질 용해물을 음성 대조군으로서 사용하였다. 면역침전시킨 단백질을 SDS-PAGE 겔 상에서 분획화하고 상기 언급된 바와 같이 웨스턴 블롯팅함으로써 탐지하였다.In order to detect the reactivity of EY2E1-B with the monoclonal antibody, total protein lysates (100 μg) from transfection were prepared from 2G12, 4G10 and ID6 (source: NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Rockville, MD, USA) were immunoprecipitated with 5 μg outer membrane-specific monoclonal antibody. The same amount of total protein lysate from cells transfected with the empty vector pVAX was used as a negative control. The immunoprecipitated proteins were fractionated on an SDS-PAGE gel and detected by western blotting as mentioned above.

간접 면역형광성 검정. EY2E1-B 및 EK2P-B 유전자의 발현을 확인하기 위한 간접 면역형광성 검정을 수행하였다. 인간 횡문근육종 (RD) 세포를, 그 다음날 10％ FBS (GIBCO)을 수반한 완전 DMEM 배지에서 60 내지 70％ 융합도를 수득하기 위한 밀도로 조직 배양 챔버 슬라이드 (공급처: BD Biosciences)에 도말하고, 밤새 부착시켜 두었다. 그 다음날, 제조업자의 지시에 따라서 FuGENE 6 형질감염 시약 (공급처: Roche)을 사용하여 pEY2E1-B, pEK2P-B 및 대조군 플라스미드 pVAX (1 ㎍/웰)로 형질감염시켰다. 형질감염시킨지 48시간 후, 세포를 찬 1 X PBS로 2회 세척하고, 15분 동안 메탄올을 이용하여 슬라이드 상에 고정시켰다. 이 슬라이드로부터 잔류 용매를 제거할 때, 세포를 항-마우스 HIV-1 env 모노클로날 F105 (공급처: NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Rockville. MD, USA)와 함께 90분 동안 항온 배양하였다. 이어서, 슬라이드를 TRITC-접합된 이차 항체 (공급처: Sigma-Aldrich)와 함께 45분 동안 항온 배양하였다. 4',6-디아미도-2-페닐인돌 히드로클로라이드 (공급처: Sigma-Aldrich)를 이차 항체 용액에 가하여 핵을 대비염색시켜 소정의 분야에서 입수 가능한 세포 총 수의 핵을 나타내었다. 슬라이드를 페이딩방지 (antifading) 시약 (공급처: Molecular Probes)을 함유하는 봉입제로 고정시켰다. 형광 현미경에 대한 상 3 프로 프로그램 (공급처: Media Cybernetics)를 사용하여 영상을 분석하였다.Indirect immunofluorescence assay. An indirect immunofluorescence assay was performed to confirm the expression of the EY2E1-B and EK2P-B genes. Human rhabdomyosarcoma (RD) cells were plated on tissue culture chamber slides (source: BD Biosciences) at a density to obtain 60-70% degree of fusion in complete DMEM medium with 10% FBS (GIBCO) the next day, It was left attached overnight. The next day, it was transfected with pEY2E1-B, pEK2P-B and control plasmid pVAX (1 μg/well) using FuGENE 6 transfection reagent (source: Roche) according to the manufacturer's instructions. 48 hours after transfection, the cells were washed twice with cold 1 X PBS and fixed on slides using methanol for 15 minutes. When removing residual solvent from this slide, the cells were incubated for 90 minutes with anti-mouse HIV-1 env monoclonal F105 (source: NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Rockville. MD, USA). The slides were then incubated for 45 minutes with a TRITC-conjugated secondary antibody (Sigma-Aldrich). Nuclei were counter-stained by adding 4',6-diamido-2-phenylindole hydrochloride (supplier: Sigma-Aldrich) to the secondary antibody solution to reveal the total number of nuclei available in a given field. The slides were fixed with an inclusion agent containing an antifading reagent (Molecular Probes). Images were analyzed using the Phase 3 Pro program for fluorescence microscopy (Media Cybernetics).

외막-특이적 항체 결정. 외막에 대해 특이적인 IgG 항체 측정을 면역시킨 마우스와 대조군 마우스 둘 다에서 ELISA (효소 결합 면역흡착 검정)에 의해 수행하였다. 눈크-임뮤노 (Nunc-Immuno™) 판 (공급처: Nalge Nunc International, Rochester, NY)을 1 ㎍/ml의 분기군 B 재조합 HIV-1 IIIB 당단백질 가용성 gpl60 (공급처: Immuno Diagnostics, MA), 분기군 A/E 일차 외막 단백질 HIV-1 93TH975 gpl20 및 분기군 C 일차 외막 단백질 HIV-1 96ZM651 gpl20 (공급처: NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Rockville, MD, USA)으로 각각 피복시키고, 실온 하에 밤새 항온 배양하였다. 세척 후, 판을 37℃ 하에 1시간 동안 PBST (1 x PBS + 0.05％ Tween-20) 중의 3％ BSA로 차단시켰다. 이어서, 판을 다시 세척하고, 특이적 마우스 혈청과 함께 항온 배양하며, 4℃ 하에 밤새 PBST 중의 3％ BSA로 희석시킨 다음, 37℃ 하에 1시간 동안 1/10,000 희석률의 HRP-접합된 염소 항-마우스 IgG (공급처: Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)와 함께 항온 배양하였다. 반응물을 기질 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) (공급처: Sigma-Aldrich)로 전개시켰다. 웰당 100 ㎕의 2.5 M 황산을 이용하여 반응을 중지시키고, 판을 450 nm의 OD 하에 EL8O8 판 판독기 (공급처: Biotech Instrument Inc.) 상에서 판독하였다.Outer membrane-specific antibody determination. Measurements of IgG antibodies specific to the outer membrane were performed by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) in both immunized and control mice. Nunc-Immuno™ plates (supplier: Nalge Nunc International, Rochester, NY) were placed at 1 μg/ml of clade B recombinant HIV-1 IIIB glycoprotein soluble gpl60 (source: Immuno Diagnostics, MA), branched Group A/E primary outer membrane protein HIV-1 93TH975 gpl20 and clade C primary outer membrane protein HIV-1 96ZM651 gpl20 (source: NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Rockville, MD, USA), respectively, and incubated overnight at room temperature Cultured. After washing, the plates were blocked with 3% BSA in PBST (1 x PBS + 0.05% Tween-20) for 1 hour at 37°C. The plates are then washed again, incubated with specific mouse serum, diluted with 3% BSA in PBST at 4° C. overnight, and then 1/10,000 dilution of HRP-conjugated goat antisense at 37° C. for 1 hour. -Incubated with mouse IgG (supplier: Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). The reaction was developed with the substrate TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) (Sigma-Aldrich). The reaction was stopped using 100 μl of 2.5 M sulfuric acid per well and the plate was read on an EL8O8 plate reader (Biotech Instrument Inc.) under an OD of 450 nm.

마우스의 면역. 4 내지 6주생 암컷 BALB/c 마우스는 다음 공급처 (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)로부터 구입하였다. 트랜스제닉 B6.Cg-Tg (HLA-A/H2-D)2Enge/J 마우스의 번식 쌍은 다음 공급처 (the Jackson Laboratory)로부터 구입하고 본 실험실의 닥터 미쉘 쿠츨러 (Dr. Michelle Kutzler)가 번식시켰다. 이들 트랜스제닉 마우스는 인간 HLA-A2.1 프로모터의 지시 하에, 인간 HLA-A2.1 유전자의 알파-1 및 알파-2 도메인과 마우스 H-2Dd 유전자의 알파-3 막관통 및 세포질성 도메인을 함유하는 종간 하이브리드 부류 I MHC 유전자인 AAD를 발현한다. 마우스 알파-3 도메인 발현은 이러한 시스템에서의 면역 반응을 증강시켜 준다. 변형되지 않은 HLA-A2.1과 비교해서, 키메라 HLA-A2.1/H2-Dd MHC 부류 I 분자는 마우스 T 세포의 효율적인 양성 선별을 매개하여, HLA-A2.1 부류 I 분자에 의해 제시된 펩티드를 인식할 수 있는 보다 완전한 T 세포 레퍼토리를 제공하였다. HLA-A2.1 부류 I 분자의 맥락에서 마우스 T 세포에 의해 제시되고 인식된 펩티드 에피토프는 HLA-A2.1+ 인간에 제시된 것과 동일하다. 4 내지 6주생 암컷 트랜스제닉 마우스를 다음에 기재된 추가의 연구를 위해 사용하였다. 이들에 관한 보살핌은 다음 기관의 지침에 따랐다 [the National Institutes of Health and the University of Pennsylvania Institutional Care and Use Committee (IACUC)]. 각 마우스는 100 ㎍의 DNA를 각각 2주 간격으로 3회 근육내 투여함으로써 면역시켰다. 각 군 별로 3마리 마우스가 있으며, 대조군 마우스는 pVAX DNA로 백신 접종하였다. 세 번째 면역시킨지 1주 후에 마우스를 희생시키고, 비장을 무균적으로 꺼냈다. 비장 세포를 수집하고 RBC 용해 완충액에 재현탁시켜 적혈구를 제거하였다. 용해 후, 동일한 군으로부터의 비장 세포를 풀링하고, 10％ FBS를 수반한 RPMI 1640에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고, 분석용으로 제조하였다.Mouse immunity. 4-6 week old female BALB/c mice were purchased from the following sources (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Breeding pairs of transgenic B6.Cg-Tg (HLA-A/H2-D)2Enge/J mice were purchased from the Jackson Laboratory and bred by Dr. Michelle Kutzler of the laboratory. . These transgenic mice contain the alpha-1 and alpha-2 domains of the human HLA-A2.1 gene and the alpha-3 transmembrane and cytoplasmic domains of the mouse H-2Dd gene under the direction of the human HLA-A2.1 promoter. Expresses AAD, an interspecies hybrid class I MHC gene. Expression of the mouse alpha-3 domain enhances the immune response in this system. Compared to unmodified HLA-A2.1, the chimeric HLA-A2.1/H2-Dd MHC class I molecule mediates efficient positive selection of mouse T cells, resulting in the peptide presented by the HLA-A2.1 class I molecule. It provided a more complete T cell repertoire capable of recognizing. The peptide epitopes presented and recognized by mouse T cells in the context of HLA-A2.1 class I molecules are the same as those presented for HLA-A2.1+ humans. Female transgenic mice aged 4-6 weeks were used for further studies described below. Their care followed the guidelines of the following institutions [the National Institutes of Health and the University of Pennsylvania Institutional Care and Use Committee (IACUC)]. Each mouse was immunized by intramuscular administration of 100 µg of DNA three times each two weeks apart. There were 3 mice for each group, and the control mice were vaccinated with pVAX DNA. One week after the third immunization, the mice were sacrificed and the spleen was removed aseptically. The splenocytes were collected and resuspended in RBC lysis buffer to remove red blood cells. After lysis, splenocytes from the same group were pooled and resuspended in RPMI 1640 with 10% FBS. Cells were counted and prepared for analysis.

IFN-γ ELISpot 검정. 고-단백질 결합성 IP 96 웰 멀티스크린™ 판 (공급처: Millipore, Bedford, MA. USA)을 사용하였다. 판을 4℃ 하에 밤새 1X PBS에서 희석시킨 마우스 IFN-γ에 대한 mAb (공급처: R&D Systems, Minneapolis. MN)로 피복시켰다. 판을 PBS로 3회 세척한 다음, 1％ BSA 및 5％ 슈크로스로 보충시킨 1X PBS로 실온 하에 2시간 동안 차단시켰다. 마우스 비장 세포를 완전 배양 배지 (10％ FBS 및 항생제를 보충시킨 RPMl 1640)에서 재현탁시킨 웰당 2 x 105개 세포의 유입 세포수로 세 번 되풀이하여 가하였다. HIV-1 아형 B, 아형 C, 군 M의 전체 단백질 컨센서스 서열 및 HIV-1 MN (아형 B 단리물), HIV-1 C.UY.01.TRA3011 및 C.ZA.01.J54Ma (2개의 아형 C 단리물) 외막의 전체 단백질 서열을 나타내는 11개 아미노산이 중복된 15개 아미노산 잔기를 각각 함유하는 6개 펩티드 세트를 다음 공급처로부터 수득하였다 (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program). env 펩티드 각 세트를 IFN-γ 방출의 특이적 자극을 위한 항원으로서 4개의 풀 내로 2 ㎍/ml/펩티드의 농도로 풀링하였다. 콘카발린 (Concavalin) A (공급처: Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 5 g/ml, 및 완전 배양 배지를 각각 양성 및 음성 대조군으로서 사용하였다. 5％ CO2 기압 항온 배양기에서 37℃ 하에 24시간 동안 항온 배양한 후 판을 4회 세척하였다. 이어서, 바이오티닐화 항-마우스 IFN-γ 탐지 항체를 가하고, 판을 4℃ 하에 밤새 항온 배양하였다. 판을 세척하고, 제조업자 ((ELlSPOT Blue Color Module, R&D Systems, Minneapolis, MN)의 지시에 따라서 색 전개를 수행하였다. 판을 공기 건조시키고 임뮤노스폿 (ImmunoSpot®) 소프트웨어를 수반한 자동화 ELISPOT 판독기 시스템 (공급처: CTL Analyzers, Cleveland, OH)을 사용하여 스팟을 계수하였다. 데이터 디스플레이를 위해 스팟 형성 세포 (SFC)의 평균 수를 1 x 106개 비장 세포가 되도록 조정하였다. ELISpot 검정을 3가지 별개의 실험에서 3회 반복하였다.IFN-γ ELISpot assay. A high-protein binding IP 96 well Multiscreen™ plate (Millipore, Bedford, MA. USA) was used. Plates were coated with mAb against mouse IFN-γ (R&D Systems, Minneapolis. MN) diluted in 1X PBS overnight at 4°C. Plates were washed 3 times with PBS and then blocked for 2 hours at room temperature with 1X PBS supplemented with 1% BSA and 5% sucrose. Mouse splenocytes were resuspended in complete culture medium (RPMl 1640 supplemented with 10% FBS and antibiotics) and added in triplicate with an incoming cell number of 2 x 10 5 cells per well. Full protein consensus sequence of HIV-1 subtype B, subtype C, group M and HIV-1 MN (subtype B isolate), HIV-1 C.UY.01.TRA3011 and C.ZA.01.J54Ma (2 subtypes) C isolate) A set of 6 peptides each containing 15 amino acid residues overlapping 11 amino acids representing the entire protein sequence of the outer membrane was obtained from the following sources (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program). Each set of env peptides was pooled at a concentration of 2 μg/ml/peptide into 4 pools as antigens for specific stimulation of IFN-γ release. Concavalin A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 5 g/ml, and complete culture medium were used as positive and negative controls, respectively. After incubating for 24 hours at 37° C. in a 5% CO 2 atmospheric pressure incubator, the plate was washed 4 times. Subsequently, biotinylated anti-mouse IFN-γ detection antibody was added, and the plate was incubated overnight at 4°C. Plate was performed for washing, the manufacturer ((ELlSPOT Blue Color Module, R & D Systems, Minneapolis, different colors in accordance with an instruction of the MN). Plates to air dry and Im immunometric spot (ImmunoSpot ®) automated ELISPOT reader involving the software Spots were counted using a system (source: CTL Analyzers, Cleveland, OH) For data display, the average number of spot forming cells (SFCs) was adjusted to be 1 x 10 6 splenocytes. It was repeated 3 times in separate experiments.

CD8+ T-세포 고갈 연구. 제조업자의 지시에 따라서 CD8에 대한 항체로 피복시킨 면역-자기 비드 (공급처: Dynal Biotech Inc., Lake Success, NY)를 사용함으로써, CD8 림프구를 비장 세포로부터 고갈시켰다. CD8+ T-세포를 고갈시킨 후, IFN-γ ELISpot 검정을 상기 언급된 바와 같이 수행하였다.CD8+ T-cell depletion study. CD8 lymphocytes were depleted from splenocytes by using immuno-magnetic beads (Dynal Biotech Inc., Lake Success, NY) coated with an antibody against CD8 according to the manufacturer's instructions. After depleting CD8+ T-cells, IFN-γ ELISpot assay was performed as mentioned above.

에피토프 지도화 연구. 반응성 에피토프를 지도화하기 위해, HIV-1 컨센서스 아형 B 및 HIV-1 MN의 전체 외막 단백질을 나타내는 11개 아미노산이 중복된 15개 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드 2개 세트를 각각 풀당 14 내지 15개 펩티드의 29개 풀 내로 풀링하고, IFN-γ ELISpot 검정을 상기 언급된 바와 같이 수행하였다. 이들 상이한 29개 풀링된 자극인자 세트를 매트릭스 검정에 사용하였는데, 이는 에피토프 지도화를 촉진시켜 준다.Epitope mapping study. To map the reactive epitope, two sets of peptides containing 15 amino acid residues overlapping 11 amino acids representing the entire outer membrane protein of HIV-1 consensus subtype B and HIV-1 MN were each prepared from 14 to 15 peptides per pool. Pooled into 29 pools of, and IFN-γ ELISpot assay was performed as mentioned above. These different sets of 29 pooled stimuli factors were used in the matrix assay, which facilitated epitope mapping.

통계학적 분석. pEY2E1-B 및 pEK2P-B로 면역시킨 마우스 간의 세포성 면역 반응을 비교하기 위하여 스튜던트 대응표본 t-시험을 사용하였다. 이러한 연구에서는, p<0.05가 통계적 유의성인 것으로 간주되었다.Statistical analysis. To compare cellular immune responses between mice immunized with pEY2E1-B and pEK2P-B, a Student's counterpart t-test was used. In this study, p<0.05 was considered statistically significant.

결과result

신규한 아형 B 초기 전달자 컨센서스에 의거한 외막 유전자의 구축 및 설계. 유전자은행으로부터 검색한 42개 아형 B 서열로부터 HIV-1 아형 B의 컨센서스 서열을 생성시켰다. 도 1에 요약된 바와 같이, 컨센서스 서열을 생성시킨 후에 몇 가지 변형을 수행하였다. 간략하게 설명하면, 점막으로 전염된 바이러스를 모방한 HIV-1 외막의 CCR5-지향성 버전을 생성시키기 위해, 초기 전달자 단리물의 서열에 따라서 V3 루프 중의 6개 중요한 아미노산을 설계하였다. 추가로, V1 루프 중의 10개 아미노산 및 V2 루프 중의 1개 아미노산을 컨센서스 서열로부터 또한 결실시켰다. 고도로 효율적인 리더 서열을 출발 코돈의 동일 프레임내 상류에서 융합시켜 발현을 촉진시켰다. 막관통 도메인을 본래의 상태로 유지시켜 표면 발현을 촉진시키고, 절단 부위를 본래의 상태로 유지시켜 외막 단백질의 숙주 프로테이나제 절단과 적당한 폴딩을 획득하였다. 세포질성 미부를 제거하여 외막 재순환을 방지시키고 보다 안정하고 보다 높은 표면 발현을 증진시켰다 [참고: Berlioz-Torrent, C., et al. 1999. Interactions of the cytoplasmic domains of human and simian retroviral transmembrane proteins with components of the clathrin adaptor complexes modulate intracellular and cell surface expression of envelope glycoproteins. J. Virol. 73:1350-1359; Bultmann, A., et al., 2001. Identification of two sequences in the cytoplamic tail of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein that inhibit cell surface expression. J. Virol. 75:5263-5276]. 더우기, 보다 고 수준의 발현을 위해, 이러한 유전자의 코돈 사용을 호모 사피엔스 (Homo Sapiens) 유전자의 코돈 바이어스에 맞도록 적응시켰다 [참고: Andre, S., et al. B. 1998. Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage. J Virol 72:1497-503; Deml, L., et al. 2001. Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 gag protein. J. Virol. 75:10991-11001]. 또한, RNA 최적화 [참고: Schneider, R., et al., 1997. Inactivation of the human immunodeficiency virus type 1 inhibitory elements allows Rev-independent expression of Gag and Gag/protease and particle formation, J. Virol. 71:4892-4903]을 또한 수행하였다: 극히 높은 (>80％) 또는 극히 낮은 (<30％) GC 함량 영역 및 시스-작용성 서열 모티프, 예를 들어 내부 TATA 박스, 카이 (chi)-부위 및 리보솜성 빈 부위는 피하였다. 공학적으로 처리시킨 합성 EY2E1-B 유전자를 구축하였는데, 이는 길이가 2734 bp였다. EY2E1-B 유전자를 추가의 연구를 위해 BamHI 및 NotI 부위에서 pVAX 내로 서브클로닝하였다.Construction and design of the outer membrane gene based on the novel subtype B early messenger consensus. The consensus sequence of HIV-1 subtype B was generated from 42 subtype B sequences retrieved from the Genbank. As summarized in Figure 1, several modifications were made after generating the consensus sequence. Briefly, in order to generate a CCR5-directed version of the HIV-1 outer membrane that mimics a virus transmitted to the mucosa, six important amino acids in the V3 loop were designed according to the sequence of the initial messenger isolate. In addition, 10 amino acids in the V1 loop and 1 amino acid in the V2 loop were also deleted from the consensus sequence. The highly efficient leader sequence was fused upstream in the same frame of the start codon to promote expression. The transmembrane domain was maintained in its original state to promote surface expression, and the cleavage site was maintained in its original state to obtain host proteinase cleavage and proper folding of the outer membrane protein. Removal of the cytoplasmic tail prevented adventitial recirculation and promoted more stable and higher surface expression [See: Berlioz-Torrent, C., et al. 1999. Interactions of the cytoplasmic domains of human and simian retroviral transmembrane proteins with components of the clathrin adapter complexes modulate intracellular and cell surface expression of envelope glycoproteins. J. Virol. 73:1350-1359; Bultmann, A., et al., 2001. Identification of two sequences in the cytoplamic tail of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein that inhibit cell surface expression. J. Virol. 75:5263-5276]. Furthermore, for higher levels of expression, the codon use of these genes was adapted to match the codon bias of the Homo Sapiens gene [Reference: Andre, S., et al. B. 1998. Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage. J Virol 72:1497-503; Deml, L., et al. 2001. Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 gag protein. J. Virol. 75:10991-11001]. In addition, RNA optimization [Reference: Schneider, R., et al., 1997. Inactivation of the human immunodeficiency virus type 1 inhibitory elements allows Rev-independent expression of Gag and Gag/protease and particle formation, J. Virol. 71:4892-4903] were also carried out: extremely high (>80%) or extremely low (<30%) GC content regions and cis-functional sequence motifs such as internal TATA box, chi-site And ribosomal empty areas were avoided. An engineered synthetic EY2E1-B gene was constructed, which was 2734 bp in length. The EY2E1-B gene was subcloned into pVAX at the BamHI and NotI sites for further study.

계통발생학적 분석. 무작위로 샘플링된 외막 아형 B 서열로부터 EY2E1-B 서열까지의 거리 분포를 평가하기 위해, 계통발생학적 분석을 수행하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, EY2E1-B 서열과 샘플링된 모든 서열과의 상대적 친밀성이 관찰되었다. EY2E1-B 서열을 일차 단리물 EK2P-B 서열과 비교하는 경우, 이는 거의 동등한 수준의 유사율 스코어 분포를 나타내었다 (표 1). EY2E1-B에 대한 평균 유사율 스코어는 85.7％인 반면, EK2P-B에 대한 평균 유사율 스코어는 79.4％였다.Phylogenetic analysis. Phylogenetic analysis was performed to evaluate the distribution of the distance from the randomly sampled outer membrane subtype B sequence to the EY2E1-B sequence. As shown in Fig. 2, relative intimacy between the EY2E1-B sequence and all of the sampled sequences was observed. When comparing the EY2E1-B sequence with the primary isolate EK2P-B sequence, it showed an almost equivalent level of similarity score distribution (Table 1). The average similarity score for EY2E1-B was 85.7%, while the average similarity score for EK2P-B was 79.4%.

잠재적 외막 백신 후보와 아형 B 외막 서열 정렬 간의 유사율 스코어 평균 및 범위 (％)Average and range of similarity scores between potential envelope vaccine candidates and subtype B envelope sequence alignment (%) 평균 유사율 스코어 (％)Average similarity score (%) 유사율 스코어 범위 (％)Similarity score range (%) EY2E1-BEY2E1-B 85.785.7 92.1-79.692.1-79.6 EK2P-BEK2P-B 79.479.4 86.3-73.986.3-73.9

EY2E1-B의 생체내 발현 및 항원성 결정. pEY2E1-B 및 pEK2P-B의 생체내 발현을 시험하기 위해, RD 세포를 재료 및 방법 섹션에 기재된 바와 같이 이들 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염시킨 후 세포 용해물로부터 총 단백질을 추출하고 재료 및 방법 섹션에서 언급된 외막-특이적 모노클로날 항체 2G12로 면역블롯팅하여 pEY2E1-B의 발현을 탐지하였다. 웨스턴 블롯 결과는 이들 두 구조물이 외막 단백질을 발현하였다고 표시하였다 (도 3A). 탐지된 외막 단백질은 약 120 KD였다. 표 2는 pEY2E1-B와 pEK2P-B의 비교를 나타낸 것이다.In vivo expression and antigenic determination of EY2E1-B. To test the in vivo expression of pEY2E1-B and pEK2P-B, RD cells were transfected with these plasmids as described in the Materials and Methods section. After transfection, total protein was extracted from the cell lysate and immunoblotted with the outer membrane-specific monoclonal antibody 2G12 mentioned in the Materials and Methods section to detect the expression of pEY2E1-B. Western blot results indicated that these two structures expressed the outer membrane protein (Fig. 3A). The detected outer membrane protein was about 120 KD. Table 2 shows a comparison of pEY2E1-B and pEK2P-B.

컨센서스/
일차Consensus/
Primary 초기 전달자Early forwarder 코돈 최적화Codon optimization RNA 최적화RNA optimization IgELSIgELS 세포질성
미부Cytoplasm
empennage EY2E1-BEY2E1-B 컨센서스Consensus 예Yes 예Yes 예Yes 예Yes 아니오no EK2P-BEK2P-B 일차Primary 아니오no 예Yes 예Yes 예Yes 아니오no

항원성 에피토프를 결정하기 위해, RD 세포 용해물로부터 발현된 외막 단백질을 3가지 상이한 gp12O-특이적 항체 2G12, 4G10 및 ID6으로 면역침전시켰다. 면역침전을 수행한 후, 웨스턴 블롯팅을 수행하여 면역침전된 단백질을 탐지하였다. 본 발명자들의 결과는 합성 면역원이 항체 2G12 및 ID6과는 결합할 수 있었지만, 4G10과는 그렇치 않았다는 것을 나타내었다. 항체 2G12는 광범위한 각종 일차 단리물을 중화시키고 입체 형태적 및 탄수화물-의존성 gp120 에피토프와 반응하며, 항체 ID6은 gp120 및 gp160과 결합하고 gp120의 처음 204개 aa에 대하여 유도되기 때문에, 본 발명자들의 결과는 공학적으로 처리시킨 합성 면역원 EY2E1-B가 비교적 천연 입체 형태로 폴딩될 수 있고 몇몇 천연 항원성 에피토프를 보존할 수도 있다는 것을 제안하였다. 더우기, 항체 4G10은 T-세포주 적응시킨 균주인 LAI gp160을 인식하는 HIV-1 LAI/BRU V3 모노클로날 항체이기 때문에, 본 발명자들의 데이터는 또한, 이러한 합성 외막이 공-수용체 CXCR4를 활용하지 않을 것이란 사실을 제안하였다.To determine the antigenic epitope, outer membrane proteins expressed from RD cell lysates were immunoprecipitated with three different gp12O-specific antibodies 2G12, 4G10 and ID6. After immunoprecipitation was performed, Western blotting was performed to detect immunoprecipitated proteins. Our results indicated that the synthetic immunogen was able to bind antibodies 2G12 and ID6, but not 4G10. Since antibody 2G12 neutralizes a wide variety of primary isolates and reacts with conformational and carbohydrate-dependent gp120 epitopes, and antibody ID6 binds gp120 and gp160 and is directed against the first 204 aa of gp120, our results are: It has been suggested that the engineered synthetic immunogen EY2E1-B can be folded into a relatively natural conformational form and may also preserve some natural antigenic epitopes. Furthermore, since antibody 4G10 is an HIV-1 LAI/BRU V3 monoclonal antibody that recognizes LAI gp160, a T-cell line-adapted strain, our data also suggest that this synthetic outer membrane does not utilize the co-receptor CXCR4 Was suggested.

발현을 추가로 확인하고 항원성 에피토프를 결정하기 위해, 형질감염시킨 RD 세포를 사용하여 간접 면역형광성 검정을 수행하였다. 형광 현미경을 사용한 결과 pEY2E1-B 및 pEK2P-B 형질감염시킨 세포에서 고 특이적 발현이 관찰되었다. 불연속적 또는 입체 형태적 gp120 에피토프와 반응하는 HIV-1 env 모노클로날 F105를 본 검정에 사용하였다. 도 3B에 표시된 바와 같이, Env 단백질을 발현하는 형질감염시킨 세포는 전형적인 로다민 형광을 나타내었는데, 이는 합성 단백질이 발현되었고 비교적 천연 입체 형태를 지니고 있다는 것을 다시 한번 제안하고 있다. 대조군으로서, pVAX 형질감염시킨 RD 세포에서는 발현이 탐지되지 않았다.To further confirm expression and determine antigenic epitopes, an indirect immunofluorescence assay was performed using transfected RD cells. As a result of using a fluorescence microscope, high specific expression was observed in pEY2E1-B and pEK2P-B transfected cells. HIV-1 env monoclonal F105 reacting with a discontinuous or conformational gp120 epitope was used in this assay. As shown in Fig. 3B, the transfected cells expressing the Env protein exhibited typical rhodamine fluorescence, which again suggests that the synthetic protein was expressed and has a relatively natural conformation. As a control, expression was not detected in pVAX-transfected RD cells.

체액성 반응의 유도. 합성 면역원이 보다 고-역가 외막-특이적 항체 반응을 유도시킬 수 있었는지를 결정하기 위하여, pVAX, pEY2E1-B 및 pEK2P-B로 면역시킨 BalB/C 마우스로부터 혈청을 수집하고 ELISA를 수행하였다. 도 4A에 도시된 바와 같이, 본 발명자들은 pEK2P-B 면역시킨 마우스에서와 비교해서 비교적 보다 고 수준의 분기군 B 외막-특이적 항체가 pEY2E1-B 면역시킨 마우스로부터 수집한 혈청과 반응한다는 것을 관찰하였다. 이와는 달리, 벡터 단독 마우스는 특이적 항체 반응을 발생시키지 못하였다. 그러나, pEY2E1-B 주사된 마우스와 pEK2P-B 주사된 마우스 둘 다에서는 분기군 A/E 및 분기군 C 단백질에 대한 탐지 가능한 어떠한 항체 반응도 없었는데 (도 4B 및 4C), 이는 합성 컨센서스에 의거한 면역원이 비교적 천연 입체 형태를 지니고 있고 천연 항원성 에피토프를 보존하고 있긴 하지만, 광범위한 교차-분기군 항체 면역 반응을 유도시키지 않을 수 있다는 것을 표시한다.Induction of humoral reactions. To determine whether the synthetic immunogen could induce a more high-titer outer membrane-specific antibody response, serum was collected from BalB/C mice immunized with pVAX, pEY2E1-B and pEK2P-B and ELISA was performed. As shown in Figure 4A, the present inventors observed that relatively higher levels of clade B outer membrane-specific antibodies react with serum collected from pEY2E1-B immunized mice compared to those in pEK2P-B immunized mice. I did. In contrast, the vector alone mice did not generate a specific antibody response. However, there was no detectable antibody response to clade A/E and clade C proteins in both pEY2E1-B injected mice and pEK2P-B injected mice (Figures 4B and 4C), which is an immunogen based on synthetic consensus. Although it has a relatively natural conformation and preserves the natural antigenic epitope, it indicates that it may not elicit a broad cross-clan antibody immune response.

ELISpot에 의해 측정된 강력하고 광범위한 세포성 면역 반응. BalB/C 마우스를 pEY2E1-B 및 pEK2P-B로 면역시키고 ELISpot 분석을 수행하여 HIV-1 컨센서스 아형 B 단백질로부터의 펩티드 4개 풀에 반응하는 항원-특이적 IFN-γ 분비성 세포 수를 결정하였다 (도 5A). 세포 100만개 당 스팟 형성 단위 (SFU) 수로써 측정된 바와 같은 반응 크기는 pEY2E1-B 백신접종한 마우스에서 27.5 내지 520의 범위였다. 비교하자면, pEK2P-B 백신접종한 마우스로부터의 비장 세포는 단지 2 내지 237.5의 스팟 범위 만을 나타내었다 (p<0.05). pEY2E1-B 면역시킨 마우스에서 모든 4개 풀에 대한 비장 세포 100만개 당 SFU의 부가 빈도는 1976.25 + 260인 반면, pEK2P-B 면역시킨 마우스에서는 세포 100만개 당 SFU의 수가 519 + 45였다. pVAX 벡터로 면역시킨 마우스로부터의 세포를 음성 대조군으로서 사용하였는데, 이는 컨센서스 외막 B 펩티드 풀에 대해 비장 세포 100만개 당 단지 60 + 5 SFU 만을 나타내었다 (p < 0.05). 본 발명자들은 3가지 별개의 연구에서 유사한 결과를 관찰하였다. 따라서, pEY2E1-B 구조물은 세포-매개형 면역 반응을 구동하는 데에 있어서 4배 정도 더 강력하다. 본 발명자들은 또한, CD8+ 림프구가 pEY2E1-B로 면역시킨 BalB/C 마우스에서 탐지된 IFN-γ 분비에 대해 책임이 있었는지에 관하여 결정하였다. 도 5B에 도시된 바와 같이, 세포 100만개 당 SFU의 수는 CD8+ 고갈 후에 127.5 + 11로 감소되었는데, 이는 CD8+ T-세포 고갈된 ELISpot에 의해 관찰된 IFN-γ 생성성 세포의 빈도가 약 90％ 정도 감소되었다는 지표이다. pEY2E1-B에 의해 유도된 IFN-γ 생성은 주로 CD8+ T-세포에 의해 매개된다.Strong and broad cellular immune response measured by ELISpot. BalB/C mice were immunized with pEY2E1-B and pEK2P-B and ELISpot analysis was performed to determine the number of antigen-specific IFN-γ secreting cells responding to a pool of 4 peptides from the HIV-1 consensus subtype B protein. (Figure 5A). The response size, as measured as the number of spot forming units (SFU) per million cells, ranged from 27.5 to 520 in pEY2E1-B vaccinated mice. By comparison, splenocytes from pEK2P-B vaccinated mice showed only a spot range of 2 to 237.5 (p<0.05). In pEY2E1-B immunized mice, the frequency of addition of SFU per million splenocytes to all four pools was 1976.25 + 260, whereas in pEK2P-B immunized mice the number of SFU per million cells was 519 + 45. Cells from mice immunized with the pVAX vector were used as negative controls, which showed only 60 + 5 SFU per million splenocytes for the consensus outer membrane B peptide pool (p <0.05). We observed similar results in three separate studies. Thus, the pEY2E1-B construct is about four times more potent in driving cell-mediated immune responses. We also determined whether CD8+ lymphocytes were responsible for the detection of IFN-γ secretion in BalB/C mice immunized with pEY2E1-B. As shown in Figure 5B, the number of SFU per million cells decreased to 127.5 + 11 after CD8 + depletion, which is about 90% of the frequency of IFN-γ-producing cells observed by CD8 + T-cell depleted ELISpot. It is an indicator that the degree has decreased. IFN-γ production induced by pEY2E1-B is primarily mediated by CD8+ T-cells.

또한, HLA-A2 제시된 항원에 대한 인간 T 세포 면역 반응을 모델링하고 이들 항원을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 트랜스제닉 HLA-A2.1/H2-Dd 마우스를 사용하여 상기 언급된 바와 동일한 ELISpot 검정을 수행하였다. 도 5C에 도시된 바와 같이, pEY2E1-B 면역시킨 트랜스제닉 마우스에서 모든 4개 풀에 대한 비장 세포 100만개 당 SFU의 부가 빈도는 2362 + 257인 반면, pEK2P-B 면역시킨 트랜스제닉 마우스에서는 세포 100만개 당 SFU의 수가 493 + 57이었다. 이들 결과는 pEY2E1-B 구조물이 상기 트랜스제닉 마우스에서 세포-매개형 면역 반응을 구동하는 데에 있어서 4배 정도 더 강력하다는 지표이다. CD8 고갈 후의 ELISpot 데이터는 pEY2E1-B에 의해 유도된 IFN-γ 생성이 주로 CD8+ T-세포에 의해 매개된다는 것을 제안하였다 (도 5D).In addition, to model human T cell immune responses to HLA-A2 presented antigens and to identify these antigens, the present inventors performed the same ELISpot assay as mentioned above using transgenic HLA-A2.1/H2-Dd mice. Performed. As shown in Figure 5C, the frequency of addition of SFU per million splenocytes to all four pools in pEY2E1-B immunized transgenic mice was 2362 + 257, whereas in pEK2P-B immunized transgenic mice, 100 cells The number of SFU per ten thousand was 493 + 57. These results are an indicator that the pEY2E1-B construct is about four times more potent in driving cell-mediated immune responses in the transgenic mice. ELISpot data after CD8 depletion suggested that IFN-γ production induced by pEY2E1-B is primarily mediated by CD8+ T-cells (Fig. 5D).

더우기, 본 발명자들은 ELISpot 검정에서 관찰된 세포성 면역 반응을 추가로 상세히 밝혀내는 데에 관심을 가졌다. 따라서, 컨센서스 아형 B 외막 단백질 전역에 걸쳐 있는 펩티드 라이브러리에 대하여 부가 세트의 ELISpot 검정을 수행하였다. 아형 B 컨센서스 외막 단백질을 포함하는, 11개 아미노산이 중복된 15량체 펩티드의 완전 세트를 사용하여 상기 지도화 연구를 수행하였다. 이러한 연구는 합성 외막에 의해 유도된 명확한 우성 에피토프가 없다는 것을 예시하였다. 그러나, pEY2E1-B-백신접종한 BalB/C 마우스로부터 유래된 비장 세포를 IFN-γ ELISpot 분석한 결과, 29개 풀 중의 18개 풀에서 50개 이상의 스팟이 나타난 반면, pEK2P-B 백신접종한 BalB/C 마우스에서는 6개 풀에서만 나타났다 (도 5E). 이들 결과는 EY2E1-B 면역원에 의해 유도된 세포성 면역 반응의 폭과 크기가 상당히 증가하였다는 것을 예시하였다.Furthermore, the inventors were interested in further elucidating the cellular immune response observed in the ELISpot assay. Thus, an additional set of ELISpot assays were performed on the peptide library spanning the consensus subtype B outer membrane protein. The mapping study was performed using a complete set of 15-mer peptides overlapping 11 amino acids, including the subtype B consensus outer membrane protein. This study exemplified the absence of a clear dominant epitope induced by the synthetic outer membrane. However, as a result of IFN-γ ELISpot analysis of splenocytes derived from pEY2E1-B-vaccinated BalB/C mice, more than 50 spots appeared in 18 of 29 pools, whereas BalB vaccinated with pEK2P-B In /C mice, it appeared only in 6 pools (FIG. These results exemplified that the width and magnitude of the cellular immune response induced by the EY2E1-B immunogen was significantly increased.

pEY2E1-B에 의해 유도된 강력한 교차-반응성 세포성 면역 반응. EY2E1-B 면역원이 광범위한 교차-반응성 세포성 면역 반응을 유도시킬 수 있었는지를 결정하기 위해, HIV-1 군 M, 컨센서스 아형 C, HIV-1 MN (아형 B 단리물), HIV-1 C.UY.01.TRA3011 및 C.ZA.01.J54Ma (2개의 아형 C 단리물) 외막 단백질을 사용하여, BalB/C 및 HLA-A2 트랜스제닉 마우스 둘 다에서 IFN-γ ELISpot을 수행하였다. 이들 검정은 도 5A, C 및 E 단독에서 관찰된 결과가 펩티드 표적과 관계가 있는지 아니면 실제적으로 면역 폭 상의 증가에 기인하는지를 추가로 결정해줄 것이다. 도 6A에 도시된 바와 같이, pEY2E1-B 백신접종한 BalB/C 마우스에서 HIV-1 MN 외막 펩티드의 4개 풀에 대한 비장 세포 100만개 당 SFU의 부가 수는 1855 + 215.8이었는데, 이는 pEK2P-B 면역시킨 BalB/C 마우스에서의 수 (비장 세포 100만개 당 SFU는 700 + 168.2였다)보다 약 2배 이상이었으며, 이는 pEY2E1-B가 아형 B 내에서 pEK2P-B보다 더 강력한 교차 반응성을 나타냈다는 지표이다. pEY2E1-B 면역시킨 BalB/C 마우스에서 4개의 HIV 군 M (도 6B) 및 아형 C (도 6C) 컨센서스 외막 펩티드 풀을 이용한 자극에 반응한 IFN-γ 스팟 수는 각각 1150 + 191.3 및 715 + 116.1이었다. pEK2P-B 백신접종한 BalB/C 마우스에서 635 + 152.3 및 345 + 82.3인 군 M 및 아형 C 펩티드에 대한 스팟 수와 비교해서, 상기 데이터는 pEY2E1-B에 의해 유도된 교차-분기군 면역 반응이 BalB/C 마우스에서 pEK2P-B에 의해 유도된 것보다 대략 45％ 더 강력하다는 것을 예시하고 있다.Strong cross-reactive cellular immune response induced by pEY2E1-B. To determine whether the EY2E1-B immunogen was able to induce a broad cross-reactive cellular immune response, HIV-1 group M, consensus subtype C, HIV-1 MN (subtype B isolate), HIV-1 C. IFN-γ ELISpot was performed in both BalB/C and HLA-A2 transgenic mice using UY.01.TRA3011 and C.ZA.01.J54Ma (two subtype C isolates) outer membrane proteins. These assays will further determine whether the results observed in Figures 5A, C and E alone are related to the peptide target or are actually due to an increase in immune width. As shown in Figure 6A, the number of SFU per million splenocytes added to the four pools of HIV-1 MN outer membrane peptides in pEY2E1-B vaccinated BalB/C mice was 1855 + 215.8, which was pEK2P-B. It was about 2 times more than the number in immunized BalB/C mice (SFU per million spleen cells was 700 + 168.2), which is an indicator that pEY2E1-B showed stronger cross-reactivity than pEK2P-B in subtype B. to be. In pEY2E1-B immunized BalB/C mice, the number of IFN-γ spots in response to stimulation using the consensus outer membrane peptide pool of four HIV group M (Fig. 6B) and subtype C (Fig. 6C) was 1150 + 191.3 and 715 + 116.1, respectively. Was. Compared to the number of spots for group M and subtype C peptides of 635 + 152.3 and 345 + 82.3 in pEK2P-B vaccinated BalB/C mice, the data show that the cross-clan immune response induced by pEY2E1-B It is illustrated to be approximately 45% more potent than that induced by pEK2P-B in BalB/C mice.

중요하게, 본 발명자들은 트랜스제닉 마우스에서 pEY2E1-B에 의해 유도된 훨씬 더 강력한 교차 반응성 세포성 면역 반응을 관찰하였다 (도 6F-J). pEY2E1-B 백신접종한 트랜스제닉 마우스에서 HIV-1 MN 외막 펩티드의 4개 풀에 대한 비장 세포 100만개 당 SFU의 부가 수는 1087 + 153이었는데, 이는 pEK2P-B 면역시킨 HLA-A2 마우스에서의 수 (비장 세포 100만개 당 SFU는 316 + 63이었다)보다 약 3배 이상이었으며 (도 6F), 이는 pEY2E1-B가 트랜스제닉 마우스에서 아형 B 내에서 pEK2P-B보다 더 강력한 교차 반응성을 유도시킬 수 있었다는 지표이다. pEY2E1-B 면역시킨 트랜스제닉 마우스에서 4개의 HIV 군 M (도 6G) 및 아형 C (도 6H) 컨센서스 외막 펩티드 풀을 이용한 자극에 반응한 IFN-γ 스팟 수는 각각 2116 + 216 및 893 + 154였다. pEK2P-B 백신접종한 트랜스제닉 마우스에서 473 + 50 및 266 + 55인 군 M 및 아형 C 펩티드에 대한 스팟 수와 비교해서, 상기 데이터는 pEY2E1-B에 의해 유도된 교차-분기군 면역 반응이 트랜스제닉 마우스에서 pEK2P-B에 의해 유도된 것보다 대략 3배 내지 4배 더 강력하다는 것을 표시하였다. 더우기, 기타 펩티드 세트에 의해 달성된 교차 반응성 및 폭을 평가하는 데에 적격한 대조군으로서 제공해야 하는 2개 아형 C 단리물 펩티드 세트를 사용하여 교차-분기군 C 면역 반응을 추가로 결정하였다. BalB/C 마우스에서 pEY2E1-B 및 pEK2P-B에 의해 유도된 이들 2개 아형 C 단리물 세트에 대한 교차 반응성의 차이가 너무 많지는 않았지만 (도 6D 및 E), pEY2E1-B에 의해 유도된 이들 2개 아형 C 단리물 세트에 대한 교차-분기군 반응성은 pEK2P-B에 의해 유도된 것보다 약 3배 정도 더 강력하였다 (도 6I 및 J). C.ZA.01.J54Ma 및 C.UY.01.TRA3011 펩티드에 대한 스팟 수는 pEY2E1-B 백신접종한 트랜스제닉 마우스에서 1080 + 206 및 890 + 150인 반면, pEK2P-B 백신접종한 트랜스제닉 마우스에서는 단지 305 + 38 및 310 + 62였다.Importantly, we observed a much stronger cross-reactive cellular immune response induced by pEY2E1-B in transgenic mice (Figs. 6F-J). In pEY2E1-B vaccinated transgenic mice, the addition number of SFU per million splenocytes to four pools of HIV-1 MN outer membrane peptides was 1087 + 153, which was the number in pEK2P-B immunized HLA-A2 mice. (SFU per million spleen cells was 316 + 63) was about 3 times more than (Fig. 6F), which indicates that pEY2E1-B was able to induce stronger cross-reactivity than pEK2P-B in subtype B in transgenic mice. It is an indicator. In pEY2E1-B immunized transgenic mice, the number of IFN-γ spots in response to stimulation with the consensus outer membrane peptide pool of four HIV group M (Fig. 6G) and subtype C (Fig. 6H) were 2116 + 216 and 893 + 154, respectively. . Compared to the number of spots for group M and subtype C peptides of 473 + 50 and 266 + 55 in transgenic mice vaccinated with pEK2P-B, the data show that the cross-clan immune response induced by pEY2E1-B is trans It was indicated to be approximately 3 to 4 times more potent than that induced by pEK2P-B in the genic mice. Furthermore, a cross-clan C immune response was further determined using a set of two subtype C isolate peptides that should serve as competent controls for assessing the cross reactivity and breadth achieved by other sets of peptides. Although the difference in cross-reactivity for these two sets of subtype C isolates induced by pEY2E1-B and pEK2P-B in BalB/C mice was not too much (Figure 6D and E), those induced by pEY2E1-B The cross-clan reactivity for the two sets of subtype C isolates was about 3 times stronger than that induced by pEK2P-B (FIGS. Spot numbers for C.ZA.01.J54Ma and C.UY.01.TRA3011 peptides were 1080 + 206 and 890 + 150 in pEY2E1-B vaccinated transgenic mice, whereas pEK2P-B vaccinated transgenic mice At only 305 + 38 and 310 + 62.

최종적으로, 본 발명자들은 BalB/C 및 HLA-A2 트랜스제닉 마우스 둘 다에서 상기 관찰된 HIV-1 MN에 대한 세포성 면역 반응을 상세히 기술함으로써 EY2E1-B 면역원에 의해 유도된 아형 특이적 표적에 대한 교차-반응성 세포성 면역 반응의 폭이 또한 증가하였는지를 결정하였다. 아형 B MN 외막 단백질 전역에 걸친 펩티드 라이브러리에 대한 에피토프 지도화 검정을 수행하였다. 그 결과는 양 마우스 균주에서 합성 외막에 의해 유도된 명확한 우성 에피토프가 없다는 것을 제안하였다. 그러나, pEY2E1-B-백신접종한 BalB/C 마우스로부터 유래된 비장 세포를 IFN-γ ELISpot 분석한 결과, 29개 풀 중의 14개 풀에서 50개 이상의 스팟이 나타난 반면, pEK2P-B 백신접종한 BalB/C 마우스에서는 9개 풀에서만 나타났다 (도 7A). 유사하게 트랜스제닉 마우스에서, pEY2E1-B 면역시킨 트랜스제닉 마우스에서는 29개 풀 중의 18개 풀에서 50개 이상의 스팟이 나타난 반면, pEK2P-B 백신접종한 트랜스제닉 마우스에서는 6개 풀에서만 나타났다 (도 7B). 이들 데이터는 BalB/C 및 HLA-A2 트랜스제닉 마우스 둘 다에서 EY2E1-B 면역원에 의해 유도된 교차 반응성 세포성 면역 반응의 폭과 크기가 상당히 증가하였다는 것을 표시하였다.Finally, the present inventors described in detail the cellular immune response to the observed HIV-1 MN in both BalB/C and HLA-A2 transgenic mice to target subtype specific targets induced by EY2E1-B immunogen It was determined whether the breadth of the cross-reactive cellular immune response was also increased. Epitope mapping assays were performed on peptide libraries across subtype B MN outer membrane proteins. The results suggested that there was no clear dominant epitope induced by the synthetic outer membrane in both mouse strains. However, as a result of IFN-γ ELISpot analysis of splenocytes derived from pEY2E1-B-vaccinated BalB/C mice, more than 50 spots appeared in 14 of 29 pools, whereas BalB vaccinated with pEK2P-B In /C mice, it appeared only in 9 pools (Fig. 7A). Similarly, in transgenic mice, pEY2E1-B immunized transgenic mice showed more than 50 spots in 18 out of 29 pools, whereas pEK2P-B vaccinated transgenic mice showed more than 50 spots (Fig. 7B). ). These data indicated that the breadth and magnitude of the cross-reactive cellular immune response induced by the EY2E1-B immunogen was significantly increased in both BalB/C and HLA-A2 transgenic mice.

논의Argument

전 세계적인 HIV-1 DNA 백신에 관한 노력은 HIV-특이적 T-세포 반응이 감염으로부터의 보호 또는 감염 후 복제 제어에 일부 기여할 수 있다는 원칙에 의해 좌우되었다. DNA 백신이 바이러스성 복제에 강한 영향력을 미칠 수 있긴 하지만, 이러한 백신은 일반적으로, 약독화 생 바이러스성 벡터 만큼 면역 유도에 있어 강력하지 못하다 [참고: Almond, N., et al.. 1995. Protection by attenuated simian immunodeficiency virus in macaques against challenge with virus-infected cells. Lancet 345:1342-1344; Berman, P. W., et al. 1996, Protection of MN- rgp120-immunized chimpanzees from heterologous infection with a primary isolate of human immunodeficiency virus type 1. J Infect Dis 173:52-9; Boyer, J., et al. 1997. Protection of chimpanzees from high-dose heterologous HIV-1 challenge by DNA vaccination. Nat Med 3:526-532; Daniel, M. C., et al. 1992. Protective effects of a live attenuated SIV vaccine with a deletion in the nef gene. Science 258: 1938-1941]. 따라서, 세포성 면역 반응의 폭과 크기를 개선시키는 데에 목표를 둔 전략이 중요하다. 본 발명은 당해 분야의 문헌에 별개의 접근 방식으로서 보고되긴 하였지만, 하나의 백신 양식에서 기존에 함께 조립되지 않았던 면역원의 몇 가지 특징을 이용하여 신규한 항원을 제공한다. 개념 실증으로서, 공학적으로 처리시킨 합성 컨센서스에 의거한 외막 면역원을 개발하였고, 이를 세포-매개형 면역 반응을 유도시키기 위한 최적화 일차 서열 면역원과 비교하였다. 발현 데이터는 이와 같이 공학적으로 처리시킨 신규한 외막 유전자가 포유류 세포주에서 효율적으로 발현될 수 있었지만, 이들 두 면역원의 발현 수준은 극히 유사하였다는 것을 보여주었다 (도 3A). 본 발명자들은 면역원성 연구에서 상기 기능성 면역원에 의해 유도된 세포성 면역 반응이 일차 외막 백신과 비교해서 증가된 다양성과 크기를 나타내었다는 사실을 관찰하였다. BalB/C 및 HLA-A2 트랜스제닉 마우스 둘 다에서 수득한 에피토프 지도화 데이터는 이러한 다양성과 크기 개선이 이들 일배체형 전반에 걸쳐 유지되었다는 사실을 입증해주었다. 이러한 발견을 추가로 확인하기 위해, 본 발명자들은 또한 컨센서스에 의거한 아형 C 외막 면역원을 개발하였고, 이를 일차 아형 C 면역원과 비교하였는데, 합성 컨센서스에 의거한 아형 C 외막 면역원이 일차 C 면역원과 비교해서 증강된 다양성과 크기의 세포성 면역 반응을 나타내었다 (공개되지 않은 데이터).The worldwide efforts for HIV-1 DNA vaccines have been driven by the principle that HIV-specific T-cell responses can contribute in part to protection from infection or control of replication after infection. Although DNA vaccines can have a strong influence on viral replication, these vaccines are generally not as potent in inducing immunity as live attenuated viral vectors [Ref: Almond, N., et al.. 1995. Protection by attenuated simian immunodeficiency virus in macaques against challenge with virus-infected cells. Lancet 345:1342-1344; Berman, P. W., et al. 1996, Protection of MN- rgp120-immunized chimpanzees from heterologous infection with a primary isolate of human immunodeficiency virus type 1. J Infect Dis 173:52-9; Boyer, J., et al. 1997. Protection of chimpanzees from high-dose heterologous HIV-1 challenge by DNA vaccination. Nat Med 3:526-532; Daniel, M. C., et al. 1992. Protective effects of a live attenuated SIV vaccine with a deletion in the nef gene. Science 258: 1938-1941]. Therefore, strategies aimed at improving the breadth and magnitude of cellular immune responses are important. The present invention, although reported as a separate approach in the literature in the art, provides novel antigens using several features of immunogens that have not previously been assembled together in one vaccine modality. As a proof of concept, an outer membrane immunogen based on an engineered synthetic consensus was developed and compared with an optimized primary sequence immunogen for inducing a cell-mediated immune response. Expression data showed that the novel outer membrane gene engineered in this way could be efficiently expressed in mammalian cell lines, but the expression levels of these two immunogens were extremely similar (FIG. 3A). In immunogenicity studies, the present inventors observed that the cellular immune response induced by the functional immunogen exhibited increased diversity and size compared to the primary adventitial vaccine. Epitope mapping data obtained in both BalB/C and HLA-A2 transgenic mice demonstrated that this diversity and size improvement was maintained throughout these haplotypes. To further confirm these findings, the inventors also developed a subtype C outer membrane immunogen based on a consensus, and compared it with a primary subtype C immunogen, in which the subtype C outer membrane immunogen based on a synthetic consensus was compared with the primary C immunogen. It showed enhanced diversity and size of cellular immune responses (unpublished data).

백신 설계 전략 관점에서 보면, 백신 후보와 감염성 또는 시험감염성 바이러스 간의 서열 상동성이 중요한 것으로 간주될 수 있다. 백신 균주와 동시에 발생하는 순환성 바이러스 간의 서열 부동률 (dissimilarity degree)을 최소화하는 데에 유효한 접근 방식은 이들 바이러스에 대해 "중추적인" 인공 서열을 창출시키는 것이다. 이러한 서열을 설계하기 위한 한 가지 전략은 정렬 내의 모든 위치에서 가장 흔한 아미노산으로부터 유래된 컨센서스 서열을 사용하는 것이다. 이 연구에서, 본 발명자들은 컨센서스에 의거한 아형 B 외막 백신을 개발하였고 이러한 합성 면역원이 보다 높은 교차 반응성을 지닐 수도 있다고 생각하였다. 본 발명자들의 연구 결과, pEY2E1-B 백신에 의해 다양한 세포성 면역 반응이 유도된 것으로 밝혀졌다. Balb/c 및 트랜스제닉 마우스 둘 다에서의 펩티드 지도화 결과 역시, EY2E1-B 면역원이 면역 반응을 확대시켰다는 것을 표시하였다. 더우기, 교차 반응성 세포성 면역 반응 연구 결과는 pEY2E1-B가 상당히 더 강력하고 광범위한 교차 반응성 세포성 면역 반응을 유도시킬 수 있었다고 표시하였다. 따라서, 인공 컨센서스 외막 면역원은 모든 개별적 천연 단리물에서 발견된 것보다 더 보존된 에피토프를 함유하고 있고, 보다 광범위한 교차-분기군 CTL 반응을 유도시킨다.From a vaccine design strategy perspective, sequence homology between a vaccine candidate and an infectious or challenge virus can be considered important. An effective approach to minimizing the degree of sequence dissimilarity between circulating viruses that coincide with the vaccine strain is to create artificial sequences that are "backbone" for these viruses. One strategy for designing such sequences is to use consensus sequences derived from the most common amino acids at all positions within the alignment. In this study, the present inventors developed a subtype B outer membrane vaccine based on consensus and thought that this synthetic immunogen may have a higher cross reactivity. As a result of our research, it was found that various cellular immune responses were induced by the pEY2E1-B vaccine. Peptide mapping results in both Balb/c and transgenic mice also indicated that the EY2E1-B immunogen enhanced the immune response. Moreover, the results of the cross-reactive cellular immune response study indicated that pEY2E1-B was able to induce a significantly stronger and broader cross-reactive cellular immune response. Thus, artificial consensus outer membrane immunogens contain more conserved epitopes than those found in all individual natural isolates and induce a broader cross-clan CTL response.

컨센서스 서열은 이론상 이점과 단점을 지니고 있다. 컨센서스 서열은 동시에 발생하는 단리물에 의거하여 생성되기 때문에, 소정의 어떠한 천연 바이러스 단리물보다 현재 순환하고 있는 바이러스성 균주와 유전적으로 보다 더 밀접할 수 있다. 그러나, 급성 감염 동안 샘플링된 바이러스 대신 만성 감염 동안 샘플링된 바이러스를 이용하여 포괄적인 서열 분석을 일반적으로 수행하기 때문에, 대부분이 도피된 에피토프 상에서 컨센서스 백신 반응을 발생시키는 것이 불리할 수 있다. 이러한 단점을 최소화하기 위해, 백신 설계를 위한 본 발명자들의 유용한 전략은 초기 전달자 서열을 고려하는 것일 것이다. 인공적으로 구축하기가 가장 어려운 HIV 단백질 중에서 외막 단백질이 있는데, 이는 HIV-1 외막 유전자 중의 초가변 영역이 신속한 삽입 및 결실에 의해 점진적으로 발달하지만, 점 돌연변이에 의해서는 그렇치 않기 때문이다. 초가변 영역의 길이 차이로 인해, 이들 영역의 컨센서스 서열을 생성시키는 것이 어렵다. 최근에는, 문헌 [참고: Gao, F., Eet al. 2005. Antigenicity and immunogenicity of a synthetic human immunodeficiency virus type 1 group m consensus envelope glycoprotein. J Virol 79:1154-63]에서는 군 M 컨센서스 외막 서열을 생성시켰지만, CRF08 BC 재조합 균주의 상응하는 영역으로부터의 비-컨센서스 서열을 이들 가변 영역에 사용하였다. 연구 결과, 보다 짧은 V1, V2 및 V4 영역을 지닌 외막 당단백질을 암호화하는 아형 C 바이러스가 우연히 예상될 수 있는 것보다 상당히 더 높은 빈도로 수용자에게 전염되는 것으로 나타났다. 초기 감염으로부터의 아형 A 외막 서열은 또한, 상당히 더 짧은 V1 및 V2 루프를 갖고 있으며, 훨씬 덜 잠재적인 N-연결 글리코실화 부위를 갖고 있다 [참고: Chohan, B., D. et al. 2005. Selection for Human Immunodeficiency Virus Type 1 envelope glycosylation variants with shorter V1-V2 loop sequences occurs during transmission of certain genetic subtypes and may impact viral RNA levels. J. Virol. 79:6528-6531]. 이와는 달리, 최근에 전염된 아형 B 변이체는 보다 짧은 V1 및 V2 루프를 갖고 있지 않았다. 그러나, 아형 B 감염 증례가 주로 동성애자간 전염이나 약물 주사 사용에 따른 결과였다는 것을 인지하는 것이 중요할 수 있다. 더우기, 연구 결과는 조밀한 V1, V2 영역을 갖는 것에 따른 가능한 기능적 결과는 CD4 결합성 도메인의 노출을 증가시킨 다음, 중화에 대한 감수성을 증강시키는 것이란 사실을 제안하였다 [참고: Edwards, T. G., et al. 2001. Relationships between CD4 independence, neutralization sensitivity, and exposure of a CD4-induced epitope in a Human Immunodeficiency Virus type 1 envelope protein. J. Virol. 75:5230-5239; Kolchinsky, P., et al. 2001. Increased neutralization sensitivity of CD4-independent Human Immnuodeficiency Virus variants. J. Virol. 75:2041-2050; Pickora, C., et al. 2005. Identification of two N-linked glycosylation sites within the core of the Simian Immunodeficiency virus glycoprotein whose removal enhances sensitivity to soluble CD4. J. Virol. 79: 12575-12583; Puffer, B. A., et al. 2002. CD4 independent of Simian Immunodeficiency Virus Envs is associated with macrophage tropism, neutralization sensitivity, and attenuated pathogenicity. J. Virol. 76:2595-2605]. 본 발명자들은 아형 B 컨센서스 서열을 생성시킨 경우에 V1 및 V2 영역을 단축시켰다.The consensus sequence has advantages and disadvantages in theory. Because consensus sequences are generated based on isolates that occur simultaneously, they may be genetically more closely related to viral strains currently circulating than any given natural viral isolate. However, since comprehensive sequencing is generally performed using viruses sampled during chronic infection instead of viruses sampled during acute infection, it can be disadvantageous to generate consensus vaccine responses on epitopes, most of which have escaped. In order to minimize these drawbacks, our useful strategy for vaccine design would be to consider the initial messenger sequence. Among the most difficult HIV proteins to construct artificially, there is an outer membrane protein, because the hypervariable region of the HIV-1 outer membrane gene gradually develops by rapid insertion and deletion, but not by point mutations. Due to the difference in length of the hypervariable regions, it is difficult to generate consensus sequences of these regions. Recently, see Gao, F., E et al. 2005. Antigenicity and immunogenicity of a synthetic human immunodeficiency virus type 1 group m consensus envelope glycoprotein. J Virol 79:1154-63] generated group M consensus outer membrane sequences, but non-consensus sequences from the corresponding regions of the CRF08 BC recombinant strain were used for these variable regions. Studies have shown that the subtype C virus, which encodes an outer membrane glycoprotein with shorter V1, V2 and V4 regions, is transmitted to recipients at a significantly higher frequency than would be accidentally expected. The subtype A outer membrane sequence from early infection also has significantly shorter V1 and V2 loops, and a much less potential N-linked glycosylation site [Chohan, B., D. et al. 2005. Selection for Human Immunodeficiency Virus Type 1 envelope glycosylation variants with shorter V1-V2 loop sequences occurs during transmission of certain genetic subtypes and may impact viral RNA levels. J. Virol. 79:6528-6531]. In contrast, the recently transmitted subtype B variants did not have shorter V1 and V2 loops. However, it may be important to note that cases of subtype B infection were primarily the result of homosexual transmission or drug injection. Furthermore, the results of the study suggested that the possible functional outcome of having a dense V1, V2 region is to increase the exposure of the CD4 binding domain and then enhance the susceptibility to neutralization [Reference: Edwards, TG, et al. 2001. Relationships between CD4 independence, neutralization sensitivity, and exposure of a CD4-induced epitope in a Human Immunodeficiency Virus type 1 envelope protein. J. Virol. 75:5230-5239; Kolchinsky, P., et al. 2001. Increased neutralization sensitivity of CD4-independent Human Immnuodeficiency Virus variants. J. Virol. 75:2041-2050; Pickora, C., et al. 2005. Identification of two N-linked glycosylation sites within the core of the Simian Immunodeficiency virus glycoprotein whose removal enhances sensitivity to soluble CD4. J. Virol. 79: 12575-12583; Puffer, B. A., et al. 2002. CD4 independent of Simian Immunodeficiency Virus Envs is associated with macrophage tropism, neutralization sensitivity, and attenuated pathogenicity. J. Virol. 76:2595-2605]. We shortened the V1 and V2 regions when generating the subtype B consensus sequence.

HIV-1 감염의 초기 상은 서서히 복제하고 그들의 주요 공동-수용체로서 CCR5를 사용하는 비-합포체-유도성 (NSI) 바이러스가 다수를 차지하고 있다. 가속 CD4 세포 강하 및 감염의 점진적 임상 과정에 앞서 감염된 개체의 약 50％에서 나타나는 합포체-유도성 (SI) 바이러스는 주요 공동-수용체로서 CXCR4를 사용한다. HIV 변이체의 차별적 공동-수용체 활용이 모든 아형에 대해 입증되었다. 아형 C 바이러스는 대부분의 기타 아형과 상이한 것으로 여겨지는데, 이는 아형 C에서 HIV 변이체를 이용한 CXCR4의 과소 표시가 자주 보고되었기 때문이다. 따라서, CCR5 활용이 백신 설계에 있어 극히 중요하게 고려되어야 한다. 기존의 보고서는 gp120의 V3 영역이 공동-수용체 활용에 중요한 역할을 하는 것으로 제시하였다. V3 루프 중의 6개 잔기가 CCR5 상호 작용에 결정적인 것으로 확인되었다: 아르기닌307, 리신314, 이소루이신316, 아르기닌322, 페닐알라닌324 및 알라닌337. 그러나, 아형 C 초기 전달자의 서열을 기초로 하여, 위치 322에서의 잔기는 아르기닌 대신 글루타민이어야 한다. 요약하면, 초기 전달자의 서열과 CCR5 활용에 중요한 잔기를 나타내는 기존의 연구를 근거로 하여, 본 발명자들은 이론상 CCR5 공동-수용체 활용을 표적으로 할 수 있는 면역 반응을 구동시킬 수 있었던 아형 B 컨센서스 외막 면역원을 설계하였다.The early phase of HIV-1 infection is dominated by non-conjugate-inducing (NSI) viruses that replicate slowly and use CCR5 as their main co-receptor. The syncytial-inducible (SI) virus, which appears in about 50% of infected individuals prior to accelerated CD4 cell drop and the gradual clinical course of infection, uses CXCR4 as the major co-receptor. Differential co-receptor utilization of HIV variants has been demonstrated for all subtypes. The subtype C virus is believed to be different from most other subtypes because under-expression of CXCR4 with the HIV variant in subtype C has been frequently reported. Therefore, the use of CCR5 should be considered extremely important in vaccine design. Previous reports have suggested that the V3 domain of gp120 plays an important role in co-receptor utilization. Six residues in the V3 loop were found to be critical to the CCR5 interaction: arginine 307, lysine 314, isoleucine 316, arginine 322, phenylalanine 324 and alanine 337. However, based on the sequence of the subtype C early messenger, the residue at position 322 should be glutamine instead of arginine. In summary, based on previous studies indicating the sequence of the initial messenger and residues important for CCR5 utilization, the inventors of the present invention have theoretically suggested that the subtype B consensus outer membrane immunogen could drive an immune response that could target CCR5 co-receptor utilization Was designed.

잠재적 교차 반응성을 최대화하기 위해, HIV-1 군 M 컨센서스 외막 서열을 창출시켰다. 그러나, 아형 특이적 외막 컨센서스 백신이 적어도 세포성 면역 반응 수준에서 순환성 바이러스와 비교해서 백신 항원의 전반적인 서열 유사성에 대한 보상을 나타낼 수 있는 것이 가능하다. 연구 결과, 아형 B 및 C 외막 단백질의 상이한 영역에서 높은 선별율이 확인된 것으로 밝혀졌다. 이는 아형 B 및 C에서 외막 단백질의 상이한 영역 상에서의 상이한 면역 압력에 의해 유발될 수 있다. 따라서, 아형 특이적 외막 백신을 사용하는 것이 유리할 수 있는데, 이는 백신 및 순환성 바이러스에 대한 면역 반응이 항원 도메인을 공유할 수도 있기 때문이다. 이러한 문제를 추가로 명료하게 하기 위해서는, 군 M 및 아형 특이적 외막 백신을 비교하는 더 많은 실험이 필요하다.To maximize potential cross-reactivity, an HIV-1 group M consensus outer membrane sequence was created. However, it is possible that a subtype-specific outer membrane consensus vaccine may exhibit compensation for the overall sequence similarity of the vaccine antigen compared to circulating viruses, at least at the level of cellular immune response. As a result of the study, it was found that high selectivity was confirmed in different regions of the subtype B and C outer membrane proteins. This can be caused by different immune pressures on different regions of the outer membrane protein in subtypes B and C. Thus, it may be advantageous to use a subtype specific outer membrane vaccine, since the vaccine and immune responses to circulating viruses may share antigenic domains. To further clarify this problem, more experiments are needed comparing group M and subtype specific outer membrane vaccines.

컨센서스 서열을 사용하는 것과 관련한 또 다른 중요한 우려는 그의 서열이 어떠한 천연 바이러스에서도 발견되지 않은 조합의 다형성과 연관이 있을 수 있으므로, 잠재적으로 부적절한 단백질 입체 형태가 생성될 수 있다는 것이다. 기존의 연구 결과, 군 M 컨센서스 면역원이 천연 입체 형태로 폴딩될 수 있었고, 외막 항원성 에피토프를 보존할 수 있으며 약한 중화 항체 반응을 유도시킬 수 있었다고 나타났다. 합성 단백질이 항체 2G12, ID6 및 F105와 결합할 수 있었다는 사실에 기초하여, 본 발명자들은 pEY2E1-B가 다소 천연 구조적 입체 형태를 지닐 수 있다고 생각하였다. 중요하게도, 본 발명자들의 데이터는 또한, EY2E1-B 면역원이 보다 고-역가 아형 B 외막-특이적 항체를 유도시킬 수 있었다는 것을 입증하였는데, 이는 이러한 합성 면역원이 보다 많은 부류 II 에피토프를 또한 보존할 수 있다는 지표이다. 이러한 분야에 관한 보다 많은 연구가 중요할 것이다.Another important concern with the use of consensus sequences is that their sequences may be associated with combinatorial polymorphisms not found in any natural virus, resulting in potentially inappropriate protein conformations. As a result of previous studies, it was shown that the group M consensus immunogen could be folded into a natural three-dimensional form, preserved epitope antigenic epitopes, and induced a weak neutralizing antibody response. Based on the fact that the synthetic protein was able to bind antibodies 2G12, ID6 and F105, the inventors thought that pEY2E1-B may have a somewhat natural structural conformation. Importantly, our data also demonstrated that the EY2E1-B immunogen was able to induce more high-titer subtype B outer membrane-specific antibodies, which this synthetic immunogen could also preserve more class II epitopes. It is an indicator that there is. More research in these areas will be important.

신규 HIV-1 백신 전략이 개발됨에 따라, 임상전 모델을 사용하여 인간에게서 이들 백신의 효능을 예측하고자 하는 수요가 또한 증가하고 있다. 본 발명자들의 연구에서는, HLA-A2 트랜스제닉 마우스를 사용하여 합성 면역원에 의해 유도된 세포성 면역 반응을 연구하였다. 연구 결과, 이러한 트랜스제닉 균주가 인간 CD8+ 세포용해성 T 세포의 최적의 자극과 관련된 감염성 질병에 대한 백신을 설계 및 시험하는 데에 있어서 중요한 임상전 모델이란 사실이 밝혀졌다. 이러한 모델에서의 결과는 EY2E1-B가 EK2P-B와 비교해서 훨씬 더 광범위하고 강력한 세포성 면역 반응을 유도시킬 수 있었다고 표시하였는데, 이는 상기 신규 백신이 HLA-A2-제한된 세포성 반응을 유도시키는 데에 보다 강력할 수 있었다는 사실을 제안한다. 비인간 영장류에서 이러한 면역원에 관한 추가의 연구가 계획 중에 있다.As new HIV-1 vaccine strategies are developed, there is also an increasing demand to predict the efficacy of these vaccines in humans using preclinical models. In our study, HLA-A2 transgenic mice were used to study cellular immune responses induced by synthetic immunogens. Studies have shown that this transgenic strain is an important preclinical model for designing and testing vaccines against infectious diseases associated with optimal stimulation of human CD8+ cytolytic T cells. The results in this model indicated that EY2E1-B was able to induce a much more extensive and potent cellular immune response compared to EK2P-B, indicating that the novel vaccine induced HLA-A2-restricted cellular responses Suggests that it could have been more powerful. Further studies on these immunogens in non-human primates are pending.

종합해 보면, 본 발명자들의 연구 결과는 EY2E1-B가 DNA 백신 카세트로서 CTL 반응의 크기와 폭 둘 다를 증가시키는 면역원으로서 제공된다는 사실을 제안하고 있다. 보다 일반적인 측면에서 보면, 상기 구조물은 비-DNA 벡터 접근 방식에서 HIV 균주에 대한 보다 강력하고 광범위한 세포성 면역 반응을 유도하기 위한 기타 플랫폼에 유용할 수 있다.Taken together, our findings suggest that EY2E1-B serves as a DNA vaccine cassette as an immunogen that increases both the size and breadth of the CTL response. In a more general aspect, the construct may be useful for other platforms to induce a stronger and broader cellular immune response against HIV strains in a non-DNA vector approach.

실시예 2: 유도된 세포성 면역 반응의 다양성과 폭을 증강시켜 주는, 공학적으로 처리시킨 신규한 HIV-1 분기군 C 외막 DNA 백신의 개발Example 2: Development of an engineered novel HIV-1 clade C outer membrane DNA vaccine that enhances the diversity and breadth of the induced cellular immune response

강력한 HIV-1 특이적 CTL 반응은 급성 및 무증후성 감염 동안 바이러스성 부하를 관리하는 데에 중요한 역할을 한다. 그러나, 컨센서스 면역원에 관한 최근의 연구는 개선된 세포성 면역 반응을 현저히 입증할 수 없었다. 본 실시예에서 본 발명자들은 개선된 세포성 면역 반응을 알아보기 위해 공학적으로 처리시킨 신규한 분기군 C 컨센서스에 의거한 외막 면역원을 시험하였다. 신규 백신 (pEY3E1-C)을 HIV-1 분기군 C 컨센서스 외막 서열로부터 창출시켰다. 몇 가지 변형을 수행하였는데, 이에는 초기 전달자 서열에 기준한 고도로 가변적인 V1 및 V2 영역의 단축, CCR5 활용을 위한 V3 루프의 잔류, 외막 재순환을 방지하기 위해 C-말단으로부터의 세포질성 미부 영역 제거, 및 적당한 폴딩을 위한 절단 부위 및 TMD의 잔류가 포함된다. 또한, IgE 리더 서열을 N-말단에 가하였다. 이러한 컨센서스 DNA 백신을 또한 RNA 최적화 및 코돈 최적화시켰다. 세포성 면역 반응은 ELISpot 및 에피토프 지도화 검정을 통하여 BalB/C 마우스에서 연구하였다. pEK3P-C (분기군 C env의 일차 단리물로부터 유래됨)과 비교해서 DNA 백신으로서 연구한 경우, 본 발명자들의 구조물 (pEY3E1-C)이 세포성 면역 반응을 구동하는 데에 있어서 보다 더 유효하였다. pEY3E1-C는 컨센서스 분기군 C 펩티드로써 자극하는 경우에 pEK3P-C보다 더 큰 크기의 세포성 면역 반응을 유도시켰다. 부가적으로, 컨센서스 면역원은 분기군 C로부터의 일차 단리물 펩티드의 2가지 기타 세트로써 자극하는 경우에 세포성 면역 반응의 크기 증가를 유도시켰다. 크기 증대 이외에도, 29개의 강력하게 반응성인 펩티드 풀 (비장 세포 100만개 당 50개 이상의 스팟을 갖는다) 중의 15개 이상을 유도시킬 수 있는 pEY3E1-C의 능력에 의해 CTL 반응의 폭 증강이 뒷받침되는 반면, pEK3P-C은 반응 폭을 평가하기 위한 엄격한 대조군으로서 제공될 수 있는 능력과 독특성 때문에 선택된 2개의 일차 단리물 펩티드 세트에 반응하여 강력한 반응성을 나타내는 29개 풀 중의 3개 풀 및 29개 풀 중의 9개 풀 만을 유도시켰다. 더우기, pEY3E1-C는 분기군 B 펩티드로 자극하는 경우에 보다 강력한 교차-분기군 세포성 면역 반응을 유도시켰다. 컨센서스 면역원 pEY3E1-C는 DNA 백신 카세트로서 CTL 반응의 크기와 폭 둘 다를 증강시켜 준는데, 이는 컨센서스 면역원이 HIV 백신 칵테일에서 성분 항원으로서 제공될 수 있다는 잠재력을 추가로 조사할 가치가 있다는 것을 제안하고 있다.The strong HIV-1 specific CTL response plays an important role in managing the viral load during acute and asymptomatic infections. However, recent studies on consensus immunogens have not been able to significantly demonstrate an improved cellular immune response. In this example, the present inventors tested an adventitial immunogen based on a novel clade C consensus engineered to investigate an improved cellular immune response. A new vaccine (pEY3E1-C) was created from the HIV-1 clade C consensus outer membrane sequence. Several modifications were performed, including shortening of the highly variable V1 and V2 regions based on the initial messenger sequence, retention of the V3 loop for CCR5 utilization, and removal of the cytoplasmic tail region from the C-terminus to prevent outer membrane recycling. , And the cleavage site for proper folding and the retention of the TMD. In addition, an IgE leader sequence was added to the N-terminus. This consensus DNA vaccine was also RNA optimized and codon optimized. Cellular immune responses were studied in BalB/C mice via ELISpot and epitope mapping assays. When studied as a DNA vaccine compared to pEK3P-C (derived from the primary isolate of clade C env), our construct (pEY3E1-C) was more effective in driving a cellular immune response. . pEY3E1-C induced a larger-sized cellular immune response than pEK3P-C when stimulated with the consensus clade C peptide. Additionally, the consensus immunogen induced an increase in the magnitude of the cellular immune response when stimulated with two other sets of primary isolate peptides from clade C. In addition to the size increase, the enhancement of the breadth of the CTL response is supported by the ability of pEY3E1-C to induce more than 15 out of a pool of 29 strongly reactive peptides (having more than 50 spots per million spleen cells). In addition, pEK3P-C exhibited strong reactivity in response to two sets of primary isolate peptides selected because of its uniqueness and ability to serve as a stringent control for assessing response width. Only 9 grasses were induced. Moreover, pEY3E1-C induced a more potent cross-clan cellular immune response when stimulated with clade B peptide. The consensus immunogen pEY3E1-C is a DNA vaccine cassette that enhances both the size and breadth of the CTL response, suggesting that it is worth further investigating the potential that the consensus immunogen could serve as a component antigen in an HIV vaccine cocktail. have.

기존 균주의 광범위한 유전적 다양성, 신속한 돌연변이 및 재조합으로 인해, 유효한 백신을 개발하기가 상당히 곤란하다. 개개의 단리물로부터 유래된 후보 DNA 백신은 HIV-1의 다양한 순환성 균주에 대한 보호에 필요한 교차-반응성을 유도시킬 수 없을 수도 있다.Due to the wide genetic diversity, rapid mutation and recombination of existing strains, it is quite difficult to develop effective vaccines. Candidate DNA vaccines derived from individual isolates may not be able to induce the cross-reactivity required for protection against various circulating strains of HIV-1.

부가적으로, HIV-1 외막 당단백질을 발현하는 DNA 백신은 극히 면역원성이 아닌 것으로 보고되었다.Additionally, it has been reported that DNA vaccines expressing the HIV-1 outer membrane glycoprotein are not extremely immunogenic.

본 발명자들은 바이러스의 순환성 균주에 대한 보호를 가능한 제공하기 위해 DNA 백신에 의해 유도된 CTL 반응의 효력을 증가시키기 위한 다상 전략을 사용하였다.We used a multiphase strategy to increase the potency of the CTL response induced by DNA vaccines to provide possible protection against circulating strains of the virus.

최근의 연구 결과, 컨센서스 면역원이 신속하게 진화하는 HIV-1 바이러스에 의해 창출된 다양성 장애를 극복할 수 있는 것으로 밝혀졌다.Recent studies have shown that consensus immunogens can overcome the diversity barrier created by the rapidly evolving HIV-1 virus.

데르데인 (Derdeyn) 등은 보다 짧은 V1-V4 영역이 초기 전염성 아형 C 바이러스의 특징이란 사실을 밝혀내었고, 본 발명자들의 구조물은 초기 전염된 바이러스로부터 비롯되는 면역 반응을 생성시키는 데에 유용할 수도 있는 상기 특징을 수반하도록 설계하였다.Derdeyn et al. have found that shorter V1-V4 regions are characteristic of early infectious subtype C viruses, and our constructs may be useful for generating immune responses resulting from early infectious viruses. It was designed to accompany the above features.

더우기, 본 발명의 DNA 백신의 발현 수준은 코돈 최적화, RNA 최적화, 및 면역글로불린 리더 서열의 부가에 의해 증강되었다.Moreover, the expression level of the DNA vaccine of the present invention was enhanced by codon optimization, RNA optimization, and addition of immunoglobulin leader sequences.

HIV-1 특이적 CTL 반응은 급성 및 무증후성 감염 동안의 바이러스성 부하 및 AIDS 발병을 제어하는 데에 있어서 중요한 것으로 밝혀졌으므로, 다음 데이터는 본 발명의 신규 면역원에 의해 유도된 CTL 반응에 초점을 두고 있다.As HIV-1 specific CTL responses have been found to be important in controlling viral load and the onset of AIDS during acute and asymptomatic infections, the following data focuses on the CTL responses induced by the novel immunogens of the present invention. have.

도 13은 유도된 세포성 면역 반응의 다양성과 폭을 증강시키는, 공학적으로 처리시킨 신규한 HIV-1 분기군 C 외막 DNA 백신을 개발하기 위한 면역원 설계를 도시한 것이다.FIG. 13 shows an immunogen design to develop a novel engineered HIV-1 clade C outer membrane DNA vaccine that enhances the diversity and breadth of the induced cellular immune response.

도 14는 계통발생학적 관계를 도시한 것이다: 36개 HIV-1 아형 C 외막 서열, EY3E1-C, EK3P-C, 2개의 아형 B, 1개의 아형 A 및 1개의 아형 D 서열 (외집단)을 계통발생학적 분석에 포함시켰다. 광범위한 다양성 샘플을 나타내는 아형 C 외막 서열은 12개 국가로부터 유래되었다.Figure 14 shows the phylogenetic relationship: lineage of 36 HIV-1 subtype C outer membrane sequences, EY3E1-C, EK3P-C, 2 subtype B, 1 subtype A and 1 subtype D sequence (external population). Included in embryological analysis. Subtype C outer membrane sequences representing a wide variety of samples were derived from 12 countries.

표 3은 잠재적 외막 백신 후보와 아형 C 외막 서열 정렬 간의 유사율 스코어 평균 및 범위 (％)를 나타낸다.Table 3 shows the mean and range (%) similarity scores between potential outer membrane vaccine candidates and subtype C outer membrane sequence alignment.

평균 유사율 스코어 (％)Average similarity score (%) 유사율 스코어 범위 (％)Similarity score range (%) pEY3E1-BpEY3E1-B 85.385.3 82.7-93.182.7-93.1 pEK3P-CpEK3P-C 87.487.4 83.6-90.283.6-90.2

3마리 Balb/C 마우스 3개 군을 100 ㎍의 DNA로 2주 간격으로 3회 면역시켰다. 7번째 주에, 세포성 연구를 위해 비장을 수거하였다.Three groups of three Balb/C mice were immunized three times with 100 µg of DNA every two weeks. On the 7th week, spleens were harvested for cellular studies.

도 15 패널 A 및 B에 도시된 바와 같이, pEY3E1-C에 의해 강력한 세포성 반응이 유도되었다.As shown in Figure 15 panels A and B, a strong cellular response was induced by pEY3E1-C.

도 16은 pEY3E1-C에 의해 유도된 강력하고 광범위한 세포성 반응을 도시한 것이다. 컨센서스 C env 펩티드의 29개 풀로 자극한 경우: pEY3E1-C 백신접종한 마우스는 23개 풀로부터 비장 세포 100만개 당 50개 이상의 스팟을 유도시켰고; pEK3P-C 백신접종한 마우스는 2개 풀로부터 비장 세포 100만개 당 50개 이상의 스팟을 유도시켰다.Figure 16 shows the potent and extensive cellular responses induced by pEY3E1-C. When stimulated with 29 pools of consensus C env peptides: pEY3E1-C vaccinated mice induced more than 50 spots per million splenocytes from 23 pools; Mice vaccinated with pEK3P-C induced more than 50 spots per million splenocytes from two pools.

도 17 패널 A-D는 동일한 분기군 내에서 pEY3E1-C에 의해 유도된 교차-반응성 세포성 반응을 도시한 것이다.Figure 17 Panels A-D depict cross-reactive cellular responses induced by pEY3E1-C within the same clade.

도 18 패널 A 및 B는 pEY3E1-C에 의해 유도된 강력하고 광범위한 교차-반응성 세포성 반응을 도시한 것이다. 패널 A는 아형 C (우루과이) env-특이적 IFN-γ ELISpot으로부터의 데이터를 나타낸다. 분기군 C (우루과이) env 펩티드의 29개 풀로 자극한 경우: pEY3E1-C 백신접종한 마우스는 12개 풀로부터 비장 세포 100만개 당 50개 이상의 스팟을 유도시켰고; pEK3P-C 백신접종한 마우스는 3개 풀로부터 비장 세포 100만개 당 50개 이상의 스팟을 유도시켰다. 패널 B는 아형 C (남아프리카) env-특이적 IFN-γ ELISpot으로부터의 데이터를 나타낸다. 분기군 C (남아프리카) env 펩티드의 29개 풀로 자극한 경우: pEY3E1-C 백신접종한 마우스는 13개 풀로부터 비장 세포 100만개 당 50개 이상의 스팟을 유도시켰고; pEK3P-C 백신접종한 마우스는 5개 풀로부터 비장 세포 100만개 당 50개 이상의 스팟을 유도시켰다.18 Panels A and B depict potent and extensive cross-reactive cellular responses induced by pEY3E1-C. Panel A shows data from subtype C (Uruguay) env-specific IFN-γ ELISpot. When stimulated with 29 pools of clade C (Uruguay) env peptides: mice vaccinated with pEY3E1-C induced more than 50 spots per million splenocytes from 12 pools; Mice vaccinated with pEK3P-C induced more than 50 spots per million splenocytes from three pools. Panel B shows data from subtype C (South Africa) env-specific IFN-γ ELISpot. When stimulated with 29 pools of clade C (South Africa) env peptides: pEY3E1-C vaccinated mice induced more than 50 spots per million splenocytes from 13 pools; Mice vaccinated with pEK3P-C induced more than 50 spots per million splenocytes from 5 pools.

도 19 패널 A-F는 분기군 사이에서 pEY3E1-C에 의해 유도된 강력한 교차-반응성 세포성 반응을 도시한 것이다.Figure 19 Panels A-F depict potent cross-reactive cellular responses induced by pEY3E1-C between clades.

EOC 면역원에 의해 유도된 세포성 면역 반응의 폭과 크기가 상당히 증가되었다. 보다 광범위한 교차-분기군 반응성이 이러한 면역원의 부가 이득으로서 여겨진다.The breadth and magnitude of the cellular immune response induced by the EOC immunogen was significantly increased. The broader cross-clan responsiveness is believed to be an added benefit of this immunogen.

실시예 3:Example 3:

E6/E7 융합 단백질을 암호화하는, 공학적으로 처리시킨 신규한 HPV-16 DNA 백신의 효능Efficacy of a novel engineered HPV-16 DNA vaccine encoding the E6/E7 fusion protein

폴리단백질로서 발현되도록 함으로써 E6 서열과 E7 서열이 단백질 분해적 절단 부위에 의해 분리되도록 면역원을 설계하였다. 폴리단백질은 또한 IgE 리더 서열을 이용하여 발현되었다. 폴리단백질 설계에는 p53 결합 및 분해에 있어 중요한 E6 서열 상의 결실 또는 돌연변이, 및 E7 단백질 상의 Rb 결합 부위에 있어서의 돌연변이가 포함된다. 도 23은 면역원 설계를 예시한 것이다.The immunogen was designed so that the E6 sequence and the E7 sequence were separated by proteolytic cleavage sites by allowing them to be expressed as a polyprotein. Polyproteins were also expressed using the IgE leader sequence. Polyprotein design includes deletions or mutations on the E6 sequence that are important for p53 binding and degradation, and mutations in the Rb binding site on the E7 protein. 23 illustrates immunogen design.

폴리단백질을 암호화하는 암호화 서열을 벡터 pVAX 내로 삽입하여 플라스미드 p1667을 생성시켰다. 도 24는 pVAX 및 p1667의 지도를 도시한 것이다.Plasmid p1667 was generated by inserting the coding sequence encoding the polyprotein into the vector pVAX. Figure 24 shows a map of pVAX and p1667.

TC1 종양 세포를 HPV-16 E7로 불멸화시키고, c-Ha-ras 종양형성 유전자로 형질전환시켰다. 이들 세포는 저 수준의 E7을 발현하고 극히 종양원성이다.TC1 tumor cells were immortalized with HPV-16 E7 and transformed with the c-Ha-ras tumorigenic gene. These cells express low levels of E7 and are extremely tumorigenic.

마우스를 대상으로 한 면역원성 연구에서는, C57BL6 마우스 한 군당 3마리 마우스에게 마우스당 100 ㎍의 DNA를 투여하였다. 여러 군에는 1) pVAX-대조군 벡터를 투여한 대조군 및 2) p1667을 투여한 시험군이 포함되었다. 마우스를 0, 14 및 28일째에 백신 접종하였다. 35일째에, 마우스를 희생시키고 ELISPOT를 수행하였다 (CMI에 초점을 맞춤).In an immunogenicity study in mice, 3 mice per group of C57BL6 mice received 100 μg of DNA per mouse. Several groups included 1) a control group administered with pVAX-control vector and 2) a test group administered with p1667. Mice were vaccinated on days 0, 14 and 28. On day 35, mice were sacrificed and ELISPOT was performed (focus on CMI).

DNA 면역원 p1667에 의해 유도된 세포성 면역 반응에 대한 데이터가 도 25에 도시되었다. HPV16 컨센서스 E6 및 E7 펩티드 (9개 aa가 중복되는 37, 15량체)를 2개 풀에 사용하였다 - 풀 1: 18개 펩티드; 풀 2: 19개 펩티드. 패널 A 및 C는 총 비장 세포로부터의 데이터를 나타낸다. 패널 B 및 D는 CD8 고갈시킨 샘플로부터의 데이터를 나타낸다.Data on the cellular immune response induced by the DNA immunogen p1667 is shown in Figure 25. HPV16 consensus E6 and E7 peptides (37, 15-mer overlapping 9 aa) were used in 2 pools-Pool 1: 18 peptides; Pool 2: 19 peptides. Panels A and C show data from total splenocytes. Panels B and D show data from CD8 depleted samples.

도 26은 면역우성 에피토프 지도화 결과를 도시한 것이다. 2개의 서열이 인지되었다.26 shows the results of immunodominant epitope mapping. Two sequences were recognized.

마우스를 대상으로 한 예방적 연구에서는, C57BL6 마우스 한 군당 5마리 마우스에게 마우스당 100 ㎍의 DNA를 투여하였다. 여러 군에는 1) 미처치 군 (PBS 주사함), 2) pVAX-대조군 벡터를 투여한 대조군 및 3) p1667을 투여한 시험군이 포함되었다. 마우스를 0, 14 및 28일째에 백신 접종하였다. 35일째에, 마우스를 TC-1 세포로 시험감염시킨 후, 종양 크기를 측정하였다. 그 결과가 도 27에 도시되었다. IL-15 구조물을 공동-투여한 군으로부터의 데이터가 또한 도시되었다.In a prophylactic study in mice, 5 mice per group of C57BL6 mice received 100 μg of DNA per mouse. Several groups included 1) untreated group (PBS injection), 2) a control group administered with a pVAX-control vector, and 3) a test group administered with p1667. Mice were vaccinated on days 0, 14 and 28. On day 35, mice were challenged with TC-1 cells and then tumor size was measured. The results are shown in Fig. 27. Data from the group co-administered with the IL-15 construct are also shown.

마우스를 대상으로 한 종양 퇴행 연구에서는, C57BL6 마우스 한 군당 5마리 마우스에게 마우스당 100 ㎍의 DNA를 투여하였다. 여러 군에는 1) 미처치 군 (PBS 주사함), 2) pVAX-대조군 벡터를 투여한 대조군 및 3) p1667을 투여한 시험군이 포함되었다. 마우스를 0일째에 5 X 104개 TC-1 세포로 시험감염시켰다. 3, 10 및 17일째에 마우스에게 DNA 백신을 투여하였다. 8일째부터 종양을 측정하기 시작하였다. 그 결과가 도 28에 도시되었다. IL-15 구조물을 공동-투여한 군으로부터의 데이터가 또한 도시되었다.In a tumor regression study in mice, 5 mice per group of C57BL6 mice received 100 μg of DNA per mouse. Several groups included 1) untreated group (PBS injection), 2) a control group administered with a pVAX-control vector, and 3) a test group administered with p1667. Mice were challenged with 5 X 10 4 TC-1 cells on day 0. On days 3, 10 and 17, mice were administered a DNA vaccine. Tumors were measured from the 8th day. The results are shown in Fig. 28. Data from the group co-administered with the IL-15 construct are also shown.

비장에서 E7 사량체 양성 림프구 수준을 결정하였다. 도 29는 E7 사량체 양성 림프구 ％로서의 데이터를 도시하였다. DNA 백신 p1667은 비장 내에서 CD62Llo인 E7-특이적 CD8+ T 세포의 활성화를 유도시킨다.The level of E7 tetramer positive lymphocytes in the spleen was determined. 29 shows data as% of E7 tetramer positive lymphocytes. DNA vaccine p1667 induces activation of E7-specific CD8+ T cells , CD62L lo, in the spleen.

종양에서 E7 사량체 양성 림프구 수준을 결정하였다. 도 30은 E7 사량체 양성 림프구 ％로서의 데이터를 도시하였다. DNA 백신 p1667은 종양 내에서 CD62Llo인 E7-특이적 CD8+ T 세포의 활성화를 유도시킨다.E7 tetramer positive lymphocyte levels in tumors were determined. 30 depicts data as% E7 tetramer positive lymphocytes. DNA vaccine p1667 induces activation of E7-specific CD8+ T cells , CD62L lo, in tumors.

트랜스제닉 마우스에서 E6/E7 DNA 백신 보호 연구를 수행하였다. 미처치, pVAX, p1667, p1667 + IL-15 및 E7/HisB를 서로 비교하였다. 데이터가 도 31에 도시되었다. p1667 및 p1667 + IL-15는 완전히 보호하였다.E6/E7 DNA vaccine protection studies were performed in transgenic mice. Untreated, pVAX, p1667, p1667 + IL-15 and E7/HisB were compared to each other. The data is shown in Figure 31. p1667 and p1667 + IL-15 were completely protected.

본 실시예에서 제시된 데이터는 다음 결론을 뒷받침해준다: p1667 구조물은 IFN-g 반응 상승을 매개하는 E7-특이적 CD8+ 림프구를 유도할 수 있는 강력한 세포성 면역 반응을 유도시킨다. 본 발명자들은 DNA 구조물을 투여한 후 그에 대하여 항원 특이적 CTL 반응을 생성시키는 신규한 준우성 및 우성 HPV-16 에피토프 둘 다를 확인하였다. p1667 구조물은 C57/BL6 및 트랜스제닉 마우스 둘 다에서 종양 성장을 방지할 수 있고 종양의 퇴행을 유발시킬 수 있다. DNA 백신 p1667은 극히 작은 HPV-관련 암을 표적으로 하는 신규한 치료 전략에 대한 대단한 가능성을 나타낸다.The data presented in this example support the following conclusions: The p1667 construct elicits a potent cellular immune response capable of inducing E7-specific CD8+ lymphocytes that mediate elevated IFN-g responses. We have identified both novel quasi-dominant and dominant HPV-16 epitopes that generate antigen-specific CTL responses to DNA constructs after administration. The p1667 construct can prevent tumor growth and cause regression of tumors in both C57/BL6 and transgenic mice. The DNA vaccine p1667 represents great potential for novel therapeutic strategies targeting extremely small HPV-related cancers.

실시예 4Example 4

HIV Env 컨센서스 서열을 암호화하는 핵산 서열은, 예를 들어 근육내 또는 피내 전달을 위한 전기천공 기술을 사용하여 각종의 기타 HIV 단백질, 예를 들어 Gag, Pol, Gag/Pol, Nef, Vif, 및 Vpr을 암호화하는 핵산 서열과 병용해서 DNA 백신으로서 투여할 수 있다. 다가 HIV 백신 구조물은 증강된 면역 반응을 제공할 수 있으므로 특히 유용하다. 몇몇 양태에서는, IL-12 암호화 서열이 부가적으로 제공된다. 본원에 참고로 도입되는 미국 공개특허공보 제20070106062호에는 HIV Vif DNA 백신이 기재되어 있다. 본원에 참고로 도입되는 미국 공개특허공보 제20040106100호에는 HIV 보조 단백질을 포함하는 HIV 백신 뿐만 아니라 부가의 백신 구조물을 제조하기 위해 사용될 수 있는 상기 단백질의 서열이 기재되어 있다. 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제6,468,982호, 제5,817,637호, 및 제5,593,972호에는 HIV gag, HIV pol 및 HIV gag/pol 구조물을 포함한 DNA 백신이 기재되어 있다. 전기천공은 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제7,245,963호에 기재되어 있다. 본원에 참고로 도입되는 PCT 특허출원 PCT/US97/19502에는 IL-12 구조물이 기재되어 있다. 본원에 참고로 도입되는 미국 공개특허공보 제20070041941호에는 IL-15를 암호화하는 구조물이 기재되어 있다.Nucleic acid sequences encoding the HIV Env consensus sequence can be prepared using electroporation techniques for intramuscular or intradermal delivery, for example, various other HIV proteins, such as Gag, Pol, Gag/Pol, Nef, Vif, and Vpr. It can be administered as a DNA vaccine in combination with a nucleic acid sequence encoding Multivalent HIV vaccine constructs are particularly useful as they can provide an enhanced immune response. In some embodiments, an IL-12 coding sequence is additionally provided. US Patent Publication No. 20070106062, which is incorporated herein by reference, describes an HIV Vif DNA vaccine. US Patent Publication No. 20040106100, which is incorporated herein by reference, describes sequences of these proteins that can be used to prepare HIV vaccines, as well as additional vaccine constructs, comprising an HIV helper protein. U.S. Patent Nos. 6,468,982, 5,817,637, and 5,593,972, which are incorporated herein by reference, describe DNA vaccines comprising HIV gag, HIV pol and HIV gag/pol constructs. Electroporation is described in US Pat. No. 7,245,963, incorporated herein by reference. The IL-12 structure is described in PCT patent application PCT/US97/19502, which is incorporated herein by reference. US Patent Publication No. 20070041941, which is incorporated herein by reference, describes a structure encoding IL-15.

실시예 5Example 5

짧은 꼬리 원숭이 2개 군을 플라스미드 IL-12를 수반하거나 수반하지 않으면서 최적화된 플라스미드 gag 및 env 구조물로 3회 IM 면역시켰다. 2개의 부가 군에 대해서 동일한 면역 전략을 사용하였는데, 단 플라스미드는 생체내 전기천공을 수반하거나 수반하지 않으면서 전달하였다.Two groups of macaque monkeys were IM immunized three times with the optimized plasmid gag and env constructs with or without plasmid IL-12. The same immunization strategy was used for the two additional groups, except that the plasmid was delivered with or without in vivo electroporation.

각 면역 후 및 기억 반응을 위해 5개월 후에 IFNγ ELISpot함으로써 세포성 반응을 결정하였다. 연구 전반에 걸쳐 재조합 p24 및 gp160 ELISA에 의해 체액성 반응을 평가하였다. 항원 특이적 T 세포의 증식 능력을 CFSE 염색에 의해 결정하였다. 세포내 사이토킨 염색을 수행하여, 상기 유도시킨 T 세포 반응의 기능적 특징을 추가로 성상 확인하였다.Cellular responses were determined by IFNγ ELISpot 5 months after each immunization and for memory responses. The humoral response was evaluated by recombinant p24 and gp160 ELISA throughout the study. The proliferative ability of antigen-specific T cells was determined by CFSE staining. By performing intracellular cytokine staining, functional characteristics of the induced T cell response were further confirmed.

플라스미드 IL-12는 본 발명자들의 최적화된 구조물에 대한 세포성 반응을 증강시켰다. 그러나, 플라스미드의 전달을 증강시키기 위해 전기천공을 사용하는 것은 플라스미드 IL-12를 이용한 IM 면역과 비교해서 세포성 반응과 체액성 반응 둘 다를 개선시킬 수 있었다. 플라스미드 IL-12와 전기천공을 병용한 결과, 각종 파라미터에 의해 측정된 바와 같이 일차 및 기억 모두의 가장 우수한 면역 반응이 유발되었다.Plasmid IL-12 enhanced cellular responses to our optimized constructs. However, using electroporation to enhance delivery of plasmids could improve both cellular and humoral responses compared to IM immunity with plasmid IL-12. As a result of the combination of plasmid IL-12 and electroporation, the best immune response of both primary and memory was induced as measured by various parameters.

DNA 아주반트로서 플라스미드 IL-12의 존재 또는 부재 하에 붉은털 짧은 꼬리 원숭이에게서 HIV gag 및 env를 암호화하는 최적화된 DNA 구조물을 비교하였다. IL-12는 정량적 ELISpot 포맷에서 T 세포 반응을 실질적으로 5배 증가시켜 실질적으로 보다 우수한 기억 T 세포 반응을 유발시킬 수 있었다. 그러나, EP 전달된 DNA는 T 세포 반응과 기억을 생성시키는데 있어서 보다 효율적이었는데, 이는 IL-12 IM 아주반트된 DNA 백신과 비교해서 2배 더 높았다. EP + IL- 12 아주반트의 병용 요법 군 (combination arm)에서 가장 우수한 반응이 관찰되었다. 이러한 군에서의 기억 반응은 IM DNA 단독보다 10배 더 높았고 EP 단독보다 대략 2배 더 높았다. 본 발명자들은 또한, EP 단독과 비교해서 EP + IL-12 군에서 CFSE에 의해 4배 더 우수한 면역 확장을 관찰하였다. 다기능성 T 세포의 존재 또한, DNA + 사이토킨 + EP 군이 가장 유효하다는 사실을 제안하였다. Optimized DNA constructs encoding HIV gag and env in rhesus macaques with or without plasmid IL-12 as DNA adjuvant were compared. IL-12 could substantially increase the T cell response by a factor of 5 in the quantitative ELISpot format, resulting in a substantially better memory T cell response. However, the EP delivered DNA was more efficient in generating T cell responses and memories, which was 2 times higher compared to the IL-12 IM adjuvanted DNA vaccine. The best response was observed in the combination arm of EP + IL-12 adjuvant. The memory response in this group was 10 times higher than IM DNA alone and approximately 2 times higher than EP alone. We also observed a 4-fold better immune expansion by CFSE in the EP + IL-12 group compared to EP alone. The presence of multifunctional T cells also suggested that the DNA + cytokine + EP group is most effective.

재료 및 방법Materials and methods

동물:animal:

붉은털 짧은 꼬리 원숭이 (Macaca mulatta)는 미국 실험실용 동물 보호 인가협회의 표준에 따라서 바이오쿠얼, 인코포레이티드 [BIOQUAL, Inc. (Rockville, MD)]에서 사육하였다. 실험에 앞서 검역소에서 30일 이상 동안 동물을 새 환경에 순응시켰다.The rhesus macaque ( Macaca mulatta ) is BioQUAL, Inc. (Rockville, MD)]. Prior to the experiment, animals were acclimated to the new environment for at least 30 days in quarantine.

면역: Immunity :

5마리 붉은털 짧은 꼬리 원숭이를 0, 4, 및 11주째에 1.O mg의 pGag4Y 및 pEY2E1-B로 면역시켰다. 각 면역 시점에서 DNA를 2개의 주사 부위 (각각 대퇴사두근 내에 있음) 내로 전달하였다. 짧은 꼬리 원숭이 3마리를 IM 주사 후 전기천공시켰다. 또 다른 5마리 붉은털 원숭이 군을 0, 4, 및 8주째에 1.O mg의 pGag4Y, pEY2E1-B, 및 WLV104로 면역시켰다. 5마리 동물 중에서, 2마리 동물은 IM 주사함으로써 면역시켰고, 3마리 동물은 IM 주사 후에 전기천공시켰다. 모든 전기천공 과정은 일정 전류 콜렉트라 (Cellectra™) 장치 (공급처: VGX Immune Therapeutics Division of VGX Pharmaceuticals, The Woodlands, TX)를 사용하여 수행하였다. 전기천공 조건은 0.5 Amp, 3 펄스, 52 msec 펄스 길이 (펄스 간극 1초)였다. 이러한 소프트웨어-제어식 장치는 플라스미드 전달 및 일정 전류 구형파 (square wave) 펄스의 발생 직전에 조직 내성을 측정하도록 설계하여, 근육 조직 외부로의 전달과 잠재적 플라스미드 손실 위험을 없앴다.Five rhesus macaques were immunized with 1.0 mg of pGag4Y and pEY2E1-B at 0, 4, and 11 weeks. At each immunization time point, DNA was delivered into two injection sites (each within the quadriceps muscle). Three macaque monkeys were electroporated after IM injection. Another group of 5 rhesus monkeys were immunized with 1.O mg of pGag4Y, pEY2E1-B, and WLV104 at 0, 4, and 8 weeks. Of the 5 animals, 2 animals were immunized by IM injection, and 3 animals were electroporated after IM injection. All electroporation procedures were performed using a constant current collector (Cellectra™) device (VGX Immune Therapeutics Division of VGX Pharmaceuticals, The Woodlands, TX). Electroporation conditions were 0.5 Amp, 3 pulses, and 52 msec pulse length (pulse gap 1 second). These software-controlled devices are designed to measure tissue tolerance just prior to plasmid delivery and the occurrence of constant current square wave pulses, eliminating the risk of delivery outside muscle tissue and potential plasmid loss.

혈액 수집: Blood collection :

동물을 대상으로 하여 연구 기간 동안 2주 마다 방혈시켰다. 10 ml의 혈액을 EDTA 튜브에 수집하였다. PBMC를 표준 피콜-하이파크 (Ficoll-hypaque) 원심분리에 의해 단리시킨 다음, 완전 배양 배지 (10％ 열 불활성화 태아 소 혈청, 100 IU/ml 페니실린, lOO ㎍/ml 스트렙토마이신 및 55 μM/L β-머캅토에탄올로 보충시킨 2 mM/L L-글루타민을 수반한 RPMI 1640)에 재현탁시켰다. RBC를 ACK 용해 완충액 (공급처: Cambrex Bio Science, East Rutherford, NJ)로 용해시켰다.Animals were bled every two weeks for the duration of the study. 10 ml of blood was collected in EDTA tubes. PBMCs were isolated by standard Ficoll-hypaque centrifugation followed by complete culture medium (10% heat inactivated fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin and 55 μM/L Resuspended in RPMI 1640 with 2 mM/L L-glutamine supplemented with β-mercaptoethanol). RBCs were dissolved in ACK lysis buffer (available from Cambrex Bio Science, East Rutherford, NJ).

플라스미드 및 플라스미드 생성물: Plasmids and Plasmid Products :

Gag4Y는 HIV 분기군 A, B, C 및 D의 gag 단백질의 컨센서스 서열을 암호화하는 발현 카세트를 함유하는데, 다음을 포함한 몇 가지 변형을 수반한다: 코작 서열 및 치환된 IgE 리더 서열의 부가, 포유류 세포에서의 발현을 위한 코돈 및 RNA 최적화 (서열 11은 HIV Gag 컨센서스 서열을 기술하고 있다). Gag4Y 유전자를 추가 연구를 위해 발현 벡터 pVax 내로 서브클로닝하였다. pEY-2E1-B는 HIV 분기군 B의 외막의 컨센서스 서열을 암호화하는 발현 카세트를 함유하고 있다 (서열 3은 HIV Env 컨센서스 서열을 기술하고 있다). WLV104M은 붉은털 원숭이 IL-12 유전자를 암호화하는 플라스미드이다. 플라스미드는 알데브론 [Aldevron (Fargo, ND)]에서 생산하였고, 저 분자량 0.1％ 폴리-L-글루타메이트 나트륨 염을 수반하여 주사용 멸균수 중의 VGX 면역 치료제 (공급처: The Woodlands, TX)로 다시 제형화하였다.Gag4Y contains an expression cassette encoding the consensus sequence of gag proteins of HIV clade A, B, C and D, with several modifications including: addition of Kozak sequence and substituted IgE leader sequence, mammalian cells Codon and RNA optimization for expression in (SEQ ID NO: 11 describes the HIV Gag consensus sequence). The Gag4Y gene was subcloned into the expression vector pVax for further study. pEY-2E1-B contains an expression cassette encoding the consensus sequence of the outer membrane of HIV clade B (SEQ ID NO: 3 describes the HIV Env consensus sequence). WLV104M is a plasmid encoding the rhesus monkey IL-12 gene. Plasmid was produced by Aldevron [Aldevron (Fargo, ND)] and formulated again as VGX immunotherapy (supplier: The Woodlands, TX) in sterile water for injection with a low molecular weight 0.1% poly-L-glutamate sodium salt. I did.

냉동-보존된 PBMC의 CFSECFSE of cryo-preserved PBMC

냉동-보존된 PBMC를 37℃ 수욕에서 급속 해동시키고 완전 배지로 세척하였다. 세포를 37℃ 항온 배양기에서 밤새 항온 배양하고 그 다음 날에 세포 계수치를 수득하였다. 세포를 펠릿화하고 PBS 중의 1 ml CFDA SE (공급처: Molecular Probes, Eugene, OR)에 재현탁시켰다 (1:2000 희석률). 세포를 37℃ 하에 10분 동안 항온 배양하였다. 세포를 완전 배지로 세척하고 1x1O6개 세포/100 ㎕의 농도가 되도록 재현탁시키며, 100 ㎕의 2 ㎍/ml 재조합 HIV-1 p24 또는 gp120 (공급처: ImmunoDiagnostics, Woburn, MA) 플러스 펩티드 풀로 96 웰 환저 판에 도말하였다. 5 ㎍/ml 콘카발린 A (양성) 및 완전 배지 (음성)를 대조군으로서 사용하였다. 배양물을 5일 동안 항온 배양하였다. 세포를 먼저, 생/사멸 세포 마커인 비비드 (Vivid) 염료 바이올렛으로 얼음 상에서 15분 동안 염색시켰다. 세포를 PBS로 1회 세척하였다. 그 다음, 세포를 4℃ 하에 1시간 동안 항-인간 CD3-PE (클론 SP34-2) (공급처: BD Pharmingen) 및 항-인간 CD4-PerCP (클론 L200), 항-인간 CD8-APC (SK1)을 사용하여 염색시켰다. 이어서, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 1％ 파라포름알데히드로 고정시켰다. LSRII 유동 세포계수기 (공급처: BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)를 사용하여 데이터를 수집하였다. 플로우조 (FlowJo) 소프트웨어 (공급처: Tree Star, Ashland, OR)를 사용하여 유동 세포계수 데이터를 분석하였고, CD3+ 림프구 상에서 통문하였다. 샘플당 3만개 내지 5만개 CD3+ 림프구를 수집하였다.Freeze-preserved PBMCs were rapidly thawed in a 37° C. water bath and washed with complete medium. The cells were incubated overnight in a 37° C. incubator and cell count values were obtained the next day. Cells were pelleted and resuspended in 1 ml CFDA SE (source: Molecular Probes, Eugene, OR) in PBS (1:2000 dilution). Cells were incubated for 10 minutes at 37°C. The cells were washed with complete medium and resuspended to a concentration of 1x10 6 cells/100 μl, and 100 μl of 2 μg/ml recombinant HIV-1 p24 or gp120 (supplier: ImmunoDiagnostics, Woburn, MA) plus peptide pool 96 wells Smeared on the round bottom plate. 5 μg/ml concavalin A (positive) and complete medium (negative) were used as controls. The culture was incubated for 5 days. Cells were first stained for 15 minutes on ice with Vivid dye violet, a live/dead cell marker. The cells were washed once with PBS. The cells were then subjected to anti-human CD3-PE (clone SP34-2) (source: BD Pharmingen) and anti-human CD4-PerCP (clone L200), anti-human CD8-APC (SK1) for 1 hour at 4° C. It was dyed using. The cells were then washed twice with PBS and fixed with 1% paraformaldehyde. Data was collected using an LSRII flow cytometer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Flow cytometric data was analyzed using FlowJo software (Source: Tree Star, Ashland, OR) and passaged on CD3+ lymphocytes. 30,000 to 50,000 CD3+ lymphocytes were collected per sample.

효소 연결 면역흡착 검정 (ELlSA): Enzyme-linked immunosorbent assay (ELlSA) :

96 웰 판을 100 ng/웰의 재조합 HIV-1 IIIB p24 또는 gp120 (공급처: ImmunoDiagnostics)로 밤새 피복시켜 HIV gag 및 env 반응을 각각 결정하였다. 1OO ng/웰의 소 혈청 알부민으로 피복시킨 판이 음성 대조군으로서 제공되었다. 판을 37℃ 하에 1시간 동안 3％ BSA-PBST로 차단시켰다. 그 다음, 판을 37℃ 하에 1시간 동안 4배 일련의 혈청 희석물과 함께 항온 배양하였다. 이어서, 염소 항-원숭이 IgG 서양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 항체를 1:10,000 희석률로 (공급처: MP Biomedicals, Aurora, OH) 판에 가하고 37℃ 하에 1시간 동안 항온 배양하였다. 테트라메틸벤지딘 (공급처: R&D systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 판을 전개시키고, 2 N H2SO4을 사용하여 반응을 중지시켰다. 이어서, 광밀도 (OD)를 측정하였다.The 96 well plates were coated overnight with 100 ng/well of recombinant HIV-1 IIIB p24 or gp120 (ImmunoDiagnostics) to determine HIV gag and env responses, respectively. Plates coated with 100 ng/well of bovine serum albumin served as a negative control. The plate was blocked with 3% BSA-PBST at 37° C. for 1 hour. The plates were then incubated at 37° C. for 1 hour with a 4-fold serial dilution of serum. Then, goat anti-monkey IgG horseradish peroxidase-conjugated antibody was added to a plate at a dilution of 1:10,000 (supplier: MP Biomedicals, Aurora, OH) and incubated at 37° C. for 1 hour. The plate was developed using tetramethylbenzidine (source: R&D systems, Minneapolis, MN), and the reaction was stopped using 2 NH 2 SO 4. Then, the optical density (OD) was measured.

IgG 종말점 역가는 BSA 웰의 평균 OD 값보다 2배 더 큰 OD 값을 생성시키는 혈청 희석률 역수로서 정의하였다.The IgG endpoint titer was defined as the reciprocal of the serum dilution that produced an OD value that was 2 times greater than the mean OD value of the BSA wells.

효소 연결 면역스폿 검정 (ELISpot)Enzyme-linked immune spot assay (ELISpot)

펩티드를 함유하는 웰로부터 음성 대조군 웰 중의 스팟 수를 공제함으로써 항원 특이적 반응을 결정하였다. 그 결과는 세 번 되풀이 하여 수행된 웰에 대해 수득된 평균 값 (비장 세포 100만개 당 스팟 수)으로서 제시하였다.The antigen specific response was determined by subtracting the number of spots in the negative control wells from the wells containing the peptide. The results are presented as the average value (spot number per million spleen cells) obtained for wells performed in triplicate.

1. 세포내 사이토킨 염색1. Intracellular cytokine staining

항체 시약Antibody reagent

직접 접합된 항체를 다음으로부터 획득하였다: BD Biosciences (San Jose, CA): 1L-2 (PE), CD3 (Pacific Blue), IFN-γ (PE-Cy7), 및 TNF-α (Alexa Fluor 700), CD8 (APC) 및 CD4 (PerCP).Directly conjugated antibodies were obtained from: BD Biosciences (San Jose, CA): 1L-2 (PE), CD3 (Pacific Blue), IFN-γ (PE-Cy7), and TNF-α (Alexa Fluor 700) , CD8 (APC) and CD4 (PerCP).

세포 자극 및 염색Cell stimulation and staining

PBMC를 완전 RPMI에서 1 x 1O6개 세포/100 ㎕가 되도록 재현탁시키고, 1:200 희석률의 자극성 펩티드 100 ㎕으로 96 웰 판에서 도말하였다. 자극되지 않은 양성 대조군 [스타필로코쿠스 (Staphylococcus) 엔테로톡신 B, 1 ㎍/ml; 공급처: Sigma-Aldrich]를 각 검정에 포함시켰다. 세포를 37℃ 하에 5시간 동안 항온 배양하였다. 항온 배양을 수행한 후, 세포를 세척하고 (PBS) 표면 항체로 염색시켰다. 세포를 세척하고 지시에 따라서 사이토픽스/사이토펌 (Cytofix/Cytoperm) 키트 (공급처: BD PharMingen, San Diego, CA)를 사용하여 고정시켰다. 고정시킨 후, 세포를 상기 펌 완충액에서 2회 세척하고 세포내 마커에 대한 항체로 염색시켰다. 염색시킨 후, 세포를 세척하고, 고정시키며 (1％ 파라포름알데히드를 함유하는 PBS), 분석할 때까지 4℃ 하에 저장하였다.PBMC were resuspended to 1 x 10 6 cells/100 μl in complete RPMI, and plated in 96 well plates with 100 μl of stimulatory peptide at a dilution of 1:200. Unstimulated positive control [ Staphylococcus enterotoxin B, 1 μg/ml; Source: Sigma-Aldrich] was included in each assay. Cells were incubated for 5 hours at 37°C. After performing incubation, the cells were washed (PBS) and stained with surface antibody. Cells were washed and fixed using the Cytofix/Cytoperm kit (BD PharMingen, San Diego, CA) according to the instructions. After fixation, the cells were washed twice in the perm buffer and stained with antibodies against intracellular markers. After staining, cells were washed, fixed (PBS containing 1% paraformaldehyde) and stored at 4° C. until analysis.

유동 세포계수법Flow cytometry

세포를 변형된 LSR II 유동 세포계수기 (공급처: BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA) 상에서 분석하였다. 샘플당 5만개 CD3+ 사건을 수집하였다. 플로우조 버전 8.4.1 (공급처: FreeStar, San Carlos, CA)을 사용하여 데이터 분석을 수행하였다. 초기 통문은 정방향 산란 면적 (FSC-A) 대 높이 (FSC-H) 플롯을 사용하여 이중선을 제거하였다. 상기 사건을 대상으로 하여 FSC-A 대 SSC 플롯에 의해 림프구 통문을 수행하였다. 이를 수행한 후, 사건은 CD3+, CD8+ 및 CD4- 사건 대 IFN-γ 상에서 순차적으로 통문시켜 하향 조절을 기대하였다. CD8+ T 세포를 확인한 후, 최적의 분리를 제공한 조합을 이용하여 각각의 기능에 대한 통문을 만들었다. 각 기능에 대한 통문을 창출시킨 후, 본 발명자들은 불 (Boolean) 통문 플랫폼을 사용하여 가능한 조합의 완전한 어레이를 창출시켰는데, 이는 3가지 기능을 시험한 경우에 8개 반응 패턴과 동등시하였다. 배경 교정 후에 데이터를 보고하였다. 양성 반응에 대한 역치는 10개 사건 또는 0.05％였다.Cells were analyzed on a modified LSR II flow cytometer (BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA). 50,000 CD3+ events were collected per sample. Data analysis was performed using FlowJaw version 8.4.1 (source: FreeStar, San Carlos, CA). Initial passages removed doublets using a forward scatter area (FSC-A) versus height (FSC-H) plot. Lymphocyte passage was performed by the FSC-A vs. SSC plot for this event. After doing this, events were passed sequentially on CD3 + , CD8 + and CD4 − events versus IFN-γ to expect downregulation. After identifying the CD8 + T cells, a passage for each function was made using the combination that provided optimal separation. After creating passages for each function, the inventors created a complete array of possible combinations using a Boolean communication platform, which equated to eight response patterns when testing three functions. Data was reported after background correction. The threshold for a positive response was 10 events or 0.05%.

통계학적 분석Statistical analysis

프리즘 그래프패드 (Prism Graphpad) 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, 이를 평균 ± SEM로 표현하였다.Data was analyzed using Prism Graphpad software and expressed as mean±SEM.

결과result

ELISpot 분석ELISpot analysis

각 면역시킨 후 IFNγ ELISpot에 의해 세포성 면역 반응 유도를 평가하였다. 단일 면역 후 (도 1), IM 주사에 의해서만 플라스미드 DNA를 투여한 군은 약한 세포성 반응을 나타내었다 (74 ± 29 SFU/106 PBMC). 붉은털 원숭이 IL-12 플라스미드로 공동-면역시키면 보다 높은 반응이 나타났다 (136 ± 51.4 SFU/106 PBMC). 전기천공시킨 (EP) 군은 평균 반응을 나타냈는데, 이는 IM 군보다 6배 더 높았다 (482 ± 181 SFU/106 PBMC). IL-12 공동-면역을 EP와 병용하면 IFNγ-생성 세포 수가 추가로 배가되었다 (1030 ± 494 SFU/106 PBMC).After each immunization, the induction of cellular immune responses was evaluated by IFNγ ELISpot. After a single immunization (Fig. 1), the group to which plasmid DNA was administered only by IM injection showed a weak cellular response (74±29 SFU/10 6 PBMC). Co-immunization with the rhesus monkey IL-12 plasmid resulted in a higher response (136 ± 51.4 SFU/10 6 PBMC). The electroporated (EP) group showed an average response, which was 6 times higher than that of the IM group (482 ± 181 SFU/10 6 PBMC). Combining IL-12 co-immunity with EP further doubled the number of IFNγ-producing cells (1030 ± 494 SFU/10 6 PBMC).

2회 면역시킨 후 (도 1), IM 군과 IM + IL-12 군은 ELISpot 계수치에서 적당한 수준의 증가를 나타내었다 (각각 104 ± 67.9 SFU/106 PBMC 및 223 ± 76.6 SFU/106 PBMC). EP 군은 기존의 면역보다 대략 4배 더 높은 반응을 나타내었고 (1924 ± 417 SFU/106 PBMC), EP+IL-12 군은 EP 군 단독과 비교해서 IFNγ-생성 세포 수를 다시 배가시켰다 (2819 ± 872 SFU/106 PBMC).After immunization twice (FIG. 1), the IM group and the IM + IL-12 group showed an appropriate level of increase in the ELISpot coefficient (104 ± 67.9 SFU/10 6 PBMC and 223 ± 76.6 SFU/10 6 PBMC, respectively). . The EP group showed approximately 4 times higher response than the conventional immunity (1924 ± 417 SFU/10 6 PBMC), and the EP+IL-12 group doubled the number of IFNγ-producing cells again compared to the EP group alone ( 2819 ± 872 SFU/10 6 PBMC).

세 번째 면역시킨 후 (도 1), EP 군에서 항원 특이적 세포 수는 IM 군의 항원 특이적 세포 수보다 log 이상 더 많았다 (각각 5300 ± 3781 및 370 ± 110 SFU/106 PBMC). IM+IL-12 군은 세포성 면역 상의 현저한 증가를 또한 나타냈는데, ELISpot 계수치는 기존의 면역보다 거의 log 더 많았다 (2042 ± 311 SFU/106 PBMC). 다른 2회 면역과 같이, EP+IL-12 군은 모든 백신접종 군 중에서 가장 강력하였다 (7228 ± 2227 SFU/106 PBMC).After the third immunization (Fig. 1), the number of antigen-specific cells in the EP group was log or more than the number of antigen-specific cells in the IM group (5300 ± 3781 and 370 ± 110 SFU/10 6 PBMCs, respectively). The IM+IL-12 group also showed a significant increase in cellular immunity, and the ELISpot coefficient was almost log higher than that of the conventional immunity (2042 ± 311 SFU/10 6 PBMC). Like the other two immunizations, the EP+IL-12 group was the most potent of all vaccinated groups (7228 ± 2227 SFU/10 6 PBMC).

교차-반응성 외막 반응의 유도Induction of cross-reactive adventitial reaction

성공적인 HIV 백신은 EP+IL-12가 다른 펩티드 라이브러리에 대한 교차-반응성 크기를 개선시킬 수 있었는지를 알아보는 데에 관심이 있었다는 점과 관련하여 교차 반응성 면역 반응의 유도를 요구할 것이다. 본 발명자들은 컨센서스 군 M으로부터의 펩티드 라이브러리를 사용하여 env 항원에 의해 유도된 교차 반응성 CTL 반응을 비교하였다. 모든 군에서 교차 반응성이 관찰되었다. 그러나, 결과는 아형 B ELISpot 분석에서 관찰된 동일한 크기차를 표시하였다 (도 2). 3회 면역 후, IM 군은 군 M 외막 펩티드에 대한 가장 낮은 반응을 나타내었다 (222 ± SEM SFU/106 PBMC). IL-12를 부가하면 반응이 배가되었다 (540 ± SEM SFU/106 PBMC). EP를 사용하면 보다 높은 군 M 외막 반응이 유도되었는데 (830 ± SEM SFU/106 PBMC), 이는 IL-12 공동-주사에 의해 추가로 증강되었다 (1238 ± SEM SFU/106 PBMC).A successful HIV vaccine would require the induction of a cross-reactive immune response in connection with the interest in seeing if EP+IL-12 could improve the magnitude of cross-reactivity against other peptide libraries. We compared the cross-reactive CTL responses induced by the env antigen using a peptide library from consensus group M. Cross reactivity was observed in all groups. However, the results indicated the same size difference observed in the subtype B ELISpot analysis (FIG. 2). After 3 immunizations, the IM group showed the lowest response to the group M outer membrane peptide (222±SEM SFU/10 6 PBMC). The addition of IL-12 doubled the reaction (540±SEM SFU/10 6 PBMC). The use of EP induced a higher group M outer membrane response (830 ± SEM SFU/10 6 PBMC), which was further enhanced by IL-12 co-injection (1238 ± SEM SFU/10 6 PBMC).

1. 기억 T 세포 반응1. Memory T cell response

중요한 논점은 DNA 플랫폼을 이용하여 기억 반응의 발생을 개선시킬 수 있어야 하는 것이다. 본 발명자들은 마지막 DNA 백신접종한지 5개월 후에 ELISpot 분석을 수행하였다 (도 3). IM 군에서는, 플라스미드 IL-12를 부가하면 기억 세포가 거의 10배 증가하였다 (751 ± 11.1 및 78.6 ± 16.9 SFU/106 PBMC). IL-12가 이러한 중요한 T 세포 표현형에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다는 것이 명백하다. 항원-특이적 IFNγ-생성 세포의 수는 EP 군에서 또한 상당하였지만, IL-12 아주반트 + EP는 가장 원기왕성한 기억 반응을 유발시켰는데 (각각 1231 ± 523.5 및 3795 ± 1336 SFU/106 PBMC), 이는 병용 기술이 극히 강력한 T 세포 기억 반응을 구동시킨다는 사실을 보여주는 반응이다.An important point is that the DNA platform should be used to improve the occurrence of memory responses. The present inventors performed ELISpot analysis 5 months after the last DNA vaccination (FIG. 3). In the IM group, the addition of plasmid IL-12 resulted in an almost 10-fold increase in memory cells (751 ± 11.1 and 78.6 ± 16.9 SFU/10 6 PBMCs). It is clear that IL-12 can have a positive effect on this important T cell phenotype. The number of antigen-specific IFNγ-producing cells was also significant in the EP group, but IL-12 adjuvant + EP induced the most vigorous memory responses (1231 ± 523.5 and 3795 ± 1336 SFU/10 6 PBMCs, respectively). , This is a response that demonstrates that the combination technique drives an extremely powerful T cell memory response.

DNADNA 백신에 대한 For vaccine 체액성Humoral 면역 반응 Immune response

IM DNA 백신 기술의 약점은 비인간 영장류 및 인간 임상 연구에서 명백한 항체 반응을 유도시킬 수 없다는 것이다. 본 발명자들은 ELISA 포맷에서 재조합 p24 및 gp160 항원에 대한 HIV-1 gag 및 env 특이적 항체 역가 둘 다를 유도시킬 수 있는 각 군의 능력을 평가하였다. 양 항원에 대해, IM 및 IM + IL-12 군은 상당한 항체 역가를 나타내지 않았다 (<l:50 종말점 역가). 전기천공시킨 군은 재조합 p24와 결합할 수 있었던 현저하게 더 높은 gag 항체 역가를 나타내었다. EP 군과 EP + IL-12 군 둘 다가 12주째에 유사한 종말점 역가를 나타내긴 하였지만 (각각 22,400 및 12,800), EP + IL-12 군은 보다 효율적인 항체 반응을 발생시켰다. 이러한 반응은 면역 도식에서보다 초기에 나타났고, 신속하게 최대 수준으로 상승하였다. env 항체 반응 또한, 보다 낮은 종말점 역가를 수반함에도 불구하고 gag 항원을 이용하여 본 발명자들이 관찰한 결과를 반영하였다.The weakness of the IM DNA vaccine technology is that it cannot elicit an apparent antibody response in non-human primate and human clinical studies. We evaluated the ability of each group to induce both HIV-1 gag and env specific antibody titers against the recombinant p24 and gp160 antigens in an ELISA format. For both antigens, the IM and IM + IL-12 groups did not show significant antibody titers (<l:50 endpoint titers). The electroporated group showed a significantly higher gag antibody titer that was able to bind with the recombinant p24. Although both the EP group and the EP + IL-12 group showed similar endpoint titers at week 12 (22,400 and 12,800, respectively), the EP + IL-12 group generated more efficient antibody responses. This response appeared earlier than in the immune scheme and quickly rose to a maximum level. The env antibody response also reflects the results observed by the present inventors using the gag antigen, despite having a lower endpoint titer.

CD4CD4 ++ 및 CD8 And CD8 ++ T 세포 증식 T cell proliferation

상당한 ELISpot 반응이 관찰되었기 때문에, 본 발명자들은 이어서 세포성 면역의 부가 파라미터를 조사하였다. 본 발명자들은 상이한 면역 군 중에서 펩티드 자극을 수행한 후 시험관 내에서 증식할 수 있는 gag 특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 능력을 조사하였다. 최종 면역시킨지 2주 후에 수집한 냉동 보존된 샘플을 자극시키고 CFSE 검정에 의해 분석하였다. 평균 CD4+ 반응은 ELISpot 검정에서 관찰된 바와 유사한 수준으로 증가하였다. 비교하자면, CD8 증식 유도는 크기 면에서 훨씬 더 현저하였다. 본 발명자들은 IL-12가 IM 단독에 비해 CD8+ T 세포 증식을 증가시켰고 EP가 실질적으로 더 높다는 사실을 관찰하였다. EP + IL-12 군은 가장 높은 비율의 CD8+ 세포를 가졌는데, 이는 시험관내 자극 후에 증식할 수 있었다 (각각 2.51 ± SEM ％ 및 4.88 ± SEM ％). 명백한 CD8 T 세포 증식 밴드가 EP + IL-12 군에서 관찰되었는데, 이는 이러한 병용 면역의 강력한 증식 잠재력을 입증해준다.Since a significant ELISpot response was observed, we then investigated additional parameters of cellular immunity. We investigated the ability of gag-specific CD4 + and CD8 + T cells to proliferate in vitro after performing peptide stimulation among different immune groups. Cryopreserved samples collected 2 weeks after the last immunization were stimulated and analyzed by CFSE assay. The mean CD4 + response increased to a level similar to that observed in the ELISpot assay. In comparison, the induction of CD8 proliferation was much more pronounced in terms of size. We observed that IL-12 increased CD8 + T cell proliferation compared to IM alone and had a substantially higher EP. The EP + IL-12 group had the highest proportion of CD8 + cells, which were able to proliferate after in vitro stimulation (2.51±SEM% and 4.88±SEM%, respectively). A clear CD8 T cell proliferation band was observed in the EP + IL-12 group, demonstrating the strong proliferative potential of this combination immunity.

다기능성Versatility CD8CD8 ++ T 세포 반응 T cell response

본 발명자들이 EP 및 IL-12 공동-면역 후에 강력한 IFNγ 효과인자 반응 유도를 관찰하긴 하였지만, 본 발명자들은 각종 군에서 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응의 기능을 추가로 성상 확인하고자 하였다. 최종 면역시킨지 3개월 후에 취한 샘플을 gag 펩티드로 자극하고, IFNγ, TNFα 및 IL-12의 세포내 사이토킨 생성을 알아보기 위해 염색하였다. 모든 군 중에서, IM + IL-12 중의 단지 1마리 동물과 EP 군 중의 1마리 동물 만이 탐지 가능한 IFNγ 반응을 나타내었다. 그러나, EP + IL-12 면역시킨 군 중의 3마리 동물 중에서 2마리가 gag-특이적 IFNγ-생성 CD8+ T 세포를 가졌다. IM + IL-12 반응인자는 3개 모든 사이토킨을 알아보기 위해 염색시킨 다기능성 세포 뿐만 아니라 IL-12를 생성시킬 수 있는 능력을 상실한 집단을 적은 비율로 가졌다. EP 반응인자는 4가지 상이한 집단으로 구성된 약간 더 높은 다기능성 반응을 나타내었다. 가장 현저한 반응이 제2 EP + IL-12 동물에서 관찰되었다. 그의 CD8+ T 세포의 2％ 초과가 3개 모든 사이토킨을 생성시킬 수 있었고, 2％가 IFNγ와 TNFα 둘 다를 생성시킬 수 있었다. 명백하게, 각 군에서의 동물 수는 적고, 이들 결과를 확인하기 위한 부가의 영장류 연구를 요구하지만, 집합적으로 관찰된 경향은 명백하고 고무적인 것으로 여겨진다.Although the present inventors observed the induction of strong IFNγ effector response after EP and IL-12 co-immunity, the present inventors sought to further confirm the function of antigen-specific CD8 + T cell responses in various groups. Samples taken 3 months after the final immunization were stimulated with gag peptide, and stained to determine intracellular cytokine production of IFNγ, TNFα and IL-12. Of all groups, only 1 animal in IM + IL-12 and 1 animal in EP group showed detectable IFNγ response. However, of the 3 animals in the EP + IL-12 immunized group, 2 had gag-specific IFNγ-producing CD8 + T cells. The IM + IL-12 responder had a small percentage of the population that lost the ability to produce IL-12 as well as multifunctional cells stained to identify all three cytokines. The EP response factor exhibited a slightly higher multifunctional response consisting of four different populations. The most pronounced response was observed in the second EP + IL-12 animal. More than 2% of its CD8 + T cells were able to produce all three cytokines, and 2% were able to produce both IFNγ and TNFα. Obviously, the number of animals in each group is small and requires additional primate studies to confirm these results, but the trends observed collectively are considered clear and encouraging.

논의Argument

DNA 백신 아주반트로서의 IL-12는 플라스미드 단독에 비해 ELISpot 반응을 몇배로 개선시켰다. 또한 증식이 명백히 증강되었다. EP 군은 IM 군 단독이나 병용 ELISpot 반응을 나타내는 IM + IL-12 군보다 더 높은 평균 반응을 나타냈는데, 이는 IM + IL-12 군보다 3배 더 높았다. 가장 우수한 ELISpot 반응은 EP + IL-12 군에서 관찰되었는데, 이는 IM+IL-12 군에 비해서는 대략 4배 더 높았고 IM 단독에 비해서는 19배 더 높았다.IL-12 as a DNA vaccine adjuvant improved the ELISpot response several times compared to the plasmid alone. Also, the proliferation was clearly enhanced. The EP group showed a higher mean response than the IM group alone or the IM + IL-12 group, which showed a combined ELISpot response, which was 3 times higher than that of the IM + IL-12 group. The best ELISpot response was observed in the EP + IL-12 group, which was approximately 4 times higher compared to the IM+IL-12 group and 19 times higher compared to the IM alone.

각 면역 후, IFNγ ELISpot에 의해 항원 특이적 반응 크기를 결정하였다. 단일 면역 후, EP 및 EP + IL-12 군 중의 모든 동물은 탐지 가능한 반응을 나타냈을 뿐만 아니라 3회 면역 후 IM 군에서 관찰된 것보다 더 높은 평균치를 나타내었다. 2회 면역 후, EP 및 EP + IL-12 군에서의 IFNγ 반응은 바이러스성 벡터를 사용하는 연구에서 보고된 반응과 거의 동등한 수준이었다. 마지막 면역시킨지 5개월 후에 IM + IL-12 군과 양 EP 군에서 상당한 기억 반응이 관찰되었다.After each immunization, the antigen-specific response size was determined by IFNγ ELISpot. After a single immunization, all animals in the EP and EP + IL-12 groups showed detectable responses as well as higher mean values than those observed in the IM group after 3 immunizations. After two immunizations, the IFNγ responses in the EP and EP + IL-12 groups were approximately equivalent to those reported in studies using viral vectors. Significant memory responses were observed in the IM + IL-12 group and both EP groups 5 months after the last immunization.

IL-12를 수반하거나 수반하지 않는 IM 면역은 상당한 양의 항체를 생성시키지 않았다. 전기천공은 기존에 보고된 바와 같이 체액성 면역 반응을 증강시킬 수 있었다. 전기천공시킨 군 중의 모든 동물은 혈청 전환되었다. EP 군과 EP + IL-12 군이 3회 면역 후에 유사한 종말점 역가를 지니고 있긴 하지만, 항체 유도 역학은 EP + IL-12 군에서 다소 더 신속하였다.IM immunity with or without IL-12 did not produce significant amounts of antibody. Electroporation was able to enhance the humoral immune response as previously reported. All animals in the electroporated group were seroconverted. Although the EP group and the EP + IL-12 group had similar endpoint titers after 3 immunizations, the antibody induction kinetics were somewhat faster in the EP + IL-12 group.

CD8 T 세포의 증식 능력은 EP 및 플라스미드 IL-12를 사용하는 경우에 증강되는 것으로 여겨졌다. 이러한 데이터는 항원 특이적 T 세포의 확장이 EP + IL-12 군의 증강된 증식 잠재력의 결과인 것으로 예상되는 ELISpot 검정에서 관찰된 기억 확장을 뒷받침해준다.It was believed that the proliferative capacity of CD8 T cells was enhanced when using EP and plasmid IL-12. These data support the memory expansion observed in the ELISpot assay, where expansion of antigen specific T cells is expected to be a result of the enhanced proliferative potential of the EP + IL-12 group.

SEQUENCE LISTING <110> The Trustees of the University of Pennsylvania Weiner, David B. Yan, Jian <120> IMPROVED VACCINES AND METHODS FOR USING THE SAME <130> 133172.01602 <150> US 60/833861 <151> 2006-07-28 <150> US 60/890352 <151> 2007-02-16 <150> US 60/833586 <151> 2006-07-28 <160> 43 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 2142 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Subtype A consensus Envelope DNA sequence construct <400> 1 ggatccatgg actggacctg gattctgttc ctggtggccg ccgccaccag agtgcacagc 60 agagtgatgg gcatccagcg gaattgccag cacctgtgga gatggggcac catgatcctg 120 ggcatgatca tcatctgctc tgccgccgag aacctgtggg tgaccgtgta ctacggcgtg 180 cctgtgtgga aggacgccga gaccaccctg ttctgcgcca gcgacgccaa ggcctacgat 240 accgaagtgc acaatgtgtg ggccacccac gcctgcgtgc ctaccgatcc caacccccag 300 gagatcaacc tggagaacgt gaccgaggag ttcaacatgt ggaagaacaa catggtggag 360 cagatgcaca ccgacatcat cagcctgtgg gaccagagcc tgaagccttg cgtgaagctg 420 acccctctgt gcgtgaccct gaactgcagc aacgtgaacg tgaccaccaa catcatgaag 480 ggcgagatca agaactgcag cttcaacatg accaccgagc tgcgggacaa gaagcagaaa 540 gtgtacagcc 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Yan, Jian <120> IMPROVED VACCINES AND METHODS FOR USING THE SAME <130> 133172.01602 <150> US 60/833861 <151> 2006-07-28 <150> US 60/890352 <151> 2007-02-16 <150> US 60/833586 <151> 2006-07-28 <160> 43 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 2142 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Subtype A consensus Envelope DNA sequence construct <400> 1 ggatccatgg actggacctg gattctgttc ctggtggccg ccgccaccag agtgcacagc 60 agagtgatgg gcatccagcg gaattgccag cacctgtgga gatggggcac catgatcctg 120 ggcatgatca tcatctgctc tgccgccgag aacctgtggg tgaccgtgta ctacggcgtg 180 cctgtgtgga aggacgccga gaccaccctg ttctgcgcca gcgacgccaa ggcctacgat 240 accgaagtgc acaatgtgtg ggccacccac gcctgcgtgc ctaccgatcc caacccccag 300 gagatcaacc tggagaacgt gaccgaggag ttcaacatgt ggaagaacaa catggtggag 360 cagatgcaca ccgacatcat cagcctgtgg gaccagagcc tgaagccttg cgtgaagctg 420 acccctctgt gcgtgaccct gaactgcagc aacgtgaacg tgaccaccaa catcatgaag 480 ggcgagatca agaactgcag cttcaacatg accaccgagc tgcgggacaa gaagcagaaa 540 gtgtacagcc 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Sequence <220> <223> Subtype C consensus Envelope protein sequence construct <400> 6 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Arg Val Arg Gly Ile Leu Arg Asn Cys Gln Gln Trp Trp Ile 20 25 30 Trp Gly Ile Leu Gly Phe Trp Met Leu Met Ile Cys Asn Val Met Gly 35 40 45 Asn Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala 50 55 60 Lys Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Glu Thr Glu 65 70 75 80 Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn 85 90 95 Pro Gln Glu Met Val Leu Glu Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp 100 105 110 Lys Asn Asp Met Val Asp Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp 115 120 125 Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr 130 135 140 Leu Asn Cys Arg Asn Asn Val Asn Asn Asn Asn Thr Met Lys Glu Glu 145 150 155 160 Ile Lys Asn Cys Ser Phe Asn Ile Thr Thr Glu Leu Arg Asp Lys Lys 165 170 175 Gln Lys Val Tyr Ala Leu Phe Tyr Arg Leu Asp Ile Val Pro Leu Asn 180 185 190 Glu Lys Asn 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gtgcgtgacc ctgaactgca ccgacggcat gaggaacgac accaacgata ccaacgtgac 420 catggaggag ggcgagatga agaactgcag cttcaacatc accaccgaag tgcgggacaa 480 gaagaagcag gtgcacgccc tgttctacaa gctggacgtg gtgcccatcg acgacaacaa 540 caccaacaac agcaactacc ggctgatcaa ctgcaacacc agcgccatca cccaggcctg 600 ccccaaagtg accttcgagc ccatccccat ccactactgc gcccctgccg gcttcgccat 660 cctgaagtgc aaggataaga agttcaacgg caccggcccc tgcaagaatg tgagcaccgt 720 gcagtgcacc cacggcatca gacccgtggt gtccacccag ctgctgctga acggcagcct 780 ggccgaggag gagatcatca tccggagcga gaacctgacc aacaacgcca agatcatcat 840 tgtgcagctg aacgagagcg tgaccatcaa ttgcacccgg ccctacaaca atacccggaa 900 gcgcatcccc atcggcctgg gccaggcctt ctacaccacc agaggcatca tcggcgacat 960 cagacaggcc cactgcaata tcagcggagc cgagtggaat aagaccctgc agcaggtggc 1020 caagaagctg ggcgacctgc tgaacaagac caccatcatc ttcaagccta gcagcggcgg 1080 cagacctaga atcaccaccc acagcttcaa ttgtggcggc gagttcttct actgcaatac 1140 cagccggctg ttcaacagca cctggagcaa gaacagcacc agcaactcca ccaaggagaa 1200 caacaccatc accctgccct gccggatcaa gcagatcatc aatatgtggc agggagtggg 1260 caaggccatg tacgcccctc ccatcgaggg cctgatcaag tgcagcagca acatcaccgg 1320 cctgctgctg accagagatg gcggagccaa caactcccac aacgagacct tcagacctgg 1380 cggcggagac atgagggaca actggcggag cgagctgtac aagtacaaag tggtgaagat 1440 cgagcccctg ggcgtggccc ccaccagagc caagagaaga gtggtggagc gggagaagag 1500 agccatcgga ctgggcgcca tgttcctggg cttcctggga gccgccggaa gcaccatggg 1560 agccgccagc ctgaccctga ccgtgcaggc cagacagctg ctgagcggca tcgtgcagca 1620 gcagaacaac ctgctgagag ccattgaggc ccagcagcac ctgctgcagc tgacagtgtg 1680 gggcattaag cagctgcagg ccaggattct ggccgtggag cgctacctga aggatcagca 1740 gctgctggga atctggggct gcagcggcaa gcacatctgc accaccaccg tgccttggaa 1800 tagcagctgg agcaacaaga gcctggacga gatctggaac aacatgacct ggatggagtg 1860 ggagagggag atcgacaact acaccggcct gatctacagc ctgatcgagg agagccagac 1920 ccagcaggag aagaacgagc aggagctgct ggagctggac aagtgggcca gcctgtggaa 1980 ctggttcagc atcacccagt ggctgtggta catcaagatc ttcatcatga ttgtgggcgg 2040 cctgatcggc ctgagaatcg tgttcgccgt gctgagcctg tgactcgag 2089 <210> 8 <211> 714 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Subtype D consensus Envelope protein sequence construct <400> 8 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Arg Val Arg Gly Ile Lys Arg Asn Tyr Gln His Leu Trp Lys 20 25 30 Trp Gly Thr Met Leu Leu Gly Met Leu Met Thr Cys Ser Val Ala Glu 35 40 45 Asn Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala 50 55 60 Thr Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ser Tyr Lys Thr Glu 65 70 75 80 Ala His Asn Ile Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn 85 90 95 Pro Gln Glu Ile Glu Leu Glu Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp 100 105 110 Lys Asn Asn Met Val Glu Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp 115 120 125 Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr 130 135 140 Leu Asn Cys Thr Asp Gly Met Arg Asn Asp Thr Asn Asp Thr Asn Val 145 150 155 160 Thr Met Glu Glu Gly Glu Met Lys Asn Cys Ser Phe Asn Ile Thr Thr 165 170 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gcttccctgt gagagcccag gtggccctga gagccatgac ctacaaggcc 300 gccgtggatc tgagccactt cctgaaggag aagggcggcc tggagggcct gatctacagc 360 cagaagcggc aggacatcct ggatctgtgg gtgtaccaca cccagggcta cttccccgac 420 tggcagaatt acacccctgg ccctggcatc agataccctc tgaccttcgg ctggtgcttc 480 aagctggtgc ctgtggagcc tgagaaagtg gaggaggcca acgagggcga gaacaattct 540 gccgcccacc ctatgagcct gcacggcatg gacgatcccg agagggaagt gctggtgtgg 600 aagttcgaca gcaggctggc cttccaccac atggccagag agctgcaccc cgagtactac 660 aaggactgcc ggggcaggaa gagaagaagc gccggcagaa gcggcgacag cgacgaggag 720 ctgctgaaaa cagtgcggct gatcaagttc ctgtaccaga gcaaccctcc tcccagcccc 780 gagggcacca gacaggcccg gagaaaccgg aggaggcggt ggagagagag gcagcggcag 840 atcagaagca tcagcgagtg gattctgagc acctacctgg gcagacccgc cgagcccgtg 900 cccctgcagc tgccccccct ggagagactg accctggact gcaacgagga ctgcggcacc 960 agcggcaccc agggagtggg cagcccccag atcctggtgg agagccctgc cgtgctggag 1020 agcggcacca aggagtgatg agcggccgc 1049 <210> 10 <211> 341 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Subtype B consensus Nef-Rev protein sequence construct <400> 10 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Ser Lys Arg Ser Val Val Gly Trp Pro Thr Val Arg Glu Arg 20 25 30 Met Arg Arg Ala Glu Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala Val Ser Arg 35 40 45 Asp Leu Glu Lys His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr Ala Ala Asn 50 55 60 Asn Ala Asp Cys Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly 65 70 75 80 Phe Pro Val Arg Ala Gln Val Ala Leu Arg Ala Met Thr Tyr Lys Ala 85 90 95 Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly 100 105 110 Leu Ile Tyr Ser Gln Lys Arg Gln Asp Ile Leu Asp Leu Trp Val Tyr 115 120 125 His Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro 130 135 140 Gly Ile Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro 145 150 155 160 Val Glu Pro Glu Lys Val Glu Glu Ala Asn Glu Gly Glu Asn Asn Ser 165 170 175 Ala Ala His Pro Met Ser Leu His Gly Met Asp Asp Pro Glu Arg Glu 180 185 190 Val Leu Val Trp Lys Phe Asp 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cggctgaagc accttgtgtg ggccagcaga 180 gagctggaga gattcgccct gaatcctggc ctgctggaga ccagcgaggg ctgtaagcag 240 atcatcggcc agctgcagcc cgccctgcag accggcagcg aggagctgag aagcctgtac 300 aacaccgtgg ccaccctgta ctgcgtgcac gagaagatcg aggtgaagga caccaaggag 360 gccctggaca agatcgagga ggagcagaac aagagcaagc agaaggccca gcaggccgcc 420 gccgacaccg gcaacagcag ccaggtgtcc cagaactacc ccatcgtgca gaatctgcag 480 ggccagatgg tgcaccaggc catcagcccc agaaccctga atgcctgggt gaaggtgatc 540 gaggagaagg ccttcagccc tgaggtgatc cctatgttca gcgccctgag cgagggcgcc 600 acacctcagg acctgaacac catgctgaac acagtggggg gccaccaggc cgccatgcag 660 atgctgaagg ataccatcaa cgaggaggcc gccgagtggg acagactgca ccccgtgcac 720 gccggaccta tcgcccctgg ccagatgaga gagcccagag gcagcgacat cgccggcacc 780 acctccaccc tgcaagagca gatcggctgg atgaccagca acccccccat ccctgtgggc 840 gacatctaca agcggtggat catcctgggc ctgaacaaga ttgtgaggat gtacagcccc 900 gtgtccatcc tggatatcag gcagggcccc aaggagccct tcagagacta cgtggaccgg 960 ttcttcaaga ccctgagagc cgagcaggcc agccaggacg tgaagaactg gatgaccgag 1020 accctgctgg tgcagaacgc caaccccgac tgtaagacca tcctgagagc cctgggccct 1080 ggcgccaccc tggaggagat gatgaccgcc tgccagggag tgggcggacc cggccacaag 1140 gccagagtgc tggccgaggc catgagccag gccaccaaca gcaacatcat gatgcagcgg 1200 ggcaacttca gaggccccag gaggatcgtg aagtgcttca actgtggcaa ggagggccac 1260 atcgccagaa actgtagggc ccccaggaag aagggctgct ggaagtgtgg caaagagggg 1320 caccagatga aggactgtac cgagcggcag gccaatttcc tggggaagat ctggcccagc 1380 cacaagggca gacccggcaa tttcctgcag agcagacctg agcccaccgc ccctcccgcc 1440 gagagcttcg gcttcggcga ggagatcacc cccagcccca agcaggagcc caaggacaga 1500 gagctgtacc ctctggccag cctgaagagc ctgttcggca acgatcccct gagccagtac 1560 ccctacgacg tgcccgatta cgcctgagaa ttcgtaagta agtgtcatat gggagagctc 1620 gactagactg gacagccaat gacgggtaag agagtgacat ttctcactaa cctaagacag 1680 gagggccgtc aaagctactg cctaatccaa tgacgggtaa tagtgacaag aaatgtatca 1740 ctccaaccta agacaggcgc agcctccgag ggatgtgtct tttgtttttt ataattaaaa 1800 agggtgacat gtccggagcc gtgctgcccg gatgatgtct tggcctctgt ttgctgcggc 1860 cgc 1863 <210> 12 <211> 524 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gag consensus protein sequence of subtype A, B, C and D construct <400> 12 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Lys Leu Asp Ala 20 25 30 Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Arg Leu 35 40 45 Lys His Leu Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Leu Asn 50 55 60 Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Lys Gln Ile Ile Gly Gln 65 70 75 80 Leu Gln Pro Ala Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr 85 90 95 Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Glu Lys Ile Glu Val Lys 100 105 110 Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser 115 120 125 Lys Gln Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asp Thr Gly Asn Ser Ser Gln 130 135 140 Val Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val 145 150 155 160 His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile 165 170 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Artificial Sequence <220> <223> IgE leader sequence <400> 15 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His <210> 16 <211> 692 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Subtype A consensus Envelope protein sequence <400> 16 Ser Arg Val Met Gly Ile Gln Arg Asn Cys Gln His Leu Trp Arg Trp 1 5 10 15 Gly Thr Met Ile Leu Gly Met Ile Ile Ile Cys Ser Ala Ala Glu Asn 20 25 30 Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Asp Ala Glu 35 40 45 Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu Val 50 55 60 His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro 65 70 75 80 Gln Glu Ile Asn Leu Glu Asn Val Thr Glu Glu Phe Asn Met Trp Lys 85 90 95 Asn Asn Met Val Glu Gln Met His Thr Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp 100 105 110 Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr Leu 115 120 125 Asn Cys Ser Asn Val Asn Val Thr Thr Asn Ile Met Lys Gly Glu Ile 130 135 140 Lys Asn Cys Ser Phe Asn Met Thr Thr Glu Leu Arg Asp Lys Lys Gln 145 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Ala Cys His Ser Ala Ala 370 375 380 Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe Ile Arg Gly Thr Arg Val Val 385 390 395 400 Pro Arg Gly Gln Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn Glu 405 410 415 Asn Met Glu Ala Met Asp Ser Asn Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg Tyr 420 425 430 Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg Ala 435 440 445 Ser Ala Gly Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg Asn 450 455 460 Leu Pro Phe Glu Arg Ala Thr Ile Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn Thr 465 470 475 480 Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Met Met Glu 485 490 495 Ser Ala Arg Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe Glu 500 505 510 Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp Met 515 520 525 Asn Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr Asp 530 535 540 Asn Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 545 550

Claims (26)

서열 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.A nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서, 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.7. The nucleic acid molecule of claim 1 comprising a nucleotide sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 서열 4를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.A nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding SEQ ID NO: 4. 제7항에 있어서, 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.8. The nucleic acid molecule of claim 7 comprising a nucleotide sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 제1항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드인 핵산 분자.9. The nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 8, wherein the nucleic acid molecule is a plasmid. 제1항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는, 개체에서 HIV에 대하여 면역 반응을 유발하기 위한 제약 조성물.9. A pharmaceutical composition for inducing an immune response against HIV in an individual comprising a nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 8. 제1항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는, 개체에서 HIV에 대하여 면역 반응을 유발하기 위한 주사가능한 제약 조성물.9. An injectable pharmaceutical composition for inducing an immune response against HIV in an individual comprising a nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 8. 제1항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 백신.9. A recombinant vaccine comprising the nucleic acid molecule of any one of claims 1 and 6 to 8. 제12항에 있어서, 재조합 백시니아 백신인 재조합 백신.13. The recombinant vaccine according to claim 12, which is a recombinant vaccinia vaccine. 제1항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 생 약독화 병원체.A live attenuated pathogen comprising the nucleic acid molecule of any one of claims 1 and 6 to 8. 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질.A protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제15항에 있어서, 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 단백질.16. The protein of claim 15, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17. 제15항 또는 제20항의 단백질을 포함하는, 개체에서 HIV에 대하여 면역 반응을 유발하기 위한 제약 조성물.20. A pharmaceutical composition for inducing an immune response against HIV in an individual comprising a protein of claim 15 or 20. 제15항 또는 제20항의 단백질을 포함하는, 개체에서 HIV에 대하여 면역 반응을 유발하기 위한 주사가능한 제약 조성물.20. An injectable pharmaceutical composition for inducing an immune response against HIV in an individual comprising a protein of claim 15 or 20. 제15항 또는 제20항의 단백질을 포함하는 재조합 백신.20. A recombinant vaccine comprising the protein of claim 15 or 20. 제23항에 있어서, 재조합 백시니아 백신인 재조합 백신.24. The recombinant vaccine according to claim 23, which is a recombinant vaccinia vaccine. 제15항 또는 제20항의 단백질을 포함하는 생 약독화 병원체.A live attenuated pathogen comprising the protein of claim 15 or 20. 제1항 또는 제7항의 핵산 분자 또는 제15항 또는 제20항의 단백질을 포함하는, 개체에서 HIV에 대하여 면역 반응을 유발하기 위한 조성물.
A composition for inducing an immune response against HIV in a subject, comprising the nucleic acid molecule of any one of claims 1 or 7 or the protein of claim 15 or 20.
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