KR101579381B1

KR101579381B1 - Ｆｔ-ｉｒ 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석을 이용한 감귤의 기능성 성분 함량 예측 방법

Info

Publication number: KR101579381B1
Application number: KR1020140085955A
Authority: KR
Inventors: 김인중
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2014-07-09
Filing date: 2014-07-09
Publication date: 2015-12-21

Abstract

본 발명은 감귤 시료로부터 추출물을 얻고; 상기 추출물을 이용하여 FT-IR 분석 스펙트럼 데이터를 얻고; 상기 FT-IR 분석 스펙트럼 데이터의 수학적 전처리를 수행하고; 상기 전처리가 완료된 FT-IR 스펙트럼 데이터를 이용하여 부분최소 자승(Partial Least Square: PLS) 회귀분석을 수행하여 감귤의 기능성 성분 함량 예측 모델을 확립하고; 그리고 상기 확립된 감귤의 기능성 성분 함량 예측 모델을 이용하여 감귤의 기능성 성분 함량을 예측하는 단계; 를 포함하는, FT-IR 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석을 이용한 감귤의 기능성 성분 함량 예측 방법을 제공한다.

Description

ＦＴ-ＩＲ 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석을 이용한 감귤의 기능성 성분 함량 예측 방법{METHOD FOR PREDICTING QUANTITY OF CITRUS FUNCTIONAL INGREDIENTS USING FT-IR FINGERPRINTING COMBINED BY MULTIVARIATE ANALYSIS}

본 발명은 FT-IR 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석을 이용한 감귤의 기능성 성분 함량 예측 방법에 대한 것이다.

감귤은 제주도에서 2008년 이후 6,000억원 이상의 생산액을 꾸준히 나타냈고, 국내 과수 총 생산량의 1/4 이상을 차지할 만큼 생산량이 높은 과실이다. 최근 중국, 일본, 미국, 유럽과의 FTA 등 수입개방화로 인해 감귤류의 수입량이 증가하면서 국내 시장에 많은 비중을 차지하고 있다. 이에 따라 국내 감귤 산업의 생존이 위협받고 있는 실정이다. 또한, 2012년부터 시행된 UPOV 협약에 따라 제주도에서 재배되는 99%의 일본 품종 감귤이 품종 보호되면서 로열티에 대한 문제가 발생하고 있다. 그 중 일부 품종인 궁천, 흥진, 일남 1호 등이 품종보호기간 25년이 만료되었지만, 한라봉, 천혜향, 감평, 진지향 등은 품종보호가 되고 있다.

품종보호뿐만이 아니라 2003년 이후 급격히 증가하고 있는 오렌지 수입량이 12만 톤 이상으로 증가하고 있고, 한미 FTA 발효에 따라 가격이 저렴해지면서 국내 시장을 위협하고 있다. 이것은 국내 감귤농가에 큰 피해로 다가오고 있고, 비상품 감귤의 가공적인 측면에서도 많은 피해가 발생하고 있다.

이러한 문제점들을 극복하기 위한 한가지 방법으로 돌연변이 육종이 대두되고 있다. 이 방법은 인위적으로 유전적 변이를 유도하여 개체의 형질을 변화시키는 방법이다. 전세계적으로 80년 이상 사용되었고, 1960년대부터 국내에서도 벼, 콩, 마늘 등의 다양한 품종에 활용되고 있다. 하지만 과수에서는 주로 교배 육종이 사용되고 있어 돌연변이 육종은 거의 이루어지고 있지 않다.

FT-IR(Fourier transform infrared) 분석 방법은 스펙트럼이 가지고 있는 다양한 정보를 이용할 수 있는 장점이 있다(비특허문헌 1).

다변량통계 분석기법중 하나인 부분최소자승(Partial Least Square; PLS) 회귀분석(regression)은 시료로부터 정확한 정량분석 데이터와 동일시료의 스펙트럼 데이터의 상관분석을 통해 다양한 성분들의 함량 예측 모델링 방법으로 활용이 이루어지고 있다(비특허문헌 2).

본 발명자들은 FT-IR 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석 기법을 이용하여 기능성 성분 함량이 높은 우수한 감귤 품종의 신속한 선발체계를 확립하기 위해 연구를 계속하여 본 발명을 완성하였다.

Krishnan, P., N.J. Kruger, and R.G. Ratcliffe. 2005. Metabolite fingerprinting and profiling in plants using NMR. J. Exp. Bot. 56:255-265. Wold, S., M. Sjostrom, and L. Eriksson. 2001. PLS-regression: a basic tool of chemometrics. Chemometrics and Intelligent Lab. Systems 58:109-130. Lichtenthaler, H.K. and C. Buschmann. 2001. Chlorophylls and carotenoids: measurement and characterization by UV-VIS spectroscopy. Curr. Prot. Food Anal. Chem. F4.3.1F 4.3.8.

본 발명의 목적은 FT-IR 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석을 이용한 감귤의 기능성 성분 함량 예측 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 FT-IR 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석을 이용한 감귤의 기능성 성분 함량 예측 방법을 제공한다.

상기 예측 방법은

감귤 시료로부터 추출물을 얻고;

상기 추출물을 이용하여 FT-IR 분석 스펙트럼 데이터를 얻고;

상기 FT-IR 분석 스펙트럼 데이터의 수학적 전처리를 수행하고;

상기 전처리가 완료된 FT-IR 스펙트럼 데이터를 이용하여 부분최소 자승(Partial Least Square: PLS) 회귀분석을 수행하여 감귤의 기능성 성분 함량 예측 모델을 확립하고; 그리고

상기 확립된 감귤의 기능성 성분 함량 예측 모델을 이용하여 감귤의 기능성 성분 함량을 예측하는 단계;

를 포함하는, FT-IR 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석을 이용한 감귤의 기능성 성분 함량 예측 방법일 수 있다.

상기 감귤은 궁천조생(Citrus unshiu Marc. cv. Miyagawa), 금귤(Fortunella japonica), 세토카(C. hybrid 'Setoka'), 감평(C. hybrid 'Kanpei'), 청견(C. hybrid 'Kiyomi') 그리고 부지화(한라봉)(C. hybrid 'Shiranuhi')으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니며, 감귤에 해당하는 종류의 과실이라면 어느 것이나 포함될 수 있다.

상기 기능성 성분은 카로티노이드, 플라보노이드 및 페놀로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니며, 감귤 내에 존재하는 기능성 성분이라면 어느 것이나 포함될 수 있다.

상기 FT-IR 분석 스펙트럼 데이터는 4,000-400cm^-1의 범위에서 4cm^-1 간격으로 측정되어 얻어질 수 있다.

상기 FT-IR 분석 스펙트럼 데이터의 수학적 전처리는, 바탕선(baseline) 교정을 위해 FT-IR 스펙트럼 분석 영역인 1,800-800cm^-1의 흡광도를 0으로 조정하고, 각 스펙트럼을 동일 면적으로 정규화(normalization)하고 그리고 상기 스펙트럼 데이터의 평균 중심화(mean centering) 과정을 거쳐 2차 미분을 수행할 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 통상의 기술자라면 이 기술분야의 감귤 과실에 최적화된 수학적 전처리 과정을 수행할 수 있을 것이다.

상기 확립된 감귤의 기능성 성분 함량 예측 모델을 이용하여 감귤의 기능성 성분 함량을 예측하는 단계에서, 상기 예측은 감귤을 재배하는 시기에 이루어질 수 있다.

상기 감귤을 재배하는 시기는 3월 내지 11월일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 통상의 기술자의 재배 방법 및 재배 조건에 따라 재배 시기는 조절될 수 있다.

본 발명의 PLS 회귀분석은 다변량 통계기법 중의 하나이다. 다변량 통계기법이란, 설정된 변동변수와 목표변수를 이용하여 수학식 1과 같은 수학식을 모델링하는 것이다.

[수학식 1]

y = ax₁ + bx₂ + cx₃ + dx₄

여기서, x₁, x₂, x₃, 및 x₄는 변동변수이고, y는 목표변수이며, a, b, c, d는 상수이다.

다변량 통계분석기법 중 하나인 PLS는 측정변수와 예측변수 사이의 상관관계를 바탕으로 다변량 데이터를 분석하는 방법인데, 수학식 1에서 변동변수 및 목표변수가 각각 측정변수와 예측변수에 해당하는 것이다. 이 때, 측정변수를 x로 설정하고, 예측변수를 y로 설정하여 x, y 각각의 상관관계를 회귀(regression)한다.

부분최소자승법은 예측변수의 수가 측정변수의 수보다 많을 경우에도 사용이 가능하며, 이때 x와 y의 다중 상관관계를 이용하여 예측모델을 구축할 수 있는데 이러한 점이 단순회귀분석모델을 이용하는 경우와 비교하여 감귤의 기능성 성분 함량을 포함하는 다양한 형질과 예측의 유효관계를 판단하게 해 줄 수 있는 장점을 가지고 있다.

아직까지 감귤 시료에서 카로티노이드 함량 예측 모델링 연구가 보고된 바가 없어 정확한 비교는 어려우나, 카로티노이드 함량이 높은 당근의 경우 FT-IR 스펙트럼과 총 카로티노이드 함량의 상관관계 분석을 통해 상관계수(R ² )가 0.9정도 임이 보고된 바 있다(Zude et al., Analytica Chimica Acta 623:204-212., 2008). 총 플라보노이드의 함량 예측의 경우 커피(Pascoa et al., Food Res. Intl. 51:579-586., 2013)에서 보고된 바 있으며 이 경우 함량 예측 모델링의 상관계수는 각각 R ² = 0.94, R ² = 0.94 로 보고되었고, 아프리칸 얌에서 같은 연구가 진행되었으나 본 연구에 비해 상관계수가 낮게 보고되었다(Song et al., Kor. J. Hort. Sci. Technol. 32:105-114., 2014). 향후 PLS 모델링의 정확도 향상을 위한 시료의 분석조건 표준화, 모델링에 사용되는 분석시료의 개체 수 증대, 기능성 성분의 양적 변화가 큰 시료가 모델링에 활용되는 등의 보완이 이루어진다면, 보다 정확한 성분 예측 모델링으로 활용이 가능할 것으로 기대된다.

또한, 감귤이 함유하고 있는 기능성 성분들에 대한 항산화 효과와 항염증 효과가 연구되고 있으며(Park et al., J. Fd Hyg. Safety. 26:355-360., 2011; lee et al., J. Fd Hyg. Safety. 28:342-348., 2013), 최근에는 기능성 성분들에 대한 연구가 매우 활발히 진행되고 있다(Khan et al., J. Food Composition and Analysis. 33:85-104., 2014; Tripoli et al., Food Chem. 104:466-479., 2007; Peterson et al., J. Food Composition and Analysis. 19:S66-S73., 2006). 그러나, 기능성 성분을 정량 분석하기 위해서는 많은 시간이 필요하고, 대량의 시료를 분석하는데 어려움이 있다. 따라서 본 발명을 토대로 기능성 성분 예측 모델링을 구축하고 활용한다면, 쉽고 빠르고 비교적 정확하게 기능성 성분을 예측할 수 있기 때문에 시간적, 비용적인 측면에서 손쉽게 활용이 가능할 것으로 사료된다.

본 발명에 따른 대사체 수준에서의 감귤의 유용 기능성 성분 함량 예측 모델링은 아직 동정 및 표준화가 이루어지지 않은 다수의 감귤 시료로부터 품질특성 평가 수단으로 활용이 가능하여 우수한 감귤 품종이나 계통의 신속한 선발 수단으로서 활용이 가능할 것이다. 또한, 선발된 라인은 육종의 직접적인 소재로 활용이 가능하여 감귤의 기능성 품종개발 가속화에 기여할 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 예측 방법을 이용하면 감귤 과실의 수확 전에 기능성 성분 함량이 높은 감귤을 신속하게 선발할 수 있으며, 본 발명에 따른 FT-IR 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석 기법을 이용하여 수확 시기 감귤의 신속한 식별 및 선발 체계를 확립할 수 있다. 또한, 선발된 라인은 육종의 직접적인 소재로 활용이 가능하여 감귤의 기능성 품종개발 가속화에 기여할 수 있다.

도 1은 감귤 시료의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 도이다 ; 단백질/아마이드 I, II : 1500-1700cm^-1, 인산디에스테르 그룹 : 1300-1500cm^-1, 당 화합물 : 950-1100cm^-1. 화살표는 감귤 시료에서 상당한 스펙트럼 변화를 나타내는 FT-IR 영역. CMB : 비가림 재배 궁천조생(Citrus unshiu Marc. cv. Miyagawa (under rain shelter)), CBP : 노지 재배 궁천조생(C. unshiu Marc. cv. Miyagawa (on the field)), FJ : 금귤(Fortunella japonica), CS : 세토카(C. hybrid 'Setoka'), CP : 감평(C. hybrid 'Kanpei'), CK : 청견(C. hybrid 'Kiyomi'), CR : 부지화(C. hybrid 'Shiranuhi').
도 2는 감귤 시료의 FT-IR 스펙트럼 데이터에 대한 PCA 스코어(A) 및 하중값(loading values) 플롯(B)을 나타낸 도이다 ; (A)의 원형 점선은 높거나(CS) 중간(CP) 또는 낮은(FJ) 함량의 총 페놀 및 플라보노이드를 포함하는 감귤 시료의 클러스터 경계. (B)의 화살표는 감귤 시료 클러스터링에서 유의미한 역할을 하는 FT-IR 영역. CMB : 비가림 재배 궁천조생(Citrus unshiu Marc. cv. Miyagawa (under rain shelter)), CBP : 노지 재배 궁천조생(C. unshiu Marc. cv. Miyagawa (on the field)), FJ : 금귤(Fortunella japonica), CS : 세토카(C. hybrid 'Setoka'), CP : 감평(C. hybrid 'Kanpei'), CK : 청견(C. hybrid 'Kiyomi'), CR : 부지화(C. hybrid 'Shiranuhi').
도 3은 감귤 시료의 FT-IR 스펙트럼 데이터에 대한 PLS-DA 스코어 플롯을 나타낸 도이다 ; 원형 점선은 높거나(B) 낮은(A) 함량의 기능성 성분을 포함하는 감귤 시료의 클러스터 경계. CMB : 비가림 재배 궁천조생(Citrus unshiu Marc. cv. Miyagawa (under rain shelter)), CBP : 노지 재배 궁천조생(C. unshiu Marc. cv. Miyagawa (on the field)), FJ : 금귤(Fortunella japonica), CS : 세토카(C. hybrid 'Setoka'), CP : 감평(C. hybrid 'Kanpei'), CK : 청견(C. hybrid 'Kiyomi'), CR : 부지화(C. hybrid 'Shiranuhi').
도 4는 감귤 시료 FT-IR 스펙트럼 데이터의 PLS 회귀분석 모델에 의한 총 카로티노이드(A), 플라보노이드(B), 페놀(C) 함량의 측정값과 예상값 사이의 선형회귀분석을 나타낸 도이다 ; 희귀상관계수(R ² )는 각각 0.99.

이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 또한 본 발명에서 인용하고 있는 참고문헌은 본 발명의 명세서의 일부로 통합된다.

< 실시예 1> 감귤 시료 수득

감귤은 제주도내에서 가장 많이 재배되며 시중에 판매되고 있는 7종의 감귤을 사용하였다. 실험에 사용된 감귤은 비가림 재배 궁천조생(Citrus unshiu Marc. cv. Miyagawa (under rain shelter)), 노지 재배 궁천조생(C. unshiu Marc. cv. Miyagawa (on the field)), 금귤(Fortunella japonica), 세토카(C. hybrid 'Setoka'), 감평(C. hybrid 'Kanpei'), 청견(C. hybrid 'Kiyomi') 그리고 부지화(C. hybrid 'Shiranuhi')이며 각 종별로 3개를 대사체 분석에 사용하였다. 각각의 시료는 동결건조 하였고, 막자와 막자사발을 이용하여 분말형태로 분쇄하였다. 분쇄된 감귤 시료는 -70℃ 초저온 냉동고에 보관하여 사용하였다.

< 실시예 2> 감귤 시료의 총 카로티노이드 함량 측정

감귤 시료의 총 카로티노이드(total carotenoids) 함량은 Yang et al. (1998)의 방법을 이용하여 UV-VIS 분광광도계(spectrophotometer)(DU^®730, BECKMAN COULTER, Brea, CA, America)를 통해 조사하였다. 감귤 분말 시료 20mg을 80% 아세톤(acetone) 1mL이 들어있는 튜브에 넣어주고 용매와 잘 섞이도록 흔들어 주었다. 용매와 잘 섞인 시료를 상온에서 13,000rpm으로 5분간 원심분리 하였다. 원심분리가 끝난 후 시료의 상징액을 새로운 튜브에 옮겨 주었다. 새로운 튜브에 옮겨진 추출물을 흡광도가 0.3-0.85이 되도록 희석하였고, 350-750nm 측정범위에서 >2nm 간격으로 UV-VIS 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도로부터 Lichtenthaler and Buschmann(Curr. Prot. Food Anal. Chem. F4.3.1F 4.3.8., 2001)의 방법을 이용하여 감귤 시료로부터 총 카로티노이드 함량을 조사하였고 함량계산식은 아래와 같다.

C _a (μg·L^-1) = 12.25*A₆₆₃-2.79*A₆₄₇

C _b (μg·L^-1) = 21.50*A₆₄₇-5.1*A₆₆₃

C _(x+c) (μg·L^-1) = (1000*A₄₇₀-1.82*C _a -85.02*C _b )/198

함량계산식에 사용된 C _a 는 엽록소 a(chlorophyll a), C _b 는 엽록소 b(chlorophyll b)를 나타낸다. 또한, C _(x+c)에서 x+c는 엽황소(xanthophylls)와 카로틴(carotenes)의 합은 총 카로티노이드 함량을 나타낸다. 측정된 값은 분산분석(Analysis of variance, ANOVA)을 이용하여 유의성을 판별하였다.

그 결과, 표 1과 같이 총 카로티노이드 함량은 세토카가 3.53μg·g^-1 건조중량(wt)으로 감귤 품종 가운데서 가장 높았으며 다음으로 노지 재배 궁천조생 및 부지화가 각각 1.93 및 1.54μg·g^-1 건조중량(wt)으로 나타나 총 카로티노이드 함량이 높은 품종임을 알 수 있었다. 반면에 금귤과 비가림 재배 궁천조생은 다른 감귤 품종들에 비해 총 카로티노이드 함량이 낮은 품종임을 알 수 있었다.

품종	라인 개수	성분 함량
품종	라인 개수	총 카로티노이드 (μg·g^-1건조중량( WT))	총 플라보노이드 (μg·g^-1건조중량( WT))	총 페놀 (mg·g^-1건조중량( WT))
FJ	9	0.75±0.09	1.97±0.09	1.26±0.12
CK	9	0.90±0.06	2.85±0.07	6.16±0.44
CMP	9	1.93±0.13	3.02±0.05	5.16±0.15
CMB	9	0.85±0.04	3.01±0.23	4.20±0.17
CP	9	1.02±0.07	2.73±0.24	4.44±0.50
CS	9	3.53±0.34	4.50±0.36	6.29±0.24
CR	9	1.54±0.13	2.35±0.06	3.67±0.17

CMB : 비가림 재배 궁천조생(Citrus unshiu Marc. cv. Miyagawa (under rain shelter)), CBP : 노지 재배 궁천조생(C. unshiu Marc. cv. Miyagawa (on the field)), FJ : 금귤(Fortunella japonica), CS : 세토카(C. hybrid 'Setoka'), CP : 감평(C. hybrid 'Kanpei'), CK : 청견(C. hybrid 'Kiyomi'), CR : 부지화(C. hybrid 'Shiranuhi').

< 실시예 3> 감귤 시료의 총 플라보노이드 함량 측정

감귤 시료로부터 총 플라보노이드(total flavonoids) 함량은 Zhishen et al. (1999)의 방법을 이용하여 UV-VIS 분광광도계를 통해 조사하였다. 감귤 시료 10mg을 무수에틸알콜(absolute ethanol) 1mL이 들어있는 튜브에 넣어주었다. 용매와 잘 섞이도록 흔들어준 후 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 시료를 상온에서 13,000rpm으로 5분간 원심분리하고, 원심분리가 끝난 시료의 상징액 100μL를 새로운 튜브에 옮겼다. 옮겨진 시료 100μL에 2차 증류수 400μL를 첨가하여 혼합한 다음 5% NaNO₂ 30μL를 첨가하여 상온에서 10분간 반응시켰다. 10분간 반응이 끝난 후 10% AlCl₃용액 30μL를 첨가하여 상온에서 다시 1분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 1M NaOH 200μL를 첨가하여 반응액의 최종 부피가 1mL가 되도록 2차 증류수 240μL를 첨가하였다. 준비된 시료는 UV-VIS 분광광도계를 이용하여 510nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 카테킨(catechin)(100mg·L^-1)을 사용하여 조사하여 총 플라보노이드 함량을 측정하였다. 측정된 값은 분산분석을 이용하여 유의성을 판별하였다.

그 결과, 표 1과 같이 총 플라보노이드 함량은 세토카가 4.50μg·g^-1 건조중량(wt)으로 가장 함량이 높은 품종으로 나타났으며, 노지 재배 궁천조생과 비가림 재배 궁천조생이 그 다음으로 총 플라보노이드 함량이 높아 궁천조생의 재배 방법이 다르나 총 플라보노이드 함량은 비슷함을 알 수 있었다. 금귤은 카로티노이드의 함량분석 결과와 마찬가지로 총 플라보노이드 함량이 가장 낮은 품종으로 나타났다.

< 실시예 4> 감귤 시료의 총 페놀 함량 측정

감귤 시료의 총 페놀(total phenolics) 함량은 Wu et al. (2007)의 방법을 이용하여 UV-VIS 분광광도계를 통해 조사하였다. 감귤 시료 10mg을 80% 에탄올(ethanol) 50μL가 들어가 있는 튜브에 넣어주었다. 용매와 잘 섞이도록 흔들어준 후 95℃에서 5분간 가열하여 추출하였다. 추출된 시료는 상온에서 12,000rpm으로 15분간 원심분리하고, 원심분리가 끝난 시료의 상징액 20μL를 새로운 튜브에 옮겼다. 옮겨진 추출물 20μL에 2N 폴린 시오칼투 시약(Folin-Ciocalteu reagent) 50μL와 20% Na₂CO₃ 100μL를 첨가하고 최종 부피가 1mL가 되도록 2차 증류수 830μL를 첨가하여 준비하였다. 대조군으로 사용될 용액은 2차 증류수 850μL에 2N 폴린 시오칼투 시약 50μL와 20% Na₂CO₃ 100μL를 첨가하고 최종 부피가 1mL가 되도록 준비하였다. 표준물질은 20μL 에탄올(ethanol)이 포함된 클로로겐산(chlorogenic acid)에 2N 폴린 시오칼투 시약 50μL와 20% Na₂CO₃ 100μL를 첨가하고 최종 부피가 1mL가 되도록 2차 증류수 830μL를 첨가하여 부피를 조정하였다. 준비된 시료는 상온에서 20분간 반응시킨 후에 UV-VIS 분광광도계를 이용하여 725nm 파장에서 흡광도를 조사하였다. 측정된 값은 분산분석을 이용하여 유의성을 판별하였다.

그 결과, 표 1과 같이 총 페놀 함량은 세토카가 6.29mg·g^-1 건조중량(wt)으로 가장 높은 품종이며, 금귤이 다른 감귤 품종들에 비해 함량이 낮음을 알 수 있었다.

종합적으로 감귤 시료의 기능성 성분 정량분석 결과를 보면, 총 카로티노이드, 플라보노이드 및 페놀 함량이 다른 품종에 비해 세토카에서 높게 나타났으며, 총 카로티노이드, 플라보노이드 및 페놀 함량은 각각의 감귤 품종들 사이에 함량 차이가 나타남을 알 수 있었다. 이 결과는 Park et al.(2011)에 따른 감귤에 존재하는 total phenolics 함량 등 기능성 성분들의 경우 품종에 따라서 질적 차이는 물론 양적 차이가 매우 크다는 보고와 일치한다.

< 실시예 5> 감귤 시료의 전세포추출물 제조

궁천조생(비가림 재배), 궁천조생(노지 재배), 금귤, 세토카, 감평, 청견 그리고 부지화의 분말 20mg을 튜브에 넣고 20% 메탄올(methanol) 용액을 200μL씩 첨가하여 잘 섞어주었다. 각 튜브를 50°C 수조에서 20분간 반응시킨 다음 13,000rpm에서 15분간 원심분리한 후 상징액을 새로운 튜브에 옮겼다. 회수한 상징액은 원심분리과정을 반복하여 찌꺼기가 들어가지 않도록 조심스럽게 새로운 튜브에 상징액을 옮겼다. 회수된 상징액은 -20°C에서 보관한 다음 FT-IR 스펙트럼 조사에 사용하였다.

< 실시예 6> FT - IR 스펙트럼 데이터 분석

FT-IR(Fourier transform infrared) 스펙트럼 조사는 Tensor 27(Bruker Optics GmbH, Ettlingen, Germany)를 사용하였고, DTGS(deuterated triglycine sulfate) 검출기로 분석하였다. 추출된 각각의 시료 5μL를 384-웰 셀렌화아연 플레이트(384-well ZnSe plate)에 분주하여, 37°C 핫플레이트(hot plate)에서 약 20분간 건조하였다. 건조된 셀렌화아연 플레이트는 Tensor 27에 장착된 HTS-XT(Bruker Optics GmbH) 고효율 자동화 장치를 이용하여 스펙트럼을 조사하였다. 각 시료의 스펙트럼은 총 4,000-400cm^-1 범위에서 그리고 4cm^-1 간격으로 총 128회 반복 측정된 평균 스펙트럼을 분석에 사용되었다. 각 시료의 FT-IR 스펙트럼은 통계적 분석을 위해 각각 3회 반복 측정하였다. FT-IR 스펙트럼 조사 및 데이터 변환에 사용된 프로그램은 Bruker에서 제공하는 OPUS Lab(ver. 6.5, Bruker Optics Inc.)를 사용하였다.

각 감귤 시료의 FT-IR 스펙트럼을 비교한 결과, 감귤 시료들은 FT-IR 스펙트럼상의 1,700-1,500, 1,500-1,300, 1,100-950cm^-1 부위에서 대사체의 양적, 질적 패턴 변화가 크게 이루어짐을 알 수 있었다(도 1). FT-IR 스펙트럼의 1,700-1,500, 1,500-1,300 그리고 1,100-950cm^-1 부위는 각각 아미노산 및 단백질의 아마이드결합(amide bond) I 과 II, 핵산 및 인지질로부터 인산디에스테르결합(phosphodiester bond) 및 인을 포함하는 유기산, 그리고 단당류나 복합 다당류를 포함하는 탄수화물 계열의 화합물들의 질적, 양적 정보를 반영한다(D’Souza et al., Chem. Insights 3:135-143., 2008; Dumas and Miller, Vib. Spec. 32:3-21., 2003; Lopez-Sanchez et al., J. Agric. Food Chem. 58:82-87., 2010; Parker, Plenum Press. New York. 527., 1983; Wolkers et al., Carb. Res. 339:1077-1085., 2004; Yee et al., Environ. Sci. Technol. 38:775-82., 2004). 즉, FT-IR 스펙트럼 상의 질적, 양적 차이는 감귤에 함유되어 있는 아미노산이나 단백질, 지방산, 그리고 탄수화물 계통의 화합물들의 질적, 양적 차이가 현저하게 나타남을 의미한다.

따라서, FT-IR 스펙트럼 분석은 감귤 시료들 사이에서 주요 대사체의 질적, 양적 변화를 조사하고 이들 화합물의 함량이 높은 계통의 신속한 선발 수단으로 활용이 가능하다.

< 실시예 7> FT - IR 스펙트럼 데이터 다변량 통계분석

FT-IR 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석을 위해 먼저 FT-IR 스펙트럼 데이터의 바탕선(baseline) 교정, 정규화(normalization) 및 평균 중심화(mean centering) 등 스펙트럼의 전처리 과정을 R 프로그램(version 2.15.0, Auckland, New Zealand)을 이용하여 수행하였다. 바탕선 교정을 위해 FT-IR 스펙트럼 분석 영역의 양 끝점(1,800-800cm^-1)의 흡광도를 0으로 조정하였으며 실험상의 오차를 최소화하기 위하여 각 스펙트럼을 동일 면적으로 정규화하였다. 이후 데이터의 평균 중심화 과정을 거쳐 2차 미분을 수행한 다음 전처리가 완료된 스펙트럼 데이터를 다변량 통계분석 분석을 위한 표준화된 데이터로 사용하였다. 가공된 FT-IR 스펙트럼 데이터는 NIPALS 알고리즘(Wold, 1966)을 이용하여 R 프로그램(version 2.15.0)에서 PCA(Principal component analysis)와 PLS-DA(Partial least square discriminant analysis) 분석(Fiehn et al., Nat. Biotechnol. 18:1157-1161., 2000; Trygg et al., J. Proteomes Res. 6:467-479., 2007)을 수행하였다.

FT-IR 스펙트럼 데이터의 PCA 분석 결과, PC 1과 2 스코어는 전체 변이량의 각각 37.0%, 9.3%의 설명력을 갖고 있으며 이는 전체 변이량의 약 48.3%를 반영하고 있음을 알 수 있었다(도 2A). PC 1과 PC 2를 기준으로 감귤 시료들의 PCA 스코어 플롯을 관찰한 결과 감귤 시료들은 PC 1을 기준으로 좌측에는 금귤과 비가림 재배 궁천조생 품종들이 주로 위치하였으며, 우측에는 노지 재배 궁천조생, 청견, 부지화, 감평, 세토카 품종들이 위치하였다. 이상의 결과를 미루어볼 때 PCA score plot 상에서 공간적인 분포위치와 이들 시료의 기능성 성분들 총 카로티노이드, 플라보노이드 및 페놀의 함량과 밀접한 상관관계가 있음을 알 수 있었다.

하중값(Loading value) 분석 결과, 감귤 시료의 좌우 구분에 중요한 PC 1을 결정하는 중요한 FT-IR 스펙트럼 부위는 주로 1,700-1,500과 1,500-1,300cm^-1부분임을 알 수 있었고, 감귤 시료의 상하 구분에 중요한 PC 2의 경우 주로 1,100-950cm^-1부분임을 알 수 있었다(도 2B). 이들 FT-IR 스펙트럼 부위는 감귤 시료의 FT-IR 스펙트럼 비교에서 보였던 차이가 큰 부위(도 1)와 일치하는 것으로 아마이드 I, II, 지방산과 탄수화물 계열의 화합물들의 질적, 양적 차이가 감귤의 대사체 수준 식별에 중요한 역할을 하고 있음을 의미하는 결과라 사료된다. 특히 기능성 성분들의 함량 차이에 따른 감귤 시료의 구분에 있어서 중요한 역할을 하는 PC 2의 경우 탄수화물 계열의 화합물들의 질적, 양적 차이가 크게 영향을 줌을 알 수 있었다. 이 결과로 미루어볼 때 이들 당 계열의 일차대사산물들의 양적 변화가 이차대사산물의 질적, 양적 변화와 양의 상관관계에 놓여 있음을 의미하는 결과라 사료된다.

PLS-DA 분석의 경우, PCA 분석보다 더욱 확실하게 감귤 시료들의 그룹 식별이 가능하였다(도 3). 각각의 감귤 시료들의 그룹 경계는 PCA에 비해 더욱 작아졌으며 동일 품종에 속하는 각 시료들의 반복구들도 각 그룹 내에 위치하여 PCA보다 감귤의 식별능력이 향상되었음을 알 수 있었다. 총 카로티노이드, 플라보노이드 함량이 비교적 낮았던 시료인 금귤의 경우 PCA 스코어 플롯 상에서 좌측 상단에 별도의 그룹을 형성하였으며, 총 카로티노이드, 플라보노이드 및 페놀 함량이 가장 높았던 시료인 세토카의 경우 PLS-DA 스코어 플롯 상에서 우측 하단에 별도의 그룹을 형성하며 분포하는 것을 관찰할 수 있었다. 기능성 성분들의 함량이 중간인 그룹은 주로 우측 상단에 분포하였다. 이상의 결과를 미루어볼 때 PCA와 마찬가지로 PLS-DA 역시 각 감귤 시료들의 스코어 플롯 상에서 공간적인 분포위치와 이들 시료의 기능성 성분들 총 카로티노이드, 플라보노이드 및 페놀의 함량과 밀접한 상관관계가 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 8> 감귤 시료의 총 카로티노이드, 플라보노이드 및 페놀 함량 예측 PLS 모델링

감귤 시료의 FT-IR 스펙트럼 데이터로부터 총 카로티노이드, 플라보노이드 및 페놀 함량 예측 모델을 개발하였다. 총 7종 감귤 시료의 FT-IR 스펙트럼 데이터와 동일 시료로부터 얻어진 총 카로티노이드, 플라보노이드 및 페놀 함량 실측 정량 데이터를 이용하여 X 변수에는 FT-IR 스펙트럼 데이터를 사용하였고, 3개의 Y 변수에는 UV-VIS 분광광도계를 통해 얻어진 총 카로티노이드, 플라보노이드 및 페놀 함량 정량 데이터를 각각 사용하였다. PLSR(partial least square regression) 분석은 R 프로그램(version 2.15.0)을 이용하였다. 예측 모델링의 정확도를 향상시키기 위하여 1개의 X 변수에 대해 3개의 Y 변수를 각각 교차검정을 실시하였다. 확립된 예측 모델링을 이용하여 각각의 감귤 시료의 총 카로티노이드, 플라보노이드 및 페놀 함량 예측을 수행하였다. 함량 예측 모델링의 정확도를 조사하기 위하여 감귤 시료로부터 총 카로티노이드, 플라보노이드 및 페놀 함량 실측치와 예측치에 대한 선형회귀분석을 수행하여 상관계수를 조사하였다.

PLS 모델링을 통해 FT-IR 스펙트럼 데이터로부터 예측된 함량 값과 동일 시료의 실측 함량 값을 이용하여 회귀분석을 수행한 결과, 총 카로티노이드의 경우 상관계수가 R ² = 0.99로 높게 나타났다(도 4A). 총 플라보노이드와 총 페놀의 함량 예측 모델링을 통한 선형회귀분석 상관계수는 각각 R ² = 0.99(도 4B) 및 0.99(도 4C)로 나타났다. 이들 결과는 감귤 시료의 FT-IR 스펙트럼 데이터만으로도 이들 시료 내에 존재하는 총 카로티노이드, 플라보노이드 및 페놀의 함량을 90%이상의 정확성으로 함량을 예측할 수 있는 결과라 사료된다.

본 발명을 토대로 기능성 성분 예측 모델링을 구축하고 활용한다면 보다 쉽고 빠르고 정확하게 기능성 성분을 예측할 수 있으므로, 시간적, 비용적인 측면에서 보다 손쉽게 활용이 가능할 것으로 사료된다.

본 발명에 따른 대사체 수준에서의 감귤의 유용 기능성 성분 함량 예측 모델링은 아직 동정 및 표준화가 이루어지지 않은 다수의 감귤 시료로부터 품질특성 평가 수단으로 활용이 가능하여 우수한 감귤 품종이나 계통의 신속한 선발 수단으로서 활용이 가능할 것이다. 또한, 선발된 라인은 육종의 직접적인 소재로 활용이 가능하여 감귤의 기능성 품종개발 가속화에 기여할 수 있다.

Claims

감귤 시료로부터 추출물을 얻고;
상기 추출물을 이용하여 FT-IR 분석 스펙트럼 데이터를 얻고;
상기 FT-IR 분석 스펙트럼 데이터의 수학적 전처리를 수행하고;
상기 전처리가 완료된 FT-IR 스펙트럼 데이터를 이용하여 부분최소 자승(Partial Least Square: PLS) 회귀분석을 수행하여 감귤의 기능성 성분 함량 예측 모델을 확립하고; 그리고
상기 확립된 감귤의 기능성 성분 함량 예측 모델을 이용하여 감귤의 기능성 성분 함량을 예측하는 단계;
를 포함하는, FT-IR 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석을 이용한 감귤의 기능성 성분 함량 예측 방법으로,
상기 FT-IR 분석 스펙트럼 데이터의 수학적 전처리는, 바탕선(baseline) 교정을 위해 FT-IR 스펙트럼 분석 영역인 1,800-800cm^-1의 흡광도를 0으로 조정하고, 각 스펙트럼을 동일 면적으로 정규화(normalization)하고 그리고 상기 스펙트럼 데이터의 평균 중심화(mean centering) 과정을 거쳐 2차 미분을 수행하는 것인 FT-IR 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석을 이용한 감귤의 기능성 성분 함량 예측 방법.
제1항에 있어서,
상기 감귤은 궁천조생(Citrus unshiu Marc. cv. Miyagawa), 금귤(Fortunella japonica), 세토카(C. hybrid 'Setoka'), 감평(C. hybrid 'Kanpei'), 청견(C. hybrid 'Kiyomi') 그리고 부지화(C. hybrid 'Shiranuhi')으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 FT-IR 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석을 이용한 감귤의 기능성 성분 함량 예측 방법.
제1항에 있어서,
상기 기능성 성분은 카로티노이드, 플라보노이드 및 페놀로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 FT-IR 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석을 이용한 감귤의 기능성 성분 함량 예측 방법.
제1항에 있어서,
상기 FT-IR 분석 스펙트럼 데이터는 4,000-400cm^-1의 범위에서 4cm^-1 간격으로 측정되어 얻어진 것인 FT-IR 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석을 이용한 감귤의 기능성 성분 함량 예측 방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 확립된 감귤의 기능성 성분 함량 예측 모델을 이용하여 감귤의 기능성 성분 함량을 예측하는 단계에서, 상기 예측은 감귤을 재배하는 시기에 이루어지는 것인 FT-IR 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석을 이용한 감귤의 기능성 성분 함량 예측 방법.
제6항에 있어서,
상기 감귤을 재배하는 시기는 3월 내지 11월인 FT-IR 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석을 이용한 감귤의 기능성 성분 함량 예측 방법.