KR101556547B1 - 고정화 효소를 이용하여 바이오매스로부터 당화합물을 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고정화 효소를 이용하여 바이오매스로부터 당화합물을 제조하는 생물전환(bioconversion) 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 유성분쇄 방식, 또는 마멸분쇄 방식의 물리적 전처리 단계에 의하여 바이오매스를 분쇄하여 고정화 효소의 접근성을 높임으로써 독성 부산물의 발생과 바이오매스의 손실을 줄이고 당 수율을 향상시켜 친환경적으로 바이오연료를 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 효소의 반복사용에 따른 활성저하를 최소화하고 효소의 회수율을 높여 전체공정의 소요비용을 절감할 수 있는 당화합물의 제조방법에 대한 것이다.

Description

고정화 효소를 이용하여 바이오매스로부터 당화합물을 제조하는 방법 {Manufacturing Method Of Saccharides From Biomass Using Immobilized Enzyme}

본 발명은 고정화 효소를 이용하여 바이오매스로부터 당화합물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 유성분쇄 방식, 또는 마멸분쇄 방식의 물리적 전처리 단계에 의하여 바이오매스를 분쇄하여 고정화 효소의 접근성을 높임으로써 독성 부산물의 발생과 바이오매스의 손실을 줄이고 당 수율을 향상시켜 친환경적으로 바이오연료를 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 효소의 반복사용에 따른 활성저하를 최소화하고 효소의 회수율을 높여 전체공정의 소요비용을 절감할 수 있는 당화합물의 제조방법에 대한 것이다.

바이오매스의 당화(saccharification) 공정은 셀룰로오스를 분해해서 글루코스로 변환하거나 헤미셀룰로오스를 분해해서 자일로스나 만노스(mannose) 등으로 분해하는 공정으로 셀룰라아제나 헤미셀룰라아제 같은 효소가 촉매로 작용한다.

이때, 상기 당화 공정에 사용되는 효소들은 매우 고가의 물질로서 전체 바이오에너지 생산이나 바이오리파이너리(biorefinery)의 비용을 증가시키는 주요 원인이 되고 있다.

또한, 바이오매스의 당화 공정은 상당한 시간(72~144시간)이 소요되는데 상기 당화 공정을 수행하는 동안 수용액 상에서 쉐이킹(shaking)되면서 효소의 3차원 구조가 변형되어 효소 활성(activity)을 잃게 되는 경우가 많다. 이는 효소의 반복적인 사용을 어렵게 만들어 전체 당화공정의 소요비용을 높이게 되며, 이 외에도 효소를 단독으로 사용하는 경우 사용된 효소를 회수하기가 쉽지 않아 효소의 재사용률이 낮아지는 원인이 되고 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 효소를 고정화하여 사용하는 기술이 제안되고 있다. 특히, 나노파티클, 자성나노입자, 나노파이버와 같은 나노구조체에 효소를 고정화하여 사용하는 경우, 부피대비 표면적이 넓어 효소의 당화 효율을 높일 수 있다는 장점이 있다.

그러나, 이와 같은 효소 고정화 기술을 바이오매스의 당화공정에 적용하는 경우, 도 1a, 1b에 도시한 것과 같이, 바이오매스가 매우 큰 물질이기 때문에 고정화된 효소가 바이오매스 내부까지 침투하여 분해하기가 어려워진다.

즉, 효소는 일반적으로 수십 나노 수준의 분자인데 일반 화학물질을 분해하는 경우 화학물질이 작아 효소가 화학물질과 제대로 반응할 수 있지만, 바이오매스의 경우 그 크기가 상대적으로 크기 때문에 고정화되어 자유롭게 움직이지 못하는 상태의 효소가 바이오매스를 완전히 분해하기가 매우 어려워진다.

한편, 바이오매스의 전처리 공정은 섬유소의 함량을 증가시키고 미세섬유의 결정성을 감소시켜 바이오매스의 단위면적당 효소의 흡착율을 높임으로써, 섬유소의 반응성을 증가시키고 효소 가수분해 능력을 증가시키기 위한 공정이다.

상기 전처리 방법으로는 바이오매스의 종류에 따라 다양한 물리적, 화학적 방법이 있으며, 예를 들어 증기 폭쇄법, 알칼리 처리법, 이산화황 처리법, 과산화수소 처리법, 초임계 암모니아 처리법, 약산 추출 처리법, 암모니아 동결 폭쇄법 등이 알려져 있다.

이중 가장 많이 사용되는 약산 추출 처리법은 고온고압의 반응기에 목재 등을 미분쇄하여 장입하고 그 틈새로 저농도의 산을 흘러 보내주어 헤미셀룰로스와 일부 리그닌을 추출하여 제거하는 방법이다. 그러나, 상기 방법은 바이오매스 조직의 물리적 파쇄를 유발하기 어렵고 추출수에 미세입자가 동반하여 배관이 폐색되거나 처리 전 미분쇄에 과도한 동력이 소요되는 등의 문제점이 있다.

또한, 알칼리 전처리의 경우 높은 pH 값(≥ 10)에 의해서 이후에 따르는 셀룰로스 분해 효소 및 자일란 분해 효소의 활성을 저해하게 되어 이후에 pH 저해 공정이 뒤따라야 한다. 이 공정에서는 다량의 물을 사용해야 하며 산 처리시는 불필요한 염류를 형성하여 여전히 해결해야 하는 문제로 남아있다.

무엇보다도 현재 가장 많이 사용되는 두 가지 전처리 방법 모두 단당류만 생성되는 것이 아니라 약산, 퓨란 유도체, 페놀계 화합물 등이 발생하게 되며, 이런 화학물들은 이후 발효 공정에서 활용될 미생물에 치명적인 독성을 유발하게 되어 뒤따르는 발효 공정의 효율을 저감시키는 영향을 미치게 된다.

이런 문제를 해결하기 위해 화학적인 처리 방법이 아닌 물리적인 처리 방법을 이용한 바이오매스 처리 방법들이 최근 연구되고 있다. 대한민국 등록특허 10-1171922에서는 바이오매스의 전처리를 위해 먼저 스톤 그라인딩, 기계적 째기, 찢기, 핀 그라인딩, 공기 마찰 밀링에 의해 초기 바이오매스의 크기를 감소시키고 이후 전자빔 조사를 통해 바이오매스를 분해하는 공정이 개시하고 있다. 그러나, 이 경우 두 번의 전처리 공정을 수행하게 되고 무엇보다도 전자빔 조사는 에너지 소비가 높아서 실제 바이오매스 분해를 통해서 생성되는 에너지보다 더 많은 에너지를 소비하게 되는 문제점이 있다.

또한, 대한민국 특허 10-1159290은 디스크 밀링 방법을 사용하여 바이오매스를 전처리하는 방법을 사용하고 있으나, 이는 비교적 겉 표면막이 약한 해조류 바이오매스에만 적용될 수 있으며, 전처리 후에도 H2SO, HCl, HBr, HNO3, CH3COOH, HCOOH, HClO4, H3PO4, PTSA(para-toluene sulfonic acid)와 같은 고체산 촉매 처리가 뒤따르는 2단계 전처리 공정이 필요하다.

한편 Energy & Fuels (2006) 20, 807-811에서는 볼 분쇄(ball milling)를 통해서 셀룰로오스의 결정성을 약화시키는 기술이 개시하고 있으나, 이 기술은 볼 분쇄된 셀룰로오스를 약산 처리하여 셀룰로오스 결정성 약화의 효과를 얻는 것이다. 또 다른 공지 기술인 AIChE Journal (2010) 57, 793-800 에서도 마찬가지로 볼 분쇄를 사용하여 셀룰로오스의 분해에 미치는 영향을 공지하였으며 이 기술의 경우 고압증기에 상태에서 볼 분쇄를 병행하여 사용하고 있다.

즉, 오로지 물리적인 분쇄(milling) 만을 이용한 바이오매스의 효율적인 전처리 공정은 아직 개발되지 못하였다.

본 발명의 목적은 상기의 문제점을 해결하기 위한 것으로 종래의 화학적 전처리 방법이 가지고 있는 독성 부산물의 생성, 바이오매스의 질량 손실, 환경 오염 등의 문제점을 해결함과 동시에 종래의 볼 분쇄 방법이 가지는 낮은 분쇄 효율의 문제를 해결할 수 있으며, 고정화 효소의 바이오 매스에 대한 접근성을 높여 효소의 반복사용에 따른 활성저하를 최소화하고 효소의 회수율을 높여 전체공정의 소요비용을 절감할 수 있는 당화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 i) 바이오매스를 분쇄하는 물리적 전처리 단계; 및 ⅱ) 상기 물리적 전처리된 바이오매스를 효소를 이용하여 분해시키는 당화 단계;를 포함하며, 상기 ⅱ) 당화 단계에서, 물리적 전처리된 바이오매스의 분해를 위하여 고정화 효소(immobilized enzyme)가 사용되는 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법을 제공한다.

이때, 상기 고정화 효소가 바이오매스 내부까지 침투하여 당화가 충분히 이루어질 수 있도록, 상기 물리적 전처리 단계는 a) 바이오매스와 버퍼의 혼합물을 공자전하는 용기 내에서 볼을 이용하여 분쇄하는 유성분쇄(planetary mill) 방식, 또는 b) 바이오매스와 버퍼의 혼합물을 교반기가 구비된 용기 내에서 볼을 이용하여 분쇄하는 마멸분쇄(attrition mill) 방식으로 이루어지는 것이 바람직하다.

상기 고정화 효소는 다양한 방식으로 제조될 수 있으나, 바람직한 일 실시예로 버퍼용액에 효소를 첨가하여 효소용액을 준비하는 단계, 상기 준비된 효소용액에 나노구조체를 첨가한 후, 상기 나노구조체가 첨가된 효소용액을 교반, 배양하여 상기 나노구조체 표면에 효소를 흡착시키는 단계, 및 상기 나노구조체 표면에 흡착된 효소들을 응집 및 가교결합시키는 단계를 통해서 제조될 수 있다.

이때, 상기 나노구조체 표면에 흡착된 효소들을 응집 및 가교 결합시키기 위하여, 응집제 및 가교결합제가 별도로 첨가될 수 있는데, 상기 응집제는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 부틸알콜, 아세톤, PEG, 암모늄 설페이트, 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 소듐 포스페이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 설페이트, 포타슘 포스페이트 및 이들의 수용액으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있으며, 상기 가교결합제는 디이소시아네이트, 디안히드라이드, 디에폭사이드, 디알데하이드, 디이미드, 1-에틸-3-디메틸 아미노프로필카보디이미드, 글루타르알데하이드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다.

상기 응집제 및 가교결합제를 통하여 응집 및 가교 결합된 효소는 상기 나노구조체의 표면을 둘러싼 쉘을 형성하는 것을 특징으로 한다. 상기 나노구조체를 둘러싼 쉘의 형태를 가진 고정화 효소는 물리적으로 분쇄된 바이오매스를 분해하여 효율적으로 당화가 이루어질 수 있도록 한다.

한편, 본 발명의 또 다른 실시예에 따라 상기 고정화 효소는, 나노구조체가 효소용액에 잘 퍼지게 함과 동시에 효소가 고정화될 수 있는 반응면적이 넓어지도록 나노구조체를 풀어주는 단계, 및 상기 나노구조체를 효소용액에 첨가한 후 상기 나노구조체가 첨가된 효소용액을 교반, 배양하여 상기 나노구조체 표면에 효소를 흡착시키는 단계를 통해서 제조될 수 있다.

이때, 상기 나노구조체가 버퍼용액에 잘 퍼지게 함과 동시에 효소가 고정화될 수 있는 반응면적이 넓어지도록 풀어주기 위하여, 나노구조체를 에탄올에 30초~5분간 담구는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명에 따른 i) 물리적 전처리 단계가 효율적으로 이루어지기 위하여, 물리적 전처리는 100~120분 동안 진행되며, 바이오매스의 농도는 20~40g/ℓ인 것이 바람직하며, 사용되는 볼의 크기는 1~5Φ이고, 바이오매스의 분쇄를 위한 용기 또는 교반기의 회전 속도는 150~400rpm인 것이 바람직하다.

또한, 상기 바이오매스와 버퍼의 혼합물과 볼의 부피비는 1 : 0.5~1.5(혼합물 : 볼)이고, 바이오매스, 버퍼 및 볼의 총 부피는 상기 용기의 60~70%인 것이 바람직하다. 그리고, 상기 i) 물리적 전처리 단계에서 사용되는 버퍼는 후속공정인 ⅱ) 당화 단계에서 사용되는 버퍼와 동일하며, 상기 i) 물리적 전처리 단계 후에 별도의 부산물 제거 단계 없이 바로 ⅱ) 당화 단계가 이어지는 것이 바람직하다.

한편, 상기 ⅱ) 당화 단계에서, 효소 처리가 30~40 시간 동안 진행되며, 효소 사용량이 0.8~1 FPU/g-biomass인 것이 바람직하다.

본 발명의 고정화 효소를 이용하여 바이오매스로부터 당화합물을 제조하는 방법은 종래의 화학적 전처리 방법이 가지고 있는 독성 부산물의 생성, 바이오매스의 질량 손실, 환경 오염 등의 문제점을 해결함과 동시에 종래의 볼 분쇄 방법이 가지는 낮은 분쇄 효율의 문제를 해결할 수 있으며, 고정화 효소의 바이오 매스에 대한 접근성을 높여 효소의 반복사용에 따른 활성저하를 최소화하고효소의 회수율을 높여 전체공정의 소요비용을 절감하는 효과를 얻을 수 있다.

도 1a,b는 바이오매스의 당화공정에서 고정화되지 않은 효소(a)와 고정화효소를 사용하는 경우의 당화 여부를 설명하기 위한 도면이다.
도 2a,b는 본 발명의 일 실시예에 따른 전처리 방법으로서, 유성분쇄 방식(a)과 마멸분쇄 방식(b)의 원리를 설명하는 도면이다.
도 3은 전처리 전과 유성분쇄와 마멸분쇄 방식의 전처리 후의 볏짚의 SEM 사진 모습이다. (전처리 전의 볏짚의 모습(a), 유성 분쇄 후 볏짚의 모습(전처리 볏짚 농도 5 g/ℓ(b), 10 g/ℓ(c), 20 g/ℓ(d), 40 g/ℓ(e), 60 g/ℓ(f)), 마멸 분쇄 후 볏짚의 모습(전처리 볏짚 농도 5 g/ℓ(g), 10 g/ℓ(h), 20 g/ℓ(i), 40 g/ℓ(j), 60 g/ℓ(k))
도 4는 본 발명의 물리적 전처리를 하지 않은 바이오매스와 물리적 전처리를 한 바이오매스에 대하여 본 발명의 실시예에 따른 고정화 효소(1)(2)를 이용하여 당화 공정을 수행한 경우 생성된 단당류 글루코오즈의 농도를 표시한 그래프이다.
도 5a,b는 본 발명의 물리적 전처리를 한 바이오매스에 대하여 실시예에 따른 고정화 효소(1)(2)를 이용하여 당화 공정을 5회 반복 수행하는 경우 효소의 활성(activity) 저하 정도를 표시한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 물리적 전처리를 한 바이오매스에 대하여 고정화 효소(2)를 이용하여 바이오매스 분해를 시행하는 경우, 효소 반응기에서의 단당류 생성 정도를 시간에 따라 표시한 그래프이다.

이하, 본 발명의 고정화 효소를 이용하여 바이오매스로부터 당화합물을 제조하는 방법을 첨부된 도면 및 실시예들을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 당화합물의 제조방법은 i) 바이오매스를 분쇄하는 물리적 전처리 단계, 및 ⅱ) 상기 물리적 전처리된 바이오매스를 효소를 이용하여 분해시키는 당화 단계를 포함하며, 상기 ⅱ) 당화 단계에서, 물리적 전처리된 바이오매스의 분해를 위하여 고정화 효소(immobilized enzyme)가 사용되는 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 고정화 효소가 상대적으로 더 큰 바이오매스의 내부까지 침투하여 충분히 분해할 수 있도록, 상기 물리적 전처리 단계가 도 2a,b에 도시된 것과 같이 a) 바이오매스와 버퍼의 혼합물을 공자전하는 용기 내에서 볼을 이용하여 분쇄하는 유성분쇄(planetary mill) 방식, 또는 b) 바이오매스와 버퍼의 혼합물을 교반기가 구비된 용기 내에서 볼을 이용하여 분쇄하는 마멸분쇄(attrition mill) 방식으로 이루어지게 된다.

바이오매스의 당화 공정에 사용되는 효소들은 매우 고가의 물질일 뿐만 아니라, 당화 공정을 수행하는 동안 효소의 3차원 구조가 변형되어 활성을 잃게 되는 경우가 많으며, 사용된 효소의 회수가 어려워 당화 공정의 소요비용을 높이는 주된 원인이 되고 있다.

이에, 효소의 변형을 방지하고 회수를 손쉽게 하기 위하여 고정화 효소를 사용하는 방법이 제안될 수 있으나, 고정화 효소를 바이오매스의 당화공정에 적용하는 경우, 도 1a, 1b에 도시한 것과 같이 바이오매스가 고정화 효소보다 상대적으로 큰 물질이기 때문에 고정화된 효소가 바이오매스 내부까지 침투하여 분해하기가 어려워진다.

본 발명에서는 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 바이오매스를 유성분쇄(planetary mill) 방식, 또는 마멸분쇄(attrition mill) 방식의 물리적 전처리로 분쇄하여 목질계 바이오매스에 존재하는 리그닌과 같이 일반적인 볼 분쇄로는 처리가 어려운 단단한 껍질도 분쇄할 수 있을 뿐만 아니라, 고정화 효소가 내부까지 침투하여 충분히 분해할 수 있도록 바이오매스를 분쇄하는 것을 특징으로 한다.

종래의 물리적 전처리 방법인 볼 분쇄(ball milling) 방법은 일정 속도 이상 회전력을 높이면 세라믹볼에 작용하는 원심력과 구심력이 평형을 이루게 되면서 세라믹볼이 더 이상 낙하하지 않아 분쇄가 발생하지 않게 되어 분쇄 효율을 향상시키는데 한계가 있었다. 또한, 목질계 바이오매스와 같이 셀룰로오즈를 둘러싼 리그닌을 깨뜨려야 비로소 셀룰로오즈를 통한 당화와 발효 공정이 가능한 경우에는 낮은 분쇄 효율로 인하여 충분한 전처리가 이루어지기 어려웠다.

이에 반해, 본 발명에 따른 물리적 전처리 방법은 a) 도 2a에 도시된 바와 같이 용기가 서로 다른 회전축으로 공전과 자전을 동시에 함으로써, 두 개의 서로 다른 회전축을 가진 회전력을 통해 내부의 세라믹볼의 회전을 극대화하여 바이오매스를 분쇄하는 유성분쇄(planetary mill) 방식을 이용하거나, b) 도 2b에 도시된 바와 같이 샤프트 핀(shaft pin)이 형성된 교반기(agitator)에 의해서 용기 내에 힘의 구배를 유도하고, 상기 힘의 구배가 형성된 용기 내에서 세라믹볼 간의 마찰을 유도하여 내부에 있는 바이오매스를 분쇄하는 마멸분쇄(attrition mill) 방식을 이용하여 물리적 전처리를 수행하는 것을 특징으로 한다.

이와 같이 본 발명의 물리적 전처리 방법은 종래의 화학적 전처리 방법이 가지고 있는 독성 부산물의 생성, 바이오매스의 질량 손실, 환경 오염 등의 문제 및 종래의 볼 분쇄 방법이 가지는 낮은 분쇄 효율의 문제를 해결할 수 있다.

이때, 분쇄가 충분히 이루어지면서 전처리에 소요되는 에너지 대비 단당류 생성 효율을 최대화하기 위하여 상기 물리적 전처리가 100~120분 동안 진행되는 것이 바람직하며, 내부 용액의 점성을 높이지 않으면서도 볼과 바이오매스와의 충돌이 충분히 이루어지도록 상기 바이오매스의 농도는 20~40g/l 인 것이 바람직하다.

또한, 충분한 분쇄효과를 얻으면서도 볼과 용기의 손상을 방지하기 위하여, 상기 물리적 전처리 단계에서 사용되는 볼의 크기는 1~5Φ인 것이 바람직하며, 상기 바이오매스의 분쇄를 위한 용기 또는 교반기의 회전 속도는 150~400rpm인 것이 바람직하다.

그리고, 최적의 분쇄 효과를 얻기 위하여, 상기 바이오매스와 버퍼의 혼합물과 볼의 부피비는 1:0.5~1.5, 바람직하게는 1:1의 부피비로 사용될 수 있으며, 상기 바이오매스, 버퍼 및 볼의 총 부피는 상기 용기의 60~70%인 것이 바람직하다.

한편, 상기 바이오매스는 볏짚 등 다양한 바이오매스가 사용될 수 있으며, 효율적인 분쇄를 위하여 버퍼와의 혼합물 형태로 용기 내로 투입된다. 이때, 상기 버퍼는 다양한 물질이 사용될 수 있으나, 본 발명의 전처리 방법은 독성 부산물 제거 및 세척 등을 위한 후처리 공정이 필요하지 않으므로, 바이오연료 제조를 위한 후속 공정인 당화 공정에 사용되는 버퍼와 동일한 버퍼를 사용하여 후속공정에서 그대로 이용할 수 있으며, 이 경우 버퍼를 교환하는 추가 공정 및 비용이 발생하지 않는다.

또한, 효소 처리에 소요되는 시간 대비 단당류 생성 효율을 최대화하기 위하여 효소 처리는 30~40 시간 동안 진행되는 것이 바람직하며, 또한, 효소 사용량 대비 단당류 생성 효율을 최대화하기 위하여 효소 사용량은 0.8~1 FPU/g-biomass인 것이 바람직하다.

한편, 물리적 전처리가 완료된 바이오매스는 바로 당화 공정으로 넘어가게 되는데, 이때 고정화 효소(immobilized enzyme)가 분쇄된 바이오매스 사이사이로 침투하여 바이오매스의 당화를 수행하게 된다.

이때, 상기 고정화 효소는 다양한 방식으로 제조될 수 있으나, 바람직한 일 실시예로 포스페이트(phosphate) 버퍼와 같은 버퍼용액(buffer solution)에 효소를 첨가하여 효소용액(enzyme solution)을 준비하는 단계, 상기 준비된 효소용액에 나노구조체를 첨가한 후, 상기 나노구조체가 첨가된 효소용액을 교반, 배양하여 상기 나노구조체 표면에 효소를 흡착시키는 단계, 및 상기 나노구조체 표면에 흡착된 효소들을 응집 및 가교결합시키는 단계를 통해서 제조될 수 있다.

상기 나노구조체는 나노파티클, 자성나노입자, 나노파이버 등 다양한 형태가 사용될 수 있으며, 상기 나노구조체 표면에 흡착된 효소들을 응집 및 가교 결합시키기 위하여, 응집제 및 가교결합제가 별도로 첨가될 수 있다.

상기 응집제는 나노구조체 표면에 흡착된 효소들이 서로 응집하여 더 큰 덩어리를 형성하는 효과를 얻기 위한 것으로, 효소의 활성에 영향을 주지 않으면서 응집효과를 가져올 수 있는 모든 물질이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 부틸알콜, 아세톤, PEG, 암모늄 설페이트, 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 소듐 포스페이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 설페이트, 포타슘 포스페이트 및 이들의 수용액으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다.

또한, 상기 가교결합제는 상기 응집된 효소들이 서로 가교결합하여 나노구조체를 쉘(shell)처럼 둘러싸도록 하는 효과를 얻기 위한 것으로, 효소의 활성에 영향을 주지 않으면서 가교결합을 형성할 수 있는 모든 물질이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 디이소시아네이트, 디안히드라이드, 디에폭사이드, 디알데하이드, 디이미드, 1-에틸-3-디메틸 아미노프로필카보디이미드, 글루타르알데하이드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다.

상기 응집제 및 가교겹합제를 통하여 응집 및 가교 결합된 효소는 상기 나노구조체의 표면을 둘러싼 쉘을 형성하게 되며, 이러한 구조를 통하여 나노구조체와 효소간에 실질적인 결합이 형성되지 않은 경우에도 나노구조체의 표면에 최대한 많은 양의 효소가 고정화될 수 있다.

한편, 본 발명의 또 다른 실시예에 따라 상기 고정화 효소는, 나노구조체가 효소용액에 잘 퍼지게 함과 동시에 효소가 고정화될 수 있는 반응면적이 넓어지도록 나노구조체를 풀어주는 단계, 및 상기 풀어진 나노구조체를 효소용액에 첨가한 후 상기 나노구조체가 첨가된 효소용액을 교반, 배양하여 상기 나노구조체 표면에 효소를 흡착시키는 단계를 통해서 제조될 수 있다.

나노파이버 등의 나노구조체는 물에 잘 퍼지지 않는 경우가 많아, 효소용액 내에서 물과 경계층이 생기거나, 아예 효소용액 내에서 가라앉지 못하고 표면에 떠버려 효소와 제대로 반응하지 못하는 경우가 있을 수 있다. 이에, 상기 나노구조체를 효소용액에 잘 퍼지게 함과 동시에 효소가 고정화될 수 있는 반응면적이 넓어지도록 풀어주기 위하여, 나노구조체를 에탄올과 같은 소수성 액체에 30초~5분간 담구어 그 구조를 풀어준 후 사용하는 것이 바람직하다.

이와 같이 제조된 고정화 효소는 반복사용에 따른 초기 안정성은 응집제 및 가교겹합제를 사용한 경우보다는 다소 떨어지지만 바이오매스의 당화 효율을 높이는 효과를 얻을 수 있다.

이하 본 발명에 따라 볏짚을 이용하여 당화합물을 제조한 실시예들을 통하여 본 발명의 효과를 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

마멸 분쇄와 유성 분쇄를 이용한 바이오매스 전처리

본 발명의 전처리 공정을 실시하기 위해 먼저 볏짚을 먼저 400μm ~ 2cm 의 크기로 가정용 분쇄기(Blending)로 분쇄한 후 마멸 분쇄(Attrition mill)와 유성 분쇄(Planetary mill)를 시행하였다.

상기 마멸 분쇄(Attrition mill)와 유성 분쇄(Planetary mill)를 사용할 때에는 버퍼(Buffer)를 첨가하되, 후에 진행할 당화 공정을 생각하여 효소 분해공정에서 사용되는 동일한 버퍼인 50 mM의 소디움 포스페이트 혹은 소디움 포스페이트버퍼를 사용하였다.

또한, 이때 3Φ 크기의 볼(ball)을 사용하였으며, 볏짚과 버퍼(Buffer)를 합한 혼합물과 볼(Ball)의 부피비가 1:1의 비율이 되도록 하였으며, 용기(Vessel) 안의 볏짚과 버퍼(Buffer), 볼(Ball)을 포함하는 총 부피가 65%가 되도록 하였다.

상기의 조합으로 세라믹 볼과 볏짚을 넣고 마멸 분쇄기와 유성 분쇄기에 넣은 후, 300 rpm의 회전속도로 분쇄를 실시하여 샘플을 채취하였다.

전처리시 바이오매스의 농도에 따른 볏짚의 크기 분석

먼저 본 발명에 따른 전처리시 바이오매스의 농도에 따라 얻어진 볏짚의 크기를 알아보고자 8시간 동안 마멸 분쇄(Attrition mill)와 유성 분쇄(Planetary mill)를 실시한 후 SEM(Scanning Electron Microscop) 분석을 시행하였고 이를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 볼 수 있듯이, 전처리된 볏짚은 농도가 낮을수록 분쇄 효율이 더 좋았고 마멸 분쇄(Attrition mill)보다는 유성 분쇄(Planetary mill)로 분쇄를 시행하였을 때 좀 더 향상된 효과를 보였다.

전체적인 모습을 봤을 때 유성 분쇄의 경우 볏짚을 깨뜨리는 것과 같은 형상을 보이지만 마멸 분쇄는 볏짚을 표면부터 마모시키는 형상을 보이고 있다.

나노파이버의 제조

PS(polystyrene)와 PSMA(poly(styrene-co-maleic anhydride))을 2:1의 중량비로 THF 용매에 용해하여 고분자 혼합 용액을 준비하였다. 상기 준비된 고분자 혼합 용액을 30-gauge 스텐레스 스틸 니들이 형성된 플라스틱 실린지(Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)에 채운 후, 고전압 서플라이(ES30P-10W, Gamma High Voltage Research, Ormond Beach, FL,USA)를 사용하여 상기 니들에 7kV의 전압을 걸어 나노파이버를 전기방사하였다. 상기 전기방사된 나노파이버를 니들 팁으로부터 7cm 떨어진 거리에 위치한 알루미늄 포일에 모았다. 생성된 나노파이버는 200~1000nm의 직경을 가지는 것으로 관찰되었다.

고정화 효소(1)의 제조

셀룰라아제-나노파이버 복합체를 제조하기 위하여, 먼저 100-mM 포스페이트 버퍼(pH 8.0)에 10㎎/㎖의 효소 용액을 준비하였다. 상기 실시예3에서 제조한 나노파이버를 효소용액 1㎖에 첨가한 후, 30분 동안 상온에서 200rpm으로 교반한 후, 라커(locker)로 옮겨 4℃에서 2시간 동안 60rpm으로 교반하였다. 그 다음, 3% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 1㎖와 암모늄 설페이트 0.5g 를 첨가하고, 2시간 동안 상온에서 200rpm으로 교반한 후, 라커(locker)로 옮겨 4℃에서 밤새 30rpm으로 배양하였다.

이와 같이 제조된 셀룰라아제-나노파이버 복합체를 100-mM 포스페이트 버퍼로 워싱(washing)한 후, 글루타르 알데하이드의 결합되지 않은 기능기들은 100mM Tris-HCL을 사용하여 캐핑(capping)하였다. 캐핑된 셀룰라아제-나노파이버 복합체를 100-mM 포스페이트 버퍼로 워싱 용액에 효소가 관찰되지 않을 때까지 워싱(washing)하였다.

고정화 효소(2)의 제조

보다 많은 양의 셀룰라아제를 고정화셀룰라아제-나노파이버 복합체로 형성하기 위하여, 먼저 상기 실시예 3에서 제조한 나노파이버를 에탄올에 1분간 담가서 소수성으로 뭉쳐있는 나노파이버를 보다 넓게 풀어주고 이를 꺼내서 셀룰라아제-나노파이버 복합체를 제조하였다.

먼저, 셀룰라아제를 100 mM 포스페이트 (pH 8.0)에 10㎎/㎖의 농도로 준비하였다. 상기 실시예 3에서 제조하고 에탄올에 담근 나노파이버를 상기 효소용액 1㎖에 첨가한 후, 30분 동안 상온에서 200rpm으로 교반하고, 라커(locker)로 옮겨 4℃에서 2시간 동안 60rpm으로 교반하였다. 이와 같이 제조된 셀룰라아제-나노파이버 복합체를 워싱 용액에 효소가 관찰되지 않을 때까지 워싱(washing)하였다.

두가지 방법에 따른 셀룰라아제-나노파이버 복합체의 효소 분해능 비교

상기 실시예 4,5에서 준비된 셀룰라아제-나노파이버 복합체의 바이오매스 분해능을 비교하기 위하여, 상기 셀룰라아제-나노파이버 복합체가 단위 나노파이버 무게당 얼마만큼의 고정화되지 않은 셀룰라아제의 성능을 나타내는지 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.

	Represented enzyme activity onto nanofiber (mg-E/mg-NF)
EtOH사용 고정화 (실시예 5)	0.111±0.011
EtOH사용하지 않은 고정화 (실시예 4)	0.032±0.005

<실시예 4,5의 셀룰라아제-나노파이버 복합체의 효소 분해능 비교>

상기 표1에서 보는 바와 같이 에탄올을 사용하여 나노파이버를 풀어준 경우 에탄올을 사용하지 않은 경우에 비해서 약 3.5배 가량 분해능이 더 좋았다. 이는 에탄올을 통해서 나노파이버를 풀어줘서 효소가 고정화될 수 있는 반응 면적이 훨씬 넓어져 더 많은 양의 셀룰라아제가 고정화됐기 때문으로 볼 수 있다.

전처리 여부에 따른 단당류 생성 향상 효과 비교

상기 실시예 4, 5에서 준비된 고정화 효소(1),(2)를 사용하여 실시예 1의 유성분쇄 전처리를 한 바이오매스와 본 발명의 물리적 전처리를 하지 않은 바이오매스에 대하여 당화공정을 수행하여 생성된 단당류 글루코오즈의 농도를 측정하였다.

도 4의 결과에서 볼 수 있듯이, 고정화 효소(1),(2)의 경우 모두 물리적 전처리를 하지 않은 바이오매스보다 전처리를 한 바이오매스에서 훨씬 높은 당화 효율을 나타냄을 확인할 수 있었다.

전처리 시간에 따른 단당류 생성 향상 효과 비교

상기 실시예 4, 5에서 준비된 고정화 효소(1),(2)를 사용하여 실시예 1의 유성분쇄 전처리를 한 바이오매스에 대하여 당화공정을 5회 반복 수행하여 효소의 활성(activity) 저하 여부를 측정하였다.

도 5a,b의 결과에서 볼 수 있듯이, 고정화 효소(1)의 경우에는 안정성이 뛰어나 효소의 활성이 지속적으로 유지되고, 고정화 효소(2)의 경우에는 초기에는 안정성이 조금 떨어지지만 이후에는 활성이 지속적으로 유지되는 것으로 확인되었다.

효소반응기에서 장시간 바이오매스 분해에 따른 단당류 생성

상기 실시예 4,5에서 준비된 고정화 효소(1),(2) 중 효소의 담지량이 많아서 분해능이 높고 반복 사용에도 효소 활성을 유지하는 고정화 효소(2)를 사용하여 전체 반응 부피 20㎖의 회분식 효소 반응기에 볏짚 바이오매스를 넣고 당화공정을 실시하였다.

도 6에서 보는 바와 같이 시간이 지나면서 단당류인 글루코즈가 점점 증가하다가 52시간에 이르러서 더 이상 당화가 이루어지지 않고 saturation되는 것을 확인할 수 있어서 본 연구에서 준비된 고정화 효소(2)를 사용하면 52시간 만에 바이오매스의 분해를 충분히 할 수 있다는 것을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 당화합물 제조방법은 물리적 전처리 단계에 의하여 고정화 효소의 접근성을 높임으로써, 독성 부산물의 발생과 바이오매스의 손실을 줄이고 당 수율을 향상시켜 친환경적으로 바이오연료를 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 효소의 반복사용에 따른 활성저하를 최소화하고 효소의 회수율을 높여 전체공정의 소요비용을 절감하는 효과를 얻을 수 있다.

본 발명은 상술한 특정의 실시예 및 설명에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형 실시가 가능하며, 그와 같은 변형은 본 발명의 보호 범위 내에 있게 된다.

Claims (14)

1. 고정화 효소를 이용하여 바이오매스로부터 당화합물을 제조하는 방법으로서,
   i) 바이오매스를 분쇄하는 물리적 전처리 단계; 및 ⅱ) 상기 물리적 전처리된 바이오매스를 효소를 이용하여 분해시키는 당화 단계;를 포함하고,
   상기 ⅱ) 당화 단계에서, 물리적 전처리된 바이오매스의 분해를 위하여 고정화 효소(immobilized enzyme)가 사용되는 것을 특징으로 하며,
   상기 고정화 효소는, 나노구조체가 효소용액에 잘 퍼지게 함과 동시에 효소가 고정화될 수 있는 반응면적이 넓어지도록, 나노구조체를 풀어주는 단계; 및 상기 나노구조체를 효소용액에 첨가한 후, 상기 나노구조체가 첨가된 효소용액을 교반, 배양하여 상기 나노구조체 표면에 효소를 흡착시키는 단계;
   를 통해서 제조되는 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 물리적 전처리 단계는, a) 바이오매스와 버퍼의 혼합물을 공자전하는 용기 내에서 볼을 이용하여 분쇄하는 유성분쇄(planetary mill) 방식, 또는 b) 바이오매스와 버퍼의 혼합물을 교반기가 구비된 용기 내에서 볼을 이용하여 분쇄하는 마멸분쇄(attrition mill) 방식 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 제1항에 있어서,
   상기 나노구조체가 효소용액에 잘 퍼지게 함과 동시에 효소가 고정화될 수 있는 반응면적이 넓어지도록, 나노구조체를 에탄올에 30초~5분간 담그는 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법.
10. 제2항에 있어서,
    상기 i) 물리적 전처리 단계에서, 물리적 전처리는 100~120분 동안 진행되며, 바이오매스의 농도는 20~40g/ℓ인 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법.
11. 제2항에 있어서,
    상기 i) 물리적 전처리 단계에서, 사용되는 볼의 크기는 1~5Φ이며, 바이오매스의 분쇄를 위한 용기 또는 교반기의 회전 속도는 150~400rpm인 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법.
12. 제2항에 있어서,
    상기 i) 물리적 전처리 단계에서, 바이오매스와 버퍼의 혼합물과 볼의 부피비는 1 : 0.5~1.5(혼합물 : 볼)이고, 바이오매스, 버퍼 및 볼의 총 부피는 상기 용기 부피의 60~70%인 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법.
13. 제2항에 있어서,
    상기 i) 물리적 전처리 단계에서 사용되는 버퍼가 후속공정인 ⅱ) 당화 단계에서 사용되는 버퍼와 동일하며,
    상기 i) 물리적 전처리 단계 후에 별도의 부산물 제거 단계 없이 바로 ⅱ) 당화 단계가 이어지는 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법.
14. 제1항에 있어서,
    상기 ⅱ) 당화 단계에서, 효소 처리가 30~40 시간 동안 진행되며, 효소 사용량이 0.8~1 FPU/g-biomass인 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법.

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