KR101534911B1 - Cosmetic composition comprising the extract of Juniperus rigida Sieb. or Juniper berry as active ingredient - Google Patents

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Abstract

본 발명은 노간주나무(Juniperus rigida Sieb.) 또는 노간주열매(Juniper berry) 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 대한 것으로, 종래보다 우수한 효과를 가지는 항노화용, 미백용 및/또는 주름개선용 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다. 본 발명자들은 노간주나무 및/또는 노간주열매의 전자공여능, SOD(Superoxide radical dismutase) 유사활성능, 잔틴산화효소(xanthine oxidase) 저해활성, 티로시나아제(tyrosinase) 저해활성 측정, 엘라스타제(elastase) 저해활성, 콜라게나아제(collagenase) 저해활성 측정을 통하여 노간주 추출물의 화장품으로서의 우수한 약리활성을 확인하였으며, 이에 따라 노간주나무 또는 노간주열매 추출물을 포함하는 조성물은 종래보다 우수한 효과를 가지는 항노화용, 미백용 및/또는 주름개선용 화장료 조성물로 이용 가능하다. The present invention relates to a cosmetic composition comprising Juniperus rigida Sieb. Or Juniper berry extract. The present invention provides a cosmetic composition for anti-aging, whitening and / or wrinkle, . The inventors of the present invention have found that the effect of the present invention on the electron donating ability, the superoxide radical dismutase (SOD) -like activity, the xanthine oxidase inhibiting activity, the tyrosinase inhibiting activity, the elastase, Inhibitory activity, and collagenase inhibitory activity, the composition of the present invention showed excellent pharmacological activity as a cosmetic product. Thus, the composition containing the extract of the juniper or juniper fruit was superior in anti-aging, whitening And / or a cosmetic composition for improving wrinkles.

Description

노간주나무 또는 노간주열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising the extract of Juniperus rigida Sieb. or Juniper berry as active ingredient}The present invention relates to a cosmetic composition comprising an extract of Juniperus rigida Sieb. or Juniper berry as active ingredient}

본 발명은 노간주나무(Juniperus rigida Sieb.) 또는 노간주열매(Juniper berry) 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 대한 것으로, 종래보다 우수한 효과를 가지는 항노화용, 미백용 및/또는 주름개선용 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다.
The present invention relates to a cosmetic composition comprising Juniperus rigida Sieb. Or Juniper berry extract. The present invention provides a cosmetic composition for anti-aging, whitening and / or wrinkle, .

자외선은 노화뿐만 아니라 피부 멜라닌 생성을 유발하며 일반적으로 멜라닌은 자외선과 같은 외부자극으로부터 피부를 보호하기 위해 만들어지지만, 과도한 멜라닌 합성과 축적은 기미, 주근깨와 같은 질병을 일으키게 된다. 멜라닌 생성은 tyrosinase, tyrosinase related protein-1 (TRP-1), TRP-2의 세 효소에 의해 조절된다. 그 중 멜라닌 생성과정에서 주요 효소인 tyrosinase는 L-DOPA가 합성되는 단계와 L-DOPA로부터 DOPA quinone이 합성되는 단계를 촉진하여 멜라닌 합성을 촉진한다. 멜라닌 생합성에 관여한 인자로는 tyrosinase, dopachrome conversion factor, prostaglandin (PG), interferon (IFN), melanocyte stimulating hormone (MSH), Vit. D3,histamine등이 보고되어 있으며, 현재 tyrosinase 저해제로서 kojic acid와 albutin이 미백제로 많이 사용되고 있으나 세포독성, 돌연변이 유발 등의 부작용 등이 보고되고 있다. Ultraviolet rays cause not only aging but also skin melanin production. Melanin is generally made to protect the skin from external stimuli such as ultraviolet rays, but excessive melanin synthesis and accumulation causes diseases such as stain and freckles. Melanogenesis is regulated by three enzymes, tyrosinase, tyrosinase related protein-1 (TRP-1) and TRP-2. Among them, tyrosinase, a major enzyme in melanin production, promotes melanin synthesis by promoting the step of synthesizing L-DOPA and the step of synthesizing DOPA quinone from L-DOPA. Melanin biosynthesis was associated with tyrosinase, dopachrome conversion factor, prostaglandin (PG), interferon (IFN), melanocyte stimulating hormone (MSH), Vit. D 3 , and histamine. Currently, tyrosinase inhibitors kojic acid and albutin are widely used as whitening agents, but cytotoxicity and side effects such as mutagenesis have been reported.

또한, 자외선에 의해 증가되는 여러 단백질 분해효소 중에서 기질을 분해하는 matrix metalloproteinase (MMPs)는 피부 광노화 발생에 중요한 역할을 한다. 피부 진피 내 세포 외 기질단백질(extracellular matrix)은 피부의 구조와 탄력성을 유지하는데 중요한 역할을 하는데, 그 중 80~85%가 제 1형 교원질(type Ⅰ procollagen)로 이루어져 있다. 제 1형 교원질은 전구체인 procollagen 형태로 합성이 된 후 세포 밖으로 배출되어 아미노 말단과 카복실말단이 잘려나간 후 완성된 교원질을 만들게 된다. 기질 단백질의 재구성에는 여러 생체 반응이 관여하며, 이 중 특히 MMPs가 기질 단백질들을 분해하는 중요한 역할을 하고 있으며 intestitial collagenase (MMP-1), 72kD gelatinase (MMP-2), 92kD gelatinase (MMP-9), neutrophil collagenase (MMP-8), collagenase (MMP-13) 등 26가지 이상의 MMPs가 이미 알려져 있다. 자외선에 노출된 피부에서는 MMPs의 발현이 증가되며, 증가된 MMPs가 피부를 구성하고 있는 교원질을 분해하여 기질 단백질의 결핍을 초래하게 됨으로써 피부노화가 일어난다. 최근에 노화에 따른 MMPs의 증가와 관련된 세포 신호 전달 경로는 주로 stress-activated mitogen-activated protein (MAP) kinase pathway가 관여한다고 보고되어 있으며, 또한 MAP kinase 신호전달 경로는 cell growth, MMP 발현, 교원질 합성 등을 조절하는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 자외선에 의해 세포표면에 있는 growth factor와 cyrokine receptor가 활성화 되면 ERK (extracellular signal-regulated kinase), p38을 포함한 MAP kinase signal transduction pathway를 경유하여 신호를 조절하게 된다. 따라서 노화된 세포에서는 전사인자인 AP-1의 활성도가 증가되어 있다. 증가된 AP-1 활성도는 교원질 분해 효소인 MMP들의 발현을 증가시켜 피부에서 교원질의 결핍을 초래하는 것이다. 그러므로 stress-activated MAP kinase pathway는 전사인자인 AP-1을 활성화 시키고 결과적으로 MMPs의 발현을 증가시킨다.In addition, matrix metalloproteinases (MMPs), which degrade substrates among various proteolytic enzymes that are increased by ultraviolet light, play an important role in the skin photoaging. Extracellular matrix proteins in the dermis play an important role in maintaining the structure and elasticity of the skin, of which 80 to 85% are composed of type I collagens. Type 1 collagen is synthesized in the form of procollagen, which is a precursor, and then released out of the cell, resulting in the formation of the finished collagen after the amino and carboxyl ends are cleaved. MMP-1, 72 kD gelatinase (MMP-2), and 92 kD gelatinase (MMP-9), which are involved in the degradation of matrix proteins, , MMP-8, and collagenase (MMP-13) have been known. In skin exposed to ultraviolet light, the expression of MMPs is increased, and the increased MMPs break down the collagen that constitutes the skin, leading to the deficiency of the substrate protein, thereby causing skin aging. Recently, it has been reported that the signaling pathway related to the increase of MMPs due to aging is mainly involved in the stress-activated mitogen-activated protein (MAP) kinase pathway. MAP kinase signaling pathway is also involved in cell growth, MMP expression, It is known to play an important role in controlling the back. Activation of growth factors and cyrokine receptors on the cell surface by ultraviolet light modulates signals through the MAP kinase signal transduction pathway, including ERK (extracellular signal-regulated kinase) and p38. Therefore, the activity of AP-1, a transcription factor, is increased in senescent cells. Increased AP-1 activity increases the expression of the collagenase, MMPs, leading to collagen deficiency in the skin. Therefore, the stress-activated MAP kinase pathway activates the transcription factor AP-1 and consequently increases the expression of MMPs.

한편, 노간주나무(Juniperus rigida Sieb.)는 한국에서 석회암 지대에서 자라며, 원대가 옆으로 뻗으며 그 중간에서 뿌리가 나오는 갯노간주(J.conferta),높이 15 m의 소교목이지만 대개 줄기가 여러 갈래로 나오는 높이 3-5 m의 관목상으로 자라며 수피는 회갈색인 두송(J.communis),기본 종에 비해 잎의 길이가 4-8 mm로 짧고 열매가 6-7 mm로 잎보다 긴 곱향나무(J.communis var. montana)그리고 바닷가에서 자라는 해변노간주(Juniperus rigida Sieb.et Zuccvar. Koreana T.Lee) 등이 있다. 추위에 강하고 해풍을 잘 견디는 특징이 있어 해안이나 간척지 부근에서 방풍림 또는 풍치림으로 이용되고 있다. 노간주나무는 껍질이 붉은 갈색이고 4월에 꽃이 피며 열매는 흑갈색의 공 모양으로 맛은 좀 달며, 건조한 곳에서 잘 자랄 수 있을 뿐만 아니라 종자가 새들에 의하여 잘 전파될 수 있는 특성이 있으며, 어릴 때에서는 맹아력이 강하고 또 잎이 뾰족하여 동물의 침해가 어려워 능히 살아남을 수 있다고 한다.On the other hand, Juniperus rigida Sieb. Grows in limestone area in Korea, and is a small tree of 15m high, J. conferta, whose roots extend sideways and whose roots come out in the middle, (J.communis), the length of the leaves is 4-8 mm shorter than that of the basic species, the fruit is 6-7 mm longer than the leaves, J.communis var montana) and a beach juniper (Juniperus rigida Sieb.et Zuccvar. Koreana T.Lee) that grows on the beach. It is strong against the cold and can withstand the sea breeze, and is used as a windbreak or infestation near the coast or reclaimed land. The juniper tree has reddish brown skin, flowers bloom in April, and the fruit is a blackish brown ball with a little taste. It can grow well in a dry place and has a characteristic that seeds can spread well by birds. It is said that it is possible to survive because it is difficult to infest the animal because of strong point of the leaves and sharp point of the leaves.

또한, 이러한 노간주나무의 종자에서 채취한 기름은 이뇨제 등의 약리적 효과가 있다고 알려져 있어 부종, 통풍, 요로 생식기 질환에 사용하며, insect repellent로 이용하기도 하며, 서양에서는 노간주나무의 열매인 두송실(juniper berry)을 열매량의 3-4배가 되게 독한 술을 넣고 밀봉하여 6개월 정도 보관 후 건더기는 건져 버리고 술만 따로 보관해서 마시거나 향으로 이용하였다. 중국 본초도감에 따르면 과실에는 α-pinine, mycene, limonene 등이 들어있으며 거풍, 제습, 이뇨에 효능이 있고, 수종, 통풍, 요로질환 등을 치유시킨다고 하였다.In addition, the oil extracted from the seeds of Junjoo tree is known to have a pharmacological effect such as diuretic and is used for edema, gout, urinary tract disease, insect repellent, and juniper berry ) Was sealed 3-4 times as much as the fruit volume and sealed. After storing for about 6 months, it was saved and the drink was stored separately and used as a drink or incense. According to Chinese mainland guideline, fruit contains α-pinine, mycene, limonene, etc., and it is effective for breeze, dehumidification, diuretic, and it heals species, gout and urinary tract diseases.

그러나, 이와 같이 노간주나무를 이용한 기존의 연구는 대부분 한방 치료를 위한 것이거나 술로 이용하는 것이 대부분이었으며, 화장료 조성물로서의 효과는 미흡한 실정이었다. 이에 따라, 노간주나무를 이용한 화장료 조성물에 대한 필요성은 항시 존재하고 있는 실정이다.
However, most of the conventional studies using the juniper tree were for herbal medicine treatment or for drinking, and the effect as a cosmetic composition was insufficient. Accordingly, there is always a need for a cosmetic composition using juniper tree.

상기한 문제점을 해결하기 위한 본 발명은 우수한 효과를 가지는 항노화용, 미백용 및/또는 주름개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이 목적이다.The present invention for solving the above problems is to provide a cosmetic composition for anti-aging, whitening and / or wrinkle which has excellent effects.

그리고, 본 발명은 화장품으로 사용하기에 적합 우수한 전자공여능, SOD(Superoxide radical dismutase) 유사활성능, 잔틴산화효소(xanthine oxidase) 저해활성, 티로시나아제(tyrosinase) 저해활성 측정, 엘라스타제(elastase) 저해활성, 콜라게나아제(collagenase) 저해활성 등을 가지는 노간주나무 및/또는 노간주열매 추출물을 제공하기 위한 것이다. The present invention also relates to a pharmaceutical composition which is suitable for use as a cosmetic product and which has excellent electron donating ability, superoxide radical dismutase (SOD) -like activity, xanthine oxidase inhibiting activity, tyrosinase inhibiting activity, elastase ) Inhibitory activity, collagenase inhibitory activity, and the like.

또한, 본 발명은 티로시나아제 저해활성, 멜라노마 세포에서의 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 단백질 발현 및 mRNA 발현억제 효과가 우수해서, 더욱 증진된 효과를 가지는 미백용 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다. Further, the present invention provides a cosmetic composition for whitening which has excellent tyrosinase inhibitory activity, MITF, TRP-1, TRP-2 and tyrosinase protein expression and mRNA expression inhibiting effect in melanoma cells, .

또한, 본 발명은 엘라스타제 저해활성정, 콜라게나아제 저해활성, MTT assay에 의한 세포생존율, 프로콜라겐 생합성량, MMP-1 저해활성, MMP-1의 발현 억제 효과 등이 우수해서, 더욱 개선된 효과를 가지는 피부 주름개선용 화장료 조성물을 제공하고자 한다.
In addition, the present invention is excellent in inhibition of elastase inhibition activity, collagenase inhibition activity, cell survival rate by MTT assay, amount of procollagen biosynthesis, inhibition of MMP-1 and inhibition of expression of MMP-1. And to provide a cosmetic composition for improving skin wrinkles.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 노간주나무(Juniperus rigida Sieb.)의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매(Juniper berry) 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물이다.To achieve the above object, the present invention is a cosmetic composition comprising stem and root or Juniper berry extract of Juniperus rigida Sieb. As an active ingredient.

또한, 본 발명은 노간주나무의 줄기 및 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 항노화용 화장료 조성물일 수 있다.In addition, the present invention may be an anti-aging cosmetic composition comprising stem and root extract of juniper tree as an active ingredient.

상기한 본 발명은 노간주나무의 줄기 및 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하고, 노간주열매 추출물보다 높은 전자공여능 및 SOD(Superoxide radical dismutase)활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항노화용 화장료 조성물인 것도 가능하다.The present invention can be used as an anti-aging cosmetic composition, which comprises stem and root extracts of juniper tree as an active ingredient, and has higher electron donating ability and SOD (superoxide radical dismutase) activity than the Junnan fruit extract.

또한, 본 발명은 노간주나무의 줄기 및 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물이다.In addition, the present invention is a whitening cosmetic composition comprising stem and root extract of juniper tree as an active ingredient.

여기서, 상기 노간주나무의 줄기 및 뿌리 추출물은 1.0~50 ppm 범위 내의 농도를 가지는 것이 바람직하다. Here, the stem and root extracts of the Junjoo tree preferably have a concentration within a range of 1.0 to 50 ppm.

또한, 본 발명은 노간주열매 추출물을 유효성분으로 포함하고, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 추출물보다 높은 티로시나아제(tyrosinase) 발현억제효능을 가지는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물일 수 있다.In addition, the present invention may be a cosmetic composition for whitening, which comprises a juniper fruit extract as an active ingredient and has a higher inhibitory effect on tyrosinase expression than stem and root extracts of Juniperia japonica.

또한, 본 발명은 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름개선용 화장료 조성물이다.In addition, the present invention is a cosmetic composition for improving wrinkles containing stem and root or juniper fruit extract of juniper tree as an active ingredient.

여기서, 본 발명은 노간주나무의 줄기 및 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하고, 노간주열매 추출물보다 높은 콜라게나아제(Collagenase) 저해활성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. Herein, the present invention can be characterized in that it contains stem and root extracts of Juniperus japonica as an active ingredient and has a collagenase inhibitory activity higher than that of Junzui fruit extract.

또한, 본 발명은 노간주열매 추출물을 유효성분으로 포함하고, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 추출물보다 높은 엘라스타아제(elastase) 저해활성을 가지는 것을 특징으로 하는 것도 가능하다.
In addition, the present invention is also characterized in that the extract contains the juniper fruit extract as an active ingredient and has a higher elastase inhibitory activity than the stem and root extracts of Juniperia japonica.

기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
The details of other embodiments are included in the detailed description and drawings.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 노간주나무 또는 노간주열매 추출물을 포함함으로서, 우수한 효과를 가지는 항노화용, 미백용 및/또는 주름개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다. The cosmetic composition according to the present invention can provide a cosmetic composition for anti-aging, whitening and / or wrinkle, which has excellent effects, by containing a juniper or fruit extract of Juniper.

본 발명에 따른 노간주나무 및/또는 노간주열매 추출물은 전자공여능, SOD(Superoxide radical dismutase) 유사활성능, 잔틴산화효소(xanthine oxidase) 저해활성, 티로시나아제(tyrosinase) 저해활성 측정, 엘라스타제(elastase) 저해활성, 콜라게나아제(collagenase) 저해활성 등이 높아서 화장품으로 사용하기에 적합한 우수한 약리활성을 가진다. The fruit extract of Juniperus and / or Juniperus according to the present invention can be used as an effective ingredient for the treatment of diseases such as electron donating ability, SOD (superoxide radical dismutase) like activity, xanthine oxidase inhibiting activity, tyrosinase inhibiting activity, elastase inhibitory activity, collagenase inhibitory activity, etc., and thus has excellent pharmacological activity suitable for use in cosmetics.

특히, 본 발명에 따라 노간주나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은, 티로시나아제 저해활성, 멜라노마 세포에서의 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 단백질 발현 및 mRNA 발현억제 효과가 우수하여, 더욱 증진된 효과를 가지는 미백용 화장료 조성물을 제공할 수 있다. Particularly, the composition containing the Juniperia extract as an active ingredient according to the present invention is excellent in tyrosinase inhibitory activity, MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase protein expression and mRNA expression inhibitory effect in melanoma cells , It is possible to provide a whitening cosmetic composition having a further enhanced effect.

또한, 본 발명에 따라 노간주나무 및/또는 노간주열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은, 엘라스타제 저해활성, 콜라게나아제 저해활성, MTT assay에 의한 세포생존율, 프로콜라겐 생합성량, MMP-1 저해활성, MMP-1의 발현 억제 효과 등이 우수하여, 더욱 증진된 효과를 가지는 미백용 화장료 조성물을 제공할 수 있다. 더욱 개선된 효과를 가지는 피부 주름개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
In addition, the composition comprising the extract of juniper and / or juniper fruit according to the present invention as an active ingredient can inhibit elastase activity, collagenase inhibitory activity, cell survival rate by MTT assay, amount of procollagen biosynthesis, MMP-1 Inhibitory activity, inhibitory effect on the expression of MMP-1, and the like, thereby providing a whitening cosmetic composition having a further enhanced effect. It is possible to provide a cosmetic composition for improving skin wrinkles having a further improved effect.

도 1 은 본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 조성물이 전자공여능의 활성에 미치는 효과의 일례를 나타낸 그래프이다.
도 2 는 본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 조성물이 SOD 유사활성능에 미치는 효과의 일례를 나타낸 그래프이다.
도 3 은 본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 조성물이 잔틴옥시다아제의 저해활성에 미치는 효과의 일례를 나타낸 그래프이다.
도 4 는 본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 조성물이 티로시나아제 저해활성에 미치는 효과의 일례를 나타낸 그래프이다.
도 5 는 본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 조성물이 멜라노마 세포의 세포 생존율에 미치는 효과의 일례를 나타낸 그래프이다.
도 6 은 본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 조성물의 미백 효과 실험을 위한 RT-PCR에서 사용한 프라이머 순서의 일례를 나타낸 그래프이다.
도 7 은 본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 조성물의 멜라노마 세포에서 tyrosinase 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 8 는 본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 조성물의 멜라노마 세포에서 TRP-1 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 9 은 본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 조성물의 멜라노마 세포에서 TRP-2 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 10 는 본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 조성물의 멜라노마 세포에서 MITF 단백질 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 11 는 본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 조성물의 멜라노마 세포에서 tyrosinase의 mRNA 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 12 은 본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 조성물의 멜라노마 세포에서 TRP-1의 mRNA 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 13 는 본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 조성물의 멜라노마 세포에서 TRP-2의 mRNA 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 14 는 본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 조성물의 멜라노마 세포에서 MITF의 mRNA 단백질 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 15 은 본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 조성물의 RT-PCR에서 tyrosinase의 mRNA 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 16 은 본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 조성물의 RT-PCR에서 TRP-1의 mRNA 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 17 는 본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 조성물의 RT-PCR에서 TRP-2의 mRNA 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 18 는 본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 조성물의 RT-PCR에서 MITF의 mRNA 발현억제효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 19 는 본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 조성물의 엘라스타아제의 저해활성에 미치는 효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 20 는 본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 조성물의 콜라게나아제의 저해활성에 미치는 효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 21 은 본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 조성물이 섬유아 세포의 세포 생존율에 미치는 효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 22 은 본 발명에 따른 노간주나무 조성물이 프로 콜라겐 생합성에 미치는 효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 23 은 본 발명에 따른 노간주나무 조성물이 MMP-1의 저해활성에 미치는 효과 일례를 나타낸 그래프이다.
도 24 는 본 발명에 따른 노간주나무 조성물의 주름개선 효과를 위한 RT-PCR에서 사용한 프라이머 순서의 일례를 나타낸 그래프이다.
도 25 은 본 발명에 따른 노간주나무 조성물의 웨스턴블롯을 통한 단백질 발현량의 일례를 측정한 결과이다.
도 26 은 본 발명에 따른 노간주나무 조성물이 RT-PCR에서 mRNA 발현량의 일례를 측정한 결과이다.
1 is a graph showing an example of an effect of the stem and root or juniper fruit composition according to the present invention on the activity of electron donating ability.
FIG. 2 is a graph showing an example of an effect of the stem and root or juniper fruit composition according to the present invention on SOD-like action performance.
FIG. 3 is a graph showing an example of an effect of the stem and root or juniper fruit composition according to the present invention on the inhibitory activity of xanthine oxidase.
FIG. 4 is a graph showing an example of an effect of tyrosinase inhibitory activity on the stem and root or juniper fruit composition according to the present invention.
FIG. 5 is a graph showing an example of the effect of the stem and root composition of Juniperia japonica on cell survival rate of melanoma cells according to the present invention.
6 is a graph showing an example of the sequence of primers used in the RT-PCR for the whitening effect test of the juniper stem and root composition according to the present invention.
FIG. 7 is a graph showing an example of inhibition of tyrosinase expression in melanoma cells of the stem and root composition of Juniperia japonica according to the present invention.
FIG. 8 is a graph showing an example of TRP-1 expression inhibition effect in melanoma cells of the stem and root composition of Juniperia japonica according to the present invention.
FIG. 9 is a graph showing an example of TRP-2 expression inhibition effect in melanoma cells of the stem and root composition of Juniperia japonica according to the present invention.
FIG. 10 is a graph showing an example of the effect of inhibiting MITF protein expression in melanoma cells of the stem and root composition of Juniperia japonica according to the present invention.
FIG. 11 is a graph showing an example of inhibitory effect of tyrosinase mRNA on melanoma cells of the stem and root composition of Juniperia japonica according to the present invention.
FIG. 12 is a graph showing an example of the effect of inhibiting mRNA expression of TRP-1 in melanoma cells of the stem and root composition of Juniperia japonica according to the present invention.
FIG. 13 is a graph showing an example of the effect of inhibiting mRNA expression of TRP-2 in melanoma cells of the stem and root composition of Juniperia japonica according to the present invention.
FIG. 14 is a graph showing an example of the effect of inhibiting mRNA expression of MITF in melanoma cells of rhizome stem and root composition according to the present invention.
15 is a graph showing an example of the effect of inhibiting mRNA expression of tyrosinase in RT-PCR of stem and roots composition of Juniperia japonica according to the present invention.
16 is a graph showing an example of the effect of inhibiting mRNA expression of TRP-1 in RT-PCR of stem and root compositions of Juniperus oblique according to the present invention.
17 is a graph showing an example of an effect of inhibiting mRNA expression of TRP-2 in RT-PCR of stem and root composition of Juniperus according to the present invention.
FIG. 18 is a graph showing an example of the effect of inhibiting mRNA expression of MITF in RT-PCR of stem and root compositions of Juniper stem according to the present invention. FIG.
FIG. 19 is a graph showing an example of an effect on the inhibitory activity of elastase of the stem and root or juniper fruit composition according to the present invention.
FIG. 20 is a graph showing an example of an effect of the present invention on the inhibitory activity of collaginase in the stem and root or juniper fruit composition of Juniperia japonica.
21 is a graph showing an example of an effect of the stem and root composition of Juniperia japonica according to the present invention on the cell survival rate of fibroblast cells.
22 is a graph showing an example of the effect of the juniper tree composition according to the present invention on procollagen biosynthesis.
FIG. 23 is a graph showing an example of an effect of the juniper tree composition according to the present invention on the inhibitory activity of MMP-1.
24 is a graph showing an example of the order of primers used in the RT-PCR for wrinkle-improving effect of the juniper tree composition according to the present invention.
25 shows the result of measurement of an amount of protein expression by western blotting of the juniper tree composition according to the present invention.
FIG. 26 shows the result of measuring the amount of mRNA expression in RT-PCR of Juniper composition according to the present invention.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The present invention is capable of various modifications and various embodiments, and specific embodiments are illustrated in the drawings and will be described in detail in the detailed description. It is to be understood, however, that the invention is not to be limited to the specific embodiments, but includes all modifications, equivalents, and alternatives falling within the spirit and scope of the invention. DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.The terminology used in this application is used only to describe a specific embodiment and is not intended to limit the invention. The singular expressions include plural expressions unless the context clearly dictates otherwise. In the present application, the terms "comprises" or "having" and the like are used to specify that there is a feature, a number, a step, an operation, an element, a component or a combination thereof described in the specification, But do not preclude the presence or addition of one or more other features, integers, steps, operations, elements, components, or combinations thereof.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
The terms first, second, etc. may be used to describe various components, but the components should not be limited by the terms. The terms are used only for the purpose of distinguishing one component from another.

본 발명은 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 대한 것으로, 특히 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 노화방지용, 미백용, 및/또는 주름개선용 화장료 조성물이다. 상기 화장료 조성물은 피부 노화를 방지하거나 화이트닝(whitening) 기능을 갖거나 주름을 예방 또는 제거할 수 있는 기능을 갖는 화장품 또는 피부 외용제일 수 있다. The present invention relates to a cosmetic composition comprising stem and root or juniper fruit extract of Juniperum japonica, and more particularly to a cosmetic composition comprising stem, root or juniper fruit extract of Juniperum japonica as an active ingredient for anti-aging, whitening, and / . The cosmetic composition may be a cosmetic or skin external preparation having a function of preventing skin aging, having a whitening function, or preventing or eliminating wrinkles.

본 발명자들은 노간주나무의 줄기 및 뿌리 추출물과 노간주열매 추출물 각각의 에탄올 추출물을 대상으로 in vitro 효소 실험을 통하여 그 효과를 검증하였고, 그 결과 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물은 항노화용, 미백용 및/또는 주름개선용 화장료 조성물로서 우수한 효과를 가지고 있음을 확인한 후, 본 발명을 완성하였다. The present inventors verified the effect of the ethanol extract of each of the stem, root and juniper fruit extracts of Juniperia japonica in vitro by in vitro enzyme experiments. As a result, the stem and root or juniper fruit extract of japonica showed anti-aging, whitening The present invention has been completed upon confirming that the composition has excellent effects as a cosmetic composition for improving cosmetics and / or wrinkles.

즉, 본 발명자들은 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물의 전자공여능, SOD 유사활성능, xanthine oxidase 저해활성, tyrosinase 저해활성 측정, elastase 저해활성, collagenase 저해활성 측정을 통하여 대체적으로 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물의 화장품약리활성이 우수함을 확인하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 항노화 효능의 측정과 관련하여 전자공여능 측정, SOD 유사활성 측정, 잔틴산화효소 측정실험을 하였고, 미백 효능 측정과 관련하여 티로시나아제 저해활성 측정, 멜라노마 세포에서의 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 단백질 발현 및 mRNA 발현억제 효과를 측정하였으, 주름개선 효능 측정과 관련하여 엘라스타제 저해활성 측정, 콜라게나아제 저해활성 측정, MTT assay에 의한 세포생존율 측정, 프로콜라겐 생합성량 측정, MMP-1 저해활성 측정, MMP-1의 발현 억제 효과 측정 실험을 하였다.In other words, the present inventors have found that, through electron donating ability, SOD-like action activity, xanthine oxidase inhibitory activity, tyrosinase inhibitory activity, elastase inhibitory activity, and collagenase inhibitory activity of the stem and root or juniper fruit extract of Juniperia japonica, And extracts of root or juniper fruit were excellent in pharmacological activity of cosmetics. Specifically, the present inventors conducted measurements of electron donating ability, measurement of SOD-like activity, and measurement of xanthine oxidase in connection with the measurement of anti-aging efficacy. Measurement of tyrosinase inhibitory activity in relation to measurement of whitening efficacy, measurement of MITF , TRP-1, TRP-2, and tyrosinase protein expression and mRNA expression inhibition were measured. The anti-wrinkle activity was measured by measuring the inhibitory activity of elastase, measuring collagenase inhibitory activity, measuring cell viability by MTT assay, Measurement of the amount of procollagen biosynthesis, measurement of inhibitory activity of MMP-1, and measurement of inhibitory effect of MMP-1.

노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물의 전자공여능을 측정한 결과, 노간주나무의 줄기 및 뿌리(JRE) 및 노간주열매(JBE) 에탄올 추출물은 각각 1,000 ppm에서 75.5%, 59.1%의 활성을 나타내었다(도 1 참조). As a result of electron donating ability of stem, root or juniper fruit extract of juniper tree, the extracts of JRE and JBE of juniper showed 75.5% and 59.1% (See Fig. 1).

그리고, Superoxide에 대한 산화 억제 작용을 알아보기 위해 superoxide와 반응하여 갈변물질을 내는 pyrogallol의 자동 산화반응을 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 에탄올 추출물에 이용하여 측정한 결과 노간주나무의 줄기 및 뿌리(JRE) 및 노간주열매(JBE) 에탄올 추출물은 각각 1,000 ppm에서 20.8%, 17.0%의 활성을 나타내었다(도 2 참조). In order to investigate the antioxidant activity of superoxide, the autoxidation reaction of pyrogallol, which reacts with superoxide, was applied to the stem and root or the ethanol extract of the juniper fruit. The results showed that the stem and root of juniper JRE) and juniper fruit (JBE) ethanol extracts showed 20.8% and 17.0% activity at 1,000 ppm, respectively (see FIG. 2).

또한, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 에탄올 추출물의 xanthine oxidase 저해활성을 측정한 결과, 노간주나무의 줄기 및 뿌리(JRE) 및 노간주열매(JBE) 에탄올 추출물은 각각 1,000 ppm에서 58.0%, 58.2%의 저해효과를 나타내었다(도 3 참조). In addition, the extracts of JNE and JBE showed 58.0% and 58.2%, respectively, in the extracts of juniper plants. (See Fig. 3).

또한, 피부 내에서 멜라닌 중합체 생합성을 효과적으로 저해할 수 있는 tyrosinase 저해활성을 농도별로 측정한 결과, 노간주나무의 줄기 및 뿌리(JRE) 에탄올 추출물의 경우 1,000 ppm에서 40.8%, 노간주열매(JBE) 에탄올 추출물의 경우 1,000ppm에서 53.4%로 노간주열매(JBE) 에탄올 추출물의 저해효과가 더 높다는 것을 확인하였다(도 4 참조).In addition, tyrosinase inhibitory activity, which can effectively inhibit the melanin polymer biosynthesis in the skin, was measured by concentration. The ethanol extract of JOE from juniper showed 40.8% at 1,000 ppm, ethanol extract of juniper berries (JBE) (JBE) ethanol extracts at the concentration of 1,000 ppm to 53.4% (see FIG. 4).

상기한 바와 같이, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물의 화장품약리활성 결과, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 추출물의 활성이 전반적으로 우수하여 미백 및 주름개선 메커니즘 분석은 노간주나무 줄기 및 뿌리 추출물을 중심으로 측정하였다. 그 결과는 다음과 같다.As described above, the pharmacological activity of the extracts of the stem and root of the Junjoo mushroom or the extract of the Junjoo mushroom showed excellent pharmacological activity of the stem and root extracts of the Junjoo mushroom, and the whitening and wrinkle improvement mechanism analysis showed that . the results are as follow.

즉, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 추출물에 의한 melanoma 세포의 생존율을 MTT assay에 의해 확인한 결과 10 ug/mL 이하에서 90% 이상의 세포 생존율을 나타내는 것을 확인하였고(도 5 참조), 이에 따라 아래 본 실험에서는 50 ug/mL 이하의 농도로 실험을 하였다. That is, it was confirmed by MTT assay that the survival rate of melanoma cells by stem and root extracts of Juniperia showed a cell survival rate of 90% or more at 10 ug / mL or less (see FIG. 5) 50 ug / mL or less.

그리고, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물이 melanin 합성에 관계된 효소인 tyrosinase에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma 세포에 농도별로 5, 25, 50 ug/mL 처리 한 후 24시간 후에 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2 protein 발현을 western blotting으로 확인한 결과, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물을 농도별로 5, 25, 50 ug/mL을 처리한 B16F10에서는 tyrosinase(도 7 참조), MITF(도 10 참조), TRP-1(도 8 참조), TRP-2(도 9 참조) protein의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. In order to investigate the effect of stem and root ethanol extracts of Junjoo tree on tyrosinase enzyme involved in the synthesis of melanin, B16F10 mouse melanoma cells were treated with 5, 25, and 50 ug / mL of the concentration, and tyrosinase, MITF, The expression of TRP-1 and TRP-2 protein was confirmed by western blotting. As a result, tyrosinase (see FIG. 7) and MITF (FIG. 7) were detected in B16F10 treated with 5, 25 and 50 ug / 10), TRP-1 (see FIG. 8) and TRP-2 (see FIG. 9) protein.

또한, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물이 melanin 합성에 관계된 key enzyme인 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2 mRNA에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma 세포에 농도별로 5, 25, 50 ug/mL 처리한 후 24시간 후에 polymerase chain reaction (PCR)으로 mRNA 발현양을 측정한 결과, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물을 농도별로 5, 25, 50 ug/mL을 처리한 B16F10세포에서는 tyrosinase(도 11 참조), MITF(도 14 참조), TRP-1(도 12 참조), TRP-2(도 13 참조) mRNA 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. In order to investigate the effect of stem and root ethanol extracts of rhizosphere on the tyrosinase, MITF, TRP-1 and TRP-2 mRNAs, which are key enzymes involved in the synthesis of melanin, B16F10 mouse melanoma cells were treated with 5, 25 and 50 μg 24 h after the treatment, the amount of mRNA expression was measured by polymerase chain reaction (PCR). As a result, the stem and root ethanol extracts from Jun jiuquan tree were treated with 5, 25, 50 ug / mL of tyrosinase (See FIG. 11), MITF (see FIG. 14), TRP-1 (see FIG. 12) and TRP-2 (see FIG. 13) mRNA expression was decreased.

또한, Real-time polymerase chain reaction (PCR)을 이용하여 tyrosinase(도 15 참조), MITF(도 18 참조), TRP-1(도 16 참조), TRP-2(도 17 참조)의 mRNA를 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물을 처리하여 실시간으로 분석한 결과 농도 의존적으로 mRNA 발현이 감소하였음을 확인할 수 있었다.The mRNA of tyrosinase (see FIG. 15), MITF (see FIG. 18), TRP-1 (see FIG. 16) and TRP-2 (see FIG. 17) And ethanol extracts of roots and roots, the results showed that mRNA expression was decreased in a concentration dependent manner.

또한, 주름 생성과 관련한 elastase의 활성 억제 효과를 확인하기 위해, Elastase 저해활성을 측정한 결과 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 에탄올 추출물은 1,000 ppm에서 각각 23.0%, 29.4%로 노간주열매 에탄올 추출물이 더 높은 저해활성을 나타내었다(도 19 참조).Elastase inhibitory activity of the extracts from the stem, root or juniper fruit of Junjoo was 23.0% and 29.4% at 1,000 ppm, respectively, in order to confirm the inhibitory effect of elastase activity on wrinkle formation. And exhibited higher inhibitory activity (see Fig. 19).

또한, Collagenase의 저해활성을 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 에탄올 추출물을 사용하여 측정한 결과 노간주나무의 줄기 및 뿌리 및 노간주 열매 에탄올 추출물의 저해활성은 각각 1,000 ppm에서 71.5%, 67.9%로 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물이 더 높은 저해활성을 나타내었다(도 20 참조).Inhibitory activity of collagenase inhibitory activity of the extracts of stem, root and juniper fruit of Jun junhoe were 1,000 ppm to 71.5% and 67.9%, respectively, Tree stem and root ethanol extracts showed higher inhibitory activity (see Fig. 20).

또한, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물을 처리한 fibroblast cell (CCD-986sk)의 생존율을 확인한 결과 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물이 50 ug/mL 에서 58.8%의 세포 생존율을 나타냄으로서, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물의 세포독성이 적다는 것을 확인할 수 있었다(도 21 참조).The survival rate of fibroblast cell (CCD-986sk) treated with stem and root ethanol extracts of juniper plants showed cell viability of 58.8% at 50 ug / mL of stem and root ethanol extracts of juniper, And the root and root ethanol extracts of the plant were less cytotoxic (see Fig. 21).

또한, 정상 섬유아세포(CCD-986sk)에 collagen 생합성 증가를 확인할 수 있는 pro-collagen type ⅠC-peptide (PICP) enzyme immunoassay를 이용하여 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물의 collagen 생합성량을 측정한 결과, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물은 50 ug/mL에서 151.52%의 생합성 촉진 효과를 나타내었다(도 22 참조). In addition, collagen biosynthesis of stem and root ethanol extracts of juniper seedlings were measured by using pro-collagen type Ⅰ-peptide (PICP) enzyme immunoassay, which showed increased collagen biosynthesis in normal fibroblasts (CCD-986sk) The stem and root ethanol extracts of juniper showed promoting biodegradation of 151.52% at 50 ug / mL (see FIG. 22).

또한, UV-A에 의해 발현이 증가되는 MMP-1에 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물이 미치는 영향을 알아보고자, 섬유아 세포에 UV-A를 조사하고 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물을 첨가하여 24시간 배양한 후 MMP-1 발현 저해효과를 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 통해 알아본 결과, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물은 100 ug/mL에서 67.1%의 MMP-1의 발현 저해효과를 나타내었다(도 23 참조).In addition, UV-A was irradiated to fibroblasts and the extracts of roots and roots of juniper plants were added to MMP-1, which is expressed by UV-A. The inhibitory effect of MMP-1 on the expression of MMP-1 was examined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The results showed that the stem and root ethanol extracts of Junjoo were inhibited the expression of MMP-1 by 67.1% at 100 ug / mL (See FIG. 23).

또한, 주름과 관계되어진 MMP-1의 단백질 발현을 측정해 본 결과, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물의 MMP-1의 단백질 발현은 50 ug/mL의 농도에서 35%의 저해율을 나타내었고, MMP-1의 mRNA 발현을 측정해 본 결과, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물은 50 ug/mL의 농도에서 39%의 저해효과를 나타내었다. 이와 같은 결과로 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물은 광노화에 의한 주름생성 억제 활성을 보이는 것으로 판단된다(도 26 참조).
In addition, the protein expression of MMP-1 associated with wrinkles was measured. As a result, the protein expression of MMP-1 in the stem and root ethanol extracts of juniper showed 35% inhibition at a concentration of 50 ug / mL, -1 mRNA expression, the stem and root ethanol extracts of juniper showed a inhibitory effect of 39% at a concentration of 50 ug / mL. As a result, the stem and root ethanol extracts of Juniperus japonica seem to exhibit anti-wrinkle activity by photoaging (see FIG. 26).

본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물은 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매와 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 또는 디에틸에테르로 이루어진 군으로부터 단독으로 선택되는 용매 또는 2종 이상 혼합되는 혼합용매를 혼합하여, 상기 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매의 유효성분을 효과적으로 추출함으로써 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 용매추출액을 형성할 수 있다. 그 중에서도 에탄올 추출물을 이용하는 것이 항노화, 미백 및 주름개선 효과에 유용한 성분을 다량으로 추출할 수 있어서 바람직하다. According to the present invention, the stem and root or juniper fruit extract of Junjoo tree according to the present invention can be obtained by extracting stem and root or juniper fruit of Junjoo tree with methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, n-hexane, chloroform, ethyl acetate, butyl acetate or diethyl ether , Or a mixed solvent of two or more kinds of them to effectively extract the active ingredient of the stem and root or juniper fruit of the Junjoo tree to obtain a stem and root of the juniper tree or a juice extract of the juniper fruit . Among them, the use of an ethanol extract is preferable because a large amount of components useful for anti-aging, whitening and wrinkle-reducing effects can be extracted.

상기와 같은 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 용매추출액을 그대로 사용하여 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물 함유 화장료 조성물을 구성할 수 있으나, 화장료 조성물을 정량적으로 용이하게 구성하려면 고체 상태인 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물을 사용하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 본 발명에서는 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 용매추출액으로부터, 감압농축이나 감압증발과 같은 기 공지된 용매 휘발 방법에 의해 용매를 휘발시켜서 분리함으로써 고체 상태, 바람직하게는 분말 상태인 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물을 구성할 수 있다. 즉, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매의 유효성분이 용매에 의해 추출되고 고/액 분리된 상등액인 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 용매추출액이 형성되고, 상기 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 용매추출액으로부터 감압농축이나 감압증발과 같은 기 공지된 용매 휘발 방법에 의해 용매가 휘발되어 분말 상태인 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물이 구성되는 것이다.The cosmetic composition containing stem, root or juniper fruit extract of juniper tree can be constituted by using the stem and root or juniper fruit extract of the juniper as described above. However, in order to quantitatively and easily constitute the cosmetic composition, It is preferable to use stem and root of tree or fruit extract of juniper fruit. Accordingly, in the present invention, the solvent is volatilized and separated from the stem, root or juniper fruit extract of the juniper by a known solvent volatilization method such as concentration under reduced pressure or evaporation under reduced pressure to obtain a solid state, Tree stem and root or juniper fruit extract. That is, stem and root or juniper fruit extract of juniper tree, which is a supernatant which is extracted with solvent and effective / liquid separated, is formed from stem and root of juniper tree or effective ingredient of juniper fruit, and stem and root or juniper The solvent is volatilized by a known solvent volatilization method such as concentration under reduced pressure or evaporation under reduced pressure from the extract of the fruit juice to form the stem and root or the juniper fruit extract of the juniper tree in the powder state.

노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 용매추출액을 구성하기 위한 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매와 용매의 추출용 혼합물은, 상기 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매가 건조중량 기준으로 100 중량부, 용매 100∼1,500 중량부가 혼합되어 이루어질 수 있다. 추출용 혼합물을 형성하도록 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 건조중량 기준으로 100 중량부에 혼합되는 용매의 양이 100 중량부 미만이면 상기 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매의 유효성분이 충분하게 추출되지 않으며, 추출용 혼합물을 형성하도록 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매의 건조중량 기준으로 100 중량부에 혼합되는 용매의 양이 1,500 중량부를 초과하면 상기 용매의 과다 사용에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 용매추출액의 용매 제거비용 증가 등의 이유로 인하여 화장료 조성물의 제조원가가 상승하게 된다.A stem and root of a juniper or a mixture for extracting a juniper fruit and a solvent for constituting a stem and a root or a juniper fruit extract of a juniper, said stem and root or juniper fruit of said juniper being 100 parts by weight , And 100 to 1500 parts by weight of a solvent. If the amount of the solvent mixed in 100 parts by weight on the basis of the dry weight of the stem and root or juniper fruit to form the extraction mixture is less than 100 parts by weight, the effective content of the stem and root or the juniper fruit of the Junjoo tree is sufficiently extracted And the amount of the solvent mixed in 100 parts by weight on the dry weight of the stem and root or juniper fruit of the juniper tree to form the mixture for extraction exceeds 1,500 parts by weight, And the cost of removing the solvent of the root extract or the extract of the juniper fruit is increased, thereby increasing the manufacturing cost of the cosmetic composition.

구체적인 예를 들면, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매, 또는 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매가 건조되고 분쇄되어 형성된 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 건조분말과 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 또는 디에틸에테르로 이루어진 군으로부터 단독으로 선택되는 용매 또는 2종 이상 혼합되는 혼합용매가 혼합되어 추출용 혼합물이 형성되고, 싱기 추출용 혼합물이 15∼40 ℃로 1∼15 일간 유지되어 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매가 용매추출된 추출 조성물이 형성되고, 상기 추출 조성물이 고/액 분리되어 액상 성분인 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 용매추출액이 수득될 수 있다. Specific examples thereof include stem and root or juniper fruit of juniper tree, stem and root of juniper tree or stem and root of juniper tree formed by drying and crushing juniper fruit, or dried powder of juniper fruit and methanol, ethanol, propanol, isopropanol , A solvent selected from the group consisting of butanol, n-hexane, chloroform, ethyl acetate, butyl acetate or diethyl ether, or a mixed solvent of two or more thereof is mixed to form an extraction mixture, Maintaining the extract at 15 to 40 DEG C for 1 to 15 days to form an extract composition in which the stem and root or juniper fruit of the juniper tree are solvent extracted and the extract composition is subjected to solid / liquid separation so that the stem and root or juniper A fruit extract solution can be obtained.

또한, 본 발명에 따른 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물은 화장료 조성물에 대하여 500~1,000 ppm 범위 내의 농도를 가지는 것이 바람직한데, 500 ppm 미만이면 잔틴산화효소 저해활성, 티로시나아제 저해활성 또는 콜라게나아제 저해활성 등이 미흡하고, 1,000 ppm 초과하면 그 효과 상승이 크지 않아 제조비용만 높아지기 때문이다. In addition, the stem, root or juniper fruit extract of Juniperia according to the present invention preferably has a concentration within the range of 500 to 1,000 ppm with respect to the cosmetic composition. When the amount is less than 500 ppm, the antineoplastic activity, tyrosinase inhibitory activity, Collagenase inhibitory activity is insufficient, and if it exceeds 1,000 ppm, the increase of the effect is not so large, and the manufacturing cost is increased.

그리고, 상기와 같은 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 용매추출액을 4∼15 ℃에서 1∼7 일간 숙성시키는 것이, 상기 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 용매추출액의 유효성분이 포함된 피부 노화방지용, 미백용, 및/또는 주름개선용 화장료 조성물의 피부에 대한 친화력을 향상시키는 측면에서 바람직하다. 이러한 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 용매추출액에서 감압증발 등에 의해 용매가 증발되어 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매의 고상 추출물이 준비될 수 있다. The aging of the stem, root or juniper fruit extract of the juniper tree at 4 to 15 ° C for 1 to 7 days is effective for preventing aging of the skin containing the active ingredient of the stem and root or jujube extract of the juniper , The whitening agent, and / or the wrinkle improving cosmetic composition. The solvent can be evaporated by evaporation under reduced pressure in the stem and root of the juniper tree or in the extract of the juniper fruit, and the solid extract of the stem and root or juniper fruit of the juniper can be prepared.

본 발명에서는 상기에서 기술된 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물이 건조 고형분 기준으로 전체 화장료 조성물 100 중량부에 대하여 0.05~3 중량부 범위 내로 포함되는 것이 바람직하다. 화장료 조성물에 함유되는 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물의 함량이 0.05 중량부 미만이면 상기 화장료 조성물의 피부 항노화, 미백 및/또는 주름개선 효과가 저하되며, 화장료 조성물에 함유되는 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물의 함량이 3중량부를 초과하면 상기 화장료 조성물은 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물의 함량 대비 피부 항노화, 미백 및/또는 주름개선효과가 저하된다.In the present invention, the above-described stem, root or juniper fruit extract of juniper seeds is preferably contained in an amount of 0.05 to 3 parts by weight based on 100 parts by weight of the total cosmetic composition based on dry solid basis. If the content of the stem and root or juniper fruit extract contained in the cosmetic composition is less than 0.05 part by weight, the effect of skin anti-aging, whitening and / or wrinkle reduction of the cosmetic composition is deteriorated. When the content of the stem and root or juniper fruit extract is more than 3 parts by weight, the cosmetic composition of the present invention is less effective in improving skin aging, whitening, and / or wrinkling compared to the contents of stem and root or juniper fruit extract of juniper tree.

또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기한 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물 외에도 필요에 따라 본 발명의 효과를 저하시키지 않는 범위 내에서 피부 외용제에 일반적으로 사용하는 각종 성분, 예를 들면 수용성 성분, 분말성분, 유분, 계면활성제, 보습제, 점도조절제, 방부제, 산화방지제, 향료, 색소 등을 배합하여 구성될 수 있다. In addition, the cosmetic composition according to the present invention may contain various components commonly used in external preparations for skin, for example, a water-soluble component , A powder component, an oil component, a surfactant, a moisturizer, a viscosity adjusting agent, an antiseptic, an antioxidant, a fragrance, a pigment, and the like.

본 발명에 따른 화장료 조성물의 제형은 임의로 선택할 수 있으되, 유효성분인 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물과 함께, 물, 생리식염수, 글리세롤, 유분, 계면활성제, 보습제, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제 또는 향료 등과 같은 기 공지된 화장료용 부형제가 혼합되어 로션제(lotiones), 액제(液劑), 유제, 에멀션제, 현탁제(懸濁劑), 정제(錠劑) 및 캡슐제(capsules) 형태를 이루는 화장료 조성물이 형성된다. 상기 화장료 조성물을 사용하여 유연 화장수, 밀크로션, 영양크림, 맛사지 크림, 에센스, 클렌싱 폼, 클렌싱 워터, 팩 또는 바디오일 등의 기초 화장료 및 화운데이션, 립스틱, 마스카라 또는 메이크업 베이스 등의 색조 화장료를 제조할 수 있으며, 또한 세안제 및 목욕제를 제조할 수 있다.The formulation of the cosmetic composition according to the present invention may be selected arbitrarily, and may be selected from the group consisting of water, physiological saline, glycerol, oil, surfactant, humectant, thickener, chelating agent, pigment A preservative or a perfume may be mixed with a conventional cosmetic agent for cosmetics such as lotions, liquid preparations, emulsions, emulsions, suspensions, tablets and capsules ) Is formed. The cosmetic composition may be used to prepare cosmetic compositions such as soft cosmetic lotion, milk lotion, nutritional cream, massage cream, essence, cleansing foam, cleansing water, pack or body oil and foundation cosmetics such as foundation, lipstick, mascara or makeup base And can also make cleansers and bath preparations.

이러한 화장료 조성물의 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물이 피부에 흡수 및 고정되는 것을 촉진하도록, 화장료용 부형제 중에서 글리세린 1∼7 중량%가 포함되어 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물 함유 화장료 조성물이 구성되는 것이 바람직하다. 화장료 조성물에 포함되는 글리세린의 함량이 1 중량% 미만이면 상기 화장료 조성물의 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물이 피부에 제대로 흡수 및 고정되지 않으며, 화장료 조성물에 포함되는 글리세린의 함량이 7 중량%를 초과하면 상기 화장료 조성물에서 글리세린 이외의 다른 화장료용 부형제의 함량이 상대적으로 저하되므로 실용적인 피부 항노화용, 미백용 및 주름개선용 화장료 조성물의 제조가 곤란하게 된다.In order to accelerate absorption and fixation of the stem and root or juniper fruit extract of the juniper tree of such a cosmetic composition, 1 to 7% by weight of glycerin is contained in the excipient for cosmetic, and the cosmetic composition containing the stem and root of the juniper tree or the extract of the juniper fruit It is preferred that the composition be constructed. If the content of glycerin contained in the cosmetic composition is less than 1% by weight, the stem, root or juniper fruit extract of the juniper tree of the cosmetic composition may not be properly absorbed and fixed to the skin. If the content of glycerin contained in the cosmetic composition is less than 7% , The content of excipients for cosmetics other than glycerin is relatively lowered in the cosmetic composition, which makes it difficult to produce practical cosmetic compositions for skin aging, whitening, and wrinkle reduction.

또한, 화장료 조성물에게 항산화 기능을 제공하도록, 화장료용 부형제 중에서 선플라워 오일(sunflower oil)이 포함되어 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물 함유 화장료 조성물이 구성되는 것이 바람직하다. 선플라워 오일은 해바라기씨에서 추출된 천연오일로서, 불포화지방산과 항산화제로 잘 알려진 디알파토코페롤이 다량으로 함유되어 있는데, 상기 디알파토코페롤은 활성산소(free radical)과 과산화물에 의해 야기된 손상으로부터 세포를 보호하는 역할을 한다.In order to provide the cosmetic composition with an antioxidant function, it is preferable that a cosmetic composition containing a stem and root of a juniper tree or a juniper fruit extract containing sunflower oil in an excipient for a cosmetic composition is formed. Sunflower oil is a natural oil extracted from sunflower seeds. It contains a large amount of diaphoretic tocopherol, which is well known as unsaturated fatty acid and antioxidant. The diaphoretic tocopherol is a natural oil extracted from the damage caused by free radicals and peroxides .

그런데, 본 발명의 화장료 조성물은 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물과 각종 화장료용 부형제가 포함되어 있으므로 성상이 변화되기 쉽고, 이러한 경향은 유연화장수 등과 같이 수분 함량이 높아서 농도가 낮은 화장료 조성물보다 영양로션, 영양크림, 에센스 등과 같이 수분 함량이 낮아서 농도가 높은 화장료 조성물에서 심하게 발생하는 경향을 나타내고 있다. 따라서, 피부 미백용 및/또는 주름개선용 화장료 조성물의 성상을 안정화시키도록, 화장료용 부형제 중에서 안정화제인 디세틸포스페이트 0.1∼1 중량%가 포함되어 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물 함유 화장료 조성물이 구성되는 것이 바람직하다. However, since the cosmetic composition of the present invention contains stem, root or juniper fruit extract and various excipients for cosmetics, the composition of the present invention is susceptible to change in appearance, and such tendency is more likely to be caused by a cosmetic composition having a low moisture content Nutritional lotion, nutritional cream, essence and the like, and thus shows a tendency to occur severely in a cosmetic composition having a high concentration. Therefore, in order to stabilize the properties of the cosmetic composition for skin whitening and / or wrinkle reduction, 0.1 to 1% by weight of dicetyl phosphate as a stabilizer is contained in the excipient for cosmetics, and the cosmetic composition containing the stem and root or juniper fruit extract of Jun- .

이와 함께, 본 발명은 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물에 기호성 식품 성분을 첨가하여 통상적으로 알려진 방법에 의하여 각종 건강기능식품을 제조할 수 있고, 또한 일반적인 제형으로 제형화될 수 있으며, 제형에 따라 당업자가 적의 적절하게 선택하여 배합할 수 있다.
In addition, the present invention can produce various health functional foods by the method known in the art by adding a palatable food ingredient to the stem, root or juniper fruit extract of Juniperum japonica and can be formulated into a general formulation, , A person skilled in the art can appropriately select and blend it.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
The present invention may be better understood by the following examples, which are for the purpose of illustrating the invention and are not intended to limit the scope of protection defined by the appended claims.

실시예 : 노간주나무의 줄기 및 뿌리 추출물의 제조Example: Preparation of stem and root extracts of Junjoo

본 실시예에서 사용된 노간주나무의 줄기 및 뿌리와 노간주열매는 ㈜토종마을과 (주)청명약초에서 각각 구입하여 에탄올 추출을 실시하였다. 시료의 에탄올 추출물은 70% 에탄올 10배의 양을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 시료 추출물은 여과지(Whatman No.2)를 이용하여 여과한 후 EYELA evaporator로 감압 농축하여 용매를 완전히 제거한 후 동결 건조하여 -20℃에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다.
The stem, root and juniper fruit used in this example were purchased from Tongjong Village and Cheongmyeong Herbal Co., respectively, and ethanol extraction was performed. The ethanol extract of the sample was dipped in an amount of 10 times 70% ethanol for 24 hours at room temperature, and the supernatant and precipitate were separated and extracted three times in the same manner. The extracts were filtered using a filter paper (Whatman No. 2) and concentrated under reduced pressure using an EYELA evaporator to completely remove the solvent, followed by lyophilization and storage at -20 ° C.

실험예Experimental Example 1 :  One : 전자공여능Electron donating ability 측정 Measure

전자공여능(EDA: electron donating abilities)은 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다. DPPH용액(sigma, U.S.A) 60 uL와 농도별 추출물을 120 uL씩 넣고 혼합한 후 15분간 방치한 다음 microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. The electron donating abilities (EDA) were measured by modifying the Blois method. 60 uL of DPPH solution (Sigma, U.S.A) and 120 uL of each extract were mixed and left for 15 minutes, and the absorbance was measured at 517 nm using a microplate reader. The electron donating ability was expressed by the absorbance reduction ratio of the sample solution and the non-additive solution.

항산화 작용의 지표로 사용되고 있으며 식물 추출물의 항산화능 측정에 많이 사용되고 있는 전자공여능은, free radical에 전자를 공여하여 지방질 산화를 억제시키는 척도로 사용되고 있을 뿐만 아니라 인체 내에서 free radical에 의한 노화를 억제하는 작용의 척도로 이용되고 있다. 전자공여능 실험에 사용된 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)는 매우 안정된 free radical로서 자신이 가지는 홀수 전자 때문에 517 nm에서 특정적인 강한 흡수 band를 나타내는 보라색 화합물이며, 항산화제 작용에 의해서 수소 혹은 전자를 받아 안전한 형태의 화합물로 전환되면 점점 노란색으로 탈색되어 색이 옅어지게 되고, 이때 탈색되는 정도를 통해 항산화 효과를 측정할 수 있다. The electron donating ability, which is used as an index of antioxidant activity and is widely used for measuring the antioxidant activity of plant extracts, is used not only as a measure for inhibiting lipid oxidation by donating electrons to free radicals but also inhibiting free radicals in the human body It is used as a measure of action. DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) used in the electron donating ability experiment is a very stable free radical, which is a violet compound showing a strong absorption band specific at 517 nm due to its odd electrons. Or when the compound is converted into a safe form of the compound, the color gradually becomes discolored in yellow, and the antioxidative effect can be measured through the degree of discoloration.

이러한 방법으로 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 에탄올 추출물의 전자공여능을 측정한 결과 노간주나무의 줄기 및 뿌리(JRE) 및 노간주열매(JBE) 에탄올 추출물은 각각 1,000 ppm에서 75.5%, 59.1%의 활성을 나타내었다(도 1 참조).
The electron donating ability of the stem and root or the juniper fruit ethanol extracts of juniper plants in this study were 75.5% and 59.1%, respectively, from 1,000 ppm in the stem and root (JRE) and juniper fruit (JBE) (See Fig. 1).

실험예Experimental Example 2 :  2 : SuperoxideSuperoxide radicalradical dismutasedismutase ( ( SODSOD ) ) 유사활성Similar activity 측정 Measure

SOD 유사활성은 Marklund의 방법을 변형하여 측정하였다. 농도별 시료용액을 20 uL에 Tris-HCl 완충용액(50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5) 130 uL와 pyrogallol (7.2 mM) 20 uL를 취하여 혼합한 후 37℃에서 10분간 반응시킨 후 산화된 pyrogallol양을 microplate reader를 이용하여 흡광도 420 nm에서 측정하였다. SOD 유사활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도감소율로 나타내었다.SOD-like activity was measured by modifying Marklund's method. (20 μL) were mixed with 130 μL of Tris-HCl buffer (50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5) and 20 μL of pyrogallol (7.2 mM), followed by reaction at 37 ° C. for 10 minutes. Then, the oxidized pyrogallol The absorbance was measured at 420 nm using a microplate reader. The SOD - like activity was expressed as the absorbance reduction ratio of the sample solution and the non - added sphere.

Superoxide radical dismutase (SOD)는 체내에서 암, 치매, 수전증 등 여러 질병의 원인이 되는 활성 산소를 제거하는 단백질로, 세포에 유해한 oxygen radical을 과산화수소로 전환시킴으로써 과산화수소가 catalase에 의해 물 분자와 산소분자로 전환될 수 있도록 하여 활성산소로부터 생체를 보호하는 기능을 한다. 활성위치에 결합되어 있는 전이금속이온의 종류에 따라 Cu/Zn-SOD, Fe-SOD, Mn-SOD 등 세 가지의 다른 metalloform으로 존재하며 SOD는 30KDa이상의 분자량을 가진 단백질 물질로, 체내에 쉽게 흡수되지 못하므로 SOD 활성을 갖는 저분자 물질이나 유사 물질에 대한 연구가 활발하다. Superoxide radical dismutase (SOD) is a protein that eliminates free radicals, which cause cancer, dementia, and embryogenesis in the body. By converting oxygen radicals that are harmful to cells into hydrogen peroxide, hydrogen peroxide is catalyzed by water molecules and oxygen molecules Thereby protecting the living body from active oxygen. There are three different metalloforms, Cu / Zn-SOD, Fe-SOD and Mn-SOD depending on the type of transition metal ions bound to the active site. SOD is a protein substance with a molecular weight of 30 KDa or more. . Therefore, studies on low-molecular substances and similar substances having SOD activity are active.

Superoxide에 대한 산화 억제 작용을 알아보기 위해 superoxide와 반응하여 갈변물질을 내는 pyrogallol의 자동 산화반응을 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 에탄올 추출물에 이용하여 측정한 결과 노간주나무의 줄기 및 뿌리(JRE) 및 노간주열매(JBE) 에탄올 추출물은 각각 1,000 ppm에서 20.8%, 17.0%의 활성을 나타내었다(도 2 참조).
In order to investigate the antioxidant activity of superoxide, the autoxidation reaction of pyrogallol, which reacts with superoxide, was applied to the stem and root or the ethanol extract of juniper fruit. (JBE) ethanol extract showed activity of 20.8% and 17.0% at 1,000 ppm, respectively (see FIG. 2).

실험예Experimental Example 3 :  3: XanthineXanthine oxidaseoxidase 저해활성 측정 Measurement of inhibitory activity

Xanthine oxidase 저해활성 측정은 Stirpe와 Corte의 방법을 변형하여 측정하였다. 농도별 시료용액 100 uL에 potassium phosphate 완충용액(0.1 M potassium phosphate buffer, pH 8.0) 600 uL와 xanthine (2 mM)을 녹인 기질액 200 uL를 첨가하고, xanthine oxidase (0.2 U/mL) 100 uL를 가하여 37℃에서 15분간 반응시킨 후 1 N HCl 1 mL를 가하여 반응정지를 시키고 반응액중에 생성된 uric acid를 흡광도 292 nm에서 측정하였다. Xanthine oxidase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. Xanthine oxidase inhibitory activity was measured by modified Stirpe and Corte method. Add 100 μL of xanthine oxidase (0.2 U / mL) to 600 μL of potassium phosphate buffer solution (0.1 M potassium phosphate buffer, pH 8.0) and 200 μL of xanthine solution (2 mM) After incubation at 37 ° C for 15 minutes, the reaction was terminated by the addition of 1 mL of 1 N HCl and the uric acid produced in the reaction solution was measured at 292 nm. Xanthine oxidase inhibitory activity was expressed by the absorbance reduction ratio of the sample solution and the non-additive solution.

Xanthine oxidase는 purine 대사에 관여하는 효소로서 xanthine 또는 hypoxanthine을 기질로 하여 uric acid가 만들어지고, uric acid가 혈장 내에 증가되면 낮은 용해성으로 인하여 골절에 축적되어 심한 통증을 동반하는 통풍을 일으키는 원인이 되기도 한다. 또한 xanthine oxidase는 생물 조직에 산화적 손상을 일으켜 염증, 동맥경화, 암 및 노화와 같은 여러 가지 질병을 일으킬 수 있는 superoxide radical을 생성한다. 통풍의 치료에 사용되는 약물로는 hypoxanthine의 유사체인 allopurinol과 alloxanthine이 있는데 allopurinol은 xanthine oxidase에 의하여 alloxanthine으로 산화된 다음, 이것이 xanthine oxidase에 강하여 결합하여 요산 생성의 최종단계에 관여하는 xanthine oxidase의 효소활성을 저해함으로서 요산의 생성을 억제하며, 저농도에서는 비경쟁적 저해제로 작용한다. Xanthine oxidase is an enzyme involved in purine metabolism. When xanthine or hypoxanthine is used as a substrate, uric acid is produced. When uric acid is increased in the plasma, it is accumulated in the fracture due to low solubility and causes gout accompanied with severe pain . In addition, xanthine oxidase causes oxidative damage to biological tissues and produces superoxide radicals that can cause various diseases such as inflammation, arteriosclerosis, cancer and aging. Allopurinol is oxidized to xanthine oxidase by alloxanthine, which is strongly bound to xanthine oxidase, and the enzyme activity of xanthine oxidase, which is involved in the final stage of uric acid production, Inhibits the production of uric acid, and acts as a noncompetitive inhibitor at low concentrations.

이러한 방법으로 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 에탄올 추출물의 xanthine oxidase 저해활성을 측정한 결과, 노간주나무의 줄기 및 뿌리(JRE) 및 노간주열매(JBE) 에탄올 추출물은 각각 1,000 ppm에서 58.0%, 58.2%의 저해효과를 나타내었다(도 3 참조).
In this way, the xanthine oxidase inhibitory activity of the extracts of stem and root or juniper fruit of juniper plants was measured to be 58.0% and 58.0%, respectively, from 1,000 ppm of junior stem and root (JRE) and junior fruit juice (JBE) % (See Fig. 3).

실험예Experimental Example 4 :  4 : TyrosinaseTyrosinase 저해활성 측정 Measurement of inhibitory activity

Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 67 mM sodium phosphate buffer (pH 6.8) 80 uL에 10 mM L-DOPA (Sigma, U.S.A)를 녹인 기질액 40 uL 및 시료용액 40 uL의 혼합액에 200 U/mL mushroom tyrosinase (Sigma, U.S.A) 40 uL을 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 492 nm에서 측정하였다. Tyrosinase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.Tyrosinase inhibitory activity was measured by Yagi et al. To the reaction mixture was added 200 U / mL mushroom tyrosinase (Sigma, USA) to a mixture of 40 μL of the substrate solution and 40 μL of the sample solution in 80 μL of 67 mM sodium phosphate buffer (pH 6.8) and 10 mM L-DOPA uL was added and reacted at 37 ° C for 10 minutes to measure the DOPA chrome produced in the reaction solution at 492 nm. The tyrosinase inhibitory activity was expressed as the absorbance reduction ratio of the sample solution and the non - added sample.

Melanin은 동물과 식물 및 미생물계에 널리 존재하는 페놀류의 고분자 천연 색소로 생육이나 발달에 필수적이진 않지만 어떤 환경에 대한 생존력과 경쟁력을 높여주는 물질인 반면 과도한 멜라닌 생성은 인체에 기미, 주근깨, 검버섯 등과 같은 색소 침착을 일으키고, 피부의 노화를 촉진시킨다. 피부에서는 세포 내의 tyrosinase라는 효소의 생합성 과정에서 만들어지는데 melanosome 내에 tyrosine을 산화시켜 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)를 만드는 tyrosine hydroxylase로 DOPA를 산화시켜 dopachrome을 만드는 DOPA oxidase로 작용하여 최종적으로 melanin polymer를 합성하므로, 이 반응을 억제하게 되면 melanin 생합성을 억제할 수 있어, 기미, 주근깨, 반점과 같은 과잉색소증 치료 등 광범위하게 이용될 수 있다. 그러므로 tyrosinase 저해는 화장품 산업에 있어서 매우 중요한 부분이다. Tyrosinase 활성시험은 tyrosine hydroxylase 억제 실험과 dopa oxidase 억제실험, 종합적인 멜라닌 합성 억제실험으로 구별되지만, tyrosinase hydroxylase 실험법과 멜라닌 합성 억제 실험은 방사성 동위원소를 이용하기 때문에 실험에 여러 가지 제약을 받으므로, 실제로는 DOPA를 기질로 하여 생성되는 DOPAchrome의 양을 측정하는 DOPA oxidase 저해실험을 진행하고 있다. Melanin is a polymeric natural colorant of phenols widely found in animals, plants and microorganisms. It is not essential for growth or development but it is a substance that enhances survival and competitiveness in an environment. Excessive melanin production, however, is caused by stain, freckles, It causes the same pigmentation and promotes skin aging. In the skin, it is formed in the process of biosynthesis of an enzyme called tyrosinase in the skin. It oxidizes tyrosine in the melanosome to oxidize DOPA with tyrosine hydroxylase that makes 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA), acts as a DOPA oxidase that produces dopachrome and finally melanin polymer is synthesized Therefore, inhibition of this reaction can inhibit melanin biosynthesis and can be used extensively for treating hyperpigmentation such as spots, freckles, and spots. Therefore, inhibition of tyrosinase is a very important part of the cosmetics industry. Tyrosinase activity test is distinguished from tyrosine hydroxylase inhibition experiment, dopa oxidase inhibition experiment, and comprehensive melanin synthesis inhibition experiment. However, since tyrosinase hydroxylase experiment and melanin synthesis inhibition experiment use radioisotope, Is conducting DOPA oxidase inhibition experiments to measure the amount of DOPAchrome produced using DOPA as a substrate.

피부 내에서 멜라닌 중합체 생합성을 효과적으로 저해할 수 있는 tyrosinase 저해활성을 농도별로 측정한 결과, 노간주나무의 줄기 및 뿌리(JRE) 에탄올 추출물의 경우 1,000 ppm에서 40.8%, 노간주열매(JBE) 에탄올 추출물의 경우 1,000ppm에서 53.4%로 노간주열매(JBE) 에탄올 추출물의 저해효과가 더 높다는 것을 확인하였다(도 4 참조).
The tyrosinase inhibitory activity, which can effectively inhibit the melanin biosynthesis in the skin, was measured by concentration. The results showed that the ethanol extracts of JOE and JRE from 1,000 ppm to 40.8% of ethanol extracts of juniper fruit juice (JBE) It was confirmed that the inhibitory effect of the ethanol extract of Juniper berries (JBE) was higher at 1,000 ppm to 53.4% (see FIG. 4).

상기한 바와 같이, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 추출물의 화장품약리활성 결과, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 추출물의 활성이 전반적으로 우수하여 미백 및 주름개선 메커니즘 분석은 노간주나무의 줄기 및 뿌리 추출물을 중심으로 측정하였다. 그 방법 및 결과는 다음과 같다.
As described above, the pharmacological activity of the extracts of the stem and root of the juniper and the extract of the juniper fruit were excellent in the activity of the stem and root extracts of the juniper tree, and the analysis of the whitening and wrinkle improvement mechanism showed that the stem and root extracts of the juniper . The method and results are as follows.

실험예Experimental Example 5 :  5: 멜라노마Melanoma 세포에서의 세포생존율 측정 Cell viability measurement in cells

각 세포의 배양은 10% FBS과 1% penicillin/streptomycin (100 U/mL)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 incubator에 적응시켜 계대 배양하였다. 세포 독성 측정은 Carmichael의 방법에 따라 측정하였다. 멜라노마(B16F10)와 섬유아(CCD-986sk) 세포를 96 well plate에 5×104 cells/well이 되게 0.18 mL 분주하고, 시료를 농도 별로 조제하여 0.02 mL 첨가한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 0.02 mL를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO 0.15 mL를 가하여 실온에서 30분간 반응시킨 뒤 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 셍존율 측정은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다. Each cell was cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 1% penicillin / streptomycin (100 U / mL) and subcultured at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator. Cytotoxicity was measured according to the method of Carmichael. Cells were cultured in 96-well plates at a density of 5 × 10 4 cells / well (0.18 mL), and the samples were added at a concentration of 0.02 mL. The cells were incubated at 37 ° C. in 5% CO 2 2 incubator for 24 hours. In the control group, the same amount of distilled water as that of the sample was added and the cells were cultured under the same conditions. After adding 0.02 mL of MTT solution (5 mg / mL) for 4 hours, remove the culture medium, add 0.15 mL of DMSO to each well, incubate at room temperature for 30 minutes, and measure the absorbance at 540 nm with an ELISA reader Respectively. Cellular ratio was measured by the absorbance reduction rate of the sample solution addition group and the no addition group.

세포 생존율을 확인하기 위한 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 담황색의 기질로서 생 세포의 미토콘드리아 내의 호흡연쇄 효소에 의해 개열되고 암적색의 formazan을 생성한다. 죽은 세포에서는 반응이 일어나지 않으므로 이 formazan의 생성량을 생 세포 측정에 이용되는검색법으로96 well plate를 사용하며, 검사결과를 ELISA reader (multiwell microplate reader)를 이용하여 많은 시료를 간단하게 판독할 수 있어 세포독성 및 세포증식 검색법으로서 널리 사용되고 있는 방법 중의 한 방법이다. 암세포의 경우 대사 과정에서 미토콘드리아의 탈수소 효소 작용에 의해 노란색 수용성 MTT tetrazolium을 자주색을 띠는 비수용성의 MTT formazan으로 환원시킨다. MTT formazan의 흡광도는 550 nm 근처 파장에서 최대가 되며, 이는 대사적으로 왕성한 세포의 농도를 반영하는 것이다. 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) is a pale yellow substrate that is cleaved by respiratory chain enzymes in the mitochondria of living cells, . Since the reaction does not occur in dead cells, the amount of this formazan production can be easily detected by using a 96-well plate as a detection method used for the determination of the living cells, and using an ELISA reader (multiwell microplate reader) Is one of the methods widely used as cytotoxicity and cell proliferation detection methods. In the case of cancer cells, the yellow water soluble MTT tetrazolium is reduced to a purple colored water insoluble MTT formazan by the dehydrogenase action of mitochondria during metabolism. The absorbance of MTT formazan is maximal at a wavelength near 550 nm, which reflects the concentration of metabolic, vigorous cells.

본 발명에서는 노간주나무의 줄기 및 뿌리 추출물에 의한 melanoma 세포의 생존율을 MTT assay에 의해 확인한 결과 10 ug/mL 이하에서 90% 이상의 세포 생존율을 나타내는 것을 확인하였고(도 5 참조), 이에 따라 아래 본 실험에서는 50 ug/mL 이하의 농도로 실험을 하였다.
In the present invention, the survival rate of melanoma cells by the stem and root extracts of Junjoo saponins was found to be 90% or higher at 10 ug / mL or less as a result of MTT assay (see FIG. 5) , The concentration was 50 ug / mL or less.

실험예Experimental Example 6 :  6: WesternWestern blotblot 을 통한 through 미백인자Whitening factor 단백질 발현 측정 Measurement of protein expression

미백인자인 microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase related protein 1 (TRP-1), tyrosinase related protein 2 (TRP-2), tyrosinase, matrix metalloproteinase-1 (MMP-1)의 활성을 보기 위하여 cell line인 B16F10을 100 mm tissue culture dish에 cell seeding 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화 시켰다. 배지를 제거한 후 추출물을 농도별로 처리한 배지로 24∼48시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 phosphate buffered saline (PBS)로 2번 세척해주었다. Radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer 10mL에 complete mini 1 tab를 가한 100 uL로 용해해서 4℃ 13,200 rpm에서 20분간 원심 분리하였다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 BCA protein assay kit를 사용하여 정량하여 20 uL의 단백질을 10% SDS-PAGE사에서 전기영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 semi dry transfer cell 기기 (Hofer, USA)를 이용하여 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking buffer (5% skim milk in TBST)에서 배양시켰다. 1차 항체를 희석하여 4℃에서 over night한 다음, 다시 10분 간격으로 tris-buffered saline and tween 20 (TBST)로 3회 washing하고 2차 항체를 1 : 1,000으로 희석하여 실온에서 2시간 배양하였다. 3회 washing한 후 LAS 4,000 기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량하였다.To investigate the activity of microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase related protein 1 (TRP-1), tyrosinase related protein 2 (TRP-2), tyrosinase and matrix metalloproteinase-1 (MMP- B16F10 cells were seeded in a 100 mm tissue culture dish and cultured for 24 hours to stabilize the cells. After removing the medium, the extracts were cultured for 24 to 48 hours in a concentration-treated medium. Then, the medium was removed again and washed twice with phosphate buffered saline (PBS). Radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer was added to each well of 100 μL of complete mini 1 tab, and centrifuged at 13,200 rpm for 20 minutes at 4 ° C. The supernatant obtained by centrifugation was quantified using a BCA protein assay kit and 20 μL of the protein was separated by electrophoresis on a 10% SDS-PAGE. The separated proteins were transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane using a semi-dry transfer cell (Hofer, USA) and incubated in blocking buffer (5% skim milk in TBST) for 1 hour at room temperature. The primary antibody was diluted and incubated at 4 ° C overnight. The cells were then washed three times with tris-buffered saline and tween 20 (TBST) every 10 minutes, diluted to 1: 1,000 with the secondary antibody, and incubated at room temperature for 2 hours . After washing three times, bands were identified and quantified using a LAS 4000 instrument.

생체 내 tyrosine으로부터 멜라닌 생성은 주로 산화적 반응에 의해서 일어나는데 이와 관련된 효소로는 tyrosinase, tyrosinase related protein-1 (TRP-1)과 tyrosinase related protein-2 (TRP-2) 등이 있다. TRP-1은 TRP-2에 의해 생성된 5,6-dihydroxy indole-2-carboxylic acid (DHICA)를 oxidation 시켜 indole-2-carboxylic acid (IQCA)를 생성하는데, IQCA는 흑갈색을 나타낸다. MITF는 microphthalmia transcription factor로서 tyrosinase 발현을 조절하므로 MITF의 억제는 tyrosinase의 발현억제를 통하여 melanin 색소 생성을 억제할 수 있다. The tyrosinase-related protein-1 (TRP-1) and tyrosinase related protein-2 (TRP-2) enzymes are involved in the production of melanin from the in vivo tyrosine. TRP-1 produces indole-2-carboxylic acid (IQCA) by oxidizing 5,6-dihydroxy indole-2-carboxylic acid (DHICA) produced by TRP-2. Since MITF regulates tyrosinase expression as a microphthalmia transcription factor, inhibition of MITF can inhibit the production of melanin pigment by inhibiting the expression of tyrosinase.

본 발명에서는 노간주나무의 줄기 및 뿌리 추출물이 멜라닌 생성에 관여하는 유전자들에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2의 단백질과 mRNA 발현에 미치는 영향을 측정하였다. 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물이 melanin 합성에 관계된 효소인 tyrosinase에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma 세포에 농도별로 5, 25, 50 ug/mL 처리 한 후 24시간 후에 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2 protein 발현을 western blotting으로 확인하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였다. In the present invention, the effect of tyrosinase, MITF, TRP-1, and TRP-2 on protein and mRNA expression was evaluated in order to evaluate the effect of stem and root extracts on the genes involved in melanogenesis. In order to investigate the effect of stem and root ethanol extracts on the tyrosinase enzyme, melanin synthesis, tyrosinase, MITF, and TRP-2 were treated with B16F10 mouse melanoma cells at 5, 25, and 50 ug / 1, TRP-2 protein expression was confirmed by western blotting. GAPDH, a house keeping gene, was used as a positive control with little difference in the expression level even in various cell conditions.

그 결과, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물을 농도별로 5, 25, 50 ug/mL을 처리한 B16F10에서는 tyrosinase(도 7 참조), MITF(도 10 참조), TRP-1(도 8 참조), TRP-2(도 9 참조) protein의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, tyrosinase (see FIG. 7), MITF (see FIG. 10), TRP-1 (see FIG. 8), and the like were observed in B16F10 treated with 5, 25 and 50 ug / The expression of TRP-2 (see Fig. 9) protein was decreased.

실험예Experimental Example 7 :  7: 멜라노마Melanoma 세포의  Cell mRNAmRNA 발현 억제 효과 측정 Measurement of inhibition of expression

실험예Experimental Example 7-1 : 총  7-1: Total RNARNA 분리 및  Separation and cDNAcDNA 합성 synthesis

세포를 100 mm culture dish에 cell seeding한 뒤 24시간 동안 배양한 후 sample을 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배지 상등액을 제거한 후 trizol lysis buffer를 각 well에 1 mL씩 분주하여 세포를 lysis한 후 chloroform 200 mL를 분주하여 20초간 위아래로 흔들어주었다. 그 후 13,200 rpm 에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 isopropanol 500 mL이 들어있는 튜브에 옮겨 섞었다. 다시 13,200 rpm에서 20분간 원심분리 하였고, 그 상층액을 제거 한 후 75% EtOH-diethylpyrocarbonate water를 각 튜브에 1 mL씩 분주하여 13,200 rpm에서 5분간 원심분리한 뒤 상층액을 제거한 뒤 실온에서 건조시켰다. DEPC를 50 uL씩 분주하여 녹인 후 96 well plate에 RNA 5 uL와 멸균수 195 uL를 첨가하여 260 nm, 280 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 total RNA양을 측정하였다. Oligo (dT) 15 primer (500 ug/mL) 1 uL, 추출한 RNA (2 ug)와 nuclease free water로 10 uL를 맞추고 75℃에서 5분간 반응시킨 후 5X reaction buffer, MgCl2, PCR necleotide mix, rnasin inhibitor, reverse transcriptase, ruclease free water를 첨가하여 25℃에서 5분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성시켰다.
Cells were seeded in a 100 mm culture dish and incubated for 24 hours. After removing the supernatant from the culture medium, trizol lysis buffer was added to each well in an amount of 1 mL. After lysing the cells, 200 mL of chloroform was dispensed and shaken up and down for 20 seconds. After centrifugation at 13,200 rpm for 20 minutes, the supernatant was transferred to a tube containing 500 mL of isopropanol. After centrifugation at 13,200 rpm for 20 minutes, the supernatant was removed, and 1 mL of 75% EtOH-diethylpyrocarbonate water was added to each tube. After centrifugation at 13,200 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed and dried at room temperature . DEPC was dissolved in 50 uL aliquots, and 5 uL of RNA and 195 uL of sterile water were added to 96 well plates. Absorbance was measured at 260 nm and 280 nm, respectively. 1 μL of Oligo (dT) 15 primer (500 μg / mL) and 10 μL of extracted RNA (2 μg) were mixed with nuclease free water for 5 min at 75 ° C. After incubation for 5 min, 5X reaction buffer, MgCl 2 , PCR necleotide mix, rnasin cDNA was synthesized by reacting with inhibitor, reverse transcriptase and ruclease free water at 25 ℃ for 5 min, 42 ℃ for 60 min and 70 ℃ for 15 min.

실시예Example 7-2 :  7-2: ReverseReverse transcriptiontranscription -- polymerase중합체 chainchain reactionreaction

미백인자인 microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase related protein 1 (TRP-1), tyrosinase related protein 2 (TRP-2), tyrosinase, matrix metalloproteinase-1 (MMP-1)의 mRNA 발현을 알아보기 위하여 polymerase chain reaction (PCR)을 실시하였다. 실험에 사용한 primer sequences는 도 6과 같다. PCR tube에 Go Flexi DNA polymerase, primer, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)는 94℃에서 30초, 55℃에서 45초, 72℃에서 45초 (35 cycles), tyrosinase는 94℃에서 30초, 60℃에서 45초, 72℃ 45초 (40 cycles), TRP-1, TRP-2, MITF는 94℃에서 30초, 58℃에서 45초, 72℃에서 45초 (40 cycles)을 하였으며, MMP-1은 94℃에서 30초, 56℃에서 60초, 72℃에서 1분 (35 cycles)를 하였다. PCR로 합성 시킨 후 0.002% ethidium bromide를 첨가한 1.5% agarose gel에 100V에서 40분간 전기영동 후 LAS 4,000을 이용하여 밴드를 확인하여 분석 정량하였다.
To investigate mRNA expression of microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase related protein 1 (TRP-1), tyrosinase related protein 2 (TRP-2), tyrosinase and matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) polymerase chain reaction (PCR). The primer sequences used in the experiment are shown in FIG. Go Flexi DNA polymerase, primer, and synthesized cDNA were added to the PCR tube and mixed well. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was incubated at 94 ° C for 30 seconds, at 55 ° C for 45 seconds, at 72 ° C for 45 seconds (35 cycles), at tyrosinase at 94 ° C for 30 seconds, at 60 ° C for 45 seconds, (40 cycles), TRP-1, TRP-2, and MITF were performed at 94 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 45 seconds, and 72 ° C for 45 seconds (60 cycles) at 72 캜 for 1 minute (35 cycles). After PCR, the cells were stained with 1.5% agarose gel containing 0.002% ethidium bromide for 40 min at 100V.

상기한 바와 같이, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물이 melanin 합성에 관계된 key enzyme인 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2 mRNA에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma 세포에 농도별로 5, 25, 50 ug/mL 처리한 후 24시간 후에 polymerase chain reaction (PCR)으로 mRNA 발현양을 측정하였다. 이때 house keeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였다. In order to investigate the effect of stem and root ethanol extracts of Junjoo mushroom on tyrosinase, MITF, TRP-1 and TRP-2 mRNAs, which are key enzymes involved in the synthesis of melanin, B16F10 mouse melanoma cells were treated with 5, 25 , And 50 μg / mL, and the amount of mRNA expression was measured by polymerase chain reaction (PCR) 24 hours later. The house keeping gene, GAPDH, was used as a positive control.

그 결과, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물을 농도별로 5, 25, 50 ug/mL을 처리한 B16F10세포에서는 tyrosinase(도 11 참조), MITF(도 14 참조), TRP-1(도 12 참조), TRP-2(도 13 참조) mRNA 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
(See FIG. 11), MITF (see FIG. 14), and TRP-1 (see FIG. 12) in B16F10 cells treated with 5, 25 and 50 ug / mL of the stem and root ethanol extracts of Jun- , And TRP-2 (see Fig. 13) mRNA expression was decreased.

이와 같은 결과로 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물이 B16F10 흑세포종에 대하여 멜라닌 색소 생성 억제 및 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2의 억제 효과를 가지고 있는 것으로 보임에 따라 미백 관련 기능성 화장품 소재로서의 가능성이 있음을 보여준다.
As a result, stem and root ethanol extracts from Juniperia showed inhibition of melanin pigment formation and inhibition of tyrosinase, MITF, TRP-1 and TRP-2 on B16F10 melanoma cell line, It shows that there is a possibility.

실험예Experimental Example 8 :  8 : RealReal -- timetime PCRPCR

멜라노마 세포로부터 추출되어 진 RNA를 260 nm와 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 추출한 RNA (2 ug)와 Oligo (dT) 15primer (500 ug/mL) 1 uL, nuclease free water와 혼합한 뒤 75℃에서 5분, ice에서 5분 반응시킨 후 5X reaction buffer, MgCl2, PCR necleotide mix, rnasin inhibitor, reverse transcriptase, nuclease free water를 첨가하여 25℃에서 5분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성시켰다. 합성한 cDNA와 2X SYBR green mix, primer, ROX를 각각 넣어 ABI step one pluse (Applied biosystem, USA)기기를 이용하여 실시간 정량 분석을 한 뒤 analysis program을 이용하여 결과를 분석하였다.The RNA extracted from melanoma cells was quantified by measuring the absorbance at 260 nm and 280 nm. Extracted RNA (2 ug) and Oligo (dT) 15primer (500 ug / mL) 1 uL, nuclease free water and one in 75 5 minutes after mixing, after 5 min reaction in ice 5X reaction buffer, MgCl 2, PCR necleotide mix, rnasin inhibitor, reverse transcriptase, and nuclease free water. The cDNA was synthesized by reacting at 25 ℃ for 5 min, 42 ℃ for 60 min, and 70 ℃ for 15 min. The synthesized cDNA, 2X SYBR green mix, primer, and ROX were each added and analyzed quantitatively using real time quantitative analysis using an ABI step one pluse (Applied biosystem, USA).

Real-time polymerase chain reaction (PCR)은 thermal cycler와 분광형광 광도계가 일체화된 장치로 실시간으로 target DNA분자의 증폭과 양의 측정을 동시에 분석하는 실험이다. 본 실험에서 tyrosinase(도 15 참조), MITF(도 18 참조), TRP-1(도 16 참조), TRP-2(도 17 참조)의 mRNA를 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물을 처리하여 실시간으로 분석한 결과 농도 의존적으로 mRNA 발현이 감소하였음을 확인할 수 있었다.
Real-time polymerase chain reaction (PCR) is a device that integrates a thermal cycler and a spectrophotometer, and simultaneously analyzes the amplification and quantification of target DNA molecules in real time. In this experiment, the mRNA of tyrosinase (see FIG. 15), MITF (see FIG. 18), TRP-1 (see FIG. 16) and TRP-2 (see FIG. 17) As a result, it was confirmed that mRNA expression was decreased in a dose dependent manner.

실험예Experimental Example 9 :  9: ElastaseElastase 저해활성 측정 Measurement of inhibitory activity

Elastase 저해활성 측정은 Cannell 등의 방법에 따라 측정하였다. 기질로서 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide(sigma,U.S.A)를 사용하여 37℃에서 30분간 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 445 nm에서 측정하였다. 즉, 각 시험용액을 일정 농도가 되도록 조제하여 40 uL씩 96-well plate에 취하고, 50 mM tris-HCl buffer (pH8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase (2.5 U/mL) (sigma, U.S.A)용액 40 uL을 가한 후 기질로 50 mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide(0.5mg/mL)을 80 uL 첨가하여 30분간 반응시켜 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 445 nm에서 측정하였다. Elastase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.Elastase inhibitory activity was measured by Cannell et al. The amount of p-nitroanilide produced from the substrate at 37 ° C for 30 min was measured at 445 nm using N-succinyl- (L-Ala) 3 -p-nitroanilide (Sigma, USA) as a substrate. Each test solution was added to a 96-well plate in a volume of 40 μL, and the porcine pancreas elastase (2.5 U / mL) (Sigma, USA) dissolved in 50 mM tris-HCl buffer (pH 8.6) (L-Ala) 3- P-nitroanilide (0.5 mg / mL) dissolved in 50 mM tris-HCl buffer (pH 8.6) was added to the substrate and the reaction was continued for 30 minutes. The amount of p-nitroanilide produced was measured at 445 nm. Elastase inhibitory activity was expressed as the absorbance reduction ratio of the sample solution and the non - added sample.

Elastin은 진피층의 3-4% 정도를 차지하며 피부의 탄력성에 영향을 주는데 나이, 자외선과 같은 내·외적 스트레스로 인하여 탄력성, 윤택성이 감소하고 과다 발현된 elastase에 의하여 elastin의 그물망 구조가 깨지게 됨으로서 피부가 처지고 주름이 생기면서 피부의 노화가 발생되기 때문에 피부 노화의 주원인 중 하나에 속하는 elastin의 분해효소인 elastase의 활성을 저해시킴으로서 피부 노화를 억제할 수 있다. elastase 저해제로는 ursolic acid가 elastase 저해제로 이용되고 있는데, ursolic acid는 물이나 오일 등의 용매에는 잘 녹지 않는 성질을 가지고 있기 때문에 제제화하기 어려워 일반적으로 사용하기 어려운 문제점이 있다. Elastin occupies about 3-4% of the dermis and affects the elasticity of the skin. It decreases the elasticity and elasticity due to internal and external stresses such as age and ultraviolet rays, and the elastin network structure is broken by the overexpressed elastase, Skin wrinkles and wrinkles occur, and skin aging is caused. Therefore, it inhibits the activity of elastase, a degradation enzyme of elastin, which is one of the main causes of skin aging, so that skin aging can be suppressed. As an elastase inhibitor, ursolic acid is used as an elastase inhibitor, and ursolic acid is difficult to formulate because it is insoluble in solvents such as water or oil, so that it is generally difficult to use.

이러한 주름 생성과 관련한 elastase의 활성 억제 효과를 확인하기 위해 측정한 결과, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 에탄올 추출물은 1,000 ppm에서 각각 23.0%, 29.4%로 노간주열매 에탄올 추출물이 더 높은 저해활성을 나타내었다(도 19 참조).
In order to confirm the inhibitory effect of elastase activity on wrinkle formation, 23.0% and 29.4% of ethanol extracts of stem, root or juniper fruit of Junjoo were 1,000 ppm, respectively. (See Fig. 19).

실험예Experimental Example 10 :  10: CollagenaseCollagenase 저해활성 측정 Measurement of inhibitory activity

Collagenase 저해활성 측정은 Wnsch E, Heindrich HG 의 방법에 따라 측정하였다. 즉 반응구는 0.1 M tris-HCl buffer (pH 7.5)에 4 mM CaCl2를 첨가하여, 0.3 mg/mL의 4-phenylazobenzyl oxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg (sigma, U.S.A)를 녹인 기질액 125 uL 및 시료용액 50 uL의 혼합액에 0.2 mg/mL의 collagenase (sigma, U.S.A) 75 uL를 첨가하여, 실온에서 20분간 방치한 후 6% citric acid 250 uL을 넣어 반응을 정지 시킨 후, ethyl acetate 1.5 mL을 첨가하여 320 nm에서 흡광도를 측정하였다. Collagenase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.Collagenase inhibitory activity was measured by Wnsch E and Heindrich HG. That is dissolved in the reaction sphere 0.1 M tris-HCl buffer (pH 7.5) 4 mM by the addition of CaCl 2, 0.3 mg / mL 4 -phenylazobenzyl oxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg (sigma, USA) of the After adding 75 μL of 0.2 mg / mL collagenase (Sigma, USA) to 125 μL of the substrate solution and 50 μL of the sample solution, the reaction was stopped by adding 250 μL of 6% citric acid for 20 minutes at room temperature. 1.5 mL of ethyl acetate was added and absorbance was measured at 320 nm. Collagenase inhibitory activity was expressed as the absorbance reduction ratio of the sample solution and the non - added sample.

세포 외 기질(extracellular matrix)의 주요구성 성분인 collagen은 피부의 섬유아 세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 피부의 주름과 보습 기능을 가지며, 사람이 나이가 들면서 생합성이 감소하는 대표적인 물질이다. 또한 생체 단백질 총 중량의 약 30%를 차지하는 중요한 단백질로서 견고한 3중 나선구조를 가지고 있다. Collagen의 주된 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포 접착의 지탱, 세포 분할과 분화의 유도 등이 알려져 있다. 그러나 자연 노화에 따른 세포 활성의 감소와 같은 내적 요인에 의한 스트레스의 증가 및 태양 광선에 의한 활성 산소종의 증가와 같은 외적 요인에 의해 분해가 가속화되어 피부 기질이 파괴되면서 주름이 생성된다. 이러한 collagen을 분해하는 효소는 그 종류가 다양하며 가장 많이 알려져 있는 것이 콜라겐 type Ⅰ을 분해하는 MMP-1 (Matrix metalloproteinase Ⅰ, collagenase)으로 피부노화에 있어 MMP-1의 저해는 중요한 요인으로 평가 되어지고 있다. Collagen, a major constituent of the extracellular matrix, is a major substrate protein produced in the fibroblasts of the skin. It has wrinkles and moisturizing functions of the skin. It is a typical material in which the biosynthesis decreases with age. It is also an important protein that accounts for about 30% of the total biomass protein weight, and has a solid triple helix structure. The main functions of collagen are known to be mechanical rigidity of skin, resistance of connective tissues and binding force of tissues, support of cell adhesion, induction of cell division and differentiation. However, the degradation is accelerated by extrinsic factors such as increase of stress caused by internal factors such as decrease of cell activity due to natural aging and increase of active oxygen species by sunlight, and skin texture is destroyed and wrinkles are formed. The enzymes that degrade collagen are diverse, and the most known is MMP-1 (Matrix metalloproteinase Ⅰ, collagenase), which degrades collagen type Ⅰ. Inhibition of MMP-1 in skin aging is evaluated as an important factor have.

이러한 Collagenase의 저해활성을 노간주나무의 줄기 및 뿌리 또는 노간주열매 에탄올 추출물을 사용하여 측정한 결과 노간주나무의 줄기 및 뿌리 및 노간주 열매 에탄올 추출물의 저해활성은 각각 1,000 ppm에서 71.5%, 67.9%로 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물이 더 높은 저해활성을 나타내었다(도 20 참조).
The inhibitory activities of these collagenase inhibitory activities on the stem, root and juniper fruit ethanol extracts of juniper plants were 1,000 ppm to 71.5% and 67.9%, respectively, using the extracts of stem, root or juniper fruit of juniper And ethanol extracts of roots showed higher inhibitory activity (see Fig. 20).

실험예Experimental Example 11 : 섬유아세포의 세포 생존율 측정 11: Measurement of cell viability of fibroblasts

세포의 배양은 10% FBS과 1% penicillin/streptomycin (100 U/mL)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 incubator에 적응시켜 계대 배양하였다. 세포 독성 측정은 Carmichael의 방법에 따라 측정하였다. 섬유아(CCD-986sk) 세포를 96 well plate에 5×104 cells/well이 되게 0.18 mL 분주하고, 시료를 농도 별로 조제하여 0.02 mL 첨가한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 0.02 mL를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO 0.15 mL를 가하여 실온에서 30분간 반응시킨 뒤 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 셍존율 측정은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다. Cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS and 1% penicillin / streptomycin (100 U / mL) and subcultured at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator. Cytotoxicity was measured according to the method of Carmichael. Fibroblast (CCD-986sk) cells were seeded at a density of 5 × 10 4 cells / well in a 96-well plate, and 0.02 mL was added to each sample. After incubation at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator for 24 hours Respectively. In the control group, the same amount of distilled water as that of the sample was added and the cells were cultured under the same conditions. After adding 0.02 mL of MTT solution (5 mg / mL) for 4 hours, remove the culture medium, add 0.15 mL of DMSO to each well, incubate at room temperature for 30 minutes, and measure the absorbance at 540 nm with an ELISA reader Respectively. Cellular ratio was measured by the absorbance reduction rate of the sample solution addition group and the no addition group.

세포 생존율을 확인하기 위한 MTT(3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium bromide)는 담황색의 기질로서 생 세포의 미토콘드리아 내의 호흡연쇄 효소에 의해 개열되고 암적색의 formazan을 생성한다. 죽은 세포에서는 반응이 일어나지 않으므로 이 formazan의 생성량을 생 세포 측정에 이용되는이검색법은96 well plate를 사용하며, 검사결과를 ELISA reader(multiwell microplate reader)를 이용하여 많은 시료를 간단하게 판독할 수 있어 세포독성 및 세포증식 검색법으로서 널리 사용되고 있는 방법 중의 한 방법이다. 암세포의 경우 대사 과정에서 미토콘드리아의 탈수소 효소 작용에 의해 노란색 수용성 MTT tetrazolium을 자주색을 띠는 비수용성의 MTT formazan으로 환원시킨다. MTT formazan의 흡광도는 550nm 근처 파장에서 최대가 되며, 이는 대사적으로 왕성한 세포의 농도를 반영하는 것이다. MTT (3- (4,5-dimetylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium bromide) is a pale yellow substrate that is cleaved by respiratory chain enzymes in the mitochondria of living cells and produces dark red formazan do. Since the reaction does not occur in dead cells, the amount of this formazan produced can be easily read by using a 96-well plate, which can be used for the determination of the viable cells, using an ELISA reader (multiwell microplate reader) And is one of the methods widely used as cytotoxicity and cell proliferation detection methods. In the case of cancer cells, the yellow water soluble MTT tetrazolium is reduced to a purple colored water insoluble MTT formazan by the dehydrogenase action of mitochondria during metabolism. The absorbance of MTT formazan is maximal at wavelengths near 550 nm, which reflects the concentration of metabolically vigorous cells.

본 발명에서는 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물을 처리한 fibroblast cell (CCD-986sk)의 생존율을 확인한 결과 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물이 50 ug/mL 에서 58.8%의 세포 생존율을 나타냄으로서, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물의 세포독성이 적다는 것을 확인할 수 있었다(도 21 참조).
In the present invention, the survival rate of fibroblast cell (CCD-986sk) treated with stem and root ethanol extracts of juniper seeds showed cell viability of 58.8% at 50 ug / mL of stem and root ethanol extracts of juniper, It was confirmed that the stem and root ethanol extract of the tree had low cytotoxicity (see FIG. 21).

실험예Experimental Example 12 :  12: ProPro -- collagencollagen typetype I 생합성 측정 I biosynthesis measurement

세포를 1×104 cells/well 농도로 96 well plate에 접종한 후, 각 well에 시료를 첨가하여 CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 이렇게 실험한 세포의 배양액을 모아 실험에 사용하였다. 세포 배양액 내 collagen 생합성 정도는 procollagen type-Ⅰ C peptide (PIP) EIA kit (Takara Bio, Japan)을 사용하여 propeptide의 양을 측정하였다.Cells were inoculated into 96-well plates at a concentration of 1 × 10 4 cells / well, and samples were added to each well and cultured in a CO 2 incubator for 24 hours. The cultures of the cells thus obtained were collected and used for the experiments. The amount of collagen biosynthesis in the cell culture medium was measured by using a procollagen type-Ⅰ C peptide (PIP) EIA kit (Takara Bio, Japan).

진피층은 90%가 collagen으로 구성되어 있어 collagen의 감소는 피부노화와 밀접한 관계를 가지고 있다. 탄력섬유인 collagen은 elastin과 함께 망상으로 존재하며 진피를 지지하는 기능을 담당하며, 1500개 정도의 아미노산으로 구성된 독특한 삼중나선 구조를 가지고 있다. 그러나 자연 노화에 따른 세포 활성의 감소와 같은 내적 요인에 의해 collagen의 생합성이 감소되고, 여러 가지 유해 환경에 의한 스트레스의 증가 및 태양 광선에 의한 활성 산소종의 증가와 같은 외적 요인에 의해 분해가 가속화되어 피부 기질이 파괴되면서 주름이 생성된다. 진피 중에는 collagen type Ⅰ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ가 가장 많고, type Ⅴ는 type Ⅰ과 Ⅲ은 hybrid 형태로 존재하며 이들은 pro-collagen이라는 전구물질의 형태로 합성된다. Pro-collagen은 아미노 말단과 카르복시 말단에 pro-peptide라는 peptide 염기서열을 포함하며, pro-peptide는 소포체에서 pro-collagen 분자의 folding을 도와줌과 동시에 collagen의 중합반응이 일어날 때 collagen 분자로부터 절단, 분리된다고 알려져 있다. 그래서 분리된 pro-peptide의 양을 측정함으로서, 세포 내에서의 collagen 생합성 정도를 파악할 수 있다. Since 90% of the dermis is composed of collagen, reduction of collagen is closely related to skin aging. Collagen, a resilient fiber, is present as a reticulum along with elastin and has a unique triple helix structure composed of about 1500 amino acids. However, degradation of collagen is accelerated by extrinsic factors such as decrease of collagen biosynthesis due to internal factors such as decrease of cell activity due to natural aging, increase of stress due to various harmful environments, and increase of active oxygen species by sunlight And the skin substrate is destroyed to form wrinkles. Collagen type Ⅰ, Ⅲ, Ⅳ and Ⅴ are the most abundant in the dermis. Type Ⅴ exists in the form of hybrid type Ⅰ and Ⅲ, and they are synthesized in the form of pro-collagen precursor. Pro-collagen contains a pro-peptide sequence at the amino terminus and carboxy terminus. The pro-peptide promotes the folding of pro-collagen molecules in the endoplasmic reticulum, and at the same time, It is known to be separated. Thus, by measuring the amount of isolated pro-peptide, the extent of collagen biosynthesis in the cell can be determined.

본 발명에서는 정상 섬유아세포(CCD-986sk)에 collagen 생합성 증가를 확인할 수 있는 pro-collagen type ⅠC-peptide (PICP) enzyme immunoassay를 이용하여 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물의 collagen 생합성량을 측정한 결과 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물은 50 ug/mL에서 151.52%의 생합성 촉진 효과를 나타내었다(도 22 참조).
In the present invention, the amount of collagen biosynthesis of the stem and root ethanol extracts of the juniper seedlings was measured by using a pro-collagen type Ⅰ-peptide (PICP) enzyme immunoassay to confirm the increase of collagen biosynthesis in the normal fibroblast (CCD-986sk) The stem and root ethanol extracts of juniper showed promoting biodegradation of 151.52% at 50 ug / mL (see FIG. 22).

실험예Experimental Example 13 :  13: MMPMMP -1 저해활성 측정-1 inhibition activity measurement

세포를 1×104 cells/well 농도로 96 well plate에 접종한 후, 각 well에 시료를 첨가하여 CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 이때 MMP-1의 활성을 높이기 위하여 TNF-α 를 10 ng/mL의 농도로 첨가하였다. 세포의 배양액을 수거하여 실험에 사용하였으며 Gross B.E 등의 방법에 따라 matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) biotrack activity assay kit을 이용하여 측정하였다.Cells were inoculated into 96-well plates at a concentration of 1 × 10 4 cells / well, and samples were added to each well and cultured in a CO 2 incubator for 24 hours. At this time, TNF-α was added at a concentration of 10 ng / mL to increase the activity of MMP-1. Cell culture media were collected and used for experiments. Cell viability was measured by matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) biotrack activity assay kit according to Gross BE et al.

생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질(Extracellular matrix, ECM)의 합성과 분해는 적절하게 조절되지만 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하여 자외선 조사에 의해 다양한 기질 단백질 분해 효소(matrix metalloproteinase, MMPs)가 피부의 fibroblast, keratinocyte 등에서 분비되어 세포 외 기질과 basement membrane을 구성하는 대부분의 성분을 분해함으로서 피부 탄력을 유지하는 결합조직이 파괴되어 주름과 탄력저하, 피부 처짐의 원인이 된다. Although the synthesis and degradation of extracellular matrix (ECM) such as collagen in vivo is moderately controlled, the synthesis of the extracellular matrix (ECM) is regulated as aging progresses, and matrix metalloproteinases (MMPs) Of fibroblast, keratinocyte, etc., and decomposing most components constituting the extracellular matrix and basement membrane, the connective tissue which maintains skin elasticity is destroyed, which causes wrinkles, elasticity deterioration and skin sagging.

본 발명에서는 UV-A에 의해 발현이 증가되는 MMP-1에 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물이 미치는 영향을 알아보고자, 섬유아 세포에 UV-A를 조사하고 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물을 첨가하여 24시간 배양한 후 MMP-1 발현 저해효과를 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 통해 알아보았다. 그 결과 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물은 100 ug/mL에서 67.1%의 MMP-1의 발현 저해효과를 나타내었다(도 23 참조).
In the present invention, UV-A was irradiated to the fibroblasts and the extracts of stem and root ethanol extracts of Mongolian japonica were applied to MMP-1, which is expressed by UV-A, After incubation for 24 hours, inhibition of MMP-1 expression was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). As a result, the stem and root ethanol extracts of juniper showed inhibitory effect on MMP-1 expression of 67.1% at 100 ug / mL (see FIG. 23).

실험예Experimental Example 14 :  14: WesternWestern blotblot 을 통한 주름개선 인자 단백질 발현 측정Of wrinkle-improving factor protein expression

MMP-1 활성을 보기 위하여 cell line (CCD-986sk)을 100 mm tissue culture dish에 cell seeding 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화 시켰다. 배지를 제거한 후 추출물을 농도 별로 처리한 배지로 24~48시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척해주었다. RIPA buffer 10 mL에 complete mini 1 tab를 가한 100 uL로 용해해서 4℃ 12,000 rpm에서 20분간 원심 분리하였다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 Bradford assay로 정량하여 30 uL의 단백질을 semi dry transfer cell 기기 (Hofer, USA)를 이용하여 PVDF membrane에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking buffer (5% skim milk in TBST)에서 incubation 시켰다. 1차 항체를 희석하여 4℃에서 over night한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 washing하고 2차 항체를 1 : 1000으로 희석하여 실온에서 2시간 배양하였다. 3회 washing한 후 LAS 4,000 기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량 하였다.
Cell line (CCD-986sk) was seeded in a 100-mm tissue culture dish and incubated for 24 hours to stabilize the cells for MMP-1 activity. After removing the medium, the extracts were cultured in a concentration-treated medium for 24 to 48 hours. Then, the medium was removed again and washed twice with PBS. To 10 mL of RIPA buffer, add 100 μL of complete mini 1 tab, and centrifuge at 4 ° C and 12,000 rpm for 20 minutes. The supernatant obtained by centrifugation was quantitated by Bradford assay, and 30 μL of protein was transferred to a PVDF membrane using semi-dry transfer cell equipment (Hofer, USA) and incubated in a blocking buffer (5% skim milk in TBST) lt; / RTI > The primary antibody was diluted and incubated at 4 ° C overnight. The antibody was further washed with TBST three times at 10-minute intervals. The secondary antibody was diluted 1: 1000 and incubated at room temperature for 2 hours. After washing three times, bands were identified and quantified using a LAS 4000 instrument.

실험예Experimental Example 14-1 : 총  14-1: Total RNARNA 분리 및  Separation and cDNAcDNA 합성 synthesis

세포를 100 mm dish에 cell seeding한 뒤 24시간 동안 배양한 후 추출물을 농도별로 처리하여 24~48시간 동안 배양하였다. 배지 상등액을 제거한 후 trizol lysis buffer를 각 well에 1 mL씩 분주하여 세포를 lysis 한 후 70℃에 보관하였다. 보관된 시료를 실온에서 녹인 후 chloroform 200 uL를 분주하여 20초간 inverting하였다. 그 후 4℃ 13,200 g에서 2분간 원심 분리하여 상층액을 isopropanol 500 uL이 들어 있는 tube에 옮겨 섞었다. 다시 4℃ 13,200 g에서 15분간 원심 분리하였고, 그 상층액을 제거 한 후 75% EtOH DEPC water를 각 tube에 1 mL씩 분주하여 4℃ 13,200 g에서 5분간 원심 분리한 뒤 상층액을 제거한 후 실온에서 건조 시켰다. Diethyl pyrocarbonate (DEPC)를 20~40 uL씩 분주하여 녹인 후 각각 흡광도를 측정하여 total RNA양을 측정하였다. Oligo (dT) 15 primer (500 ug/mL) 1 uL, dNTP mix (10 mM) 1 uL, 추출한 RNA (2 ug)와 RNase free water로 11 uL를 맞추고 75℃에서 5분간 반응시킨 후 5 reaction buffer, MgCl2, dNTP, Recombinant rnasin, Reverse transcriptase을 첨가하여 25℃ 5분, 42℃ 60분, 70℃ 15분간 반응시켜 cDNA를 합성시켰다.
Cells were seeded in 100 mm dish and incubated for 24 hours. The extracts were treated at different concentrations for 24-48 hours. After removing the supernatant from the medium, trizol lysis buffer was added to each well at a rate of 1 mL, and cells were lysed and stored at 70 ° C. The stored samples were dissolved at room temperature, and then 200 μL of chloroform was added and inverted for 20 seconds. Then, centrifugation was carried out at 13,200 g at 4 ° C for 2 minutes, and the supernatant was transferred to a tube containing 500 μL of isopropanol. After centrifugation at 13,200 g for 15 minutes at 4 ° C, the supernatant was removed and 75% EtOH DEPC water was added to each tube in an amount of 1 mL. After centrifugation at 13,200 g for 5 minutes at 4 ° C, the supernatant was removed, Lt; / RTI > Diethyl pyrocarbonate (DEPC) was dissolved in 20 ~ 40 uL aliquots and the absorbance was measured. 1 uL of Oligo (dT) 15 primer (500 μg / mL), 1 μL of dNTP mix (10 mM) and 11 μL of extracted RNA (2 μg) with RNase free water. , MgCl 2 , dNTP, Recombinant rnasin and Reverse transcriptase were added, and cDNA was synthesized by reacting at 25 ° C for 5 minutes, 42 ° C for 60 minutes, and 70 ° C for 15 minutes.

실험예Experimental Example 14-2 :  14-2: ReverseReverse transcriptiontranscription -- polymerase중합체 (( PCRPCR )을 통한 )through mRNAmRNA 발현 측정Expression measurement

MMP-1의 mRNA 발현을 알아보기 위하여 polymerase chain reaction (PCR)을 실시하였다. 실험에 사용한 primer sequences는 도 24와 같다. PCR tube에 Go Flexi DNA Polymerase, primer, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다. MMP-1은 94℃ 30초, 56℃ 60초, 72℃ 1분 (35 cycles)를 하였다. PCR로 합성 시킨 후 0.002% ethidium bromide가 첨가한 1.5% agarose gel에 100V에서 40분간 전기영동 후 LAS 4,000을 이용하여 밴드를 확인하여 분석 정량하였다.
MMP-1 mRNA expression was assessed by polymerase chain reaction (PCR). The primer sequences used in the experiment are shown in Fig. Go Flexi DNA Polymerase, primer, and synthesized cDNA were added to the PCR tube and mixed well. MMP-1 was performed at 94 ° C for 30 seconds, at 56 ° C for 60 seconds, and at 72 ° C for 1 minute (35 cycles). After PCR, the cells were electrophoresed in 1.5% agarose gel containing 0.002% ethidium bromide for 40 min at 100V.

생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질(Extracellular matrix, ECM)의 합성과 분해는 적절하게 조절되지만 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하여 자외선 조사에 의해 다양한 기질 단백질 분해 효소(matrix metalloproteinase, MMPs)가 피부의 fibroblast, keratinocyte 등에서 분비되어 세포 외 기질과 basement membrane을 구성하는 대부분의 성분을 분해함으로써 피부 탄력을 유지하는 결합조직이 파괴되어 주름과 탄력저하, 피부 처짐의 원인이 된다. 피부의 광노화에 있어 중요한 역할을 담당하고 있는 MMP-1의 발현은 UVA에 의해 세포에서 JNK/p38 활성도가 증가하고 전사인자인 activator protein-1 (AP-1)의 활성도가 증가되는 신호전달경로를 통해 MMP-1 발현을 증가시켜 피부에서 교원질의 결핍을 초래한다고 알려져 있다. Although the synthesis and degradation of extracellular matrix (ECM) such as collagen in vivo is moderately controlled, the synthesis of the extracellular matrix (ECM) is regulated as aging progresses, and matrix metalloproteinases (MMPs) Of fibroblast, keratinocyte, etc., decomposing most components constituting the extracellular matrix and basement membrane, the connective tissue that maintains skin elasticity is destroyed, which causes wrinkles, elasticity decrease and skin sagging. The expression of MMP-1, which plays an important role in the photoaging of skin, increases the activity of JNK / p38 in the cell by UVA and increases the activity of activator protein-1 (AP-1) Lt; RTI ID = 0.0 > of MMP-1 < / RTI >

본 발명에서는 주름과 관계되어진 MMP-1의 단백질 발현을 측정해 본 결과, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물의 MMP-1의 단백질 발현은 50 ug/mL의 농도에서 35%의 저해율을 나타내었고, MMP-1의 mRNA 발현을 측정해 본 결과, 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물은 50 ug/mL의 농도에서 39%의 저해효과를 나타내었다. 이와 같은 결과로 노간주나무의 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물은 광노화에 의한 주름생성 억제 활성을 보이는 것으로 판단된다(도 26 참조).
In the present invention, the protein expression of MMP-1 related to wrinkles was measured. As a result, the expression of MMP-1 protein in the stem and root ethanol extracts of juniper was 35% at a concentration of 50 ug / mL, The mRNA expression of MMP-1 was measured, and the stem and root ethanol extracts of juniper had a inhibitory effect of 39% at a concentration of 50 ug / mL. As a result, the stem and root ethanol extracts of Juniperus japonica seem to exhibit anti-wrinkle activity by photoaging (see FIG. 26).

한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to preferred embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed embodiments, but, on the contrary, It will be apparent to those skilled in the art that changes may be made.

Claims (9)

노간주나무(Juniperus rigida Sieb.)의 줄기 및 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물.
A cosmetic composition for whitening comprising a stem and root extract of Juniperus rigida Sieb. As an active ingredient.
제1항에 있어서,
상기 노간주나무의 줄기 및 뿌리 추출물은 1.0 ~ 50 ppm 범위 내의 농도를 가지는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the stem and root extracts of Junjoo have a concentration in the range of 1.0 to 50 ppm.
제1항에 있어서,
전자공여능 및 SOD(Superoxide radical dismutase)활성을 가지는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
The method according to claim 1,
An electron donating ability and a superoxide radical dismutase (SOD) activity.
제1항에 있어서,
티로시나아제(tyrosinase) 발현억제효능을 가지는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the composition has an inhibitory effect on expression of tyrosinase.
제1항에 있어서,
콜라게나아제(Collagenase) 저해활성을 가지는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the composition has a collagenase inhibitory activity.
제1항에 있어서,
엘라스타아제(elastase) 저해활성을 가지는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
The method according to claim 1,
A cosmetic composition for skin whitening characterized by having an elastase inhibitory activity.
노간주열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물.
A cosmetic composition for whitening comprising a juniper fruit extract as an active ingredient.
제7항에 있어서,
노간주나무의 줄기 및 뿌리 추출물보다 높은 티로시나아제(tyrosinase) 발현억제효능을 가지는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
8. The method of claim 7,
Wherein the composition has an inhibitory effect on expression of tyrosinase higher than that of stem and root extract of Juniperia.
제7항에 있어서,
노간주나무의 줄기 및 뿌리 추출물보다 높은 엘라스타아제(elastase) 저해활성을 가지는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
8. The method of claim 7,
Wherein the composition has a higher elastase inhibitory activity than the stem and root extracts of Juniperia.
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