KR101388776B1 - 2，3―비스［（2―하이드록시에틸）티오］―1，4―나프토퀴논을 포함하는 항염증용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학적 조성물, 식품 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 염증관련 인자인 TNF-α, PGE2, NO의 생성을 전사 단계에서부터 근본적으로 감소시켜 우수한 소염 효과를 가진다. 또한 고농도로 처리한 경우에도 세포독성을 보이지 않아서 의약품 , 식품 및 화장료에 안전하게 적용할 수 있다. 따라서 항염증제로서 중요하게 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물에 관한 것이다.
염증반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전이다. 염증반응은 외부 자극으로부터 우리 몸을 보호하는 정상적인 방어기전이나, 그 정도가 심하거나 만성적인 경우 암, 혈관 장애 및 당뇨와 같은 다양한 심각한 질병을 유발할 수 있다.
최근 연구 결과에 따르면, 염증 반응에서의 조직-관련 대식세포의 기능적 중요성이 점점 강조되고 있다. 대식세포는 만성적으로 염증이 일어난 조직에 침입하여 다양한 염증 분자를 공격적으로 조절하고 염증 내 조직 손상을 촉진시킨다고 보고되어 있다(Ohno S, Inagawa H, Dhar DK, Fujii T, Ueda S, Tachibana M, et al. Role of tumor-associated macrophages (TAM) in advanced gastric carcinoma: the impact on FasL-mediated counterattack. Anticancer Res 2005;25:463-70.). 따라서, 대식세포 조절 역할을 하는 화합물이 항염증제로서의 가능성이 있다고 생각해 볼 수 있다.
현재까지는 브라디키닌 길항제, COX 억제제 등의 기전으로 작용하는 스테로이드성 소염제 또는 비스테로이드성 소염제(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)가 많이 사용되어 왔다. 그러나 스테로이드성 소염제를 장기간 사용하면 내성 및 자성의 웅성화 현상 등 심각한 부작용이 발생하며, 비스테로이드성 항염증제를 장기간 복용하게 되면 위장관계의 소화성 궤양출혈로 인한 이차적 빈혈 초래, 혈소판 기능 억제, 분만 유도 억제, 신장에 대한 부작용, 간장 손상, 과민 반응 등의 심각한 부작용을 초래한다. 따라서, 이러한 약물의 부작용을 극복하기 위하여 인체에 부작용이 적고 항염증 효과가 우수한 치료제의 개발에 대한 필요성이 절실히 요구되고 있다.
2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone은 이중특이성(dual specificity)이 특징인 quinone 기반의 화합물로서, CDC25 phosphatase에 대해 선택적 억제 작용을 함으로써 항암효과를 가진 것으로 알려진 화합물이다. 본 발명자들은 부작용이 적고 소염효과가 우수한 항염증제에 대해 연구하던 중 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 강력한 소염효과를 가지면서도 세포독성이 거의 없는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 종래 항염증 제제들의 한계를 극복하기 위해 안출된 것으로, 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone 또는 그 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 식품 조성물 및 화장료 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone 또는 그 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 식품 조성물 및 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone은 일산화질소(NO), TNF-α(tumor necrosis factor-α) 또는 PGE2(prostaglandin E2)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로서 상기 염증질환은 피부염, 알레르기, 위궤양, 십이지장궤양, 간염, 식도염, 위염, 장염, 췌장염, 대장염, 신장염, 위암, 전신부종, 국소부종 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 그러나 염증의 종류는 이제 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일 예로 1일 유효성분을 기준으로 하였을 때 0.1 mg/kg(체중)내지 500 mg/kg(체중), 0.1 mg/kg(체중) 내지 400 mg/kg(체중) 또는 1 mg/kg(체중)내지 300 mg/kg(체중)으로 투여할 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 염증의 예방 및 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다.
본 발명의 조성물은 염증의 예방 및 개선을 목적으로 화장료에 첨가될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 기초 화장료, 메이크업 화장료, 바디 화장료, 두발용 화장료, 두피용 화장료, 면도용 화장료 또는 구강용 화장료의 용도로 제공될 수 있다. 상기 유효성분은 상기 화장료 조성물 총 중량을 기준으로 0.001 내지 50 중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하기로는 0.01 내지 20 중량%일 수 있으나, 상기 함량은 제형 또는 화장료 조성물에 함유되는 유효성분외의 성분의 함량에 따라 적절히 조절할 수 있으며, 상기 함량에 의해 본 발명에 포함되는 유효성분의 함량이 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학적 조성물, 식품 조성물 및 화장료 조성물은 염증관련 인자인 TNF-α, PGE2, NO의 생산을 전사 단계에서부터 근본적으로 감소시켜 우수한 소염 효과를 가진다. 또한 고농도로 처리한 경우에도 세포독성을 보이지 않아서 의약품, 식품 및 화장료에 안전하게 적용할 수 있다. 따라서 항염증제로서 중요하게 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone(시판 코드번호 NSC95397)이 LPS를 처리한 RAW264.7 세포내에서 일산화질소(NO) 생성에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 2는 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 LPS를 처리한 RAW264.7 세포 내에서 TNF-a 생성에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 3은 TNF-a 생성억제효과에 있어서, 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone과 공지의 약물인 pentoxyfylline , prednisolone 및 genistein을 비교한 도이다.
도 4는 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 LPS를 처리한 RAW264.7 세포내에서 PGE2 생성에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 5는 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 세포 생존률에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 6은 LPS를 처리한 RAW264.7 세포에서 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 NO와 PGE2의 생산에 관여하는 효소(iNOS, COX-2) 및 TNF-α의 mRNA에 미치는 영향을 real-time PCR법을 이용하여 정량하고, 대조군에 대한 백분율로 나타낸 도이다. 도 6a는 iNOS, 도 6b는 COX-2, 도 6c는 TNF-α에 대한 것이다.
도 7은 LPS를 처리한 RAW264.7 세포에서 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 염증유전자(iNOS, COX-2)의 mRNA 발현에 미치는 영향을 RT-PCR을 이용하여 정량한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 LPS를 처리한 RAW264.7 세포의 핵 내의 전사인자인 p65, c-fos 및 c-jun 에 미치는 영향을 면역블롯팅으로 확인한 도이다.
도 9는 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 p38, JNK, ERK의 인산화에 미치는 영향을 면역블롯팅으로 확인한 도이다.
도 10는 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 AP-1의 루시퍼라제 활성에 미치는 영향을 나타낸 도이다. 도 10a는 PMA의 유무 하에서 확인한 것이고, 도 10b는 TRIF의 유무 하에서 확인한 것이며, 도 10c는 MyD88의 유무 하에서 확인한 것이다.
도 11은 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 PDK1, src, syk의 인산화에 미치는 영향을 면역블롯팅으로 확인한 도이다.
도 12는 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 NF-κB의 루시퍼라제 활성에 미치는 영향을 나타낸 도이다. 도 12a는 PMA의 유무 하에서 확인한 것이고, 도 12b는 TRIF의 유무 하에서 확인한 것이며, 도 12c는 MyD88의 유무 하에서 확인한 것이다.
도 13은 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 IκBα 인산화에 미치는 영향을 면역블롯팅으로 확인한 도이다.
도 14는 위염을 유발시킨 마우스에서 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone을 투여한 후 위를 적출하여 미란성 점막 부식 병소를 관찰한 사진이다.
도 15는 위염을 유발시킨 마우스에서 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone과 ranitidine을 각각 투여한 후 위를 적출하여 미란성 점막 부식 병소 넓이(㎟)를 픽셀-계수기로 측정하여 비교한 도이다.
도 2는 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 LPS를 처리한 RAW264.7 세포 내에서 TNF-a 생성에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 3은 TNF-a 생성억제효과에 있어서, 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone과 공지의 약물인 pentoxyfylline , prednisolone 및 genistein을 비교한 도이다.
도 4는 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 LPS를 처리한 RAW264.7 세포내에서 PGE2 생성에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 5는 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 세포 생존률에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 6은 LPS를 처리한 RAW264.7 세포에서 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 NO와 PGE2의 생산에 관여하는 효소(iNOS, COX-2) 및 TNF-α의 mRNA에 미치는 영향을 real-time PCR법을 이용하여 정량하고, 대조군에 대한 백분율로 나타낸 도이다. 도 6a는 iNOS, 도 6b는 COX-2, 도 6c는 TNF-α에 대한 것이다.
도 7은 LPS를 처리한 RAW264.7 세포에서 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 염증유전자(iNOS, COX-2)의 mRNA 발현에 미치는 영향을 RT-PCR을 이용하여 정량한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 LPS를 처리한 RAW264.7 세포의 핵 내의 전사인자인 p65, c-fos 및 c-jun 에 미치는 영향을 면역블롯팅으로 확인한 도이다.
도 9는 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 p38, JNK, ERK의 인산화에 미치는 영향을 면역블롯팅으로 확인한 도이다.
도 10는 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 AP-1의 루시퍼라제 활성에 미치는 영향을 나타낸 도이다. 도 10a는 PMA의 유무 하에서 확인한 것이고, 도 10b는 TRIF의 유무 하에서 확인한 것이며, 도 10c는 MyD88의 유무 하에서 확인한 것이다.
도 11은 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 PDK1, src, syk의 인산화에 미치는 영향을 면역블롯팅으로 확인한 도이다.
도 12는 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 NF-κB의 루시퍼라제 활성에 미치는 영향을 나타낸 도이다. 도 12a는 PMA의 유무 하에서 확인한 것이고, 도 12b는 TRIF의 유무 하에서 확인한 것이며, 도 12c는 MyD88의 유무 하에서 확인한 것이다.
도 13은 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 IκBα 인산화에 미치는 영향을 면역블롯팅으로 확인한 도이다.
도 14는 위염을 유발시킨 마우스에서 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone을 투여한 후 위를 적출하여 미란성 점막 부식 병소를 관찰한 사진이다.
도 15는 위염을 유발시킨 마우스에서 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone과 ranitidine을 각각 투여한 후 위를 적출하여 미란성 점막 부식 병소 넓이(㎟)를 픽셀-계수기로 측정하여 비교한 도이다.
2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone의 구조식은 하기 화학식 1과 같다.
[화학식 1]
본 발명자들은 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 염증과 관련된 다양한 인자들에 미치는 영향을 전사 및 활성 단계에서 분석하여 항염효과를 확인하였다. RAW 264.7 세포에 LPS를 처리하여 염증관련 단백질들의 생산을 증가시킨 후 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone의 영향을 확인하였다. LPS(lipopolysaccharide)는 그람 음성균의 세포벽 구성성분으로서 내독소로 작용하고, 대식세포를 활성화시키는 물질이다.
실시예 1은 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 NO 생산에 미치는 영향을 확인한 것이다.
NO는 혈관을 확장시키는 역할을 하는 대표적인 염증에 관련된 인자 중 하나이다. 대식세포가 자극을 받으면 iNOS(inducible nitric oxide synthase)라는 효소에 의해 L-알기닌이 L-시트룰린으로 변하는 과정에서 일산화질소(NO)가 생성됨으로써 대식세포로부터 NO가 생성된다.
실시예 2는 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 TNF-α에 미치는 영향을 확인한 것이다.
TNF-α는 대식세포 및 T 림프구에 의해 생산되는 사이토카인으로서, COX 활성 증가, 섬유아세포 증식 유도, 급성상(acute phase) 단백질 생산 증가, MHC 분자 발현 증가 등의 작용을 매개한다. 낮은 농도에서는 적절한 지혈 및 방어 기능을 하지만, 높은 농도에서는 IL-1 등의 사이토카인과 공조하여 염증반응을 악화시켜 쇼크현상 등을 일으킨다.
도 3에서 효과를 비교하는데 사용된 물질인 pentoxyfylline, prednisolone, genistein은 각각 순환장애치료제, 스테로이드성 소염제, 항산화제로서, 모두 TNF-α의 분비를 감소시키는 효과가 있는 물질이다.
실시예 3은 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 PGE2에 미치는 영향을 확인한 것이다.
프로스타글란딘 E2(PGE2)는 포스포리파제 A2(phospholipase A2)의해 유리된 아라키돈산이 COXs(cyclooxygenaes)라고 불리우는 효소의 촉매작용을 받아 형성되는 물질이다. PGE2는 통증, 발열 등의 염증반응, 면역반응, 그리고 혈관생성(angiogenesis)을 촉진하는 등 암 발생에도 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다.
실시예 4는 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 세포생존률에 미치는 영향을 확인한 것이다.
실시예 5는 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 염증관련 인자들의 생성에 미치는 영향을 전사 단계에서 확인한 것으로서, NO 생성을 촉매하는 iNOS, PGE2 생성을 촉매하는 COX-2, TNF-α의 mRNA 수치를 측정한 것이다.
실시예 6은 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 AP-1에 미치는 영향을 확인한 것이다.
AP-1(Activating protein-1)은 여러 가지 유전자의 발현에 중요한 역할을 하는 전사조절인자이다. 특히 AP-1은 염증관련 인자들의 발현에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. AP-1의 발현은 c-fos 단백질과 c-jun 단백질이 이룬 dimer에 의해 상향조절된다.
c-fos, c-jun의 인산화로 인한 핵내이동은 신호전달에서 더 상류의 효소인 p38, JNK, ERK에 의해 조절된다. p38은 세포내 신호전달을 담당하는 MAP kinase 슈퍼패밀리에 속하며, serine/threonine kinase의 일종이다. JNK(C-Jun N-terminal kinase)는 사이토카인 등에 반응하여 c-Jun을 인산화시키는 효소이다. ERK(Extracellular signal-regulated kinases) 는 세포외 신호를 세포 내로 전달하는 데 관여하는 인산화 효소이다.
이 실험에서는 AP-1의 발현을 유도하기 위해 PMA, TRIF, MyD88을 공형질감염(co-transfection)시켰다. TRIF(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β)는 항원의 침입을 감지하는 수용체(receptor)인 TLR에 의한 신호전달이 일어나도록 하는 어댑터 분자이다. MyD88(Myeloid differentiation primary response gene 88)은 NF-κB의 활성을 억제하는 단백질인 IκB의 활성을 억제할 수 있어 NF-κB의 활성을 높이는 작용을 한다.
실시예 7은 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 NF-kB에 미치는 영향을 확인한 것이다.
NF-kB(nuclear factor-kappa B)도 염증관련 유전자들의 발현을 조절하는 중요한 전사조절인자이다. iNOS와 TNF-α, COX-2 유전자들의 프로모터에는 공통적으로 NF-kB가 결합하는 부분이 있어서, NF-kB의 활성화에 의해 이들 유전자의 발현이 조절된다. NF-kB의 가장 일반적인 형태는 p50과 p65가 이룬 heterodimer이다. NF-kB의 활성은 IkB에 의해 조절되는데, IkB는 NF-kB를 불활성화시키는 역할을 한다. IkB는 인산화를 거쳐 활성화된다.
p65의 핵내이동은 신호전달에서 더 상류의 효소인 PDK1, src, syk에 의해 조절된다. PDK1(3-phosphoinositide dependent protein kinase-1)은 AKT/PKB, PKC 등 다수의 kinase를 활성화시키는 master kinase이며 세포 내 신호전달에서 중요한 역할을 하는 효소이다. src는 tyrosine-protein kinase으로서 원암유전자로 작용한다. Syk는 세포 표면의 수용체로부터 신호를 전달하는 역할을 담당한다.
이 실험에서는 NF-kB의 발현을 유도하기 위해 PMA, TRIF, MyD88을 공형질감염(co-transfection)시켰다.
실시예 8은 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 위염을 유발시킨 마우스에 미치는 영향을 확인한 것이다. 비교군에 사용한 약물인 ranitidine은 H2 blocker로서 작용하여 위염치료제로 사용되는 약물이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : RAW264.7 세포내에서 NO의 생성 측정
1-1. 세포배양
쥐의 대식세포 세포주(RAW264.7 세포)를 100 U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신과 10% FBS로 보충된 RPMI1640 배지 내에서 유지시켰다. 세포는 37℃, 5% CO2 습한 공기에서 배양하였다.
1-2.
RAW264
.7 세포 내에서 2,3-Bis[(2-
hydroxyethyl
)
thio
]-1,4-
naphthoquinone
의 일산화질소(
NO
)의 생성 억제 효과
RAW264.7 세포(1×106 cells/㎖) 를 18시간 동안 전배양시킨 후, 전배양된 세포를 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone(0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80μM)으로 30분 동안 처리한 다음, LPS(1㎍/㎖)와 함께 24시간 동안 더 배양하였다. 상등액을 모으고, 상등액 내 일산화질소(NO)의 농도를 Griess 시약으로 측정하였다.
결과는 도 1에 나타내었다. NO 생성 억제 효과는 아무런 시료를 첨가하지 않은 대조군(control)에 대한 백분율로 표시하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone은 LPS 처리에 의해 증가된 NO 생성을 억제하였고, 15 uM 처리한 경우 아무 처리도 하지 않은 대조군과 비교하여 약 20% 정도의 NO 생성량이 감소되었으며, 농도 의존적으로 계속하여 NO 함량이 감소하여, 40 uM를 처리한 경우 90% 이상 감소한 것을 확인 하였다.
실시예 2. RAW264.7 세포내에서 TNF-α의 생성 측정 및 비교 실험
2-1.
RAW264
.7 세포 내에서 2,3-Bis[(2-
hydroxyethyl
)
thio
]-1,4-
naphthoquinone
의
TNF
-α의 생성 억제 효과
RAW264.7 세포(1×106 cells/㎖) 를 18시간 동안 전배양시킨 후, 전배양된 세포를 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone(0, 5, 10, 20, 40μM)으로 30분 동안 처리한 다음, LPS(1㎍/㎖)와 함께 24시간 동안 더 배양하였다. 상등액을 모으고, 상등액 내 TNF-α의 농도를 ELISA kit로 측정하였다. 결과는 도 2에 나타내었다. TNF-α 생성 억제 효과는 아무런 시료를 첨가하지 않은 대조군(control)에 대한 백분율로 표시하였다.
상기 도 2에 나타낸 바와 같이, 5 μM을 처리한 경우 TNF-α의 함량이 50% 가까이 감소하였고, 20 μM을 처리한 경우 80% 가까이 감소하는 것이 확인되었다.
2-2. 다른 약물과의 비교 실험
2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone의 TNF-α 생성 억제를 pentoxifylline, prednisolone 및 genistein과 비교하였다.
RAW264.7 세포(1×106 cells/㎖) 를 18시간 동안 전배양시킨 후, 전배양된 세포를 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone, pentoxifylline, prednisolone 및 genistein 으로 30분 동안 처리한 다음, LPS(1㎍/㎖)와 함께 24시간 동안 더 배양하였다. 상등액을 모으고, 상등액 내 TNF-α의 농도를 ELISA kit로 측정하였다. 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone의 TNF-α 생성에 대한 IC50 value는 8.4μM이었고, pentoxifylline, prednisolone, genistein의 경우 IC50은 각각 430, 42, 43으로 나타나, 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone의 TNF-α 생성 억제효과가 우수함이 확인되었다.
실시예 3. RAW264.7 세포내에서 프로스타글란틴 E
2
(PGE
2
)의 생성 억제 효과
RAW264.7 세포(1×106 cells/㎖) 를 18시간 동안 전배양시킨 후, 전배양된 세포를 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone(0, 5, 10, 20, 40μM)으로 30분 동안 처리한 다음, LPS(1㎍/㎖)와 함께 24시간 동안 더 배양하였다. 상등액을 모으고, 상등액 내 PGE2의 농도를 EIA 키트로 측정하였다.
결과는 도 4에 나타내었다. PGE2 생성 억제 효과는 아무런 시료를 첨가하지 않은 대조군(control)에 대한 백분율로 표시하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, LPS를 처리한 RAW264.7 세포 내에서 농도가 증가할수록 PGE2의 생성이 억제되었다.
실시예
4.
RAW264
.7 세포에서의 세포 독성 측정
RAW264.7 세포(1×106 cells/㎖) 를 18시간 동안 전배양시킨 후, 세포 부유액에 상기 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone(10, 20, 30, 60μM)를 가하고, 24시간 동안 배양하였다. 그 다음 세포독성 효과를 일반적인 MTT 어세이로 측정하였다. 즉, 배양 종료 3시간 전에 10㎖의 MTT 용액(인산염 완충액 중 10㎎/㎖, pH 7.4)을 가하고 분석 종료까지 세포를 계속 배양하였다. 15% SDS(sodium dodecyl sulphate)를 각 웰에 가하고 포마잔을 녹여 배양을 중지시킨 후, Spectramax 250 마이크로플레이트 리더를 사용하여 570~630㎚(OD570 -630)에서 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 5에 나타내었다. 세포의 생존율은 아무런 시료를 첨가하지 않은 대조군(control)에 대한 백분율로 표시하였다.
도 5에 나타난 바와 같이 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone을 처리한 경우에도 LPS를 처리한 RAW264.7 세포 생존률의 감소가 거의 나타나지 않아 세포독성이 없음을 확인하였다.
실시예
5 : 2,3-Bis[(2-
hydroxyethyl
)
thio
]-1,4-
naphthoquinone
이 염증관련 사이토카인의
mRNA
에 미치는 영향
2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone의 일산화질소(NO), PGE2의 생성 억제가 전사 수준에서 일어나는지 확인하기 위하여, 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 LPS를 처리한 RAW264.7 세포에서 iNOS 및 COX-2의 mRNA 양에 미치는 영향을 관찰하였다. 또한 TNF-α의 mRNA 양을 측정하였다.
먼저 RAW264.7 세포(5×106 cells/㎖)에 LPS(1㎍/㎖)를 처리하거나 또는 처리하지 않고 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone과 함께 6시간 동안 배양하였다. 그 다음, 제조사의 지시에 따라 TRIzol 시약 (Gibco BRL)으로 LPS-처리한 RAW264.7 세포로부터 총 RNA를 분리하고 사용 전까지 -70℃에 보관하였다. mRNA의 정량분석은 제조사(타카라, 일본)의 지시에 따라 실시간 열순환기 (Bio-Rad, USA)를 사용하여 SYBR Premix Ex Taq와 함께 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real-time RT-PCR)을 수행하였다. 결과는 GAPDH와 비교하여 상대적인 최적 밀도 비율로 나타내었다. 사용된 프라이머는 바이오니아(대전, 한국)로부터 얻었으며, 하기 표 1에 나타내었다. 결과는 도 6 및 도 7에 나타내었다.
| 프라이머 | 서열(5' -> 3') | |
| iNOS | 정방향 | GGA GCC TTT AGA CCT CAA CAG A |
| 역방향 | TGA ACG AGG AGG GTG GTG | |
| TNF-a | 정방향 | TGC CTA TGT CTC AGC CTC TTC |
| 역방향 | GAG GCC ATT TGG GAA CTT CT | |
| COX-2 | 정방향 | CACTACATCCTGACCCACTT |
| 역방향 | ATGCTCCTGCTTGAGTATGT | |
| GAPDH | 정방향 | CAA TGA ATA CGG CTA CAG CAA C |
| 역방향 | AGG GAG ATG CTC AGT GTT GG |
도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone의 농도가 증가할수록 iNOS, TNF-α 및 COX-2의 mRNA 발현 정도가 현저히 감소되었다. 이러한 결과에 의해, 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone에 의한 일산화질소(NO) 및 PGE2의 생성 억제가 전사 수준에서 일어난다는 것을 알 수 있었다.
실시예
6. 2,3-Bis[(2-
hydroxyethyl
)
thio
]-1,4-
naphthoquinone
이
AP
-1에 미치는 영향
6-1. 2,3-Bis[(2-
hydroxyethyl
)
thio
]-1,4-
naphthoquinone
이
AP
-1의 전사인자에 미치는 효과
먼저 RAW264.7 세포(5×106 cells/㎖)에 LPS(1㎍/㎖)를 처리하거나 또는 처리하지 않고 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone을 처리하고 페놀을 처리하여 6시간 동안 배양하였다. RAW264.7 세포의 세포 분획 및 핵 추출물(nuclear extracts)은 Byeon, et al(Archives of Pharmacal Research 32, 1565-1572(2009))에 기재된 바에 따라 수득하였다. Lee et al(British Journal of Pharmacology 154, 852-863(2008))에 기재된 바에 따라 c-Jun 및 c-Fos의 핵내 함량을 확인하기 위해 면역블롯팅 분석(immunoblot analysis)을 수행하였다. 상기 관찰한 결과를 도 8에 에 나타내었다. 도 8에서 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone을 처리한 경우, 특히 15분동안 처리했을 때보다 60분 동안 처리한 경우 유의적인 함량의 감소를 보임을 알 수 있다.
6-2. 2,3-Bis[(2-
hydroxyethyl
)
thio
]-1,4-
naphthoquinone
이
AP
-1의
핵내이동에
미치는 효과
RAW264.7 세포(5×106 cells/㎖)에 LPS(1㎍/㎖)를 처리하거나 또는 처리하지 않고 표시된 시간 동안 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone과 함께 6시간 동안 배양하였다. 그 다음, 세포 용해물을 상기 실시예 6-1에 기재되어 있는 방법으로 준비하고, p38, JNK, ERK 및 인산화된 p38, JNK, ERK의 함량을 면역블롯팅으로 확인하였다.
결과는 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타난 바와 같이, 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone은 세포핵 내 p38, JNK, ERK의 인산화 반응을 현저히 억제시킴을 확인하였다.
6-3.
NSC95397
이
AP
-1의 활성에 미치는 영향
제조사의 프로토콜(Jin et al., 2009)에 따라 12-well plate에 PEI 방법을 이용하여 PMA, TRIF(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β), MyD88의 유무 하에 AP-1-Luc 각각을 포함하는 플라스미드 1㎍을 HEK293 (1×106cells/ml)세포에 주입(transfection)하고, 48시간 동안 배양한 후, 루시퍼라제 분석법(Luciferase assays)을 이용하여 AP-1 활성을 측정하였다. 상기 루시퍼라제 분석법은 상기 제조사의 프로토콜(Jung et al., 2009)에 보고된 루시퍼라제 분석 시스템(Promega C)에 따라 수행하였다.
결과는 도 10에 나타내었다. 도 10에는 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone을 처리한 경우 AP-1의 활성이 저해되어 AP-1의 활성화에 의해 유도되는 루시퍼라제 활성이 현저히 억제됨이 나타나 있다.
실시예
7. 2,3-Bis[(2-
hydroxyethyl
)
thio
]-1,4-
naphthoquinone
이
NF
-κB에 미치는 영향
7-1. 2,3-Bis[(2-
hydroxyethyl
)
thio
]-1,4-
naphthoquinone
이
NF
-κB의
subunit
에 미치는 영향
먼저 RAW264.7 세포(5×106 cells/㎖)에 LPS(1㎍/㎖)를 처리하거나 또는 처리하지 않고 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone을 처리하여 6시간 동안 배양하였다. RAW264.7 세포의 세포 분획 및 핵 추출물(nuclear extracts)은 Byeon, et al(Archives of Pharmacal Research 32, 1565-1572(2009))에 기재된 바에 따라 수득하였다. Lee et al(British Journal of Pharmacology 154, 852-863(2008))에 기재된 바에 따라 p65의 핵내 함량을 확인하기 위해 면역블롯팅 분석(immunoblot analysis)을 수행하였다. 상기 관찰한 결과를 도 8에 나타내었다.
7-2. 2,3-Bis[(2-
hydroxyethyl
)
thio
]-1,4-
naphthoquinone
이
NF
-κB의
핵내이동에
미치는 효과
RAW264.7 세포(5×106 cells/㎖)에 LPS(1㎍/㎖)를 처리하거나 또는 처리하지 않고 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone과 함께 6시간 동안 배양하였다. 그 다음, 세포 용해물을 상기 실시예 6-1에 기재되어 있는 방법으로 준비하고, PDK1, src, syk의 함량을 면역블롯팅으로 확인하였다.
결과는 도 11에 나타내었다. 도 11에 나타난 바와 같이, 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone은 세포핵 내 PDK1, src, syk의 인산화 반응을 현저히 억제시킴을 확인하였다.
7-3. 2,3-Bis[(2-
hydroxyethyl
)
thio
]-1,4-
naphthoquinone
이
NF
-κB의 활성에 미치는 영향
제조사의 프로토콜(Jin et al., 2009)에 따라 12-well plate에 PEI 방법을 이용하여 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone을 처리하고 PMA, TBK1, MyD88(Myeloid differentiation primary response gene 88)의 유무 하에 AP-1-Luc 각각을 포함하는 플라스미드 1㎍을 HEK293 (1×106cells/ml)세포에 주입(transfection)하고, 48시간 동안 배양한 후, 루시퍼라제 분석법(Luciferase assays)을 이용하여 AP-1 활성을 측정하였다. 상기 루시퍼라제 분석법은 상기 제조사의 프로토콜(Jung et al., 2009)에 보고된 루시퍼라제 분석 시스템(Promega C)에 따라 수행하였다.
결과는 도 12에 나타내었다. 도 12에는 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone을 처리한 경우 NF-κB의 활성이 저해되어 NF-κB의 활성화에 의해 유도되는 루시퍼라제 활성이 현저히 억제됨이 나타나 있다.
7-4. 2,3-Bis[(2-
hydroxyethyl
)
thio
]-1,4-
naphthoquinone
이 IκBα에 미치는 영향
RAW264.7 세포(5×106 cells/㎖)에 LPS(1㎍/㎖)를 처리하거나 또는 처리하지 않고 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone과 함께 6시간 동안 배양하였다. 그 다음, 세포 용해물을 준비하고, IκBα 및 인산화된 IκBα의 함량을 면역블롯팅으로 확인하였다.
결과는 도 13에 나타내었다. 도 13에서 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone이 IκBα를 인산화시켜 활성화시킴을 알 수 있다.
실시예
8 : 생체 내 염증 모델에서 2,3-Bis[(2-
hydroxyethyl
)
thio
]-1,4-
naphthoquinone
의 항염증 활성 확인
8-1. 위염 유발 및 2,3-Bis[(2-
hydroxyethyl
)
thio
]-1,4-
naphthoquinone
,
ranitidine
투여
공지된 방법에 따라 에탄올/염산으로 ICR 마우스의 위의 염증을 유발하였다 [Okabe S, Miyake H, Awane Y. Cytoprotective effects of NC-1300 and omeprazole on HClethanol-induced gastric lesions in rats. Jpn J Pharmacol 1986;42:123-33.]. 금식시킨 ICR 마우스 (7마리)에게 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone(10 및 30 ㎎/㎏) 또는 ranitidine (40 ㎎/㎏)을 3일 동안 경구 투여하였다. 30분 후, 150mM 염산 내 60% 에탄올 400㎕를 경구 투여하였다. 각각의 실험 동물을 마취시키고 괴사제 투여 1시간 후에 우레탄을 치사량 투여하여 희생시켰다.
8-2. 병소 부위 관찰
위를 절개한 후 조심스럽게 흐르는 수돗물로 헹구어내었다. 대만부를 따라 위를 열고 보드 위에 펼친 후, 미란성 점막 부식 병소의 넓이(㎟)를 픽셀-계수기를 이용하여 측정하였다. 또한, 점막 부식 병소의 사진을 찍어 육안으로 관찰하였다.
결과는 도 14 및 도 15에 나타내었다. 도 14 및 도 15에 나타난 바와 같이, 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone은 위염이 유발된 마우스에서 에탄올/염산에 의한 위 손상을 현저히 감소시켰다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
Claims (5)
- 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone 또는 그 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 일산화질소(Nitric Oxide, NO), TNF-α(Tumor necrosis factor-α) 또는 PGE2(prostaglandin E2)의 생성 억제를 통한 위염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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- 삭제
- 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone 또는 그 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 일산화질소(Nitric Oxide, NO), TNF-α(Tumor necrosis factor-α) 또는 PGE2(prostaglandin E2)의 생성 억제를 통한 위염의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 2,3-Bis[(2-hydroxyethyl)thio]-1,4-naphthoquinone 또는 그 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 일산화질소(Nitric Oxide, NO), TNF-α(Tumor necrosis factor-α) 또는 PGE2(prostaglandin E2)의 생성 억제를 통한 위염의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
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| KR1020120083743A KR101388776B1 (ko) | 2012-07-31 | 2012-07-31 | 2，3―비스［（2―하이드록시에틸）티오］―1，4―나프토퀴논을 포함하는 항염증용 조성물 |
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| KR101388776B1 true KR101388776B1 (ko) | 2014-04-23 |
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| KR (1) | KR101388776B1 (ko) |
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|---|---|---|---|---|
| US20090012107A1 (en) | 2007-01-15 | 2009-01-08 | Mohammad Javad Aman | Antiviral Compounds and Methods of Using Thereof |
| US20110257206A1 (en) | 2006-04-05 | 2011-10-20 | Gregory Burke | Combinations of Therapeutic Agents for Treating Cancer |
| WO2012018948A2 (en) | 2010-08-04 | 2012-02-09 | Pellficure Pharmaceuticals, Inc. | Novel treatment of prostate carcinoma |
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-
2012
- 2012-07-31 KR KR1020120083743A patent/KR101388776B1/ko not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
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