KR101365921B1 - 분석물질 분리장치 및 이를 이용한 분석물질 검출장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 분석물질과 수용체가 결합한 분석물질-수용체 복합체를 분석물질과 결합하지 않은 자유로운 수용체로부터 분리한 후 상기 분리된 분석물질-수용체 복합체를 바이오센서와 같은 검출기로 이동시켜 검출할 수 있는 분석물질 분리장치 및 이를 이용한 분석물질 검출장치에 관한 것이다.
상기 분석물질 분리장치는 제1 내지 제6 포트가 형성된 하우징의 내부에 선회 가능하게 배치되며 충전 위치와 주입 위치에 따라 상기 제1 내지 제6 포트 중 상호 인접하여 배치되는 2개의 포트를 선택적으로 연결하는 제1 내지 제3 유로가 내부에 형성되어 있는 밸브몸체를 구비한 6방향 밸브; 상기 제1 포트와 제4 포트 사이를 연결하는 시료 튜브; 및 상기 시료 튜브를 연결하기 전에 제1 포트 내부에 먼저 삽입되어 분석물질-수용체 복합체는 거르고 분석물질과 결합하지 않은 자유로운 수용체는 통과시키는 필터를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명을 이용할 경우 한 개의 센서 칩으로 여러 물질을 검출할 수 있는 효과가 있을 뿐만 아니라, 친화도가 낮은 수용체를 이용하여 높은 감도로 분석물질을 검출할 수 있고, 묽은 시료를 농축하여 검출할 수 있으며, 신호를 증폭시키는 것이 용이한 장점이 있다.

Description

분석물질 분리장치 및 이를 이용한 분석물질 검출장치{Apparatus for Separating Analytes and Apparatus for Detecting Analytes Using the Same}
본 발명은 분석물질 분리장치 및 이를 이용한 분석물질 검출장치에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 분석물질과 수용체가 결합한 분석물질-수용체 복합체를 분석물질과 결합하지 않은 자유로운 수용체로부터 분리한 후 상기 분리된 분석물질-수용체 복합체를 바이오센서와 같은 검출기로 이동시켜 검출할 수 있는 분석물질 분리장치 및 이를 이용한 분석물질 검출장치에 관한 것이다.
바이오센서는 신호발생장치(signal transducer)에 인식 물질(sensing material)로 작용하는 수용체(receptor)를 고정시킨 것으로 수용체와 분석물질(analyte) 사이의 특이적이고 강한 상호작용을 통해 분석물질을 매우 민감하게 검출할 수 있는 장점을 가지고 있다. 수용체란 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로서 대표적인 예로는 항체, 펩티드, DNA, 탄수화물 등을 들 수 있다. 이와 같은 바이오센서에서는 서로 다른 분석물질을 검출할 경우 각 분석물질에 대한 수용체를 고정시킨 서로 다른 센서 칩을 사용해야만 한다. 따라서 센서 칩의 개발에 많은 비용이 들고 사용이 번거로운 단점이 있다.
그리고 펩티드와 같이 친화도가 낮은 수용체를 직접 고정시킨 센서 칩을 이용하여 FIA(flow injection analysis) 방법으로 박테리아와 같은 입자 상태의 분석물질을 검출할 경우 흘러가는 시료에 포함된 박테리아가 센서 칩 표면의 수용체에 결합할 확률이 낮아지기 때문에 검출 감도가 낮아지는 단점도 있다. 또한 바이오센서에 주입할 수 있는 시료의 부피가 한정되어 있기 때문에 분석물질의 농도가 낮은 시료는 검출하기 어려운 문제점이 있다.
따라서 본 발명자는 이러한 문제를 해결하기 위하여 분석물질-수용체 복합체와 분석물질과 결합하지 않은 자유로운 수용체를 분리시키기 위한 3-방향 밸브를 한국 공개특허공보 제2011-54105호에 제안하였다.
상기 공개특허공보에 제안된 3-방향 밸브는 분석물질-수용체 복합체와 분석물질과 결합하지 않은 자유로운 수용체를 함유하는 시료가 공급되는 제 1 포트와, 분석물질과 결합하지 않은 자유로운 수용체를 배출하기 위한 제 2 포트와, 상기 분석물질-수용체 복합체를 바이오센서 칩으로 배출하는 제 3 포트를 구비하는 하우징; 상기 하우징 내에 회전 가능하게 설치되며, 제 1 및 제 2 입구와 연결되는 내부통로를 구비하고, 초기상태일 때 상기 제 1 및 제 2 입구가 상기 제 1 및 제 2 포트와 정합되고, 회전된 상태일 때 상기 제 1 및 제 2 입구가 제 3 및 제 1 포트와 정합되는 회전체; 및 상기 회전체의 제 1 입구와 제 2 입구 사이의 내부통로에 설치되어 상기 분석물질-수용체 복합체는 거르고 분석물질과 결합하지 않은 자유로운 수용체는 통과시키는 필터를 포함하고 있다.
상기 3-방향 밸브를 사용할 경우 분석물질과 수용체가 결합한 분석물질-수용체 복합체를 분석물질과 결합하지 않은 자유로운 수용체로부터 분리한 후 분석물질-수용체 복합체를 검출함으로써 분석물질을 직접 검출하는 것과 동일한 효과를 얻을 수 있다. 이와 같이 분석물질을 직접 검출하는 대신 분석물질-수용체 복합체를 검출할 경우 한 종류의 수용체를 고정시킨 한 종류의 센서 칩으로 여러 종류의 분석물질을 검출할 수 있다.
그러나, 상기 3-방향 밸브를 제품으로 실용화하고자 할 경우 새롭게 제작해야 하기 때문에 많은 비용이 소요되는 단점이 있다. 또한, 상기 3-방향 밸브는 회전체의 제 1 입구와 제 2 입구 사이의 내부통로에 필터가 설치되어 있어 새로운 분석물질을 검출하기 위해 새로운 필터로 교체할 때 밸브를 해체해야 하기 때문에 사용이 번거로운 단점이 있다.
한편, 한국 공개특허공보 제2007-97068호 및 제2011-50626호에는 한 쌍의 인젝션 밸브와 분리용 칼럼 등을 포함하는 액체 크로마토그래피 장치가 개시되어 있다. 상기 하나의 인젝션 밸브는 6개 노즐을 구비하고 스위칭에 따라 밸브 내부의 유로가 절환되는 전환밸브를 사용하고 있고, 다른 하나의 인젝션 밸브는 세정액용 펌프에 의해 세정액용 용기로부터 송출되는 세정액을 세정장치 또는 시료주입용 니들에 선택적으로 공급하도록 2개의 포트를 선택적으로 접속 가능한 3개의 포트를 구비하고 있다.
또한, 한국 공개특허공보 제2011-73533호에는 각각 6방향 밸브와 주입루프로 이루어진 2개의 유로전환 밸브와 칼럼을 포함하는 액체 크로마토그래피 장치가 제안되어 있다.
상기한 전환밸브 또는 방향밸브는 모두 6개의 포트(노즐)를 구비하고 스위칭에 따라 인접한 포트 사이를 연결하는 내부유로의 절환이 이루어지는 밸브이며, 이를 이용하면 다양한 시료 및 세정액을 공급하는 경로의 구성이 이루어질 수 있다.
상기한 6방향 밸브는 다수의 회사에 의해 상업적인 생산이 이루어지고 있어 쉽게 입수 가능하다.
상기한 6방향 밸브는 상용화되어 있어 저렴한 비용으로 구입할 수 있는 점을 이용하여 상기한 한국 공개특허공보 제2011-73533호, 공개특허공보 제2007-97068호 및 제2011-50626호에 제안된 것과 같은 복잡한 공정과 부품들을 구비하지 않고, 6방향 밸브에 필터를 조합함에 의해 한국 공개특허공보 제2011-54105호에 제안된 3-방향 밸브를 대체하여 간단하게 분석물질을 분리할 수 있는 분석물질 분리장치를 제안하는 것이 본 발명의 과제이다.
따라서 본 발명은, 상기와 같은 3-방향 밸브의 실용화를 용이하게 하기 위하여 안출된 것으로, 그 목적은 상용화되어 있는 6방향 밸브(6-directional valve)와 필터를 이용하여 분석물질과 수용체가 결합한 분석물질-수용체 복합체를 분석물질과 결합하지 않은 자유로운 수용체로부터 분리한 후 분리된 분석물질-수용체 복합체를 검출기로 이동시켜 분석물질을 간단하게 검출할 수 있는 분석물질 분리장치 및 이를 이용한 분석물질 검출장치를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 한 종류의 센서 칩을 이용하여 서로 다른 분석물질을 검출할 수 있어 경제성을 도모할 수 있는 분석물질 분리장치 및 이를 이용한 분석물질 검출장치를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 수용체에 각 종 표지를 붙임에 따라 다양한 검출방법을 사용할 수 있고, 신호의 증폭이 가능한 분석물질 분리장치 및 이를 이용한 분석물질 검출장치를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 친화도가 낮은 수용체를 이용하여 고감도로 분석물질을 검출할 수 있는 분석물질 분리장치 및 이를 이용한 분석물질 검출장치를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 농도가 낮은 시료의 경우에도 필터에서 농축하여 검출함에 의해 동일한 감도로 검출이 이루어질 수 있는 분석물질 분리장치 및 이를 이용한 분석물질 검출장치를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제1 내지 제6 포트가 형성된 하우징의 내부에 선회 가능하게 배치되며 충전 위치와 주입 위치에 따라 상기 제1 내지 제6 포트 중 상호 인접하여 배치되는 2개의 포트를 선택적으로 연결하는 제1 내지 제3 유로가 내부에 형성되어 있는 밸브몸체를 구비한 6방향 밸브; 상기 제1 포트와 제4 포트 사이를 연결하는 시료 튜브; 및 상기 시료 튜브를 연결하기 전에 제1 포트 내부에 먼저 삽입되어 분석물질-수용체 복합체는 거르고 분석물질과 결합하지 않은 자유로운 수용체는 통과시키는 필터를 포함하며, 상기 제2 포트는 시료가 주입되는 주입 포트이고, 상기 제3 포트는 충전 위치에서 제2 포트로 시료를 주입할 때 시료 튜브에 있던 용액과 시료 튜브를 채우고 남은 시료가 배출되는 배출 포트이며, 상기 제5 포트에는 완충용액을 공급하는 펌프가 연결되고, 제6 포트는 검출기에 연결되는 것을 특징으로 하는 분석물질 분리장치를 제공한다.
상기 필터는 PEEK(polyether ether ketone) 재질로 이루어진 프릿(frit)인 것이 바람직하다.
또한, 상기 6방향 밸브의 포트 바닥 면이 평평한 것이 바람직하다.
더욱이, 상기 검출기는 분광광도계(spectrophotometer), 형광광도계(fluorometer), 발광측정기(luminometer), 수정미소저울 바이오센서(QCM(quartz crystal microbalance) biosensor), 표면 플라스몬 공명기 바이오센서(SPR(Surface Plasmon Resonance) biosensor), 전기화학 바이오센서(electrochemical biosensor), 간섭계형 바이오센서(interferometric biosensor), 및 FET 바이오센서(field effect transistor biosensor) 중 하나를 사용할 수 있다.
상기 검출기는 분석물질-수용체 복합체의 수용체와 결합이 이루어지는 2차 수용체를 구비할 수 있다.
상기 충전 위치일 때 제1 포트와 제2 포트가 제1유로에 의해 연결되고, 제3 포트와 제4 포트가 제2유로에 의해 연결되며, 제5 포트와 제6 포트가 제3유로에 의해 연결되고, 상기 주입 위치일 때, 제2 포트와 제3 포트가 제1유로에 의해 연결되고, 제4 포트와 제5 포트가 제2유로에 의해 연결되며, 제6 포트와 제1 포트가 제3유로에 의해 연결된다.
또한, 본 발명의 분석물질 분리장치를 이용하여 분석물질을 분리할 때, 먼저 상기 6방향 밸브를 충전 위치로 설정한 후, 상기 분석물질을 함유하는 시료에 수용체를 넣어 상기 분석물질과 결합한 분석물질-수용체 복합체를 포함하는 시료를 제2 포트로 주입하여, 상기 필터에 의해 분석물질-수용체 복합체는 거르고 분석물질과 결합하지 않은 자유로운 수용체는 제3포트로 배출하며, 상기 6방향 밸브를 주입 위치로 전환하여 제1 포트를 지나는 용액의 흐름 방향을 충전 위치와 반대로 설정한 상태에서 상기 펌프로 완충용액을 주입함에 따라 필터에 걸려 있는 분석물질-수용체 복합체를 자유로운 수용체와 분리할 수 있다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 본 발명은 상기한 분석물질 분리장치에, 완충용액을 공급하는 펌프 및 상기 분석물질 분리장치에 의해 분리된 분석물질-수용체 복합체를 받아서 분석물질을 검출하는 검출기를 구비함에 따라 분석물질 검출장치를 구현할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명에서는 상용화된 6방향 밸브와 필터를 이용하여 분석물질을 분리할 수 있는 분리장치를 간단하게 구현할 수 있고, 이를 이용하여 분석물질 검출장치를 간단하게 구현할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 이미 상용화되어 있는 6방향 밸브와 필터를 이용하기 때문에 제품화가 용이할 뿐만 아니라 제품화에 적은 비용이 소요되는 장점이 있다.
더욱이, 본 발명에서는 한 종류의 센서 칩을 이용하여 서로 다른 분석물질을 검출할 수 있어 경제성을 도모할 수 있다.
또한, 본 발명에서는, 수용체에 각 종 표지를 붙임에 따라 다양한 검출방법을 사용할 수 있고, 신호의 증폭이 가능하며, 친화도가 낮은 수용체를 이용하여 고감도로 분석물질을 검출할 수 있고, 농도가 낮은 시료의 경우에도 필터에서 농축하여 검출함에 의해 동일한 감도로 검출이 이루어질 수 있다.
도 1 및 도 2는 각각 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 분석물질 검출장치를 나타낸 구성도로서, 충전 위치와 주입 위치에 따른 내부유로의 연결상태를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 분석물질 분리장치에서 충전 위치로 설정된 경우 박테리아-수용체 복합체가 제1포트에 삽입된 필터에 걸린 상태를 확대하여 나타낸 필터 확대 단면도이다.
도 4는 본 발명에 따른 분석물질 분리장치에서 주입 위치로 설정된 경우 제1포트에서의 흐름이 역전되어 박테리아-수용체 복합체가 필터로부터 떨어져 나와 센서 칩으로 향하는 상태를 확대하여 나타낸 필터 확대 단면도이다.
도 5는 본 발명에 따른 분석물질 분리장치가 이용될 경우 박테리아-수용체 복합체가 이차 수용체를 고정시킨 센서 칩에서 검출되는 것을 설명하기 위한 설명도이다.
도 6은 본 발명에 따른 분석물질 분리장치를 스트렙트아비딘이 고정된 QCM 센서 칩에 연결한 상태에서, 에드와드균과 비오틴 기가 부착된 에드와드균 결합 펩티드(P2B)의 혼합물을 충전 위치에서 밸브에 주입하고, 밸브를 주입 위치로 전환시킨 후 주파수 변화(Frequency shift)를 시간에 따라 측정한 그래프이다.
도 7은 도 6에서 측정된 에드와드균 수(Cell number)에 따른 주파수 변화(Frequency change) 값을 나타낸 그래프이다.
상술한 목적, 특징 및 장점은 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 후술되어 있는 상세한 설명을 통하여 보다 명확해 질 것이며, 그에 따라 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 기술적 사상을 용이하게 실시할 수 있을 것이다.
또한, 본 발명을 설명함에 있어서 본 발명과 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에 그 상세한 설명을 생략하기로 한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명한다.
첨부된 도 1 및 도 2는 각각 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 분석물질 검출장치를 나타낸 구성도로서, 충전 위치와 주입 위치에 따른 내부유로의 연결상태를 나타낸다. 또한, 도 3은 본 발명에 따른 분석물질 분리장치에서 충전 위치로 설정된 경우 박테리아-수용체 복합체가 제1포트에 삽입된 필터에 걸린 상태를 확대하여 나타낸 필터 확대 단면도이고, 도 4는 본 발명에 따른 분석물질 분리장치에서 주입 위치로 설정된 경우 제1포트에서의 흐름이 역전되어 박테리아-수용체 복합체가 필터로부터 떨어져 나와 센서 칩으로 향하는 상태를 확대하여 나타낸 필터 확대 단면도이다.
바람직한 실시예 설명에서 분석물질(analyte)이란 검출 대상이 되는 물질로서 대표적인 예로는 박테리아, 바이러스, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 금속 이온, 유기화합물 등을 들 수 있다.
또한, 여기에서 수용체(receptor)란 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로서 대표적인 예로는 항체 또는 효소를 비롯한 단백질, 펩티드, 핵산, 탄수화물 등을 들 수 있다.
도 1, 도 2 및 도 5를 참고하면, 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 분석물질 검출장치(1)는 크게 분석물질-수용체 복합체(40)는 거르고 분석물질(41)과 결합하지 않은 자유로운 수용체(43a)는 배출함에 의해 분석물질-수용체 복합체(40)를 분리하는 분석물질 분리장치(5), 완충용액을 공급하는 펌프(33) 및 센서 칩(35)으로 구성되어 있다.
또한, 상기 분석물질 분리장치(5)는 크게 6방향 밸브(10), 시료 튜브(sample loop)(17) 및 필터(31)를 포함하고 있다.
상기 6방향 밸브(10)는 밸브몸체(13)가 하우징(11)에 대하여 예를 들어, 60°만큼 시계 및 반시계 방향으로 회전이 가능하게 지지되어 있으며, 밸브몸체(13)는 그 내부에 제1 내지 제3 유로(15a-15c)가 형성되어 있다.
상기 하우징(11)은 60°간격으로 배치된 제1 내지 제6 포트(21-26)를 구비하고 있으며, 제1 포트(21)와 제4 포트(24) 사이에는 시료 튜브(sample loop)(17)가 연결되어 있고, 제2 포트(22)는 시료가 주입되는 주입 포트(injection port)이다.
제3 포트(23)는 도 1의 충전 위치(load position)에서 주입 포트인 제2 포트(22)로 시료를 주입할 때 시료 튜브(17)에 있던 용액과 시료 튜브(17)를 채우고 남은 시료가 배출되는 포트이다. 제5 포트(25)에는 센서 칩(35)으로 완충용액을 공급하는 펌프(33)가 연결되어 있다. 분석물질 분리장치(5)가 크로마토그래피에 사용될 경우 제5 포트(25)는 크로마토그래피 칼럼(column)으로 연결된다. 제6 포트(26)에는 센서 칩(35)으로 용액을 공급하는 튜브가 연결된다.
분석물질 분리장치(5)는 도 1에 도시된 충전 위치(load position)에서 밸브몸체(13)가 하우징(11)에 대하여 60°만큼 시계 방향으로 회전하면 도 2에 도시된 주입 위치(inject position)로 전환된다.
밸브몸체(13) 내부에 형성된 제1 내지 제3 유로(流路)(15a-15c)는 도 1의 충전 위치(load position)일 때 제1 포트(21)와 제2 포트(22)가 제1유로(15a)에 의해 연결되고, 제3 포트(23)와 제4 포트(24)가 제2유로(15b)에 의해 연결되며, 제5 포트(25)와 제6 포트(26)가 제3유로(15c)에 의해 연결되어 있다.
도 2의 주입 위치(inject position)인 경우, 제2 포트(22)와 제3 포트(23)가 제1유로(15a)에 의해 연결되고, 제4 포트(24)와 제5 포트(25)가 제2유로(15b)에 의해 연결되며, 제6 포트(26)와 제1 포트(21)가 제3유로(15c)에 의해 연결되어 있다.
본 발명의 분석물질 분리장치(5)는 또한, 제1 포트(21)에 시료 튜브(17)를 연결하기 위한 너트(도시되지 않음)를 조립하기 전에 먼저 삽입되어 분석물질-수용체 복합체(40)는 거르고 분석물질(41)에 결합하지 않은 자유로운 수용체(43a)는 빠져나갈 수 있는 필터(31)를 구비한다(도 3 내지 도 5 참조).
이 경우 상기 필터(31)는 예를 들어, PEEK(polyether ether ketone) 재질로 이루어진 프릿(frit)을 사용할 수 있다.
상기 6방향 밸브(10)는 제1 포트(21)에 삽입된 필터(31)를 안정된 상태로 지지하기 위해 포트 바닥 면이 평평한 것이 바람직하다.
제5 포트(25)에 연결되는 펌프(33)는 센서 칩(35)으로 완충용액을 공급하며, 제6 포트(26)에 도시되지 않은 튜브를 통하여 연결되는 센서 칩(35)은 도 5에 도시된 바와 같이 수용체(43)에 대한 2차 수용체(37)를 구비하고 상기 자유 수용체(43a)로부터 분리된 상기 분석물질-수용체 복합체(40)가 공급될 때 분석물질-수용체 복합체(40)의 수용체(43)가 2차 수용체(37)와 결합이 이루어지도록 하여 분석물질(41)을 검출한다.
상기 센서 칩(35)은 분석물질(41)을 검출하기 위한 검출기로서, 분광광도계(spectrophotometer), 형광광도계(fluorometer), 발광측정기(luminometer), 수정미소저울 바이오센서(QCM(quartz crystal microbalance) biosensor), 표면 플라스몬 공명기 바이오센서(SPR(Surface Plasmon Resonance) biosensor), 전기화학 바이오센서(electrochemical biosensor), 간섭계형 바이오센서(interferometric biosensor), 및 FET 바이오센서(field effect transistor biosensor) 중 하나일 수 있다.
이하에 상기와 같이 구성된 본 발명의 분석물질 검출장치(1)의 동작을 설명한다.
먼저, 분석물질(41)을 함유하는 시료에 수용체(43)를 넣어 수용체(43)와 분석물질(41)의 결합을 유도하여 상기 분석물질(41)과 결합한 분석물질-수용체 복합체(40)를 형성하게 한다. 이어서, 상기 분석물질-수용체 복합체(40)를 상기 분석물질(41)과 결합하지 않은 자유 수용체(43a)와 분리하도록 도 1의 충전 위치로 6방향 밸브(10)의 제1 내지 제3 유로(流路)(15a-15c)를 설정한다.
이 상태에서 주입 포트인 제2 포트(22)로 분석물질-수용체 복합체(40)가 포함된 시료를 주입하면, 제1 유로(15a)를 거쳐 필터(31)를 통하여 시료 튜브(17)로 이동하면서 분석물질-수용체 복합체(40)는 도 3과 같이 필터(31)의 밸브 내부 쪽 면에 걸리고 분석물질(41)에 결합하지 않은 자유로운 수용체(43a)는 필터(31)를 빠져나가 시료 튜브(17), 제4 포트(24), 제2 유로(15b) 및 제3 포트(23)를 통해 분석물질 분리장치(5)의 외부로 배출된다. 그동안 펌프(33)로부터 흘러오는 완충용액은 제5 포트(25), 제3 유로(15c), 제6 포트(26)를 통하여 센서 칩(35)으로 직접 공급된다.
그 후, 도 1의 충전 위치(load position)에서 6방향 밸브(10)의 밸브몸체(13)를 하우징(11)에 대하여 60°만큼 시계 방향으로 회전하여 도 2에 도시된 주입 위치(inject position)로 전환시킨다.
이와 같이 분석물질-수용체 복합체(40)가 필터(31)에 걸려있는 상태에서 밸브몸체(13)를 회전시키면, 제1 포트(21)를 지나는 용액의 흐름 방향이 충전 위치와 주입 위치에서 서로 반대가 된다.
이 상태에서 도 2 및 도 4와 같이 펌프(33)로 완충용액을 주입하면 완충용액이 제5 포트(25), 제2 유로(15b), 제4 포트(24), 시료 튜브(17), 필터(31), 제1 포트(21), 제3 유로(15c) 및 제6 포트(26)를 거쳐 센서 칩(35)으로 흘러가게 된다. 그 과정에서 필터(31)의 밸브 내부 쪽 면에 걸려있던 분석물질-수용체 복합체(40)는 도 4와 같이 필터(31)에서 떨어져 나와 센서 칩(35)으로 운반된다.
그 결과, 상기 자유 수용체(43a)로부터 분리된 상기 분석물질-수용체 복합체(40)는 센서 칩(35)의 수용체(43)에 대한 2차 수용체(37)와 결합이 이루어짐에 따라 검출이 이루어진다.
상기한 바와 같이, 본 발명에서는 도 1 및 도 2에 나타낸 것처럼 6방향 밸브(10)를 몇 가지 변화시킴으로써 간단하게 분석물질-수용체 복합체(40)는 거르고 분석물질(41)과 결합하지 않은 자유로운 수용체(43a)는 배출함에 의해 분석물질-수용체 복합체(40)를 분리하고, 분석물질-수용체 복합체(40)를 센서 칩(35)으로 운반하여 분석물질(41)을 검출한다.
첫째, 제1 포트(21)에 시료 튜브(17)를 연결하기 위한 너트를 조립하기 전에 먼저 필터(31)를 삽입하여 조립함에 의해 상기한 바와 같이 분석물질 분리장치(5)에 의해 간단히 분석물질(41)에 결합하지 않은 자유로운 수용체(43a)는 배출하고, 분석물질-수용체 복합체(40)만을 거르는 것이 가능하다.
예를 들어 항체를 수용체로 사용하여 분석물질인 박테리아를 검출하려고 할 경우 박테리아의 크기는 수 마이크로미터의 크기인 반면 항체의 크기는 10 나노미터 이하이기 때문에 0.2∼1 마이크로미터 정도의 구멍을 갖는 필터(31)를 이용하면 박테리아-항체 복합체만 선택적으로 거르고 박테리아에 결합하지 않은 항체는 필터(31)를 빠져나가도록 할 수 있다.
이와 같이 필터(31)를 삽입한 상태에서 박테리아와 수용체가 혼합된 시료를 주입하면 박테리아-수용체 복합체는 필터(31)의 밸브 내부 쪽 면에 걸리고 박테리아에 결합하지 않은 자유로운 수용체는 필터(31)를 빠져나가 제3 포트(23)를 통해 배출된다.
둘째, 도 1 및 도 2에 나타낸 것처럼 6방향 밸브(10)에서 일반적으로 각각 제5 포트와 제6 포트에 연결되던 센서 칩(35)과 펌프(33)를 제6 포트(26)와 제5 포트(25)로 바꿔 연결함으로써 제1 포트(21)를 지나는 완충용액의 흐름 방향이 충전 위치와 주입 위치에서 서로 반대가 되도록 하였다.
따라서 박테리아-수용체 복합체가 필터에 걸려있는 상태에서 밸브(10)를 주입 위치로 돌리면 도 2 및 도 4에 나타낸 것처럼 펌프(33)로부터 주입되는 완충용액이 시료 튜브(17)와 제1 포트(21)에 장착된 필터(31)를 거쳐 센서 칩(35)으로 흘러가게 된다. 그 과정에서 필터(31)의 밸브(10) 내부 쪽 면에 걸려있던 박테리아-수용체 복합체는 필터(31)에서 떨어져 나와 센서 칩(35)으로 운반된다.
상기한 바와 같이 본 발명에 따른 6방향 밸브와 필터를 구비한 분석물질 분리장치를 사용하는 분석물질 검출방법에는 다음과 같은 몇 가지 장점이 있다.
첫째, 한 종류의 센서 칩을 이용하여 서로 다른 분석물질을 검출할 수 있기 때문에 경제적이다. 예를 들어, 항체를 수용체로 사용하여 분석물질인 박테리아를 바이오센서로 검출하려고 할 경우 항체를 센서 칩에 직접 고정시키는 방법을 사용하면 서로 다른 박테리아를 검출하기 위해서는 각 박테리아에 대한 항체를 고정시킨 서로 다른 센서 칩을 사용해야 한다.
그러나, 본 발명에 의한 분석물질 분리장치를 사용할 경우 센서 칩에서 박테리아를 직접 검출하는 것이 아니라 박테리아-항체 복합체를 검출하기 때문에 단백질 A(protein A)나 단백질 G(protein G)와 같은 항체에 결합하는 단백질을 고정시킨 센서 칩을 사용하면 이 한 가지 센서 칩으로 모든 박테리아를 다 검출할 수 있다. 즉, 검출 특이성이 센서 칩에서 결정되는 것이 아니라 박테리아와 항체의 복합체 형성단계에서 결정되는 것이다.
또한, 박테리아에 대한 항체들을 모두 염소에서 제작하였다면 염소의 면역글로불린 G(immunoglobulin G) 단백질에 대한 이차항체를 고정시킨 센서 칩을 사용할 수도 있고, 박테리아에 대한 항체에 비오틴 기(biotin group)를 붙여놓았다면 아비딘(avidin)이나 스트렙트아비딘(streptavidin)을 고정시킨 센서 칩을 사용할 수도 있다.
두 번째 장점은 수용체에 효소, 형광원자단(fluorophore), 발색원자단(chromophore), 금 나노입자(gold nanoparticle)와 같은 표지를 붙일 수 있기 때문에 다양한 검출 방법을 사용할 수 있을 뿐만 아니라 신호의 증폭이 가능하다는 점이다. 효소의 경우 흡광, 발광, 형광뿐만 아니라 전기화학적인 방법으로 측정할 수 있고 금 나노입자는 quartz crystal microbalance(QCM)이나 surface plasmon resonance (SPR)와 같이 질량을 측정하는 바이오센서에서 신호를 증폭할 수 있다.
셋째, 친화도가 낮은 수용체를 이용하여 고감도로 분석물질을 검출할 수 있다. 예를 들어, 펩티드와 같이 친화도가 낮은 수용체를 센서 칩에 직접 고정시킨 후 시료를 흘려보내며 측정하는 흐름 주입 분석(flow injection analysis, FIA) 방법으로 박테리아를 검출할 경우 박테리아의 결합 속도가 느리기 때문에 감도가 매우 낮아진다. 또한, QCM에서는 박테리아가 센서 칩 표면에 느슨하게 결합하기 때문에 센서 칩의 진동 주파수와 어긋나게 진동하여 오히려 주파수가 증가하는 현상이 발생하기도 한다.
그러나 본 발명에 의한 분석물질 분리장치를 사용하는 검출방법에서는 비오틴 기를 부착한 펩티드와 박테리아를 먼저 섞어 박테리아-펩티드 복합체를 형성한 후, 이 복합체를 스트렙트아비딘이 고정된 센서 칩으로 검출할 수 있다. 비오틴과 스트렙트아비딘 사이의 친화도가 매우 높고 한 개의 박테리아에 여러 개의 펩티드가 결합할 수 있기 때문에 박테리아-펩티드 복합체는 센서 칩과 여러 개의 강한 결합으로 결합하게 되고 따라서 고감도 검출이 가능하게 된다.
넷째, 농도가 낮은 시료의 경우에도 필터에서 농축하여 검출 할 수 있다. 본 발명에 의한 분석물질 분리장치를 사용하는 검출방법에서는 필터에서 농축이 이루어지기 때문에 시료의 농도가 묽어도 주입하는 시료의 부피를 늘리면 농도가 높은 시료를 주입할 때와 동일한 수의 박테리아를 필터에 농축시킬 수 있다. 따라서 농도가 낮은 시료도 동일한 감도로 검출할 수 있는 장점을 가지고 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명에서는 밸브의 충전 위치(load position)에서 분석물질-수용체 복합체(40)를 주입하면 상기 복합체가 필터(31)에 걸러지고, 밸브(10)를 주입 위치(inject position)로 전환시키면 완충용액의 흐름이 반대방향으로 바뀌어 상기 필터(31)에 걸러져 있던 상기 복합체가 검출장치, 즉 센서 칩(35)로 향할 수 있도록 함에 의해 분석물질의 검출이 높은 신뢰성을 가지면서도 쉽고 간단하며 저렴한 방법으로 이루어질 수 있게 된다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 들어 보다 상세히 설명하기로 한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니라, 본 발명을 구현하는 예시적인 것에 불과하다.
<실시예 1> 비오틴 기를 부착한 펩티드를 이용한 에드와드균 검출
에드와드균(Edwardsiella tarda)은 물고기에 에드와드병(edwardsiellosis)이라는 질병을 일으키는 그람 음성 박테리아이다. 본 발명자는 이전 연구에서 파지-펩티드 문고로부터 에드와드균에 결합하는 두 종류의 펩티드를 검색하였다(특허출원 10-2011-0005112). 본 발명에 의한 분석물질 분리장치의 효율성을 확인하기 위해 두 펩티드 가운데 P2 펩티드를 사용하여 에드와드균을 검출하였다. P2 펩티드의 아미노산 서열은 WVWPARL이기 때문에 이 서열의 카르복시 말단 쪽에 세 개의 잔기 GGK를 추가하고 마지막 리신(K)의 곁사슬에 있는 아미노기를 이용하여 비오틴 기를 화학적으로 부착하였다. 이와 같이 비오틴 기를 부착하여 합성된 펩티드는 P2B로 명명되었으며 그 아미노산 서열은 WVWPARLGGK(biotin)이다.
필터가 포함된 6방향 밸브로 이루어진 분석물질 분리장치는 IDEX Health & Sciences에서 구입한 시료 주입 밸브(catalogue number V-451)와 PEEK(polyether ether ketone) frit(0.5 μm pore, catalogue number A-709)을 이용하여 제작하였다. 필터로서 사용된 PEEK frit은 단단하기 때문에 포트에 삽입하고 너트로 조여도 형태가 그대로 유지될 뿐만 아니라 양쪽 방향의 흐름에 모두 잘 견딜 수 있는 장점을 가지고 있다. 또한 PEEK 재질은 박테리아나 단백질에 부정적인 영향을 주지 않는 장점도 가지고 있다.
도 1 및 도 2에 도시된 것처럼 먼저 PEEK frit을 시료 주입 밸브의 제1 포트에 삽입한 후 제1 포트와 제4 포트에 시료 튜브 연결용 너트를 고정시켰다. 다음으로 제5 포트에 주사기 펌프를 연결하고 제6 포트를 통해 배출되는 용액이 QCM 바이오센서 시스템의 센서 칩으로 주입되도록 연결하였다. QCM 바이오센서 시스템은 아모그린텍(한국 김포)에서 구입하였고 QCM 센서 칩은 일본 Crystal Sun Life에서 구입하였다. QCM 센서 칩에 스트렙트아비딘을 고정시키는 방법은 hybrid bilayer membrane 방법을 사용하였다(Mun and Choi, 2009, Biosens. Bioelectron. 24, 2522-2527).
서로 다른 농도의 에드와드균을 포함하는 시료를 50 μg/ml 농도의 P2B 펩티드 0.1 ml와 섞고 실온에서 30 분간 반응시켰다. 도 1에 나타낸 것처럼 충전 위치에서 각 혼합물을 필터가 부착된 밸브의 주입 포트(제2 포트)에 주입하였다. 이때 박테리아-P2B 복합체는 도 3에 나타낸 것처럼 frit의 밸브 내부 쪽 면에 걸리고 박테리아에 결합하지 않은 P2B 펩티드는 frit을 지나 배출 포트로 배출된다. 박테리아에 결합하지 않은 P2B 펩티드를 frit에서 완전히 제거하기 위해 0.5 ml의 PBS(phosphate-buffered saline)를 동일한 방법으로 주입하였다.
다음으로 밸브를 주입 위치로 전환시킴으로써 펌프로부터 공급되는 PBS 용액이 도 2와 같이 시료 튜브와 제1 포트를 거쳐 센서 칩으로 향하도록 하였다. 결과적으로 frit에 걸려있던 박테리아-P2B 복합체는 도 4에 나타낸 것처럼 frit에서 떨어져 나와 QCM 센서 칩으로 주입된다. QCM 센서 칩 표면에 박테리아-P2B 복합체가 결합하는 것을 평가하기 위해 밸브를 주입 위치로 전환한 후 10초 간격으로 센서 칩의 주파수를 측정하였다.
도 6은 본 발명에 따른 분석물질 분리장치를 스트렙트아비딘이 고정된 QCM 센서 칩에 연결한 상태에서, 에드와드균과 비오틴 기가 부착된 에드와드균 결합 펩티드(P2B)의 혼합물을 충전 위치에서 밸브에 주입하고, 밸브를 주입 위치로 전환시킨 후 주파수 변화를 측정한 그래프이다. P2B control은 P2B 펩티드만 주입했을 때, E. tarda control은 에드와드균만 주입했을 때, 나머지는 해당 숫자만큼의 에드와드균과 P2B 펩티드 혼합물을 주입했을 때의 그래프이다.
그 결과 도 6과 같이 P2B 펩티드만 주입하거나 에드와드균만 주입했을 때는 거의 주파수의 변화가 없지만 에드와드균과 P2B 펩티드 혼합물을 주입했을 때는 에드와드균의 수에 비례하여 주파수가 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.
도 7은 도 6에서 주파수가 변한 정도를 에드와드균 수에 대해 그린 그래프로서, 이 방법으로 8×102∼8×106 범위에서 주파수 변화가 박테리아 수에 비례하는 것을 보여준다. 또한, 최저 8×102 개의 에드와드균을 검출할 수 있는 것으로 확인되었다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 의한 필터가 포함된 6방향 밸브로 이루어지는 분석물질 분리장치는 필터를 구비한 3-방향 밸브와 동일하게 바이오센서와 같은 검출기에 추가되어 분리-검출 방법에 의한 분석물질의 검출에 사용될 수 있다.
본 발명은 박테리아, 바이러스, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 금속 이온, 유기화합물과 같은 분석물질을 분리한 후 검출할 수 있는 검출장치에 적용된다.

Claims (12)

  1. 제1 내지 제6 포트가 형성된 하우징의 내부에 선회 가능하게 배치되며 충전 위치와 주입 위치에 따라 상기 제1 내지 제6 포트 중 상호 인접하여 배치되는 2개의 포트를 선택적으로 연결하는 제1 내지 제3 유로가 내부에 형성되어 있는 밸브몸체를 구비한 6방향 밸브;
    상기 제1 포트와 제4 포트 사이를 연결하는 시료 튜브; 및
    상기 시료 튜브를 연결하기 전에 제1 포트 내부에 먼저 삽입되어 분석물질-수용체 복합체는 거르고 분석물질과 결합하지 않은 자유로운 수용체는 통과시키는 필터를 포함하며,
    상기 제2 포트는 시료가 주입되는 주입 포트이고, 상기 제3 포트는 충전 위치에서 제2 포트로 시료를 주입할 때 시료 튜브에 있던 용액과 시료 튜브를 채우고 남은 시료가 배출되는 배출 포트이며, 상기 제5 포트에는 완충용액을 공급하는 펌프가 연결되고, 제6 포트는 검출기에 연결되며,
    상기 6방향 밸브를 충전 위치로 설정한 후, 상기 분석물질을 함유하는 시료에 수용체를 넣어 상기 분석물질과 결합한 분석물질-수용체 복합체를 포함하는 시료를 제2 포트로 주입하여,
    상기 필터에 의해 분석물질-수용체 복합체는 거르고 분석물질과 결합하지 않은 자유로운 수용체는 제3포트로 배출하며,
    상기 6방향 밸브를 주입 위치로 전환하여 제1 포트를 지나는 용액의 흐름 방향을 충전 위치와 반대로 설정한 상태에서 상기 펌프로 완충용액을 주입함에 따라 필터에 걸려 있는 분석물질-수용체 복합체를 자유로운 수용체와 분리하며,
    상기 필터는 하우징의 제1 포트 내부에 착탈 가능하게 설치되는 것을 특징으로 하는 분석물질 분리장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 필터는 PEEK(polyether ether ketone) 재질로 이루어진 프릿(frit)인 것을 특징으로 하는 분석물질 분리장치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 6방향 밸브의 포트 바닥 면이 평평한 것을 특징으로 하는 분석물질 분리장치.
  4. 제1항에 있어서, 상기 검출기는 분광광도계(spectrophotometer), 형광광도계(fluorometer), 발광측정기(luminometer), 수정 QCM 바이오센서(QCM(quartz crystal microbalance) biosensor), 표면 플라스몬 공명기 바이오센서(SPR(Surface Plasmon Resonance) biosensor), 전기화학 바이오센서(electrochemical biosensor), 간섭계형 바이오센서(interferometric biosensor), 및 FET 바이오센서(field effect transistor biosensor) 중 하나인 것을 특징으로 하는 분석물질 분리장치.
  5. 제1항에 있어서, 상기 검출기는 분석물질-수용체 복합체의 수용체와 결합이 이루어지는 2차 수용체를 구비하는 것을 특징으로 하는 분석물질 분리장치.
  6. 제1항에 있어서, 상기 충전 위치일 때 제1 포트와 제2 포트가 제1유로에 의해 연결되고, 제3 포트와 제4 포트가 제2유로에 의해 연결되며, 제5 포트와 제6 포트가 제3유로에 의해 연결되고,
    상기 주입 위치일 때, 제2 포트와 제3 포트가 제1유로에 의해 연결되고, 제4 포트와 제5 포트가 제2유로에 의해 연결되며, 제6 포트와 제1 포트가 제3유로에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는 분석물질 분리장치.
  7. 삭제
  8. 분석물질-수용체 복합체는 거르고 분석물질과 결합하지 않은 자유로운 수용체는 배출함에 의해 상기 분석물질-수용체 복합체를 분리하는 분석물질 분리장치, 상기 분석물질 분리장치에 완충용액을 공급하는 펌프 및 상기 분석물질 분리장치에 의해 분리된 분석물질-수용체 복합체를 받아서 분석물질을 검출하는 검출기를 포함하는 분석물질 검출장치로서,
    상기 분석물질 분리장치는
    제1 내지 제6 포트가 형성된 하우징의 내부에 선회 가능하게 배치되며 충전 위치와 주입 위치에 따라 상기 제1 내지 제6 포트 중 상호 인접하여 배치되는 2개의 포트를 선택적으로 연결하는 제1 내지 제3 유로가 내부에 형성되어 있는 밸브몸체를 구비한 6방향 밸브;
    상기 제1 포트와 제4 포트 사이를 연결하는 시료 튜브; 및
    상기 시료 튜브를 연결하기 전에 제1 포트 내부에 먼저 삽입되어 분석물질-수용체 복합체는 거르고 분석물질과 결합하지 않은 자유로운 수용체는 통과시키는 필터를 포함하며,
    상기 제2 포트는 시료가 주입되는 주입 포트이고, 상기 제3 포트는 충전 위치에서 제2 포트로 시료를 주입할 때 시료 튜브에 있던 용액과 시료 튜브를 채우고 남은 시료가 배출되는 배출 포트이며, 상기 제5 포트에는 완충용액을 공급하는 펌프가 연결되고, 제6 포트에는 검출기로 연결되며,
    상기 6방향 밸브를 충전 위치로 설정한 후, 상기 분석물질을 함유하는 시료에 수용체를 넣어 상기 분석물질과 결합한 분석물질-수용체 복합체를 포함하는 시료를 제2 포트로 주입하여,
    상기 필터에 의해 분석물질-수용체 복합체는 거르고 분석물질과 결합하지 않은 자유로운 수용체는 제3포트로 배출하며,
    상기 6방향 밸브를 주입 위치로 전환하여 제1 포트를 지나는 용액의 흐름 방향을 충전 위치와 반대로 설정한 상태에서 상기 펌프로 완충용액을 주입함에 따라 필터에 걸려 있는 분석물질-수용체 복합체를 분리하여 제6 포트에 연결된 검출기로 운반하며,
    상기 필터는 하우징의 제1 포트 내부에 착탈 가능하게 설치되는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출장치.
  9. 삭제
  10. 제8항에 있어서, 상기 분석물질-수용체 복합체로서 비오틴 기(biotin group)를 부착한 펩티드와 박테리아를 섞어 박테리아-펩티드 복합체를 형성하고,
    검출기로서 아비딘(avidin) 또는 스트렙트아비딘(streptavidin)을 고정시킨 센서 칩으로 상기 박테리아-펩티드 복합체를 검출하는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출장치.
  11. 제8항에 있어서, 상기 수용체로서 항체를 사용하여 박테리아를 검출하는 경우, 검출기로서 단백질 A(protein A)나 단백질 G(protein G)를 고정시킨 센서 칩으로 박테리아-항체 복합체를 검출하는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출장치.
  12. 제8항에 있어서, 상기 수용체로서 항체를 사용하여 박테리아를 검출하는 경우, 박테리아에 대한 항체는 염소의 면역글로불린 G (immunoglobulin G) 단백질이고, 검출기로서 염소의 면역글로불린 G 단백질에 대한 이차항체를 고정시킨 센서 칩을 사용하는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출장치.
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KR20110073533A (ko) * 2008-10-07 2011-06-29 아크레이 인코퍼레이티드 액체 크로마토그래피 장치 및 액체 크로마토그래피

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