KR101364312B1 - A preparation method of alginate microfibers - Google Patents

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Abstract

본 발명은 알지네이트 마이크로섬유의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인산 칼슘 화합물 및 알지네이트의 혼합 용액을 제조한 후 상기 혼합 용액을 칼슘 이온 수용액에 투입하고 교반하여 비드를 형성시킨 다음 상기 비드를 식염수 중에서 배양시킴으로써 알지네이트 마이크로섬유를 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing alginate microfibers, and more particularly, after preparing a mixed solution of a calcium phosphate compound and alginate, the mixed solution is added to an aqueous solution of calcium ions and stirred to form beads, and then the beads are brine. It relates to a method for producing alginate microfibers by culturing in air.

Description

알지네이트 마이크로섬유의 제조방법{A preparation method of alginate microfibers}A preparation method of alginate microfibers

본 발명은 알지네이트 마이크로섬유의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인산 칼슘 화합물 및 알지네이트의 혼합 용액을 제조한 후 상기 혼합 용액을 칼슘 이온 수용액에 투입하고 교반하여 비드를 형성시킨 다음 상기 비드를 식염수 중에서 배양시킴으로써 알지네이트 마이크로섬유를 제조하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for producing alginate microfibers, and more particularly, after preparing a mixed solution of a calcium phosphate compound and alginate, the mixed solution is added to an aqueous solution of calcium ions and stirred to form beads, and then the beads are brine. It relates to a method for producing alginate microfibers by culturing in air.

부착, 증식, 이주 및 분화를 포함하는 3차원적인 (3D) 세포 거동을 조절하기 위한 스캐폴드의 개발은 조직 공학 접근에 있어 핵심적인 것이다(Mooney, D. J. et al., Nature 2000, 408, 998). 인체 내에서 분해가능한 다양한 고분자 재료들이 3D 세포 및 조직 스캐폴드로서 적합하게 사용되기 위하여 다공성 폼, 섬유상 스캐폴드 및 미립자와 같은 다양한 형태로 제조되어 왔다(Kim, H. W. et al., Adv . Drug Deliv . Rev . 2009, 61, 1065).The development of scaffolds to regulate three-dimensional (3D) cell behavior, including adhesion, proliferation, migration and differentiation, is a key to tissue engineering approaches (Mooney, DJ et al., Nature 2000 , 408 , 998). . Various polymeric materials that are degradable in the human body have been prepared in various forms such as porous foams, fibrous scaffolds and particulates to be suitably used as 3D cell and tissue scaffolds (Kim, HW et al., Adv . Drug Deliv . Rev. 2009, 61, 1065) .

알지네이트는 낮은 독성 및 생분해성을 포함하는 많은 매력적인 특성을 갖는 천연 유래 다당류이다. 사실상, 다당류 사슬은 이온 결합 또는 수소 결합을 통해 분자적 자가-조립에 의해 가교되어 다량의 물을 담을 수 있는 3D 망상 구조를 갖는 하이드로겔을 형성할 수 있다(Skjak-Braek, G. et al., Trends Biotechnol . 1990, 8, 71; Halle, J. P. et al., Biomaterials 2006, 27, 3691). 따라서, 알지네이트 하이드로겔은 세포 배양 및 약물 전달을 포함하는 다양한 생체의료용 목적으로 널리 사용되어 왔다(Mooney, D. J. et al., Biomaterials , 2000, 21, 1921; Turner, N. et al., Biotechnol . Bioeng . 1999, 65, 605; Ziganshina, O. A. et al., Marine Pharmacol . 2001, 27, 53). 다공성 매트릭스, 미소구체 및 섬유와 같은 다양한 형태의 알지네이트가 또한 조직 수복을 위해 개발되었다(Qin ,Y. Polym . Int . 2008, 57, 171; Qin, Y. Textile Res . J. 2005, 75,165). 특히, 알지네이트 섬유는 일반적으로 용융 방사, 습식 방사 및 전기방사와 같은 방사 방법으로 제조되어 왔다(Thom, D. et al., FEBS Lett . 1973, 32,195; Rutledge, G. C. et al., Phys . Rev. Lett . 2003, 90, 144502; Goldstein, A. S. et al., Biomaterials , 2006, 27, 5681).
Alginates are naturally occurring polysaccharides with many attractive properties, including low toxicity and biodegradability. Indeed, polysaccharide chains can be crosslinked by molecular self-assembly via ionic or hydrogen bonding to form a hydrogel with a 3D network structure capable of containing large amounts of water (Skjak-Braek, G. et al. , Trends Biotechnol . 1990 , 8 , 71; Halle, JP et al., Biomaterials 2006 , 27 , 3691). Thus, the alginate hydrogels have been widely used for various biomedical purposes, including cell culture and drug delivery (Mooney, DJ et al, Biomaterials , 2000, 21, 1921;... Turner, N. et al, Biotechnol Bioeng . 1999, 65, 605;. . Ziganshina, OA et al, Marine Pharmacol 2001, 27, 53). Various forms of alginates such as porous matrices, microspheres and fibers have also been developed for tissue repair (Qin, Y. Polym . Int . 2008 , 57 , 171; Qin, Y. Textile Res . J. 2005 , 75 , 165). In particular, alginate fibers have generally been produced by spinning methods such as melt spinning, wet spinning and electrospinning (Thom, D. et al., FEBS Lett . 1973 , 32 , 195; Rutledge, GC et al., Phys . Rev. Lett . 2003 , 90 , 144502; Goldstein, AS et al., Biomaterials , 2006 , 27 , 5681).

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 인산 칼슘 화합물 및 알지네이트의 혼합 용액을 제조한 후 상기 혼합 용액을 칼슘 이온 수용액에 투입하고 교반하여 비드를 형성시킨 다음 상기 비드를 식염수 중에서 배양시킴으로써 알지네이트 마이크로섬유를 제조할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
Under this background, the present inventors can prepare alginate microfibers by preparing a mixed solution of calcium phosphate compound and alginate, and then adding the mixed solution to an aqueous calcium ion solution, stirring to form beads, and then culturing the beads in saline solution. The present invention was completed by confirming the presence of the present invention.

본 발명의 목적은 알지네이트 마이크로섬유의 제조방법을 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide a method for producing alginate microfibers.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 알지네이트 마이크로섬유의 제조방법을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a method for producing alginate microfibers comprising the following steps.

1) 인산 칼슘 화합물 및 알지네이트의 혼합 용액을 제조하는 단계;1) preparing a mixed solution of calcium phosphate compound and alginate;

2) 상기 혼합 용액을 칼슘 이온 수용액에 투입하고 교반하여 비드를 형성시키는 단계; 및2) adding the mixed solution to an aqueous solution of calcium ions and stirring to form beads; And

3) 상기 비드를 식염수 중에서 배양하는 단계.
3) culturing the beads in saline.

상기 단계 1은, 인산 칼슘 화합물 및 알지네이트의 혼합 용액을 제조하는 단계로서, 인산 칼슘 화합물과 알지네이트 성분을 함유하는 혼합 용액을 제조하는 단계이다.Step 1 is to prepare a mixed solution of the calcium phosphate compound and alginate, to prepare a mixed solution containing the calcium phosphate compound and the alginate component.

상기 인산 칼슘 화합물로는 트리칼슘 포스페이트, 하이드록시 아파타이트, 모노칼슘 포스페이트, 테트라칼슘 포스페이트, 디칼슘 포스페이트 등을 예로 들 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 인산 칼슘 화합물은 1종 단독으로 또는 2종 이상의 조합으로 사용 가능하다.Examples of the calcium phosphate compound include, but are not limited to, tricalcium phosphate, hydroxy apatite, monocalcium phosphate, tetracalcium phosphate, dicalcium phosphate, and the like. The said calcium phosphate compound can be used individually by 1 type or in combination of 2 or more types.

상기 인산 칼슘 화합물과 알지네이트의 혼합 비율은 중량기준으로 인산 칼슘 화합물:알지네이트의 비율이 2:1 내지 1:5일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
The mixing ratio of the calcium phosphate compound and alginate may be a ratio of calcium phosphate compound: alginate in a weight ratio of 2: 1 to 1: 5, but is not limited thereto.

상기 단계 2는, 상기 인산 칼슘 화합물 및 알지네이트의 혼합 용액을 칼슘 이온 수용액에 투입하고 교반하여 비드를 형성시키는 단계로서, 인산 칼슘 화합물 및 알지네이트의 혼합 용액을 칼슘 이온 수용액에 투입하고 교반함으로써 상기 혼합 용액이 칼슘 이온과 접촉하는 순간 표면이 경화되어 비드 형태로 형성되도록 유도하는 단계이다.In step 2, the mixed solution of the calcium phosphate compound and alginate is added to an aqueous calcium ion solution and stirred to form beads. The mixed solution of the calcium phosphate compound and alginate is added to an aqueous calcium ion solution and stirred. At the moment of contact with the calcium ions, the surface is hardened to form a bead.

상기 칼슘 이온의 농도는 10 내지 200 mM인 것이 바람직하다.The concentration of the calcium ions is preferably 10 to 200 mM.

상기 교반 시간은 10 내지 60 분인 것이 바람직하며, 가장 바람직하기로는 30분이다.
The stirring time is preferably 10 to 60 minutes, most preferably 30 minutes.

상기 단계 3은, 상기 비드를 식염수 중에서 배양하는 단계로서, 인산 칼슘 화합물 및 알지네이트를 포함하는 비드를 식염수 중에서 배양시킴으로써 비드 내부에 포함되어 있는 알지네이트가 삼출되어 비드 상에서 알지네이트 마이크로섬유가 형성되도록 유도하는 단계이다.Step 3 is a step of culturing the beads in saline, by incubating the bead containing calcium phosphate compound and alginate in saline to induce alginate contained in the bead exuded to form alginate microfibers on the beads to be.

상기 식염수는 세포를 추가로 포함할 수 있으며, 이 경우 세포 배양을 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이와 같이 세포와 세포 배양을 위한 성분을 추가로 포함하는 식염수 즉, 세포 배양 배지 내에서 비드를 배양시킬 경우, 상기 배양을 통해 형성된 알지네이트 마이크로섬유가 세포 배양 및 조직 성장을 위한 3차원적인 스캐폴드로서의 역할을 할 수 있다.The saline solution may further include a cell, in which case it may further include a component for cell culture. As such, when culturing the beads in saline, ie, cell culture medium further comprising cells and components for cell culture, the alginate microfibers formed through the culture are used as three-dimensional scaffolds for cell culture and tissue growth. Can play a role.

상기 세포로는 조골세포, 섬유아세포, 줄기세포 등을 예로 들 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 세포는 1종 단독으로 사용되거나 2종 이상의 조합으로 사용될 수 있다.Examples of the cells include osteoblasts, fibroblasts, stem cells, and the like, but are not limited thereto. The cells may be used alone or in combination of two or more thereof.

상기 세포 배양을 위한 성분은 우태아 혈청, 항생제 등을 예로 들 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.Ingredients for culturing the cell include fetal calf serum, antibiotics, and the like, but is not limited thereto.

상기 배양 시간은 수 시간에서 수십 일이 가능하며 수일 정도인 것이 바람직하다. 구체적으로는 5 시간 내지 10 일 동안 수행할 수 있다.
The incubation time may be several hours to several tens days, preferably several days. Specifically, it can be performed for 5 hours to 10 days.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in detail.

본 발명에서는 배양 배지 중에서 인산 칼슘 화합물을 함유하는 알지네이트 비드로부터 알지네이트 섬유가 삼출되는 현상을 이용하여 알지네이트 섬유를 제조하는 새로운 방법을 제공하고자 한다. 상기와 같이 생성된 구형 비드 유래의 알지네이트 섬유 숲(forest)은 조직 세포의 인시츄 배양을 위한 3D 매트릭스로서 유용한 것으로 나타났다.The present invention is to provide a new method for producing alginate fibers using the phenomenon that alginate fibers are exuded from alginate beads containing calcium phosphate compounds in the culture medium. Alginate fiber forests derived from spherical beads produced as described above have been shown to be useful as 3D matrices for in situ culture of tissue cells.

본 발명은 비드 상에서 제조된 새로운 알지네이트 마이크로섬유 시스템을 제공한다. CaCl2 내에서 경화되는 알지네이트-10% CaP 복합재 비드가 세포 배양 배지 내에서 배양됨에 따라, 알지네이트 섬유가 외부로 발생하기 시작하여 ~ 7 μm 직경 및 ~ 10 mm 길이를 갖는 긴 관상의 구조를 형성한다. 생성된 비드 상의 섬유 숲은 형태학적으로 밤송이와 유사하였으며, 조직 재생 분야에서 인시츄 세포 배양 스캐폴드로서 유용할 것으로 기대되었다.
The present invention provides a new alginate microfiber system made on beads. As the alginate-10% CaP composite beads cured in CaCl 2 are cultivated in cell culture medium, alginate fibers begin to develop externally to form long tubular structures with ˜7 μm diameter and ˜10 mm length. . The fibrous forest on the resulting beads was morphologically similar to chestnut and was expected to be useful as an in situ cell culture scaffold in the field of tissue regeneration.

본 발명은 인산 칼슘 화합물 및 알지네이트의 혼합 용액을 제조한 후 상기 혼합 용액을 칼슘 이온 수용액에 투입하고 교반하여 비드를 형성시킨 다음 상기 비드를 식염수 중에서 배양시킴으로써 알지네이트 마이크로섬유를 제조할 수 있으며 상기 비드를 세포와 세포 배양을 위한 성분을 포함하는 세포 배양 배지 내에서 배양시킴으로써 이로 인해 형성되는 알지네이트 마이크로섬유를 세포 배양 및 조직 성장을 위한 3차원적인 스캐폴드로서 이용할 수 있는 효과가 있다.
The present invention can produce alginate microfibers by preparing a mixed solution of a calcium phosphate compound and alginate, adding the mixed solution to a calcium ion aqueous solution and stirring to form beads, and then culturing the beads in saline, The alginate microfibers formed by culturing the cells in a cell culture medium containing components for cell and cell culture can be used as a three-dimensional scaffold for cell culture and tissue growth.

도 1은 Alg-CaP 비드 유래의 알지네이트 마이크로섬유 형성을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 다른 배양 시간 이후 10% CaP를 함유하는 Alg-CaP 비드로부터 형성된 알지네이트 섬유의 모습(a) 및 SEM 이미지(b)를 보여주는 것이다.
도 3은 동결 건조 후 비드의 표면 형태 및 횡단면 형태를 보여주는 SEM 이미지이다. 이때 a는 Alg 비드, b는 1% (w/v) CaP를 함유하는 Alg-CaP 비드, c는 10% (w/v) CaP를 함유하는 Alg-CaP 비드이다.
도 4는 본 발명에 따라 형성된 관상 섬유의 SEM 이미지이다.Figure 1 schematically illustrates the formation of alginate microfibers derived from Alg-CaP beads.
Figure 2 shows the appearance (a) and SEM image (b) of alginate fibers formed from Alg-CaP beads containing 10% CaP after different incubation times.
3 is an SEM image showing the surface shape and cross-sectional shape of the beads after freeze drying. Where a is Alg beads, b is Alg-CaP beads containing 1% (w / v) CaP, c is Alg-CaP beads containing 10% (w / v) CaP.
4 is an SEM image of tubular fibers formed in accordance with the present invention.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These embodiments are only for describing the present invention more specifically, and the scope of the present invention is not limited by these examples.

실시예Example 1: 재료 및 방법 1: materials and methods

고함량의 글루론산(글루론산 대비 만누론산의 몰비 0.65)을 포함하고 분자량이 70,000 Da인 소듐 알지네이트를 시그마사(St. Louis, MO)로부터 구입하였다. α-트리칼슘 포스페이트(α-TCP, Ca3(PO4)2, < 5 μm 직경)은 무수 제2인산 칼슘과 CaCO3를 함께 1400 ℃에서 열처리한 후 상온으로 급랭시킴으로써 제조하였다. 하이드록시아파타이트(HA, Ca10(PO4)6(OH)2) 분말을 Alfa Aesar로부터 구입하였다. 알파 모디파이드 이글스 배지 (Alpha MEM, cat. No LM 008-53), 우태아 혈청(FBS) 및 항생제 페니실린/스트렙토마이신을 WelGENE으로부터 구입하였다. 둘베코스 인산염-완충 식염수 (DPBS, cat. No Cat. LB 001-02)를 WelGENE으로부터 구입하였다.Sodium alginate containing a high content of gluronic acid (molar ratio of mannuronic acid to gluronic acid of 0.65) and a molecular weight of 70,000 Da was purchased from Sigma (St. Louis, MO). α -tricalcium phosphate ( α- TCP, Ca 3 (PO 4 ) 2 , <5 μm diameter) was prepared by heat-treating anhydrous dibasic calcium phosphate and CaCO 3 together at 1400 ° C. and then quenching to room temperature. Hydroxyapatite (HA, Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ) powder was purchased from Alfa Aesar. Alpha Modified Eagles Medium (Alpha MEM, cat.No LM 008-53), Fetal Bovine Serum (FBS) and the antibiotic penicillin / streptomycin were purchased from WelGENE. Dulbecos phosphate-buffered saline (DPBS, cat.No Cat. LB 001-02) was purchased from WelGENE.

주사 전자 현미경(SEM) 이미지를 JSM7000F (JEOL, Tokyo, Japan) 현미경을 이용하여 얻었다.
Scanning electron microscope (SEM) images were obtained using a JSM7000F (JEOL, Tokyo, Japan) microscope.

실시예Example 2:  2: AlgAlg -- CaPCaP 비드Bead 및 마이크로섬유의 제조 And preparation of microfibers

2% (w/v) 소듐 알지네이트 및 10% (w/v) 인산 칼슘 (CaP = 98% α-TCP 및 2% HA)을 함유하는 수용액을 시린지 니들(0.4 mm 내부 직경)을 통해 10 mM 칼슘 클로라이드 용액 내로 떨어뜨렸다. 그 다음 칼슘 클로라이드 용액을 30 분 동안 교반하여, 구형 형태로 외형이 겔화된 비드를 얻었다. 생성된 비드를 그 다음 PBS로 세척하여 과량의 CaCl2를 제거하였다. 제조된 Alg-CaP 비드를 그대로 세포 배양 배지 (10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 DMEM)에 두고 수일동안 37 ℃에서 배양시켜 비드 밖으로 알지네이트 마이크로섬유가 형성되도록 유도하였다.
An aqueous solution containing 2% (w / v) sodium alginate and 10% (w / v) calcium phosphate (CaP = 98% α- TCP and 2% HA) was added to the 10 mM calcium via syringe needle (0.4 mm inner diameter). Drop into chloride solution. The calcium chloride solution was then stirred for 30 minutes to obtain beads gelled in spherical form. The resulting beads were then washed with PBS to remove excess CaCl 2 . The prepared Alg-CaP beads were left in the cell culture medium (DMEM supplemented with 10% FBS and 1% penicillin / streptomycin) and incubated at 37 ° C. for several days to induce the formation of alginate microfibers out of the beads.

실험예Experimental Example 1:  One: AlgAlg -- CaPCaP 비드로부터From beads 형성된  Formed 알지네이트Alginate 마이크로섬유의 형태 조사 Morphology survey of microfibers

도 1은 Alg-CaP 비드로부터 알지네이트 마이크로섬유가 형성되는 메커니즘을 도식적으로 나타낸 것이다.1 schematically illustrates the mechanism by which alginate microfibers are formed from Alg-CaP beads.

Alg-CaP 방울이 CaCl2 용액과 접촉하게 되면, 상기 비드의 표면이 경화되어 얇은 표피 겔 층을 형성하였다. 그 후 상기 비드를 꺼내어 세포 배양 배지 중에서 배양하였다. Alg-CaP 비드를 약 5 시간 동안 37 ℃에서 배양 배지 중에서 배양하는 도중, 섬유가 표면 밖으로 나기 시작하였다. 이러한 섬유는 수일 이후에 약 10 mm 길이와 약 7 μm 직경으로 성장하여 마이크로섬유상의 숲으로 상기 비드 표면을 완전히 덮었다. When the Alg-CaP droplets came in contact with the CaCl 2 solution, the surface of the beads cured to form a thin epidermal gel layer. The beads were then taken out and cultured in cell culture medium. During the incubation of the Alg-CaP beads in the culture medium at 37 ° C. for about 5 hours, the fibers began to come out of the surface. These fibers grew about 10 mm long and about 7 μm in diameter after several days to completely cover the bead surface with a microfibrous forest.

알지네이트 섬유의 생성은 5일 동안의 배양 기간에 걸쳐 모니터링되었다(도 2a). 섬유와 비드의 3D 형태는 시료를 동결 건조시킨 후 SEM으로 조사하였다(도 2). 5일째, 비드 상으로 다수의 섬유가 밤송이와 유사한 형태로 관찰되었다. 상기 마이크로섬유는 약 7 μm의 두께를 갖는 관 구조를 가졌다. 상기 섬유는 비드 표면에 존재하는 몇몇의 간극 또는 균열로부터 발생하는 것으로 나타났다. 완전히 성장한 섬유는 약 10 일 이후에 분해되는 것으로 나타났다.
The production of alginate fibers was monitored over a 5 day incubation period (FIG. 2A). 3D morphology of the fibers and beads were examined by SEM after freeze drying of the sample (FIG. 2). On day 5, a number of fibers were observed in bead-like form on the beads. The microfibers had a tubular structure with a thickness of about 7 μm. The fibers have been shown to arise from several gaps or cracks present in the bead surface. Fully grown fibers were found to degrade after about 10 days.

Alg-CaP 비드로부터 하이드로겔 섬유가 성장하는 방식을 조사하기 위하여, CaP를 가지거나 가지지 않는 비드, 즉 Alg-CaP 비드 및 Alg 비드를 제조된 그대로 동결건조한 다음 SEM을 이용하여 표면 및 내부 형태를 관찰하였다.To investigate the manner in which hydrogel fibers grow from Alg-CaP beads, beads with or without CaP, ie Alg-CaP beads and Alg beads, were lyophilized as prepared and the surface and internal morphology were observed using SEM. It was.

그 결과를 도 3에 나타내었다.The results are shown in Fig.

일반적으로 칼슘 가교된 알지네이트는 알지네이트 모노머가 칼슘 이온과 이온 결합을 통해 3차원적으로 망상 구조화된, 다량의 물을 함유하는 하이드로겔 특성을 갖는다. 동결 건조된 후, 내부의 고도 다공성 구조가 Alg 비드의 하이드로겔 특성을 나타내었다(도 3a). 그러나, 표면은 CaCl2 용액 중에서 가교되어, 고도로 치밀하였다. 소량의 CaP (1%)를 첨가한 경우, 내부의 다공성 형태 및 외부의 치밀한 형태가 순수한 알지네이트 비드에서 관찰된 것과 유사하였다(도 3b). 그러나, CaP의 양을 10%로 증가시킨 경우, 놀랍게도 표면 상에서 많은 간극/미소기공이 관찰되었으며, 이점이 순수한 알지네이트 비드와 극히 대조적이었다(도 3c). 상기 기공 크기는 수 내지 수십 마이크로미터인 것으로 나타났다. 또한, 순수한 알지네이트에서는 드문 거대 기공이었으나 10% (w/v) CaP를 함유하는 Alg-CaP에서는 수많은 미소기공으로 변화되는 것으로 관찰되어, 내부 기공 크기가 크게 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 미소기공 내부 구조는 첨가된 CaP와 알지네이트 분자 간의 상호작용을 통해 발생된 것으로 보였다.
In general, calcium crosslinked alginates have hydrogel properties that contain large amounts of water, in which the alginate monomers are three-dimensionally network structured through ionic bonds with calcium ions. After freeze drying, the highly porous structure therein showed the hydrogel properties of Alg beads (FIG. 3A). However, the surface was highly cross-linked in CaCl 2 solution. When a small amount of CaP (1%) was added, the inner porous form and the outer dense form were similar to those observed in pure alginate beads (FIG. 3B). However, when the amount of CaP was increased to 10%, surprisingly many gaps / micropores were observed on the surface, which was in stark contrast to pure alginate beads (FIG. 3C). The pore size was found to be several to several tens of micrometers. It was also observed that in Alg-CaP containing 10% (w / v) CaP, numerous rare pores were observed in pure alginate, resulting in a significant decrease in internal pore size. This micropore internal structure appeared to be generated through the interaction between the added CaP and alginate molecules.

한편, 세포 배양 배지 내에서 배양하는 도중 비드 표면으로부터 하이드로겔 섬유가 발생하여 성장하는 메커니즘에 주목하였다. 헐겁게 가교된 비드의 내부에 존재하는 알지네이트 용액은 초기에 비드 표면의 간극을 통해 밖으로 나와야만 한다. 삼출된 알지네이트는 배지(세포 배양 배지, 1.82 mM의 Ca도 포함함)에 접촉하고, 이러한 접촉 표면이 경화되며, 동시에 알지네이트의 계속적인 방출과 이후 표면 경화가 발생하여 결과적으로 관상의 섬유상 형태를 형성하는 것으로 나타났다(도 4).Meanwhile, attention was paid to the mechanism by which hydrogel fibers are generated and grown from the bead surface during culturing in cell culture medium. Alginate solutions present inside the loosely crosslinked beads must initially exit through the gaps on the bead surface. The exuded alginate contacts the medium (cell culture medium, also contains 1.82 mM Ca), and this contact surface is cured, while at the same time continuous release of alginate and subsequent surface hardening occur, resulting in the formation of a tubular fibrous form. (FIG. 4).

따라서, 상기와 같이 Ca-함유 비재 중에서 알지네이트 함유 CaP 비드를 배양시킴에 따라 비드 상에 알지네이트의 섬유상 숲이 형성될 수 있음을 알 수 있다.Therefore, it can be seen that the fibrous forest of alginate can be formed on the beads by culturing the alginate-containing CaP beads in the Ca-containing ash as described above.

또한, 상기 섬유상 비드는 세포가 이주하고 증식할 수 있는 3D 섬유상 매트릭스를 제공하므로 세포의 인시츄 배양에 유용함을 알 수 있다.In addition, it can be seen that the fibrous beads are useful for in situ culture of cells because they provide a 3D fibrous matrix through which cells can migrate and proliferate.

Claims (10)

인산 칼슘 화합물 및 알지네이트의 혼합 용액을 제조하는 단계(단계 1);
상기 혼합 용액을 칼슘 이온 수용액에 투입하고 교반하여 비드를 형성시키는 단계(단계 2); 및
상기 비드를 식염수 중에 투입하여, 비드 상에 알지네이트 마이크로섬유를 형성시키는 단계(단계 3)를 포함하는 알지네이트 마이크로섬유의 제조방법.
Preparing a mixed solution of calcium phosphate compound and alginate (step 1);
Adding the mixed solution to an aqueous solution of calcium ions and stirring to form beads (step 2); And
Injecting the beads in saline, to form an alginate microfibers on the beads (step 3) manufacturing method of alginate microfibers.
제1항에 있어서, 상기 인산 칼슘 화합물은 트리칼슘 포스페이트, 하이드록시 아파타이트, 모노칼슘 포스페이트, 테트라칼슘 포스페이트, 디칼슘 포스페이트 또는 이의 조합인, 알지네이트 마이크로섬유의 제조방법.
The method of claim 1, wherein the calcium phosphate compound is tricalcium phosphate, hydroxy apatite, monocalcium phosphate, tetracalcium phosphate, dicalcium phosphate or a combination thereof.
제1항에 있어서, 상기 인산 칼슘 화합물과 알지네이트의 혼합 비율은 중량기준으로 인산 칼슘 화합물:알지네이트의 비율이 2:1 내지 1:5인, 알지네이트 마이크로섬유의 제조방법.
The method of claim 1, wherein the mixing ratio of the calcium phosphate compound and the alginate is a calcium phosphate compound: alginate ratio of 2: 1 to 1: 5 by weight.
제1항에 있어서, 상기 칼슘 이온의 농도는 10 내지 200 mM인, 알지네이트 마이크로섬유의 제조방법.
The method of claim 1, wherein the concentration of calcium ions is 10 to 200 mM.
제1항에 있어서, 상기 교반 시간은 10 내지 60 분인, 알지네이트 마이크로섬유의 제조방법.
The method of claim 1, wherein the stirring time is 10 to 60 minutes.
제1항에 있어서, 상기 식염수는 세포를 추가로 포함하는, 알지네이트 마이크로섬유의 제조방법.
The method of claim 1, wherein the saline solution further comprises cells.
제6항에 있어서, 상기 세포는 조골세포, 섬유아세포, 줄기세포 또는 이의 조합인, 알지네이트 마이크로섬유의 제조방법.
The method of claim 6, wherein the cells are osteoblasts, fibroblasts, stem cells, or a combination thereof.
제6항에 있어서, 상기 식염수는 세포 배양을 위한 성분을 추가로 포함하는, 알지네이트 마이크로섬유의 제조방법.
The method of claim 6, wherein the saline solution further comprises a component for cell culture.
제8항에 있어서, 상기 세포 배양을 위한 성분은 우태아 혈청, 항생제 또는 이의 조합인, 알지네이트 마이크로섬유의 제조방법.
The method of claim 8, wherein the component for cell culture is fetal bovine serum, antibiotic or a combination thereof.
제1항에 있어서, 상기 단계 3은 5 시간 내지 10 일간 수행되는, 알지네이트 마이크로섬유의 제조방법.The method of claim 1, wherein step 3 is performed for 5 hours to 10 days.
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