KR101317945B1 - 양파껍질의 아임계 수추출물의 항산화제 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 농산 부산물로서 폐기되는 양파껍질을 정제수를 추출용매로 하는 아임계 수추출방법을 제공하며 상기 방법에 의하여 제조된 양파껍질의 아임계 수추출물을 유효성분으로 하는 항산화제를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

양파껍질의 아임계 수추출물의 항산화제 용도{An antioxidantal use of subcritical water extracts of onion peels}

본 발명은 양파껍질의 아임계 수추출방법에 의하여 얻은 아임계 수추출물의 용도에 관한 것으로 양파의 아임계 수추출물의 항산화제로서의 용도로 사용할 수 있다.

양파 (Allium cepa L.)는 백합과에 속하는 다년생 식물로, 재배 역사가 오래되었고 특유의 맛과 향기를 지니고 있어 고추, 마늘 등과 더불어 전 세계적으로 많이 이용되고 있는 조미 채소 중의 하나이다.

최근의 연구에 의하면 양파에는 항산화 작용을 나타내는 플라보노이드계 물질과 기타 다양한 생리활성을 갖는 황화합물이 함유되어 있는 것으로 밝혀져 성인병 예방을 위한 기능성 식품으로서의 관심이 증가되고 있다. 그런데, 국내 농산물의 식품가공분야에 사용되는 양파의 10~30%는 그 껍질(peels)로서 매년 부산물이 발생하는데 이는 대부분 폐기되는 경우가 많다. 이들 폐기되는 농산 부산물은 기능성 소재로 사용되는 경우에는 농가소득을 증대하여 농촌경제에 일조할 수 있다. 특히, 양파 부산물인 양파껍질(onion peels)로부터 항균 또는 항산화 기능성 물질을 추출할 수 있다면 농촌경제를 활성화할 수 있다.

농산식품 및 그 부산물의 추출법은 속슬렛(Soxhlet) 추출과 용매추출이 대표적인 추출법으로 이용되고 있다. 그러나 이러한 추출법들은 추출 시간이 길고 아세톤, 디클로로메탄 그리고 헥산 등 다량의 용매에 의한 2차 오염을 유발 시킬 수 있다.

아임계 수추출법(subcritical water extraction; SWE)은 고체나 반고체 시료에서 온도와 압력에 따른 물의 유전상수의 변화를 이용하여 특정 유기물을 단시간 내에 추출할 수 있는 방법이다. 또한 추출 용매로 물을 사용하여 분리과정에서 사용되는 유기용매를 크게 줄일 수 있다. 아임계 조건은 물의 액체, 기체상태가 공존하는 임계점(critical point: T = 374.2℃, P = 218.3 atm) 이하의 온도와 압력 범위를 말한다. 물은 임계점 근처의 압력 50-150 기압과 온도 200-300℃에서 분자 간 수소결합이 끊어지면서 고유의 극성을 잃게되어 유전상수가 급격하게 감소된다. 이때 물의 유전상수는 2.5 이하가 되어 특정 유기물에 대한 추출용매로서 사용될 수 있다.

대한민국등록특허제10-0620568호"초임계/아임계수를이용한콩으로부터이소플라본의추출,분리및정제방법" 대한민국등록특허제10-0626221호"아임계／초임계유체및초음파를이용한건강쌀의제조장치및그제조방법" 대한민국등록특허제10-0452467호"초임계또는아임계유체를이용하여유자로부터기능성물질추출및산화성물질제거하기위한방법" 대한민국특허출원제10-2002-0069524호"초임계및아임계유체추출공정을이용하여고추냉이로부터항균성물질을추출하는방법"

Griffiths G, et. al., onion-a global benefit to health. Phytother. Res. 16: 603-615 (2002) Jakubowski H, On the health benefit of Allium sp. Nutrition 19: 167-168 (2003) Turner C, et. al., Subcritical water extraction and β-glucosidase-catalyzed hydrolysis of quercetin glycosides in onion waste. Green Chem. 8: 949-959 (2006) Ramos L, et. al., Current use of pressurized liquid extraction and subcritical water extraction in environmental analysis. J. Chromatogr. A. 975: 3-29 (2002)

따라서, 본 발명의 목적은 식품산업에서 발생되는 부산물인 양파껍질로부터 아임계 수추출법(SWE)을 이용하여 양파껍질 아임계 수추출물을 얻고 이를 유효성분으로 하는 항산화제로서의 용도를 제공하는 데 있다.

본 발명의 상기 목적은 양파껍질을 아임계 수추출하는 단계와; 상기에서 얻은 양파껍질 유래의 아임계 수추출물의 항산화 기능성을 검증하고 그 항산화제로서의 용도를 평가하는 단계를 통하여 달성하였다.

본 발명은 상기 과제해결수단에 의하여 항산화제용 양파껍질 아임계 수추출물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

도1은 본 발명 실시에 따른 바람직한 양파껍질의 바람직한 아임계 수추출방법의 공정을 보인 다이어그래프이다.
도2는 본 발명 양파껍질의 아임계 수추출물과 기타 다양한 추출물에 대한 항산화 효과를 보인 그래프이다.

실험재료 및 양파 시료의 제조

본 실험에 사용한 양파는 경상북도 의성산 양파로 시장에서 구입하여 사용하였다. 양파의 주황색의 외피 만을 사용하여 60℃에서 열풍 건조시킨 후 고속믹서기 (Blender 7012S, Waring, Torrington, USA)를 이용하여 가루 (1-10 mm)로 잘게 파쇄하여 냉장보관 (4-5℃)하며 실험에 사용하였다.

에탄올 추출

양파 껍질 20 g과 70%(v/v) 에탄올 200 mL을 혼합하고, 60℃에서 3시간 동안 추출하였다. 추출 후 Whatman No. 2 filter paper로 여과하였고, 여과 후 걸러진 잔류물은 같은 조건에서 두 번 더 추출하였다. 추출한 에탄올 추출물은 감압농축기 (EYELA N-1000V, Tokyo, Japan)를 사용하여 용매를 제거, 농축하였다. 감압농축 후 추출물은 동결건조하여 냉동보관하며 본 발명 대조구 실험에 사용하였다.

열수 추출

양파 껍질 20 g과 70%(v/v) 증류수 200 mL을 혼합하고, 80℃에서 3시간 동안 추출하였다. 추출 후 Whatman No. 2 filter paper로 여과하였고, 여과 후 걸러진 잔류물은 같은 조건에서 두 번 더 추출하였다. 추출한 열수 추출물은 감압농축기 (EYELA N-1000V, Tokyo, Japan)를 사용하여 증류수를 제거, 농축하였다. 감압농축 후 추출물은 동결건조하여 냉동보관하며 본 발명 대조구 실험에 사용하였다.

아임계 수추출물의 제조

양파껍질 추출을 위하여subcritical extractor system (DIONEX ASE 100, Dionex Corporation, Sunnyvale, California, USA)을 사용하였다. 잘게 파쇄한 양파껍질과 규조토(diatomaceous earth; DE)를 적절하게 배합하여 34 mL 또는 66 mL 크기의 충진기에 넣고 추출기에 장착한 후 추출하였다. 양파껍질과 DE의 바람직한 배합비(무게)는 1:3 또는 1:2 이다. 추출용매는 Milli-Q water만을 사용하여 각각의 추출온도와 추출시간을 설정하여 추출하였다 (도 1). 황색포도상구균의 항균 실험을 위한 추출조건은 가장 바람직하기로는 60기압 및 110℃에서 15분 추출물을 사용하였고 비교군으로는 퀘르세틴(quercetin)을 사용하였다. 본 발명 항산화 실험을 위해서 60기압 및 110℃와 165℃에서 각각 15분간 추출한 열수 추출물을 사용하여 BHT와 항산화능을 비교 측정하였다. 본 발명 수 추출물 시료는 4℃ 냉장고에서 저장하며 사용하였다.

총 polyphenol 함량 측정

Phenol 함량은 Folin-Denis법에 따라 비색 정량하였다. 일정하게 희석한 추출액 0.1 mL과 2% Na₂CO₃ 2 mL과 혼합하여, 실온에서 3분 간 방치 후 Folin-Ciocalteau 시약 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 0.1 mL을 첨가하였다. 혼합 후 30분 후 Spectrophotometer를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 quercetin을 농도 별로 조제하여 얻은 표준 검량곡선으로부터 시료 추출물의 총 phenol 함량을 산출하였다.

총 폴리페놀 화합물은 Folin 시약에 대한 추출물의 환원력 측정에 의해 분석된다. 표 1의 결과, 본 발명에서 사용된 양파 껍질 추출물의 총 폴리페놀 함량은 추출 방법에 따라 유의적 차이를 보였다. 양파 껍질의 총 폴리페놀 함량 범위는 26.68-372.5 mg 퀘르세틴(quercetin)/g 추출액(extract) 이다.

추출물 g당 총 폴리페놀 함량은 에탄올 추출물에서 가장 높았다 (372.5 mg quercetin/g extract). 그러나 양파 껍질 원재료 1 g에 대한 함량은 110℃에서 15분 동안 추출한 아임계 추출물이 가장 높았다(38.84 mg quercetin/g 양파껍질(onion peel).

SWE 추출 조건에 따른 함량은 110℃ 아임계 추출물이 165℃ 아임계 추출물 보다 높은 함량을 보였다. 이는 165℃ 아임계 추출물이 고온 상태에서 추출되므로 양파 껍질의 유효성분이 파괴, 분해된 것으로 사료된다.

총 flavonoid 함량 측정

각 추출물의 총 플라보노이드(flavonoid) 함량은 aluminum chloride법에 따라 비색 정량하였다. 추출액 0.5 mL에 95% 에탄올 1.5 mL, 10%(w/v) aluminum chloride hexahydrate (AlCl₃) 0.1 mL, 1 M potassium acetate (CH₃COOK) 0.1 mL 및 증류수 2.8 mL를 차례로 가하여 충분히 교반한 다음 실온에서 30분 간 방치한 후 415 nm에서 Spectrophotometer로 흡광도를 측정하였다. Quercetin을 표준물질로 작성된 표준 검량곡선으로부터 시료 추출물의 총 flavonoid 함량을 산출하였다.

양파 껍질 추출물의 총 flavonoid 함량은 플라본과 플라보놀의 C-3 또는 C-5 hydroxyl 그룹이 aluminum chloride와 반응하여 안정한 복합체를 형성하는 원리를 사용한 것이다.

에탄올 추출물의 총 flavonoid 함량이 (183.95 mg quercetin/g extract) 가장 높으나 110℃에서 15분 추출한 아임계 추출물이 총 폴리페놀 함량에 대한 총 flavonoid의 비율이 54% 이상으로 본 발명에서 사용된 다른 추출물보다 높았다. 따라서 양파 껍질에 다량 존재하는 flavonoid류를 추출하는 방법으로는 110℃ 아임계 추출이 적합한 것을 관찰하였다 (표 2).

DPPH 법에 의한 항산화 활성 측정

양파 추출물 0.2 mL과 100 μM DPPH 용액 1 mL 과 균질하게 혼합하였다. 실온에서 15분 간 방치 후 혼합물의 흡광도는 Spectrophotometer (Optizen 2120 UV, Daejeon, Korea)로 517 nm에서 측정하였다.

DPPH 법은 DPPH free radical 에 대한 추출물의 환원력을 측정하는 것으로 DPPH free radical을 제거하여 DPPH 용액의 색의 변화를 관찰하는 비색법이다. 표 3의 결과와 같이, SWE 추출물의 라디칼 소거능은 추출온도가 낮을수록 증가되었다. 165℃, 15분 추출한 아임계 추출물은 11.45%의 항산화능을 보이는 반면, 110℃, 15분 추출한 아임계 추출물은 약 6배 높은 항산화능인 64.72%로 나타났다. 에탄올 추출물은 70% 이상으로 추출물 중 가장 높은 항산화능을 확인하였다. 이는 추출물 1 g당 유효성분의 함량과 동등한 결과 이다. 165℃, 15분 추출한 아임계 추출물을 제외한 모든 추출물들은 0.02 mg/mL의 BHT 보다 높은 항산화능을 보이나, 0.2 mg/mL BHT 보다는 낮은 활성을 나타냈다.

Thiobarbituric acid (TBA) test에 의한 항산화 활성 측정

Valenzuela 등과 Antonella 등의 방법에 따라 Fe²⁺에 의해 유도된 linoleate의 과산화에 대한 억제효과를 thiobarbituric acid (TBA)로 발색시켜 측정하였다. 먼저 0.5 mL의 linoleic acid와 0.25 mL의 Tween 60을 섞은 후 50 mL의 증류수를 가하고, 1 N KOH로 중화시킨 다음 0.05 M potassium phosphate buffer 110 mL에 부유시켜서 10 mM의 linoleic acid 용액을 만들었다. Methanol에 녹인 추출시료를 농도 별로 희석하여 40μL와 10 mM linoleic acid 용액 10 mL을 섞은 후 37℃에서 1시간 동안 교반기 (KMCS 489S, Vision Scientific, Korea)에서 반응시켰다. 여기에 0.05 M FeSO_4.7H₂O 20 μL를 넣고 37℃에서 2시간 동안 교반하여 과산화를 유발시킨 후 800 μL를 취하고 400 μL의 TBA reagent를 첨가한 다음 boiling water bath에서 15분 간 가열한 후 냉각시켰다. 생성된 지질 과산화물을 560μL의 n-butanol로 용해시켜 3,000 rpm에서 20분간 원심분리 후 상층액을 취하여 Spectrophotometer를 이용하여 535 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 positive control로 BHT를 사용하였다.

Linoleic acid의 자동산화에서 최종 산물인 malonaldehyde는 thiobarbituric acid (TBA)와의 반응에 의해 붉은색의 복합체를 형성한다. 항산화능 측정결과 에탄올 추출물 추출의 항산화 활성이 가장 높았으며, 이외의 다른 추출물은 2.37%에서 5.34%에 범위로 유의적인 차이는 없었다 (표 4).

본 발명에서 아임계수에 의해 추출한 양파껍질 추출물의 항산화능에 대해 연구하였다. 양파 껍질의 항산화능은 BHT와 에탄올 추출물에 비해 비교적 낮은 항산화능을 보였으나, SWE는 유기용매를 사용한 전통적인 추출법을 대체할 수 있는 추출법임은 분명하다. SWE는 어떤 독성 화합물을 사용하거나 생산하지 않고, 게다가 천연에서 얻어진 성분을 요구하는 식품산업에서 SWE는 양파 껍질로부터 얻어진 유효성분의 추출에 적합한 추출법이다.

일반적으로, 아임계 수추출물의 사용은 전통적인 추출기술 이상의 많은 장점을 제공한다. 이것들은 주로 추출시간이 적고, 추출물의 질이 높으며 추출하는 약품의 비용이 적고, 환경적으로 양립 할 수 있는 기술이다. 식품가공 중에 부산물로 생성된 양파 껍질로부터 SWE의 기술을 사용하여 유용한 성분을 추출하고 이에 대한 기능성을 검증하고, 대량 생산한다면 산업적 가치가 증가될 것이다.

Ferric thiocyanate test에 의한 항산화 활성 측정

지질 과산화에 의해 생성된 ferric thiocyanate를 정량하여 항산화능을 측정하였다. 이 방법은 Osawa와 Namiki의 방법에 따라 수행하였다. 0.1 mL의 SWE 양파 추출물과 ethanol에 용해 시킨 linoleic acid 용액 (25 mg/mL) 0.2 mL, 40 mM phosphate buffer (pH 7.0) 0.4 mL, 증류수 0.2 mL를 혼합하였다. Methanol에 용해시킨 BHT는 positive control로 사용하였다. 이렇게 조제한 혼합물은 screw-cap이 있는 갈색 vial에서 37℃에서 4일 동안 저장하면서 흡광도 변화를 측정하였다. 저장 중 0.1 mL 혼합물과 70% ethanol 4 mL, 30% ammonium thiocyanate 0.1 mL을 첨가하여, 3.5% hydrochloric acid에 용해시킨 20 mM ferrous chloride 0.1 mL과 함께 3분 반응 후, 형성된 붉은 색 화합물은 Spectrophotometer를 사용하여 500 nm 에서 측정하였다.

Ferric thiocyanate (FTC)법은 지질 과산화 초기 단계에서 생성된 과산화물의 양을 측정하는 것이다.

도 2는 양파 추출물을 처리한 시료를 37℃ 인큐베이터에서 4일 동안 저장하면서 흡광도의 변화를 관찰한 것이다. Methanol의 흡광도는 시간에 비례하여 증가되었으나, 추출물 처리구는 저장 2일 후에도 낮은 흡광도를 보였다. 저장 4일째 110℃, 15분 SWE 추출물이 다른 어떤 추출물보다 낮은 흡광도로 다른 추출물에 비해 높은 항산화능을 보였다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명은 60기압, 110℃에서 15분간 수행한 아임계 수추출물은 항산화제로서의 용도를 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 생물의약 및 식품가공산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (1)

1. 세절한 양파껍질과 규조토를 무게비 1:2 또는 1:3으로 배합하여 시료를 준비하고 34mL 또는 66mL 크기의 충진기에 넣어 장착한 다음 증류수를 첨가하여 60기압 및 110℃에서 15분간 추출함을 특징으로 하는 양파껍질의 아임계 수추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화제.

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