KR101258635B1

KR101258635B1 - Ａ형 인플루엔자 바이러스 Ｈ1Ｎ1 억제 활성을 갖는 Ｂｒａｓｓｉｃａｊｕｎｃｅａ 종자의 아임계수 추출물을 함유한 무지방 우유

Info

Publication number: KR101258635B1
Application number: KR1020100126564A
Authority: KR
Inventors: 백현동; 김영봉; 정명수; 임성민; 이장현; 이경아
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2010-12-10
Filing date: 2010-12-10
Publication date: 2013-04-26
Also published as: KR20120065190A

Abstract

본 발명은 백개자(Brassica juncea)의 종자를 110℃ 의 아임계수로 추출물을 무지방 우유에 첨가하여 A형 인플루엔자 바이러스 H1N1에 대한 저해 활성을 MTT assay를 통하여 확인하고 무지방 우유에 첨가하여 그 이화학적 특성을 검증한 결과, 110℃에서 추출한 백개자 아임계수 추출물의 최대 무독성 농도는 5 mg/mL로 나타났으며 무지방 우유에 2.5 mg/mL 농도로 첨가한 항바이러스 기능성 무지방 우유를 제공할 수 있음을 확인하였을 뿐 아니라, 상기 Brassica juncea 종자의 아임계수 추출물을 신규한 식품첨가물의 용도로서 제공하는 뛰어난 특징이 있다.

Description

Ａ형 인플루엔자 바이러스 Ｈ1Ｎ1 억제 활성을 갖는 Ｂｒａｓｓｉｃａｊｕｎｃｅａ 종자의 아임계수 추출물을 함유한 무지방 우유{A non-fat milk containing subcritical water extract of Brassica juncea seeds with inhibitary activity against A type influenza virus H1N1}

본 발명은 A형 인플루엔자 바이러스 H1N1 억제활성물질을 함유한 식품 더욱 상세하게는, Brassica juncea 종자 아임계수 추출물을 함유한 A형 인플루엔자 바이러스 H1N1 억제기능성 무지방 우유에 관한 것이다.

A형 인플루엔자 바이러스 H1N1의 인체 감염사례는 2009년 4월 멕시코, 미국에서 첫 발생 보고된 후, 돼지유래 신종 플루(이하 신종 플루, Swine influenza, 2009 H1N1)는 급속히 전 세계로 확산되었다. 세계보건기구(World Health Organization, WHO)는 신종 플루가 전 세계적으로 확산되면서 28,744명의 감염자와 144명의 사망자를 초래하자 21세기 최초의 인플루엔자 대유행을 선언하고 각국의 신속한 대응을 촉구하였지만, 2009년 12월까지 신종 플루로 인한 사망자수는 세계적으로 11,516명에 이르렀다. 국내 질병관리본부의 보도 자료에 의하면 2009년 5월 국내 최초로 신종 플루 감염환자가 보고된 이후, 8월 15일 경남 지역에서 첫 사망 환자가 발생하였고 국가적인 방지 대책에도 불구하고 전파 속도는 급속히 확산되어, 12월 초 하루 감염자수가 1만 명에 육박하였고 사망자수는 117명으로 급격히 증가 하였다. 또한 신종 플루에 대해서는 호발 연령대가 학령기이며 고 위험군이 아닌 경우에도 사망이 많았다는 점 등의 결과가 외국에서 보고되고 있다.

인플루엔자 바이러스 백신 및 항바이러스제에 관련 특허문헌으로 대표적인 것이 10-1,124,360호, 10-767,500호, 10-5,932,350호, 10-1,707,520호, 10-5,556,870호, 10-9,407,760호, 10-7,022,750호, 10-7,035,710호, 10-8,710,210호, 10-5,680,130호외 공개특허번호 10-2007-7024044호, 10-2007-7013714호, 10-2007-7029582호, 10-2006-7011453호, 10-2007-14124호 등이 공지되어 있으며 현재, 인플루엔자 바이러스에 대한 치료법으로 백신 외에 항바이러스제로서 사용되고 있는 것에는 타미플루(Tamiflu) 상표 명으로 판매되고 있는 oseltamivir 외에도 amantadine, rimantadine, zanamivir 등을 들 수 있다. 그러나, 현재 사용 중인 iododeoxyuridine(IDU), acyclovir(ACV), azidothymidine(AZT), interferon(IFN) 등 항바이러스제 대부분은 세포 독성, 신경 정신학적 증상 등 여러 가지 부작용을 나타내며, 상기 언급한 신종 플루 바이러스 A와 B 및 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 치료제로 개발된 oseltamivir의 경우에도 노약자에게 투여 시 구토, 기관지염, 기침, 현기증 등의 부작용이 보고되었다. 또한, 상기 항바이러스제는 인플루엔자 바이러스에 대하여는 효과적으로 방어할 수 있지만, 투여 과정 상 번거로움으로 사용이 제한적이 될 수 있으며, 기존 약물에 대한 내성을 갖는 변종 인플루엔자 바이러스의 출현도 증가하는 것으로 보고되고 있어, 부작용이 적고 안전성이 확보된 신규 항바이러스제의 필요성이 지속적으로 요구되고 있다. 특히 천연물로부터의 항바이러스 활성 물질의 탐색에 많은 관심이 집중되고 있다.

한국을 비롯한 아시아와 남아메리카에서는 각종 질환에 대해 전통적으로 사용해 오는 약용 식물을 이용하여 치료와 예방을 하였으며, 이러한 약용 식물에 포함된 천연 항바이러스 물질의 약리 작용에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

천연 항바이러스 활성물질에 관한 특허문헌으로는 10-2004-90001호, 10-2007-996호, 10-2007-141245호, 10-2009-33167호, 10-2009-101628호, 10-2008-97442호가 개시되어 있다. 그러나, 본 발명자들은 Brassica juncea 종자의 아임계수 추출물의 A형 인플루엔자 H1N1에 대한 항바이러스 활성은 지금까지 보고한 바 없다. Brassica juncea 종자의 백개자는 쌍떡잎식물 이판화군 겨자과의 2년 초 또는 한해살이 식물로서 부패 방지 작용 및 신경통, 관절염, 통풍, 폐렴의 호흡 곤란 등에 대한 치료 목적으로 전통적으로 사용해오던 약용 식물이다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기 Brassica juncea 종자의 아임계수 추출물의 A형 인플루엔자 H1N1에 대한 항바이러스 활성을 규명하고, 이를 함유하는 무지방 우유를 제공하는 데 있다.

본 발명의 상기 목적은 유기용매를 처리하지 않고 아임계수 추출법으로 상기 백개자를 추출하여 동결건조하는 단계, 상기 아임계수 추출물을 무지방 우유에 첨가하여 항바이러스 효과와 저장 기간 중의 성분, pH, 산도, 미생물 균수 및 색도를 측정하여 항인플루엔자 활성 기능 및 이화학적 특성을 규명하므로써 달성하였다.

본 발명 백개자의 아임계수 추출물을 무지방 우유에 적용하여 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 기능성 무지방 우유를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

도 1 은 백개자(Brassica juncea seeds)의 아임계수 추출물을 제조하는 공정도이다.
도 2 는 백개자의 아임계수 추출물이 첨가된 무지방 우유의 항바이러스 효과를 보인 그래프이다.

공시재료 아임계수 추출물 제조

국내산 Brassica juncea의 종자를 subcritical extractor system (DIONEX ASE 100, Dionex Corporation, Sunnyvale, California, USA)을 사용하여 추출하였다. Brassica juncea의 종자 분말 10 g을 6 g의 규조토와 혼합한 후 추출 system에 장착하여, 110℃에서 10분 간 추출하였다(도 1). 추출액을 0.45 μm syringe filter에 여과한 후 동결 건조하여 4℃에 보관하면서 공시재료로 사용하였다.

백개자 아임계수 추출물 첨가 무지방 우유

마켓에서 무작위로 구입한 무지방 우유(매일우유, 서울)에 2.5, 5.0 mg/mL의 함량으로 위생적인 환경에서 첨가하였으며, 시중에 유통되고 있는 유제품의 저장 조건인 4℃이하의 냉장조건에서 10일 동안 저장하며 실험하였다.

인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 활성은 도 2에 나타나 있다. 우유의 vitamin A은 cell을 저해하고, 우유는 MTT assay에 의한 흡광도 값의 변화를 주기 때문에, 모든 시료는 3배수로 희석을 하여 사용하였다. 3^-1, 3^- ²희석배수에서는 cell viability가 감소한 것은 이와 같은 양상이다. 본 실험에서 3^-3희석배수에서 2.5 mg/ml의 농도로 백개자 아임계수 추출물을 첨가한 무지방 우유는 인플루엔자 바이러스에 대해 40%의 항바이러스 효과를 확인할 수 있었다.

백개자 아임계수 추출물을 첨가하지 않은 무지방 우유의 fat, protein, lactose, total solid는 0.7-0.112%, 3.53-3.77%, 4.00-4.46%, 9.28-10.14%였다. 백개자 아임계수 추출물을 첨가한 군과 비교하였을 때 큰 차이가 발견되지 않았으며, 저장 기간에 따른 성분 변화도 없었다(표 1).

바이러스 증식

본 발명에 사용된 인플루엔자 바이러스는 Influenza A/Puerto Rico/8/24 (H1N1)으로서 10일 간 부화시킨 수정란의 장뇨액(allantoic fluid)에서 증식시켰다. 추출물의 항바이러스 활성 측정을 위해 사용된 Madin-Darby canine kidney (MDCK) cell line은 10%의 FBS(heat inactivated fetal bovine serum)와 penicillin-streptomycin이 첨가된 MEM(Eagle's minimum essential medium)에 계대배양하여 사용하였다. 바이러스 감염 및 항바이러스 활성 검증을 위해 사용된 MEM 배지는 0.3%의 BSA(bovine serum albumin), penicillin-streptomycin 및 1 μg/mL의 trypsin-TPCK(N-tosyl-L-phenylalanine chloro-methyl ketone)을 첨가하여 사용하였다.

항바이러스 활성 측정

백개자 아임계수 추출물을 첨가한 무지방 우유의 항바이러스 활성을 검증하기 위해 MDCK 세포를 항생제와 10%의 FBS가 첨가된 MEM 배지를 이용하여 96-well plate에 배양하였다. 24시간 후 단층 배양된 MDCK 세포에 100TCID₅₀의 H1N1 조류인플루엔자 바이러스를 접종하고, 바이러스의 감염을 위해 2시간 동안 다시 배양하였다. 무지방 우유의 유통 기한은 유통 후 7일이므로, 바이러스에 감염된 MDCK 세포를 세척한 후 저장 8일 째의 백개자 아임계수 추출물을 첨가한 무지방 우유를 3배수 희석법으로 희석하여 포함한 배지를 첨가하였다. 48시간 후 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) assay를 통하여, 항바이러스 활성 여부를 검증하였다.

항바이러스 기능성 무지방 우유의 성분 측정

기능성 무지방 우유의 fat, protein, lactose, total solid 함량은 Milkoscan FT120(Foss Electric, Hillerod, Denmark)으로 측정하였다.

pH , 산도 측정

pH는 30 mL의 샘플을 pH 미터(model 340)로 측정하였으며, 산도는 국제분석방법공인시험서(AOAC, 1997)의 방법에 따라 샘플 10 mL을 0.1 N NaOH로 적정하여 소비된 mL를 함량(%)으로 나타내었다.

저장기간에 따른 pH 측정 결과, 첨가군과 비첨가군의 특이적인 차이가 발견되지 않았다. 산도 측정 결과는 백개자 아임계수 추출물을 5.0 mg/mL의 농도로 첨가한 무지방 우유의 경우 비첨가 군과 2.5 mg/mL 무지방 우유보다 높게 나타났으나, 우유의 품질에 영향을 주는 범위는 아니었다(표 2 및 표 3).

저장기간 동안 미생물에 대한 안전성 실험결과, 허용 기준치를 벗어나지 않았다.

미생물 균수 측정

백개자 아임계수 추출물을 첨가한 무지방 우유의 미생물의 총 균수를 측정하기 위하여 pour plate method를 사용하였다. 모든 시료는 1 mL에 0.1% 멸균 펩톤수 9 mL를 첨가하여 단계 희석하였다. 총 균수는 멸균된 47-50℃ 온도의 plate count agar에 희석된 시료를 혼합하여 petri dish에 주입한 후 36℃, 48시간 동안 배양하여 확인하였다.

색도 측정

기능성 무지방 우유의 색도 분석은 40 mL의 샘플을 petri dish(90×15 mm) 에 넣은 후 Colorimeter(Chroma meter CR-400, Konica-Minolta, Japan)로 샘플 표면을 측정하였다.

제품의 색도 측정 결과, L값에서는 첨가군과 비첨가군 모두 크게 차이는 없었으나 첨가량에 따라 농도 의존적으로 b*값(yellowness)과 a*값(redness)이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(표 4).

본 발명의 A형 인플루엔자 바이러스 H1N1 억제 활성 물질인 백개자 종자의 아임계수 추출물은 본 발명이 추구한 무지방 우유외에도 무독성 농도범위에서 A형 인플루엔자 항바이러스 식품에 첨가물로 사용할 수 있으며 이러한 사용은 본 발명의 권리범위를 침해하는 것은 물론이다.

백개자는 우리나라에서 주요 향신료로 사용되며, 약용으로 폐렴, 기관지염, 신경통 등에 사용되기도 한다. Fabre 등(1996)은 백개자로부터 항암 활성을 비롯한 여러 생리활성을 갖는 glucosinolates를 분리하였으며, 위암 조직에 대한 항암 효과가 보고되기도 하였다. Khatoon 등(2007)은 백개자로부터 중추신경계에서 중요한 역할을 하는 높은 활성의 phospholipase D를 분리하였다.

본 발명 백개자의 아임계수 추출물을 무지방 우유에 적용하여 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 기능성 무지방 우유를 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 유제품 가공산업 및 건강기능성 식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

백개자(Brassica juncea) 종자 분말과 규조토를 5:3 중량비로 혼합하여 110℃에서 10분간 아임계수 추출한 다음 0.45mm 필터로 여과한 것을 특징으로 하는 A형 인플루엔자 바이러스 H1N1 억제 활성용 백개자 종자의 아임계수 추출물.
삭제
제1항 기재의 백개자 종자의 아임계수 추출물이 우유 1mL에 대하여 5mg이하로 함유한 것을 특징으로 하는 A형 인플루엔자 바이러스 억제 기능성 무지방 우유식품.