KR101201120B1 - Ａβ 면역원성 펩티드 캐리어 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Ａβ 면역원성 펩티드 캐리어 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역원으로서 유용한 Aβ 펩티드 면역원과 단백질/폴리펩티드 캐리어 분자의 컨쥬게이트 제조 방법에 관한 것이며, 여기서, 상기 펩티드 면역원은 캐리어의 아미노산 잔기 상의 활성화된 작용기 또는 임의적으로 부착된 링커 분자의 아미노산 잔기 상의 활성화된 작용기를 통해 단백질 캐리어에 컨쥬게이트되고, 상기 아미노산 잔기 상의 임의의 비컨쥬게이트된 반응성 작용기는 캡핑을 통해 불활성화되어 캐리어 분자의 면역학적 작용성을 유지하되, 컨쥬게이트를 덜 안전하거거나 덜 유효하게 할 수 있는 바람직하지 못한 반응 성향을 감소시킨다. 나아가, 본 발명은 이러한 방법에 의해 제조된 면역원성 생성물 및 이러한 면역원성 생성물을 함유하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

Description

Ａβ 면역원성 펩티드 캐리어 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법{Aβ IMMUNOGENIC PEPTIDE CARRIER CONJUGATES AND METHODS OF PRODUCING SAME}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2003년 12월 17일 출원된 미국 가출원 60/530,481의 35 U.S.C. §119(e) 하의 이익을 주장하며, 이 문헌은 모든 목적으로 그 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다.
후천성 면역의 본질은 유기체가 외래 물질의 존재에 반응하고, 특이적으로 상호작용하고 그들의 침범으로부터 숙주를 보호할 수 있는 성분(항체 및 세포)을 생산할 수 있는 능력이다. "항원" 또는 "면역원"은 이러한 유형의 면역 반응을 유도해낼 수 있고, 또한 이에 대항하여 제조된 감작된 세포 및 항체와 상호작용할 수 있는 물질이다.
대개, 항원 또는 면역원은, 인식되고 면역계의 다양한 성분과 상호작용하는 독특한 항원 부위 또는 "에피토프(epitope)"를 함유하는 거대분자이다. 이들은 합성 유기 화학물질, 단백질, 지단백질, 당단백질, RNA, DNA 또는 다당류로 구성된 개개의 분자로 존재할 수 있거나, 또는 세포 구조체(세균 또는 진균류) 또는 바이러스의 일부로 존재할 수 있다(문헌[Harlow and Lane 1988a, b, c; Male et al., 1987] 참조).
비록 통상 짧은 펩티드와 같은 소형 분자들은 면역 반응의 생성물과 상호작용할 수 있지만, 종종 혼자 힘으로는 반응을 일으키지 못할 수 있다. 또한, "합텐(hapten)"로도 불리는 이러한 펩티드 면역원은 실제로는 불완전한 항원이며, 비록 스스로 면역원성을 일으키거나 항체 생산을 유도해낼 수는 없지만, 이들을 적합한 캐리어에 커플링시킴으로써 면역원성으로 만들 수 있다. 전형적으로, 캐리어는 생체내 투여시 면역학적 반응을 일으킬 수 있는 고 분자량으로 된 단백질 항원이다.
면역 반응에서, 항체는 T-헬퍼(T-helper; TH) 세포와 함께 B-림프구에 의해 생산되고 분비된다. 대다수의 합텐-캐리어 시스템에서, B 세포는 합텐 및 캐리어 양쪽 모두에 특이적인 항체를 생산한다. 이러한 경우, T 림프구는 캐리어에 특이적 결합 도메인을 갖게 되지만, 합텐만을 단독으로 인식할 수 없게 된다. B 세포 및 T 세포는 상승작용의 일환으로 협동하여 합텐 특이적 항체 반응을 유도한다. 이러한 면역 반응이 일어난 후, 숙주는 추후 오직 합텐만으로 공격당하는 경우, 대개 초기 면역화 후 형성된 기억 세포로부터 합텐 특이적 항체를 생산함으로써 반응하게 된다.
종종, 대형 거대분자 상의 일부 중요한 에피토프 구조를 모사하는 합성 합텐은 캐리어에 컨쥬게이트(conjugate)되어 더 큰 "모" 분자에 대한 면역 반응을 형성한다. 예를 들면, 짧은 펩티드 절편을 단백질의 공지된 서열로부터 합성하고, 캐리어에 커플링하여 본연의 단백질에 대한 면역원성을 유도할 수 있다. 이러한 유형의 면역원 생산에 대한 합성 접근은 백신을 생성하고자 하는 현재의 많은 연구들의 초석이 되었다. 그러나, 많은 경우에서, 우수하게 디자인되었다 하더라도 합성 펩티드-캐리어 컨쥬게이트를 사용함으로써 단순히 B 세포 반응을 유발시키는 것으로는 본연 그대로의 항원에 대한 완전한 보호성 면역을 항상 보장할 수 없다. 대형 바이러스 입자 또는 세균 세포로부터 짧은 펩티드 에피토프에 의해 유발된 면역 반응은 단지 B 세포 수준에서 기억을 생성하는 것에만 충분할 수 있다. 이러한 경우에서, 일반적으로 현재는 세포독성 T 세포 반응이 더 중요한 보호성 면역의 표시자라는 점이 받아들여지고 있다. B 세포 인식 및 T 세포 인식 양쪽 모두에 적합한 에피토프 결합 부위를 갖는 펩티드 면역원을 디자인하는 것은 오늘날 면역학에서 가장 의욕적인 연구 중 하나이다.
소형 분자 또는 면역원성이 낮은 분자를 대형 "캐리어" 분자에 컨쥬게이트함으로써 이러한 분자들의 면역원성을 증가시키려는 접근은 수십 년 동안 성공적으로 사용되었다(예를 들면, 문헌[Goebel et al. (1939) J. Exp. Med. 69: 53] 참조). 예를 들면, 많은 면역원성 조성물들이 기재되었으며, 여기서 정제된 캡슐형 중합체를 캐리어 단백질에 컨쥬게이트하여 이러한 "캐리어 효과"를 이용함으로써 더욱 유효한 면역원성 조성물을 생성하였다. 이에 대해, 문헌[Schneerson et al. (1984) Infect. Immun. 45: 582-591]을 참조할 수 있다. 또한, 컨쥬게이트화는 유아에서 유리된 다당류를 사용하여 면역화된 경우 대개 관찰되는 열등한 항체 반응도 피하는 것으로 밝혀졌다(문헌[Anderson et al. (1985) J. Pediatr. 107: 346; Insel et al. (1986) J. Exp. Med. 158: 294] 참조).
합텐-캐리어 컨쥬게이트는 다양한 가교 결합/커플링 시약, 예를 들면 호모이작용성(homobifunctional), 헤테로이작용성(heterobifunctional) 또는 0-길이 가교 결합제를 사용하여 성공적으로 생성되었다. 현재, 이러한 많은 방법들이 당류, 단백질 및 펩티드를 펩티드 캐리어에 커플링시키는 데 이용가능하다. 대부분의 방법은 아민, 아미드, 우레탄, 이소티오우레아, 또는 이황 결합을 생성하거나 또는 일부 경우, 티오에테르를 생성한다. 캐리어 및(또는) 합텐 분자 상의 반응성 아미노산 분자의 측쇄에 반응성 부위를 도입시키는 커플링 시약을 사용함으로써 발생하는 단점은, 반응성 부위가 중성화되지 않은 경우 유리되어 임의의 원치않는 분자와 시험관내 반응(이로써, 컨쥬게이트(들)의 작용성(functionality) 또는 안정성에 악영향을 미침)하거나 또는 생체내 반응(이로써, 제제로 면역화된 사람 또는 동물에서 유해한 사건(event)을 일으킬 가능성을 내포함)한다는 점이다. 이러한 과량의 반응성 부위를 불활성화시키기 위해 다양한 공지된 화학 반응을 사용하여 이러한 부위를 반응시키거나 또는 "캡핑(capping)"할 수 있지만, 이러한 반응은 컨쥬게이트의 작용성을 파괴할 수 있다. 이는 캐리어 분자에 반응성 부위를 도입함으로써 컨쥬게이트를 생성시키려는 경우, 그의 더욱 큰 크기 및 더욱 복합한 구조(합텐에 비해)가 이를 화학 치료의 파괴 효과에 더욱 공격받기 쉽게 할 수 있기 때문에 특히 문제가 될 수 있다. 사실상, 먼저 캐리어를 활성화시킨 다음, 컨쥬게이트화 반응으로 합텐과 반응시키고, 최종적으로 잔여 반응성 부위를 "캡핑"시킴으로써 컨쥬게이트를 제조하며, 생성되는 컨쥬게이트가 "캐리어 효과"의 원하는 성질을 갖는 면역원성 조성물로 기능하는 능력을 보존하는 방법으로서 공지된 예는 없다.
본 발명은 Aβ 펩티드 또는 Aβ의 단편 또는 이들의 유사체를 포함하는 펩티드 면역원과 단백질/폴리펩티드 캐리어로 된 면역원성 컨쥬게이트 제조 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 Aβ 또는 그들의 유사체의 Aβ 펩티드 또는 단편은 캐리어의 아미노산 잔기, 예를 들면 리신 잔기의 유도체화된 작용기를 통해 캐리어에 컨쥬게이트되고, 아미노산 잔기의 임의의 비컨쥬게이트 유도체화된 작용기는 캡핑을 통해 불활성화되어, 이들이 단백질/폴리펩티드를 비롯한 다른 분자와 반응하는 것을 차단함으로써, 캐리어 없이는 달리 발생하지 않는 펩티드 면역원에 대한 원하는 면역 반응을 유발할 수 있는 능력을 유지하도록 캐리어의 작용성을 보존한다. 나아가, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 컨쥬게이트, 및 이러한 컨쥬게이트를 함유하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 단백질/폴리펩티드 캐리어의 작용기 중 하나 이상을 유도체화하여 반응성 부위를 갖는 유도체화된 분자를 생성하는 단계, (b) 펩티드 면역원이 작용기를 통해 유도체화된 단백질/폴리펩티드 캐리어에 컨쥬게이트되도록 하는 반응 조건 하에서, 단계 (a)의 유도체화된 단백질/폴리펩티드 캐리어를 펩티드 면역원의 아미노산 잔기의 반응성 기와 반응시키는 단계, 및 (c) 상기 컨쥬게이트를 캡핑 시약(capping reagent)과 추가 반응시켜 활성화된 단백질/폴리펩티드 캐리어 상의 자유 반응성 작용기를 불활성화시킴으로써 캐리어 없이는 달리 발생하지 않는 펩티드 면역원에 대한 원하는 면역 반응을 유발할 수 있는 캐리어의 능력을 유지하도록 캐리어의 작용성을 보존하는 단계를 포함하는 Aβ 펩티드 또는 Aβ의 단편 또는 이들의 유사체를 포함하는 펩티드 면역원을 펩티드 면역원의 아미노산 잔기의 반응성 기를 통해 하나 이상의 작용기를 갖는 단백질/폴리펩티드 캐리어에 컨쥬게이트시키는 제1 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 단백질/폴리펩티드 캐리어는 인간 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 면역글로불린 분자, 티로글로불린(thyroglobulin), 난알부민(ovalbumin), 인플루엔자 헤마그글루티닌(influenza hemagglutinin), PAN-DR 결합 펩티드(PADRE 폴리펩티드), 말라리아 서컴스포로자이트(Malaria circumsporozite; CS) 단백질, B형 간염 표면 항원(HBsAg19 -28), 열 충격 단백질(Heat Shock Protein; HSP) 65, 바실러스 칼메트-구에린(Bacillus Calmette-Guerin; BCG), 콜레라 독소, 감소된 독성을 갖는 콜레라 독소 돌연변이체, 디프테리아 독소, 디프테리아 독소와 교차 반응성이 있는 CRM197 단백질, 재조합 스트렙토코커스(Streptococcal) C5a 펩티다제, 스트렙토코커스 파이오진(Streptococcus pyogenes) ORF1224, 스트렙토코커스 파이오진 ORF1664, 스트렙토코커스 파이오진 ORF 2452, 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신(Streptococcus pneumoniae pneumolysin), 감소된 독성을 갖는 뉴몰리신 돌연변이체, 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumoniae) ORF T367, 클라미디아 뉴모니아 ORF T858, 파상풍 유독소(Tetanus toxoid), HIV gp120 T1, 미생물 표면 접착 매트릭스 분자를 인식하는 성분(MSCRAMMS), 성장 인자/호르몬, 사이토카인 및 케모카인으로 이루어진 군에서 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 단백질/폴리펩티드 캐리어는 T 세포 에피토프를 함유한다.
또한, 또 다른 실시양태에서, 단백질/폴리펩티드 캐리어는 상기한 바와 같이 박테리아 유독소, 예를 들면 파상풍 유독소, 콜레라 독소 또는 콜레라 독소 돌연변이체이다. 바람직한 실시양태에서, 단백질/폴리펩티드 캐리어는 CRM197이다.
또한, 또 다른 실시양태에서, 단백질/폴리펩티드 캐리어는 인플루엔자 헤마그글루티닌, PADRE 폴리펩티드, 말라리아 CS 단백질, B형 간염 표면 항원(HBsAg19 -28), 열 충격 단백질 65(HSP 65), 또는 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis; BCG)로부터의 폴리펩티드일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 단백질/폴리펩티드 캐리어는 스트렙토코커스 rC5a 펩티다제, 스트렙토코커스 파이오진 ORF1224, 스트렙토코커스 파이오진 ORF1664 또는 스트렙토코커스 파이오진 ORF2452, 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신, 감소된 독성을 갖는 뉴몰리신 돌연변이체, 클라미디아 뉴모니아 ORF T367 및 클라미디아 뉴모니아 ORF T858로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 단백질/폴리펩티드 캐리어는 면역 반응을 자극하거나 또는 강화시키고 IL-1, IL-2, γ-인터페론, IL-10, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES로 이루어진 군에서 선택되는 성장 인자 또는 호르몬이다.
한 측면에서, 본 발명은 Aβ 내 특정한 에피토프에 대항하여 면역원성 반응을 유도해 내는 Aβ 또는 그들의 유사체의 Aβ 펩티드 또는 단편을 포함하는 펩티드 면역원을 제공한다. 본 발명의 면역원성 펩티드는 면역원성 이형(heterologous) 펩티드를 포함한다. 일부 면역원성 펩티드에서, Aβ 단편을 캐리어에 연결하여 면역원성 이형 펩티드를 형성한 다음, 이 이형 펩티드를 본 발명의 방법을 사용하여 캐리어에 연결시켜 컨쥬게이트를 형성한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 펩티드 면역원은 Aβ 중 적어도 잔기 1-5로 된 N-말단 절편을 포함하는 폴리펩티드이고, Aβ의 첫 잔기는 폴리펩티드의 N-말단 잔기이며, 여기서 상기 폴리펩티드는 Aβ의 C-말단을 함유하지 않는다. 또한, 본 발명의 또 다른 측면에서, 펩티드 면역원은 Aβ의 잔기 1-3에서 시작하고 Aβ의 잔기 7-11에서 끝나는 Aβ의 N-말단 절편을 포함하는 폴리펩티드이다. 본 발명의 일부 측면에서, 펩티드 면역원은 Aβ43의 잔기 12-43 내에서 에피토프에 대항하는 면역원성 반응을 유도하지 않으면서, Aβ의 잔기 1-3에서 시작하고 Aβ의 잔기 7-11에서 끝나는 Aβ의 N-말단 절편에 대항하는 면역원성 반응을 유도하는 약제이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 펩티드 면역원은 이형 아미노산 서열에 대항하여 헬퍼 T 세포 반응을 유도함으로써 N-말단 절편에 대항하는 B 세포 반응을 유도하는 이형 아미노산 서열에 연결된 Aβ의 절편을 포함하는 이형 폴리펩티드이다.
일부 펩티드 면역원에서, Aβ의 N-말단 절편을 그의 C-말단에서 이형 폴리펩티드에 연결한다. 일부 펩티드 면역원에서, Aβ의 N-말단 절편을 그의 N-말단에서 이형 폴리펩티드에 연결한다. 일부 펩티드 면역원에서, Aβ의 N-말단 절편을 그의 N 말단 및 C 말단에서 제1 이형 폴리펩티드 및 제2 이형 폴리펩티드에 연결한다. 일부 펩티드 면역원에서, Aβ의 N-말단 절편을 그의 N 말단에서 이형 폴리펩티드에 연결하고, 그의 C-말단에서 N-말단 절편의 하나 이상의 추가적인 카피에 연결한다. 일부 펩티드 면역원에서, 폴리펩티드는 N 말단에서부터 C 말단까지, Aβ의 N-말단 절편, N-말단 절편의 다수의 추가적인 카피 및 이형 아미노산 절편을 포함한다.
상기 펩티드 면역원 중 일부에서, 폴리펩티드는 N-말단 절편으로 된 하나 이상의 추가적인 카피를 추가로 포함한다. 상기 펩티드 면역원 중 일부에서, 단편은 Aβ43 중에서 5 개 이상의 C-말단 아미노산을 함유하지 않는다.
상기 펩티드 면역원의 일부 측면에서, 단편은 Aβ로부터의 10 개 이하의 인접 아미노산을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 Aβ 내 특정한 에피토프에 대항하여 면역원성 반응을 유도해 내는 Aβ 또는 그들의 유사체의 Aβ 펩티드 또는 단편을 포함하는 펩티드 면역원을 제공하며, 이는 다중 항원성 펩티드(MAP) 배위로 지칭되는 배위로 존재할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 일부에서, Aβ의 N-말단 절반(half)으로부터 유래하는 펩티드 면역원이 존재한다. 본 발명의 일부 측면에서, 펩티드 면역원은 Aβ1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 3-6 및 3-7로 이루어진 군에서 선택되는 Aβ 단편이다. 본 발명의 상기 측면 중 일부에서, 펩티드 면역원은 Aβ의 내부 영역으로부터 유래한다. 본 발명의 일부 측면에서, 펩티드 면역원은 Aβ13-28, 15-24, 17-28 및 25-35로 이루어진 군에서 선택되는 Aβ 단편이다. 본 발명의 상기 측면 중 일부에서, Aβ의 C-말단 끝단(end)으로부터 유래하는 펩티드 면역원이 존재한다. 본 발명의 일부 측면에서, 펩티드 면역원은 Aβ33-42, 35-40 및 35-42로 이루어진 군에서 선택되는 Aβ 단편이다. 본 발명의 일부 측면에서, 펩티드 면역원은 Aβ1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 1-28, 3-6, 3-7, 13-28, 15-24, 17-28, 25-35, 33-42, 35-40 및 35-42로 이루어진 군에서 선택되는 Aβ 단편이다. 본 발명의 일부 측면에서, 펩티드 면역원은 Aβ1-5, Aβ1-7, Aβ1-9 및 Aβ1-12로 이루어진 군에서 선택되는 Aβ 단편이다. 본 발명의 일부 측면에서, 펩티드 면역원은 Aβ1-5-L, Aβ1-7-L, Aβ1-9-L 및 Aβ1-12-L(여기서, L은 링커(linker)임)로 이루어진 군에서 선택되는 Aβ 단편이다. 본 발명의 일부 측면에서, 펩티드 면역원은 Aβ1-5-L-C, Aβ1-7-L-C, Aβ1-9-L-C 및 Aβ1-12-L-C(여기서, C는 시스테인 아미노산 잔기임)로 이루어진 군에서 선택되는 Aβ 단편이다.
본 발명의 일부 측면에서, 펩티드 면역원은 Aβ16-22, Aβ16-23, Aβ17-23, Aβ17-24, Aβ18-24 및 Aβ18-25로 이루어진 군에서 선택되는 Aβ 단편이다. 본 발명의 일부 측면에서, 펩티드 면역원은 Aβ16-22-C, Aβ16-23-C, Aβ17-23-C, Aβ17-24-C, Aβ18-24-C 및 Aβ18-25-C(여기서, C는 시스테인 아미노산 잔기임)로 이루어진 군에서 선택되는 Aβ 단편이다. 본 발명의 다른 측면에서, 펩티드 면역원은 C-Aβ16-22, C-Aβ16-23, C-Aβ17-23, C-Aβ17-24, C-Aβ18-24 및 C-Aβ18-25(여기서, C는 시스테인 아미노산 잔기임)로 이루어진 군에서 선택되는 Aβ 단편이다.
상기 펩티드 면역원 중 일부에서, 이형 폴리펩티드는 T 세포 에피토프, B 세포 에피토프 및 이들의 조합물을 갖는 펩티드로 이루어진 군에서 선택되는다.
*한 실시양태에서, 단백질/폴리펩티드 캐리어 중 하나 이상의 아미노산 분자의 작용기 또는 임의적으로 부착된 폴리펩티드 링커 중 하나 이상의 아미노산 분자의 작용기는 가교 결합 시약을 사용하여 유도체화된다. 또 다른 실시양태에서, 유도체화 시약은 0-길이 가교 결합 시약이다. 또 다른 실시양태에서, 유도체화 시약은 호모이작용성 가교 결합 시약이다. 또한, 또 다른 실시양태에서, 유도체화 시약은 헤테로이작용성 가교 결합 시약이다.
바람직한 실시양태에서, 헤테로이작용성 시약은 단백질/폴리펩티드 캐리어 중 하나 이상의 아미노산 분자의 1차 아민 또는 ε-아민 작용기 및 펩티드 면역원 중 하나 이상의 아미노산 분자의 현수(pendant) 티올기와 반응하는 시약이다. 한 실시양태에서, 헤테로이작용성 시약은 N-숙신이미딜 브로모아세테이트이다.
또 다른 실시양태에서, 1차 아민 또는 ε-아민 작용기는 리신이다. 또한, 또 다른 실시양태에서, N-숙신이미딜 브로모아세테이트를 사용하여 단백질/폴리펩티드 캐리어 중 리신의 1차 아민 또는 ε-아민 작용기를 유도체화하는 것인 단백질/폴리펩티드 캐리어의 리신 분자 상의 1차 아민 또는 ε-아민 잔기를 브로모아세틸화한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 현수 티올기는 펩티드 면역원의 시스테인 잔기이며, 이는 펩티드 면역원의 아미노 말단, 펩티드 면역원의 카르복시 말단 또는 펩티드 면역원 내부에 위치할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 현수 티올기는 티올화 시약, 예를 들면 N-아세틸 호모시스테인티오 락톤, 트라우트(Traut's) 시약(2-이미노틸란) SATA(N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트), SMPT(4-숙신이미딜옥시카르보닐-메틸 2-피리딜 디티오 톨루엔), 설포 LC SPDP(술포 숙신이미딜 피리딜 디티오 프로피온아미도 헥사노에이트), SPDP(숙신이미딜 피리딜 디티오 프로피오네이트)에 의해 생성된다. 바람직한 실시양태에서, 활성화된 단백질/폴리펩티드 캐리어 상의 유리된 반응성 작용기를 불활성화시키는 데 사용되는 캡핑 시약은 시스테아민, N-아세틸시스테아민 및 에탄올아민으로 이루어진 시약 군에서 선택되는다.
특히 바람직한 실시양태에서, 활성화된 단백질/폴리펩티드 캐리어 상의 유리된 반응성 작용기를 불활성화시키는 데 사용되는 캡핑 시약은 수산화나트륨, 탄산나트륨, 중탄산암모늄 및 암모니아로 이루어진 시약 군에서 선택되는다.
한 실시양태에서, 펩티드 면역원의 아미노산 잔기 중 반응성 기는 유리 설프히드릴 기이다.
또 다른 실시양태에서, 작용기 중 하나 이상은 링커 상에 존재하며, 이는 단백질/폴리펩티드 캐리어에 임의적으로 부착된다. 바람직한 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 펩티드 링커는 폴리리신(polylysine)이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 단백질/폴리펩티드 캐리어의 작용기 중 하나 이상 또는 임의적으로 부착된 링커 분자의 작용기 중 하나 이상을 유도체화하여 반응성 부위를 갖는 유도체화된 분자를 생성하는 단계, (b) 단계 (a)의 유도체화된 단백질/폴리펩티드 캐리어를 펩티드 면역원의 아미노산 잔기의 반응성 기와 반응시켜 공유 결합된 펩티드 면역원-단백질/폴리펩티드 캐리어 컨쥬게이트를 형성하는 단계, 및 (c) 상기 컨쥬게이트를 캡핑 시약과 추가 반응시켜 캡핑된 기가 단백질/폴리펩티드를 비롯한 다른 분자와 자유롭게 반응하지 않도록 활성화된 단백질/폴리펩티드 캐리어 상의 자유 반응성 작용기를 불활성화킴으로써, 캐리어가 캐리어 없이는 달리 발생하지 않는 펩티드 면역원에 대한 원하는 면역 반응을 유발할 수 있는 능력을 유지하도록 캐리어의 작용성을 보존하여, 하기 화학식 II를 갖는 캡핑된 펩티드 면역원-단백질/폴리펩티드 캐리어 컨쥬게이트를 생성하는 단계를 포함하는, Aβ 펩티드 또는 Aβ의 단편 또는 이들의 유사체를 포함하는 펩티드 면역원을 하기 화학식 I을 갖는 단백질/폴리펩티드 캐리어와 컨쥬게이트하는 제2 방법에 관한 것이다.
[화학식 Ⅰ]
Figure 112011068200653-pat00001
상기 식 중,
C는 단백질/폴리펩티드 캐리어이고, X는 단백질/폴리펩티드 캐리어 상의 아미노산 잔기의 유도체화 가능한 작용기 또는 임의적으로 단백질/폴리펩티드 캐리어에 공유 결합된 펩티드 링커의 아미노산 잔기의 유도체화 가능한 작용기이고, m은 0 초과 85 이하의 정수이다.
[화학식 Ⅱ]
Figure 112011068200653-pat00002
상기 식 중,
C는 단백질/폴리펩티드 캐리어이고, Xd는 단백질/폴리펩티드 캐리어의 아미노산 잔기의 유도체화된 작용기 또는 임의적으로 단백질/폴리펩티드 캐리어에 공유 결합된 펩티드 링커의 아미노산 잔기의 유도체화된 작용기이고,
P는 단백질 캐리어 상의 아미노산 잔기 상에 유도체화된 작용기에 공유 결합된 펩티드 면역원 분자 또는 임의적으로 단백질/폴리펩티드 캐리어에 공유 결합된 펩티드 링커 상의 아미노산 잔기 상에 유도체화된 작용기에 공유 결합된 펩티드 면역원 분자이고, R은 단백질/폴리펩티드 캐리어 상의 아미노산 잔기 상의 유도체화된 작용기에 공유 결합된 캡핑 분자 또는 임의적으로 단백질/폴리펩티드 캐리어에 공유 결합된 펩티드 링커 상의 아미노산 잔기 상의 유도체화된 작용기에 공유 결합된 캡핑 분자이고, n은 0 초과 85 이하의 정수이고, p는 0 초과 85 미만의 정수이다.
또한, 앞서 기재한 제1 방법에 대한 상세한 실시양태는 바로 전에 기재한 제2 방법으로 제조된 컨쥬게이트에도 적용가능하다.
한 실시양태에서, 본 발명은 단백질/폴리펩티드 캐리어가 하기 화학식 I을 갖는 펩티드 면역원-단백질/폴리펩티드 캐리어 컨쥬게이트에 관한 것이다.
[화학식 I]
Figure 112011068200653-pat00003
상기 식 중,
C는 단백질/폴리펩티드 캐리어이고, X는 단백질/폴리펩티드 캐리어 상의 아미노산 잔기의 유도체화 가능한 작용기 또는 임의적으로 단백질/폴리펩티드 캐리어에 공유 결합된 펩티드 링커의 아미노산 잔기의 유도체화 가능한 작용기이고, m은 0 초과 85 이하의 정수이고, 캡핑된 펩티드 면역원-단백질/폴리펩티드 캐리어 컨쥬게이트는 하기 화학식 II를 갖는다.
[화학식 II]
Figure 112011068200653-pat00004
상기 식 중,
C는 단백질/폴리펩티드 캐리어이고, Xd는 단백질/폴리펩티드 캐리어의 아미노산 잔기의 유도체화된 작용기 또는 임의적으로 단백질/폴리펩티드 캐리어에 공유 결합된 펩티드 링커의 아미노산 잔기의 유도체화된 작용기이고, P는 단백질 캐리어의 아미노산 잔기의 유도체화된 작용기에 공유 결합된 펩티드 면역원 분자 또는 임의적으로 단백질/폴리펩티드 캐리어에 공유 결합된 펩티드 링커의 아미노산 잔기의 유도체화된 작용기에 공유 결합된 펩티드 면역원 분자이고, R은 단백질/폴리펩티드 캐리어 상의 아미노산 잔기 상의 유도체화된 작용기에 공유 결합된 캡핑 분자 또는 임의적으로 단백질/폴리펩티드 캐리어에 공유 결합된 펩티드 링커 상의 아미노산 잔기 상의 유도체화된 작용기에 공유 결합된 캡핑 분자여서 캐리어 없이는 달리 발생하지 않는 펩티드 면역원에 대한 원하는 면역 반응을 유발할 수 있는 능력을 유지하도록 캐리어의 작용성을 보존하고, n은 0 초과 85 이하의 정수이고, p는 0 초과 85 미만의 정수이다.
또한, 상기 제1 방법 및 제2 방법에 대한 상세한 실시양태는 바로 전에 기재된 컨쥬게이트에도 적용가능하다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 제2 방법에 따라 생성되고, 하기 화학식 II를 갖는 Aβ 또는 그들의 유사체의 Aβ 펩티드 또는 단편을 포함하는 펩티드 면역원-단백질/폴리펩티드 캐리어 컨쥬게이트에 관한 것이다.
[화학식 II]
Figure 112011068200653-pat00005
상기 식 중,
C는 단백질/폴리펩티드 캐리어이고, Xd는 단백질/폴리펩티드 캐리어의 아미노산 잔기의 유도체화된 작용기 또는 임의적으로 단백질/폴리펩티드 캐리어에 공유 결합된 펩티드 링커의 아미노산 잔기의 유도체화된 작용기이고, P는 단백질 캐리어의 아미노산 잔기의 유도체화된 작용기에 공유 결합된 펩티드 면역원 분자 또는 임의적으로 단백질/폴리펩티드 캐리어에 공유 결합된 펩티드 링커의 아미노산 잔기의 유도체화된 작용기에 공유 결합된 펩티드 면역원 분자이고, R은 단백질/폴리펩티드 캐리어 상의 아미노산 잔기 상의 유도체화된 작용기에 공유 결합된 캡핑 분자 또는 임의적으로 단백질/폴리펩티드 캐리어에 공유 결합된 펩티드 링커 상의 아미노산 잔기 상의 유도체화된 작용기에 공유 결합된 캡핑 분자여서 캐리어 없이는 달리 발생하지 않는 펩티드 면역원에 대한 원하는 면역 반응을 유발할 수 있는 능력을 유지하도록 캐리어의 작용성을 보존하고, n은 0 초과 85 이하의 정수이고, p는 0 초과 85 미만의 정수이다.
또한, 상기 제2 방법에 대한 상세한 실시양태는 바로 전에 기재한 제2 방법에 의해 생성된 컨쥬게이트에도 적용가능하다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제, 희석제 및 에주반트(면역보조제; adjuvant)와 함께 본 발명의 제2 방법에 의해 생성된 펩티드 면역원과 단백질/폴리펩티드 캐리어의 컨쥬게이트를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
또한, 제2 방법에 대한 상세한 실시양태 및 상기에 의해 생성된 컨쥬게이트는 바로 전에 기재한 컨쥬게이트를 함유하는 면역원성 조성물에도 적용가능하다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 유효량의 면역원성 조성물을 포유류 피험체에 투여하는 것을 포함하는 포유류 피험체의 면역 반응 유도 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 컨쥬게이트를 함유하는 면역원성 조성물에 적용가능한 상세한 실시양태는 이러한 면역원성 조성물의 사용 방법에 관한 본 발명의 실시양태에도 적용가능하다.
본 발명은 활성화 동안 생성된 캐리어 상의 미반응 활성 작용기가 추가로 반응하는 것을 방지하기 위해 캡핑 시약, 예를 들면 N-아세틸시스테아민을 사용하여 이들을 불활성화시키는 것인 펩티드 면역원-캐리어 컨쥬게이트 생성 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생성된 캐리어-펩티드 면역원 컨쥬게이트 및 이러한 컨쥬게이트를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
도 1: Aβ 펩티드 단편을 단백질/폴리펩티드 캐리어 CRM197에 컨쥬게이트하여 Aβ/CRM197 컨쥬게이트를 형성하는 데 사용되는 공정 화학을 도시하는 흐름도이다.
도 2: 펩티드 면역원-단백질/폴리펩티드 컨쥬게이트, 예를 들면 Aβ/CRM197 컨쥬게이트의 컨쥬게이트화도의 평가로서 S-카르복시메틸시스테인 및 S-카르복시메틸시스테아민의 정량적 결정에 사용되는 산 가수분해 화학을 도시하는 흐름도이다.
도 3: 이 도면은 Aβ 펩티드/CRM 컨쥬게이트화 반응의 pH 의존성을 도시한다.
도 4: 이 도면은 펩티드:CRM 비에 대한 Aβ-펩티드/CRM 컨쥬게이트의 의존성을 도시한다.
도 5: Aβ1-7/CRM 컨쥬게이트에 대한 캡핑 공정의 검증. 반응의 pH는 9.15였다. 펩티드와의 반응 시간은 16 시간이고, N-아세틸시스테아민과의 캡핑 시간은 8 시간이었다.
도 6: 다양한 펩티드:CRM 비와 펩티드를 사용한 컨쥬게이트 및 캡핑. 반응의 pH는 9.0이었다. 펩티드와의 반응 시간은 16 시간이고, N-아세틸시스테아민과의 캡핑 시간은 8 시간이었다.
도 7: Aβ 펩티드 컨쥬게이트와 다양한 에주반트를 사용한 영장류의 면역화 후 영장류 혈청의 제 36 일 역가이다.
도 8: Aβ 펩티드 컨쥬게이트와 다양한 에주반트를 사용한 영장류의 면역화 후 영장류 혈청의 제 64 일 역가이다.
도 9: 치료군 및 시간에 따른 영장류 역가이다. 에주반트로서 백반 또는 529를 사용하여 영장류를 Aβ1-7 또는 Aβ1-5 CRM197 컨쥬게이트를 사용하여 면역화시키고, 제 29 일, 제 36 일, 제 57 일 및 제 54 일에 항-A(anti-A) 항체의 역가를 측정하였다.
도 10: 트리스-트리신 프리케스트 겔(tris-tricine precast gel)을 사용한 SDS-PAGE 웨스턴 블롯(Western blot) 분석을 사용하여 펩티드-단백질 컨쥬게이트를 특성화하였다. 레인(lane)은 다음과 같다. 마커(marker) (레인 1); L-2837524/01 (레인 2); L-28375 24/02 (레인 3); L-28375 24/03 (레인 4); L-28375 24/04 (레인 5); L-28375 24/05 (레인 6); L-28375 24/06 (레인 7) L-28375 24/07 (레인 8); L-28375 24/08 (레인 9); L-28375 24/09 (모의체 (Mock)) (레인 10); 및 BrAcCRM197 (레인 11).
서열의 간단한 설명
Figure 112011068200653-pat00006

Figure 112011068200653-pat00007

Figure 112011068200653-pat00008

Figure 112011068200653-pat00009
본 발명은 활성화 동안 생성된 캐리어 상의 미반응 활성 작용기가 추가로 반응하는 것을 방지하기 위해 캡핑 시약, 예를 들면 N-아세틸시스테아민을 사용하여 이들을 불활성화시키는 것인 펩티드 면역원-캐리어 컨쥬게이트 생성 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생성된 캐리어-펩티드 면역원 컨쥬게이트 및 이러한 컨쥬게이트를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
소형 분자 또는 면역원성이 낮은 분자, 예를 들면 당류를 컨쥬게이트화함으로써 이들 분자의 면역원성을 증가시키려는 접근은 수십 년 동안 성공적으로 사용되었고(예를 들면, 문헌[Goebel et al. (1939) J. Exp. Med.69: 53] 참조), 정제된 캡슐형 중합체를 캐리어 단백질에 컨쥬게이트하여 이러한 "캐리어 효과"를 이용함으로써 더욱 유효한 면역원성 조성물을 생성하는 것인 많은 면역원성 조성물들이 기재되었다. 예를 들면, 문헌[Schneerson et al. (J. Exp. Med. 152: 361-376, 1980)]은 미생물에 의해 유발되는 침습성 질환에 면역을 제공하는 헤모필러스 인플루엔제 b 다당류 단백질 컨쥬게이트를 기재하고 있다. PRP(폴리피보실리비톨(polyribosylribitol) 포스페이트, H. 인플루엔제 b의 캡슐형 중합체)의 컨쥬게이트는 다당류 단독의 경우보다 유효한 면역원성 조성물인 것으로 밝혀졌다(문헌[Chu et al., (1983) Infect. Immun. 40: 245; Schneerson et al. (1984), Infect. Immun. 45: 582-591] 참조). 또한, 컨쥬게이트화는 유리된 다당류로 면역화된 경우 대개 유아에서 관찰되는 열등한 항체 반응을 피하는 것으로 밝혀졌다 (문헌[Anderson et al. (1985) J Pediatr. 107: 346; Insel et al. (1986) J. Exp. Med. 158: 294] 참조).
인간의 통상의 면역화가 표준 관행인 것에 대항하여 단백질 캐리어로서 세균 독소 또는 유독소(예를 들면, 파상풍 또는 디프테리아)를 사용하는 것의 추가의 이점은 독소 또는 유독소에 대한 원하는 면역이 캡슐형 중합체와 회합된 병원체에 대항하여 면역과 함께 유도된다는 것이다.
또한, 항원 결정인자/합텐-캐리어 컨쥬게이트는 커플링된 합텐 상의 별개의 화학 에피토프를 인식할 수 있는 매우 특이적인 단일클론 항체를 생산하는 데에 사용되고 있다. 종종, 생성되는 단일클론체는 에피토프 구조 및 본래 단백질 사이의 상호작용을 조사하는 데 사용된다. 많은 경우, 이러한 단일클론체를 생성하는 데 사용된 항원 결정인자/합텐은 대형 단백질의 표면 상의 중대한 항원 부위를 나타내는 소형 펩티드 절편이다. 항원 결정인자/합텐-캐리어 컨쥬게이트를 생성하는 데 사용되는 성공적인 캐리어에 대한 기준은 면역원성, 항원 결정인자/합텐을 사용한 컨쥬게이트에 대한 적합한 작용기의 존재, 심지어 유도체화 후에도 합당한 용해도 성질 및 생체내 무독성에 대한 잠재력이다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 컨쥬게이트는 이러한 기준에 부합한다. 컨쥬게이트는 본 명세서에 기재된 컨쥬게이트 방법을 사용하여 생성된 임의의 안정한 펩티드 면역원-캐리어 컨쥬게이트일 수 있다. 이러한 컨쥬게이트는 하기 화학식 I을 갖는 단백질/폴리펩티드 캐리어가 단백질/폴리펩티드 캐리어에 공유 결합되며, 펩티드 면역원에 공유 결합되고, 펩티드 면역원-단백질/폴리펩티드 캐리어 컨쥬게이트가 하기 화학식 II를 갖는 것인 본 발명의 방법을 사용하여 생성된다.
[화학식 I]
Figure 112011068200653-pat00010
상기 식 중,
C는 단백질/폴리펩티드 캐리어이고, X는 단백질/폴리펩티드 캐리어 상의 아미노산 잔기 상의 유도체화 가능한 작용기 또는 임의적으로 단백질/폴리펩티드 캐리어에 공유 결합된 펩티드 링커의 아미노산 잔기 상의 유도체화 가능한 작용기이고, m은 0 초과 85 이하의 정수이다.
[화학식 II]
Figure 112011068200653-pat00011
상기 식 중,
C는 단백질/폴리펩티드 캐리어이고, Xd는 단백질/폴리펩티드 캐리어의 아미노산 잔기 상의 유도체화된 작용기 또는 임의적으로 단백질/폴리펩티드 캐리어에 공유 결합된 펩티드 링커의 아미노산 잔기 상의 유도체화된 작용기이고, P는 단백질/폴리펩티드 캐리어 상의 아미노산 잔기 상의 유도체화된 작용기에 공유 결합된 펩티드 면역원 또는 임의적으로 단백질/폴리펩티드 캐리어에 공유 결합된 펩티드 링커 상의 아미노산 잔기 상의 유도체화된 작용기에 공유 결합된 펩티드 면역원이고, R은 단백질/폴리펩티드 캐리어 상의 아미노산 잔기 상의 유도체화된 작용기에 공유 결합된 캡핑 분자 또는 임의적으로 단백질/폴리펩티드 캐리어에 공유 결합된 펩티드 링커 상의 아미노산 잔기 상의 유도체화된 작용기에 공유 결합된 캡핑 분자여서 캐리어 없이는 달리 발생하지 않는 펩티드 면역원에 대한 원하는 면역 반응을 유발할 수 있는 능력을 유지하도록 캐리어의 작용성을 보존하고, n은 0 초과 85 이하의 정수이고, p는 0 초과 85 미만의 정수이다.
캐리어의 선택
일부 펩티드 면역원은 면역 반응을 유도하기 위해 적합한 에피토프를 함유하지만, 면역원성이기엔 너무 작다. 이러한 경우, 펩티드 면역원을 적합한 캐리어에 연결시켜 면역 반응을 유도해 내는 것을 돕는다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 상기 개략도의 펩티드 면역원-캐리어 컨쥬게이트에서, C는 펩티드 면역원이 유도체화된 작용기를 통해 캐리어 자체의 아미노산 잔기 상에 직접 컨쥬게이트되거나 또는 작용기를 통해 캐리어에 공유 결합된 펩티드 링커 상에서 간접적으로 유도체화된 단백질/폴리펩티드 캐리어이다. 적합한 단백질/폴리펩티드 캐리어는 알부민(인간 혈청 알부민 포함), 키홀 림펫 헤모시아닌, 면역글로불린 분자, 티로글로불린, 난알부민, MSCRAMMS, 파상풍 유독소, 또는 돌연변이체, 예를 들면 디프테리아, 에스케리키아 콜라이(E. coli), 콜레라, 또는 H. 파일로리(H. pylori)를 비롯한 감소된 독성을 갖는 다른 병원체 세균 유래의 유독소, 또는 약화된 독소 유도체를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 이러한 한 캐리어로는 디프테리아 독소와 교차 반응성을 갖는 CRM197 단백질(서열 번호 40)이 있다.
다른 캐리어는 다수의 MHC 대립 유전자, 예를 들면 모든 인간 MHC 대립 유전자의 75% 이상에 결합하는 T 세포 에피토프를 포함한다. 때때로, 이러한 캐리어는 "범용(universal) T 세포 에피토프"로 당업계에 공지되어 있다. 범용 T 세포 에피토프를 갖는 예시적인 캐리어는 하기를 포함한다.
인플루엔자 헤마그글루티닌: HA307 -319 PKYVKQNTLKLAT
(서열 번호 11)
PAN-DR 펩티드(PADRE 펩티드) AKXVAAWTLKAAA
(서열 번호 12)
말라리아 CS: T3 에피토프 EKKIAKMEKASSVFNV
(서열 번호 13)
B형 간염 표면 항원: HBsAg19 -28 FELLTRILTI
(서열 번호 14)
열 충격 단백질 65: hsp65153 -171 QSIGDLIAEAMDKVGNEG
(서열 번호 15)
바실러스 칼메트-구에린(BCG) QVHFQPLPPAVVKL
(서열 번호 16)
파상풍 유독소: TT830 -844 QYIKANSKFIGITEL
(서열 번호 17)
파상풍 유독소: TT947 -967 NNFTVSFWLRVPKVSASHLE
(서열 번호 18)
HIV gp120 T1: KQIINMWQEVGKAMY
(서열 번호 19)
CRM197 서열에 대한 간단한 설명 참조 (서열 번호 40)
알부민 단편 ISQAVHAAHAEINEAGR
(서열 번호 41)
면역 반응을 자극시키거나 또는 강화시키고, 펩티드 면역원 또는 합텐에 컨쥬게이트될 수 있는 다른 캐리어는 사이토카인, 예를 들면 IL-1, IL-1α 및 IL-1β 펩티드, IL-2, γINF, IL-10, GM-CSF, 및 케모카인, 예를 들면 MIP 1α 및 MIP 1β 및 RANTES를 포함한다. 또한, 면역원성 펩티드는 모든 목적으로 그 전문이 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 오'마호니(O'Mahony)의 WO 97/17163 및 WO 97/17614에 기재된 바와 같이, 조직을 통한 수송을 강화시키는 단백질/펩티드 캐리어에 연결될 수 있다.
또한, 추가의 캐리어는 재조합 스트렙토코커스 C5a 펩티다제, 스트렙토코커스 파이오진 ORF 1224, ORF 1664 및 ORF 2452, 클라미디아 뉴모니아 ORF T367 및 ORF T858, 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신, 감소된 독성을 갖는 뉴몰리신 돌연변이체, 성장 인자 및 호르몬을 포함한다.
본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, 캐리어 단백질은 그의 최초의 서열에 한 아미노산 변화가 이루어진 디프테리아 독소의 비독성 돌연변이체인 CRM197이다. 분자의 아미노산 위치 52에 존재하는 글리신은 단일 핵산 코돈 변화에 의해 글루탐산으로 치환된다. 이 변화로 인해, 단백질은 ADP-리보실 트란스퍼라아제 활성을 잃고, 비독성이 된다. 이는 58,408 Da의 분자량을 갖는다. CRM197은 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 5,614,382호에 따라 재조합 발현에 의해 대량 생산된다. 당류, 뿐만 아니라 펩티드의 CRM197에 대한 컨쥬게이트는 리신 잔기의 ε-아미노기를 통한 연결에 의해 수행된다. 이는 CRM197이 B 세포 에피토프에 대해 우수하고 안전한 캐리어인 몇몇 상업적 제품을 통해 잘 정립되었다.
면역원성 펩티드
본 명세서에 사용된 용어 "펩티드 면역원" 또는 "합텐"은 포유류에 투여시 면역 반응을 생산하도록 유도해 내거나, 촉진하거나 또는 유발할 수 있는 것으로부터 유도된 임의의 단백질 또는 서브유닛(subunit) 구조/단편/유사체이다. 특히, 상기 용어는 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 캐리어에 커플링될 수 있는, 임의의 공급원(세균, 바이러스 또는 진핵 생물)으로부터의 폴리펩티드 항원 결정인자를 지칭하는 데 사용된다. 이러한 폴리펩티드 면역원/항원 결정인자는 바이러스, 세균 또는 진핵 생물 세포로부터 유래할 수 있다.
다양한 인간 질환의 방지, 치료, 예방 또는 완화에 면역치료제로서 사용하기 위해 펩티드 면역원을 캐리어에 컨쥬게이트시킬 수 있다. 이러한 펩티드 면역원은 알츠하이머병(AD)의 특징적인 플라크(plaque)의 주요 성분인 39-43 개의 아미노산, 바람직하게는 42 개의 아미노산으로 된 Aβ 펩티드로부터 유도된 것들(미국 특허 제 4,666,829호; 문헌[Glenner & Wong (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120: 1131, Hardy (1984) TINS 20: 1131; Hardy (1977) TINS 20: 154), 아밀린의 아밀로이드 펩티드로부터 유도된 것들, 타입 II 당뇨병과 연관된 췌장 섬 세포에 의해 생산된 폴리펩티드 물질, 동맥경화와 연관된 저 밀도 지단백질 유전자 생성물로부터 유도된 펩티드, 염증성 사이토카인으로부터 유도된 항원성 펩티드 및 성장 인자, 예를 들면 인터루킨 6(IL-6), 종양 괴사 인자 α(TNF-α) 및 GDF-8을 포함한다. 이러한 진핵 생물 펩티드 면역원은 β-아밀로이드 단백질로도 알려져 있는 T-세포(CTL) 또는 B-세포 에피토프, 또는 A4 펩티드를 포함할 수 있다.
또한, β-아밀로이드 펩티드로도 공지된 Aβ, 또는 A4 펩티드(미국 특허 제 4,666,829호; 문헌[Glenner & Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun., 120, 1131 (1984)] 참조)는 알츠하이머병의 특징적인 플라크의 주요 성분인 39-43 개의 아미노산으로 된 펩티드이다. Aβ는 β 세크레타제(secretase) 및 γ 세크레타제로 불리는 2 개의 효소에 의해 대형 단백질 APP를 가공함으로써 생성된다(문헌[Hardy, TINS 20, 154 (1997)] 참조). 알츠하이머병과 관련된 APP 중의 공지된 돌연변이는 β 세크레타제 또는 γ 세크레타제의 부위에 인접하여 발생하거나 또는 Aβ 내에서 발생한다. 예를 들면, 위치 717은 Aβ에 대한 처리시 APP의 γ-세크레타제 분절 부위에 인접하고, 위치 670/671은 β-세크레타제 분절 부위에 인접한다. 생성된 Aβ의 42/43 아미노산의 양을 증가시키기 위해 분절 반응과 상호작용함으로써 Aβ를 형성함으로써 돌연변이가 AD를 유발하는 것으로 생각된다.
Aβ는 정규 보체 케스케이드 및 대체 보체 케스케이드(classical and alternate complement cascade) 양쪽 모두를 교정하고 활성화할 수 있는 독특한 성질을 갖는다. 특히, 이는 Clq에 결합하고, 궁극적으로 C3bi에 결합한다. 이 회합은 대식세포에 대한 결합을 용이하게 하여 B 세포의 활성화를 일으킨다. 또한, C3bi는 추가 분해된 다음, T 세포 의존 방식으로 B 세포 상의 CR2에 결합하여 이들 세포의 활성화를 10,000 배 증가시킨다. 이 기전은 Aβ가 과량의 다른 항원의 경우에서 면역 반응을 일으키게 한다.
Aβ는 몇몇 천연 발생 형태를 갖는다. Aβ의 인간 형태는 Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 및 Aβ43으로 지칭된다. 이러한 펩티드의 서열 및 APP 전구체에 대한 그들의 관계는 문헌[Hardy et al., TINS 20, 155-158 (1997)]의 도 1에 의해 설명된다. 예를 들면, Aβ42는 하기 서열을 갖는다.
H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-
His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-
Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-IIe-
Ala-OH (서열 번호 21).
Aβ41, Aβ40 및 Aβ39는 각각 C-말단으로부터 Ala, Ala-Ile 및 Ala-Ile-Val이 생략되어 있다는 점에서 Aβ42와 상이하다. Aβ43은 C-말단에서 트레오닌 잔기가 존재한다는 점에서 Aβ42와 상이하다.
Aβ의 단편인 펩티드 면역원은 몇 가지 이유로 본연 그대로의 분자에 비해 본 방법에 사용하기에 유리하다. 먼저, Aβ 내의 오직 특정한 에피토프가 알츠하이머병의 치료에 유용한 면역원성 반응을 유발하기 때문에, 이러한 에피토프를 함유하는 동일한 질량 투여량의 단편은 본연 그대로의 Aβ의 투여량보다 큰 몰 농도의 유용한 면역원성 에피토프를 제공한다. 두번째, Aβ의 특정한 펩티드 면역원은 Aβ가 유도되는 APP 단백질에 대항한 현저한 면역원성 반응을 생성하지 않으면서 아밀로이드 침착물에 대한 면역원성 반응을 생성한다. 세번째, Aβ의 펩티드 면역원은 본연 그대로의 Aβ보다 짧기 때문에 제조가 더 간단하다. 네번째, Aβ의 펩티드 면역원은 본연 그대로의 Aβ와 동일하게 응집하지 않기 때문에 캐리어와의 컨쥬게이트 제조를 단순화시킨다.
Aβ의 일부 펩티드 면역원은 천연 펩티드로부터 2, 3, 5, 6, 10 개 또는 20 개 이상의 인접 아미노산으로 된 서열을 갖는다. 일부 펩티드 면역원은 Aβ로부터 10, 9, 8, 7, 5 개 또는 3 개 이하의 인접 잔기를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 컨쥬게이트 제조에 Aβ의 N-말단 절반으로부터의 펩티드 면역원을 사용한다. 바람직한 펩티드 면역원은 Aβ1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 1-11, 3-7, 1-3 및 1-4를 포함한다. 예를 들면, 명칭 Aβ1-5는 Aβ의 잔기 1-5를 비롯한 N-말단 단편을 표시한다. N-말단에서 시작되고 Aβ의 잔기 7-11 내의 잔기에서 끝나는 AP 단편이 특히 바람직하다. 또한, 단편 Aβ1-12도 사용할 수 있지만 덜 바람직하다. 일부 방법에서, 단편은 Aβ1-10 이외의 N-말단 단편이다. 다른 바람직한 단편은 Aβ13-28, 15-24, 1-28, 25-35, 35-40, 35-42 및 다른 내부 단편 및 C-말단 단편을 포함한다.
본 발명의 일부 Aβ 펩티드는 인간 환자 또는 동물에 투여시 Aβ의 잔기 16과 25 사이에서 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 면역원성 펩티드이다. 바람직한 단편은 Aβ16-22, 16-23, 17-23, 17-24, 18-24 및 18-25를 포함한다. 잔기 16과 25 사이의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체는 Aβ의 플라크에 대해 결합하지 않고 가용성 Aβ에 특이적으로 결합한다. 이러한 유형의 항체는 환자 또는 동물 모델의 뇌에서 Aβ 침착물의 플라크에 특이적으로 결합하지 않고 환자 또는 동물 모델의 순환시 가용성 Aβ에 특이적으로 결합할 수 있다. 가용성 Aβ에 대한 항체의 특이적 결합은 Aβ가 플라크로 혼입되는 것을 억제하여, 환자의 플라크 발현을 억제하거나 또는 이러한 플라크가 치료제를 투여하기 전에 이미 발현된 경우 플라크의 크기 또는 빈도가 더 증가되는 것을 억제한다.
*바람직하게는, 투여되는 Aβ의 단편에는 이 단편에 대한 T 세포 반응을 일으키는 에피토프가 결여되어 있다. 일반적으로, T 세포 에피토프는 10 개를 초과하는 인접 아미노산이다. 따라서, Aβ의 바람직한 단편은 5-10 개 또는 바람직하게는 7-10 개의 인접 아미노산 또는 가장 바람직하게는 7 개의 인접 아미노산의 크기, 즉 T 세포 반응을 일으키지 않으면서 항체 반응을 일으키기 충분한 길이로 되어 있다. T 세포 에피토프는 단편의 면역원성 활성에 필요치 않고, 환자의 부분집합에서 원치않는 염증 반응을 일으킬 수 있기 때문에 이러한 에피토프는 없는 것이 바람직하다(문헌[Anderson et al., (2002) J. Immunol. 168, 3697-3701; Senior (2002) Lancet Neurol. 1, 3] 참조).
단편 Aβ15-25 및 이의 7-8 개의 인접 아미노산으로 된 부분 단편(subfragment)은, 이러한 펩티드들이 시종일관 Aβ 펩티드에 대한 높은 면역원성 반응을 일으키기 때문에 바람직하다. 이러한 단편은 Aβ16-22, Aβ16-23, Aβ16-24, Aβ17-23, Aβ17-24, Aβ18-24 및 Aβ18-25를 포함한다. 특히 바람직한 Aβ15-25 부분 단편은 길이가 7 개인 인접 아미노산이다. 예를 들면, 명칭 Aβ15-21은 Aβ의 잔기 15-21을 포함하고 Aβ의 다른 잔기, 바람직하게는 7-10 개의 인접 아미노산은 함유하지 않는 단편을 표시한다. 이러한 단편은 끝단-특이적 항체를 포함하는 항체 반응을 일으킬 수 있다.
Aβ의 펩티드 면역원은 아밀로이드 침착물을 제거하거나 또는 방지하는 활성에 대한 스크리닝을 필요로 한다(모든 목적으로 그 전문이 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 WO 00/72880 참조). Aβ의 N-말단 단편의 투여는 생체내 및 시험관내 Aβ 침착물을 인식하는 항체의 생산을 유도한다. 일부 방법에서는, Aβ의 천연 발생 형태에 존재하는 하나 이상의, 때때로 5 또는 10 개 이상의 C-말단 아미노산을 함유하지 않는 단편이 사용된다. 예를 들면, Aβ43의 C-말단 끝단으로부터의 5 개의 아미노산이 결여된 단편은 Aβ의 N-말단 끝단으로부터의 첫 38 개의 아미노산을 포함한다.
달리 언급이 없으면, Aβ는 앞서 언급한 천연 인간 아미노산 서열, 뿐만 아니라 대립유전자 종 및 유도된 변이체를 비롯한 유사체를 포함한다. 전형적으로, 유사체는 하나, 2 개 또는 수 개의 위치에서, 종종 보존적 치환에 의해 천연 발생 펩티드와는 상이하다. 전형적으로, 유사체는 천연 펩티드와 80 또는 90% 이상의 서열 동일성을 나타낸다. 또한, 일부 유사체는 하나, 2 개 또는 수 개의 위치에서, N-말단 아미노산 또는 C-말단 아미노산의 비천연 아미노산 또는 변형물을 포함한다. 예를 들면, Aβ의 위치 1 및(또는) 7에서 천연 아스파르트산 잔기는 이소-아스파르트산으로 치환될 수 있다.
비천연 아미노산의 예로는 D, 알파, 알파-이치환 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 4-히드록시프롤린, 감마-카르복시글루타메이트, 엡실론-N,N,N-트리메틸리신, 엡실론-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, 오메가-N-메틸아르기닌, β-알라닌, 오르니틴(ornithine), 노르루신, 노르발린, 히드록시프롤린, 티록신(thyroxine), 감마-아미노 부티르산, 호모세린, 시트룰린(citrulline) 및 이소아스파르트산이 있다. 또한, 면역원성 펩티드는 Aβ의 유사체 및 그의 단편을 포함한다. 본 발명의 일부 치료제로는 all-D 펩티드, 예를 들면 all-D Aβ, all-D Aβ 단편, 또는 all-D Aβ 또는 all-D Aβ 단편의 유사체가 있다. WO 00/72880에 기재된 바와 같이, 단편 및 유사체를 비처리 대조군 또는 위약 대조군과 비교하여 트랜스제닉(transgenic) 동물 모델에서의 예방 또는 치료 효능에 대해 스크리닝할 수 있다.
또한, 펩티드 면역원은 예를 들면, 다른 아미노산과 함께 면역원성 Aβ의 펩티드를 포함하는 긴 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, 바람직한 면역원성 펩티드는 이형 아미노산 서열에 대항하여 헬퍼 T 세포 반응을 유도하여 Aβ 절편에 대항하는 B 세포 반응을 유도하는 이형 아미노산 서열에 결합된 Aβ의 절편을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 WO 00/72880에 기재된 바와 같이 동물 모델에서의 비처리된 또는 위약 대조군과 비교하여 예방 또는 치료 효능에 대해 스크리닝될 수 있다.
Aβ 펩티드, 유사체, 면역원성 단편 또는 다른 폴리펩티드는 분해된 형태 또는 응집된 형태로 투여될 수 있다. 분해된 Aβ 또는 그의 단편은 단량체 펩티드 단위를 의미한다. 일반적으로, 분해된 Aβ 또는 그의 단편은 가용성이고, 자체 응집하여 가용성 올리고머, 프로토피브릴(protofibrill) 및 ADDLs를 형성할 수 있다. Aβ 및 그의 단편의 올리고머는 대개 가용성이고, 부로 알파-나선체 또는 랜덤 코일로 존재한다. 응집된 Aβ 또는 그의 단편은 불용성 베타-시트 조립체로 회합된 Aβ 또는 그의 단편의 올리고머를 의미한다. 또한, 응집된 Aβ 또는 그의 단편은 피브릴 중합체를 의미한다. 피브릴은 대개 불용성이다. 일부 항체들은 가용성 Aβ 또는 그의 단편 또는 응집된 Aβ 또는 그의 단편을 결합시킨다. 일부 항체들은 가용성 Aβ 또는 그의 단편 및 응집된 Aβ 또는 그의 단편 양쪽 모두를 결합시킨다.
또한, 면역원성 펩티드는 단량체 면역원성 펩티드로 된 다량체(multimer)를 포함한다. Aβ 펩티드 이외의 면역원성 펩티드는 상기 나열된 Aβ의 바람직한 단편(예를 들면, Aβ1-3, 1-7, 1-10 및 3-7) 중 하나 이상에 대해 면역원성 반응을 유도해야 한다.
본 발명의 면역원성 펩티드는 본 발명의 방법을 사용하여 컨쥬게이트를 형성하도록 캐리어에 연결된다. 면역원성 펩티드는 그의 아미노 말단, 그의 카르복실 말단 또는 양쪽 모두에서 캐리어에 연결되어 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 임의적으로, 면역원성 펩티드의 다수의 반복체가 컨쥬게이트 중에 존재할 수 있다.
Aβ의 N-말단 단편은 그의 C-말단에서 캐리어 펩티드에 연결되어 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 이러한 컨쥬게이트에서, Aβ의 단편의 N-말단 잔기는 컨쥬게이트의 N-말단 잔기를 구성한다. 따라서, 이러한 컨쥬게이트는 Aβ의 N-말단 잔기가 유리된 형태로 존재할 것을 필요로 하는 에피토프에 결합하는 항체를 유도하는 데 유효하다. 본 발명의 일부 면역원성 펩티드는 C-말단에서 캐리어 펩티드 중 하나 이상의 카피에 연결되어 컨쥬게이트를 형성하는 Aβ의 N-말단 절편으로 된 다수의 반복체를 포함한다. 때때로, 이러한 컨쥬게이트로 혼입되는 Aβ의 N-말단 단편은 Aβ1-3에서 시작하고 Aβ7-11에서 끝난다. Aβ1-7, 1-3, 1-4, 1-5 및 3-7이 Aβ의 바람직한 N-말단 단편이다. 일부 컨쥬게이트는 텐덤(tandem)으로 Aβ의 상이한 N-말단 절편을 포함한다. 예를 들면, 컨쥬게이트는 Aβ1-7 뒤에 캐리어에 연결된 Aβ1-3을 포함할 수 있다.
일부 컨쥬게이트에서, Aβ의 N-말단 절편은 그의 N-말단 끝단에서 캐리어 펩티드에 연결된다. Aβ로 된 동일한 다양성으로 된 N-말단 절편을 C-말단 연결로서 사용할 수 있다. 일부 컨쥬게이트는 Aβ의 N-말단 절편의 N-말단에 연결된 캐리어 펩티드를 포함하며, 이로써 Aβ의 하나 이상의 추가적인 N-말단 절편에 연결된다. 바람직하게는, 이러한 면역원성 Aβ 단편은 적합한 캐리어에 컨쥬게이트된 후, Aβ 단편으로 특이적으로 지향되며 Aβ의 다른 단편으로는 지향되지 않는 면역원성 반응을 유도한다.
본 발명의 면역원성 펩티드는 면역원성 이형 펩티드를 포함한다. 일부 면역원성 펩티드에서, Aβ 단편은 캐리어에 연결되어 면역원성 이형 펩티드를 형성한다. 이 이형 펩티드는 본 발명의 방법을 사용하여 컨쥬게이트를 형성하도록 캐리어에 연결된다. 이러한 면역원성 이형 펩티드 중 일부는 예를 들면, US 5,196,512, EP 378,881 및 EP 427,347에 기재된 파상풍 유독소 에프토프에 연결된 Aβ의 단편을 포함한다. 임의적으로, 면역원성 펩티드는 예를 들면, 캐리어의 N 말단 및 C 말단 모두에서 캐리어의 하나 또는 다수의 카피에 연결되어 면역원성 이형 펩티드를 형성할 수 있다. 이러한 면역원성 이형 펩티드의 다른 것들은 US 5,736,142에 기재된 캐리어 펩티드에 연결된 Aβ의 단편을 포함한다. 예를 들면, 면역원성 이형 펩티드는 Aβ1-7 뒤에 Aβ1-3 뒤에 캐리어를 포함할 수 있다. 이러한 면역원성 이형 펩티드의 예는 하기를 포함한다.
선형 배위의 Aβ1-7/파상풍 유독소 830-844 + 947-967
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (서열 번호 24)
미국 특허 제 5,736,142호에 기재된 펩티드 (모두 선형 배위):
PADRE/Aβ 1-7:
AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD (서열 번호 26)
Aβ1-7 x 3/PADRE:
DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (서열 번호 27)
PADRE/Ap1-7 x 3:
AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (서열 번호 28)
Aβ1-7/PADRE:
DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (서열 번호 29)
Aβ1-7/알부민 단편:
DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR (서열 번호 30)
Aβ4-10/알부민 단편:
FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR (서열 번호 31)
Aβ3-9/알부민 단편:
EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR (서열 번호 32)
HA307 -319/Aβ1-7 x 3:
PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (서열 번호 33)
Aβ1-7/HA307 -319/Aβ1-7:
DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD (서열 번호 34)
Aβ1-7x 3/HA307 -319:
DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (서열 번호 35)
Aβ1-7x 2/HA307 -319:
DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (서열 번호 36)
Aβ1-7/HA307 -319/말라리아 CS/TT830 -844/TT947 -967/Aβ1-7
DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKEIAKMEKAS SVFNV-QYIKANSKFIGITEL-
FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD (서열 번호 37)
Aβ1-7 x 3/TT830 -844/C/TT947 -967
DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-C-
FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (서열 번호 38)
Aβ1-7/TT830 -844/C/TT947 -967
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (서열 번호 39)
Aβ1-7/TT830 -844/C/TT947 -967/Aβ1-7
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-C-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD (서열 번호 20)
일부 면역원성 이형 펩티드는 식 2X(여기서, x는 1-5의 정수임)에 의해 나타나는 면역원성 펩티드 다량체를 포함한다. 바람직하게는, x는 1, 2 또는 3이며, 2가 가장 바람직하다. x가 2인 경우, 이러한 다량체는 MAP4로 지칭되는 바람직한 배위(미국 제 5,229,490호 참조)로 연결된 4 개의 면역원성 펩티드를 갖는다. 그 다음, 이러한 면역원성 펩티드는 본 발명의 방법을 사용하여 컨쥬게이트를 형성하도록 캐리어에 연결된다.
MAP4 배위를 하기에 나타내며, 분지된 구조는 리신의 측쇄 아민 및 N-말단 양쪽 모두에서 펩티드 합성을 개시함으로써 생성된다. 리신이 서열로 혼입되고 분지되는 횟수에 따라, 생성되는 구조는 다수의 N-말단을 제공하게 된다. 이 예에서는, 분지된 리신 함유 코어 상에 4 개의 동일한 N-말단을 생성하였다. 이러한 다중성은 동족 B 세포의 반응성을 크게 강화시킨다.
Figure 112011068200653-pat00012
이러한 면역원성 이형 펩티드의 예는 하기를 포함한다.
MAP4 배위의 Aβ1-7/파상풍 유독소 830-844:
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL (서열 번호 22)
MAP4 배위의 Aβ 1-7/파상풍 유독소 947-967:
DAEFRHD-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (서열 번호 23)
MAP4 배위의 Aβ 3-9/파상풍 유독소 830-844:
EFRHDSG-QYIKANSKFIGITEL (서열 번호 25)
2 분지된 수지 상의 DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL
Figure 112011068200653-pat00013
Aβ 펩티드, 유사체, 활성 단편 또는 다른 폴리펩티드는 회합된 형태 또는 다량체 형태 또는 해리된 형태로 투여될 수 있다. 또한, 치료제는 단량체 면역원성 약제로 된 다량체를 포함한다. Aβ 펩티드 이외의 약제는 앞서 나열된 Aβ의 바람직한 단편 중 하나 이상에 대항하여 면역원성 반응을 유도해야 하며(예를 들면, 1-10, 1-7, 1-3 및 3-7), 또한, 본 발명의 방법을 사용하여 캐리어에 컨쥬게이트될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 제제는 적합한 캐리어에 컨쥬게이트된 후, Aβ의 다른 단편으로 지향되지 않고, 이러한 단편들 중 하나로 특이적으로 지향되는 면역원성 반응을 유도한다. 펩티드 면역원과 캐리어의 컨쥬게이트를 용이하게 하기 위해, 추가적인 아미노산을 항원 결정인자의 말단에 첨가할 수 있다. 또한, 펩티드 면역원의 물리적 또는 화학 성질을 변형시키는 데에 추가적인 잔기를 사용할 수 있다. 펩티드 면역원의 C-말단 또는 N-말단에서 아미노산, 예를 들면 티로신, 시스테인, 리신, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 도입할 수 있다. 또한, 아미노산, 예를 들면 글리신 및 알라닌을 함유하는 펩티드 링커도 도입될 수 있다. 또한, 항원 결정인자는 예를 들면, 알칸올(C1-C20)에 의한 말단 NH2-기 아실화, 또는 티오글리콜릴 아세틸화, 말단-카르복시아미드화, 예를 들면 암모니아, 메틸아민 등에 의해 변형된 것이라는 점에서 천연 서열과는 상이할 수 있다. 일부 경우, 이러한 변형물은 지지체 또는 다른 분자에 대한 연결용 부위를 제공할 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 본 발명의 컨쥬게이트를 생성하는 데 사용되는 펩티드 면역원은 연결을 통해 합쳐져 중합체(다량체)를 형성할 수 있거나, 또는 연결 없이 조성물 중에 혼합물로서 제제화될 수 있다. 펩티드가 동일한 펩티드에 연결되어 단일 중합체를 형성하는 경우, 다수의 반복되는 에피토프 단위가 제공된다. CTL 및(또는) 항체 펩티드 및 펩티드 양쪽 모두를 함유하는 중합체를 구조화하는 데에 예를 들면, 다중 항원성 펩티드(MAP) 기술을 사용할 수 있다. 펩티드가 상이한 경우, 예를 들면 상이한 바이러스 서브타입(subtype)을 나타내는 칵테일(cocktail), 서브타입 내 상이한 에피토프, 상이한 HLA 제한 특이성, 또는 T-헬퍼 에피토프를 함유하는 펩티드, 반복 단위를 갖는 헤테로중합체가 제공된다. 공유 연결 외에도, 분자간 결합 및 구조내 결합을 형성할 수 있는 비공유 연결도 고려된다.
이러한 펩티드 면역원 및 그들의 유사체는 고체 상 펩티드 합성 또는 재조합 발현에 의해 합성되거나, 또는 천연 공급원으로부터 얻어진다. 자동 펩티드 합성기는 다수의 공급업체, 예를 들면 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)로부터 상업적으로 입수가능하다.
재조합 발현은 세균(예를 들면, 에스케리키아 콜라이), 효모, 곤충 세포 또는 포유류 세포에서 존재할 수 있다. 재조합 발현 절차는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press, NY, 2nd ed., 1989)]에 기재되어 있다. 또한, 일부 면역원성 펩티드는 상업적으로 입수가능하다(예를 들면, 캘리포니아주 써니베일 소재의 아메리칸 펩티드스 캄파니, 인크.(American Peptides Company, Inc.) 및 캘리포니아주 나파 소재의 캘리포니아 펩티드 리서치, 인크.(California Peptide Research, Inc.)).
또한, 펩티드 또는 다른 화합물의 랜덤 라이브러리도 펩티드 면역원으로서의 적합성에 대해 스크리닝할 수 있다. 단계적으로 합성될 수 있는 많은 유형의 화합물에 대한 조합 라이브러리를 생성할 수 있다. 이러한 화합물은 폴리펩티드, 베타-턴(beta-turn) 모사체, 호르몬, 올리고머 N-치환된 글리신 및 올리고카르바메이트 등을 포함한다. 화합물의 대형 조합 라이브러리는 WO 95/12608, WO 93/06121, WO 94/08051, WO 95/35503 및 WO 95/30642(이들 각각은 모든 목적을 위해 참고 문헌으로 인용됨)에 기재된 코딩된 합성 라이브러리(ESL) 방법에 의해 구조화될 수 있다. 또한, 펩티드 라이브러리는 파지 디스플레이(phage display) 방법(예를 들면, 데블린(Devlin)의 WO 91/18980 참조)에 의해 생성될 수 있다.
면역원성 펩티드의 단백질 캐리어에 대한 유도체화 및 컨쥬게이트
단백질/폴리펩티드 캐리어에 대한 펩티드 면역원의 부착 부위 및 펩티드 면역원을 캐리어에 부착시키는 데 사용되는 가교 결합제의 성질 양쪽 모두는 이에 대항하여 생성되는 항체의 특이성에 중요하다. 적합한 인식을 위해, 펩티드 면역원은 적합한 배향을 사용하여 캐리어에 커플링되어야 한다. 추후 항체가 캐리어 없이도 유리된 펩티드 면역원을 인식하기 위해, 펩티드 면역원-단백질/폴리펩티드 캐리어 컨쥬게이트는 펩티드 면역원을 노출되고 접근가능한 형태로 제공되어야 한다. 종종, 최적 배향은 펩티드 면역원 상의 특이적 부위에 대한 가교 결합 반응을 지향시킴으로써 얻어진다. 펩티드 면역원을 사용하여 이를 달성하는 한 방법은 펩티드 합성 동안 말단 시스테인 잔기를 부착시킴으로써 이루어진다. 이는 캐리어에 컨쥬게이트시키기 위해 펩티드의 한 말단 상에 설프히드릴 기를 제공한다. 이 기를 통한 가교 결합은 오직 한 말단에서의 펩티드 면역원의 부착을 제공함으로써 일관된 배향을 보장한다.
펩티드 면역원-캐리어 컨쥬게이트에서, 목표는 캐리어의 안정성 또는 본연의 상태를 유지하는 것이 아니라, 가능한 가장 우수한 방법으로 면역계에 합텐을 제공하는 것이다. 이 목표에 도달함에 있어서, 컨쥬게이트 화학물질의 선택은 생성되는 역가, 친화력, 및 합텐에 대항하여 생성된 항체의 특이성을 조절할 수 있다. 일부 경우, 제한없는 방식으로 항원을 제공하도록 충분히 긴 스페이서 아암(spacer arm)을 함유하는 가교 결합제를 선택하는 것이 중요할 수 있다. 또한, 캐리어의 표면 상의 펩티드 면역원의 밀도를 조절하는 것도 중요할 수 있다. 펩티드 면역원 치환이 너무 적으면 반응이 거의 일어나지 않거나 또는 일어나지 않을 수 있다. 펩티드 면역원 밀도가 너무 높으면 실제로 면역학적 억제를 유발할 수 있고, 반응을 감소시킬 수 있다. 또한, 가교-링커(cross-linker) 자체도 원치않는 면역 반응을 일으킬 수 있다. 이러한 문제는 적합한 가교 결합 시약을 선택하는 것, 뿐만 아니라 단백질/폴리펩티드 캐리어와 펩티드 면역원의 적합한 비를 선택하는 데에도 고려되어야 한다.
단백질/펩티드 캐리어를 펩티드 면역원에 부착하는 데에는 다양한 수단이 가능하다. 말단 또는 리신의 ε-아미노기를 통해 이온 상호작용이 이루어질 수 있다. 또한, 잔기의 측 기와 펩티드 면역원 사이에 수소 결합이 이루어질 수 있다. 마지막으로, 단백질/펩티드 캐리어와 면역원성 펩티드 사이의 배좌 상호작용은 안정한 부착을 제공할 수 있다.
펩티드 면역원-캐리어 컨쥬게이트는 다양한 가교 결합 시약, 예를 들면 0-길이, 호모이작용성 또는 헤테로이작용성 가교 링커를 사용하여 성공적으로 생성되었다. 생체컨쥬게이트(bioconjugation)에 이용가능한 최소형 시약 시스템은 소위 0-길이 가교-링커이다. 이러한 화합물은 추가적인 원자를 함유하지 않는 결합을 형성함으로써 2 개의 분자의 컨쥬게이트를 매개한다. 따라서, 분자 중 한 원자는 스페이서이다. 많은 컨쥬게이트 계획에서, 최종 착물는 가교 결합되는 물질에 외래 구조체를 첨가하는 화학 성분에 의해 함께 결합된다. 일부 적용분야에서, 이러한 중재 링커의 존재는 원하는 용도에 유해할 수 있다. 예를 들면, 펩티드 면역원-캐리어 컨쥬게이트의 제조시에는 부착된 합텐에 면역 반응을 생성할 의도로 착물을 형성시킨다. 종종, 이 반응에 의해 생산된 항체의 부분은 컨쥬게이트 절차에 사용되는 가교 결합제에 대해 특이성을 가질 것이다. 0-길이 가교 결합제는 두 물질 사이의 직접적인 연결을 매개함으로써 이러한 유형의 교차 반응성의 가능성을 제거한다.
거대분자의 컨쥬게이트 및 변형에 사용되는 제1 가교 결합 시약인 호모이작용성 시약은 양쪽 말단에 동일한 작용기를 함유하는 이반응성(bireactive) 화합물로 이루어졌다(문헌[Hartman and Wold, 1966] 참조). 이들 시약은 양쪽 분자 상에서 동일한 공통기와 공유 반응시킴으로써 한 단백질을 또 다른 단백질에 결합시킬 수 있다. 따라서, 한 단백질의 리신 ε-아민 또는 N-말단 아민은 호모이작용성 시약의 존재 하에서 단순히 둘을 함께 혼합시킴으로써 제2 단백질 상의 동일한 작용기에 가교 결합될 수 있다.
헤테로이작용성 컨쥬게이트 시약은 단백질 및 다른 거대분자 상의 2 개의 상이한 관능 표적에 커플링할 수 있는 2 개의 상이한 반응성 기를 함유한다. 예를 들면, 가교-링커의 한 부분은 아민-반응성 기를 함유할 수 있으며, 또 다른 부분은 설프히드릴-반응성 기로 이루어질 수 있다. 그 결과, 표적 분자의 선택된 부분에 가교 결합 반응을 지향시킬 수 있어 컨쥬게이트 방법에 대한 더욱 우수한 조절을 얻을 수 있다.
헤테로이작용성 시약은 종종 호모이작용성 가교-링커를 사용하여 얻어진 중합도를 제한하는 2 단계 또는 3 단계 방법으로 단백질 및 다른 분자를 가교 결합시키는 데 사용된다.
0-길이, 호모이작용성 또는 헤테로이작용성 가교 결합제를 사용하여 단백질/폴리펩티드 캐리어에 펩티드 면역원을 커플링시키는 많은 방법들이 현재 이용가능하다. 대부분의 방법은 아민, 아미드, 우레탄, 이소티오우레아 또는 이황 결합을 생성시키거나, 또는 일부 경우, 티오에테르를 생성시킨다. 단백질 또는 펩티드를 펩티드에 커플링시키는 더욱 일반적인 방법은 이작용성 가교 결합 시약을 사용한다. 이들은 각 말단에 활성 기를 갖는 소형 스페이서 분자이다. 스페이서 분자는 각 말단에서 동일하거나 상이한 활성 기를 가질 수 있다. 형성되는 가장 통상적인 활성 작용성, 커플링 기, 및 결합은 다음과 같다.
1. 알데히드 - 아미노 → 2차 아민
2. 말레이미도 - 설프히드릴 → 티오에테르
3. 숙신이미도 - 아미노 → 아미드
4. 이미데이트 에스테르 - 아미노 → - 아미드
5. 페닐아지드 - 아미노 → 페닐 아민
6. 아실할리드 - 설프히드릴 → 티오에테르
7. 피리딜디설피드 - 설프히드릴 → 디설피드
8. 이소티오시아네이트 - 아미노 → 이소티오우레아.
주어진 캐리어 단백질의 반응성은 펩티드 면역원에 컨쥬게이트될 수 있도록 가교 결합제에 의해 변형되는 그의 능력 측면에서 그의 아미노산 조성 및 분자의 3 차원 구조 중 개개의 아미노산의 서열 위치, 뿐만 아니라 펩티드 면역원의 아미노산 조성에 의해 결정된다.
단백질/펩티드 캐리어와 다른 펩티드(예를 들면, 단백질/펩티드 캐리어 및 펩티드 면역원) 사이의 링커("L")의 경우, 스페이서는 전형적으로 Ala, Gly, 또는 비극성 아미노산 또는 중성 극성 아미노산의 다른 중성 스페이서로부터 선택된다. 특정한 실시양태에서, 중성 스페이서는 Ala이다. 임의적으로 존재하는 스페이서는 동일한 잔기를 포함할 필요가 없기 때문에 헤테로-올리고머 또는 호모-올리고머일 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예시적인 스페이서는 Ala의 호모-올리고머를 포함한다. 스페이서는 존재하는 경우 대개 하나 이상 또는 2 개의 잔기, 더욱 흔히 3 내지 6 개의 잔기로 존재하게 된다. 다른 실시양태에서, 단백질/폴리펩티드 캐리어는 바람직하게는, 아미노 말단에 위치한 단백질/펩티드 캐리어를 사용하여 펩티드 면역원에 컨쥬게이트된다. 펩티드는 중성 링커, 예를 들면 Ala-Ala-Ala 등에 의해 연결될 수 있고, 바람직하게는, 전형적으로 Ser-Ser 연결 등을 통해 펩티드 컨쥬게이트의 아미노 말단에 부착된 Lys 잔기((PAM)2Lys)의 알파 및 엡실론 아미노기에 부착된 지질 잔기, 예를 들면 팔미트산 등을 추가로 함유한다.
본 발명의 일부 측면에서, 펩티드 면역원은 Aβ1-5-L, Aβ1-7-L, Aβ1-9-L, 및 Aβ1-12-L로 이루어진 군에서 선택되는 Aβ 단편이다. 본 발명의 일부 측면에서, 링커는 GAGA이다(서열 번호 10).
펩티드 면역원과 캐리어의 컨쥬게이트를 용이하게 하기 위해, 추가적인 아미노산을 항원 결정인자의 말단에 첨가할 수 있다. 또한, 펩티드 면역원의 물리적 또는 화학적 성질을 변형시키는 데 추가적인 잔기를 사용할 수 있다. 아미노산, 예를 들면 티로신, 시스테인, 리신, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 펩티드 면역원의 C-말단 또는 N-말단에서 도입시킨다. 또한, 아미노산, 예를 들면 글리신 및 알라닌을 함유하는 펩티드 링커도 도입할 수 있다. 또한, 항원 결정인자는 말단 NH2-기 아실화에 의해, 예를 들면 알칸올(C1-C20) 또는 티오글리콜릴 아세틸화, 말단-카르복시 아미드화, 예를 들면 암모니아, 메틸아민 등에 의해 변형됨으로써 천연 서열과 상이할 수 있다. 일부 경우, 이러한 변형은 지지체 또는 다른 분자에 연결 부위를 제공할 수 있다.
본 발명의 일부 측면에서, 펩티드 면역원은 Aβ1-5-C, Aβ1-7-C, Aβ1-9-C 및 Aβ1-12-C(여기서, C는 시스테인 아미노산 잔기임)로 이루어진 군에서 선택되는 Aβ 단편이다. 본 발명의 일부 측면에서, 펩티드 면역원은 Aβ1-5-L-C, Aβ1-7-L-C, Aβ1-9-L-C 및 Aβ1-12-L-C로 이루어진 군에서 선택되는 Aβ 단편이다.
펩티드 면역원은 펩티드 면역원의 아미노 또는 카르복시 말단에서 직접 또는 링커를 통해 단백질/펩티드 캐리어에 연결된다. 펩티드 면역원 또는 단백질/펩티드 캐리어의 아미노 말단은 아실화될 수 있다. 또한, 펩티드 면역원-단백질/펩티드 캐리어 컨쥬게이트는 하기하는 바와 같이 하나 이상의 연결 잔기, 예를 들면 Gly, Gly-Gly, Ser, Ser-Ser을 통해 특정한 알칸올(C1-C20) 지질에 연결될 수 있다. 다른 유용한 지질 잔지는 콜레스테롤, 지방산 등을 포함한다.
펩티드 면역원은 화학적 가교 결합에 의해 캐리어에 연결될 수 있다. 면역원을 캐리어에 연결하는 기술은 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜-티오) 프로피오네이트(SPDP)(문헌[Carlsson, J et al.(1978) Biochem J, 173: 723,] 참조) 및 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC)를 사용하여 디설피드 연결을 형성시키는 것을 포함한다(펩티드가 설프히드릴 기를 함유하지 않는 경우, 시스테인 잔기를 합텐에 첨가함으로써 제공될 수 있음). 이러한 시약은 그들과 한 단백질 상의 펩티드 시스테인 잔기 사이에 디설피드 연결 및 리신 상의 ε-아미노, 또는 다른 아미노산 중의 다른 유리된 아미노기를 통해 아미드 연결을 생성한다. 다양한 이러한 디설피드/아미드-형성제는 문헌[Iiizinune. Rev. 62: 85 (1982)]에 기재되어 있다. 다른 이작용성 커플링제는 디설피드 연결을 형성하지 않고 티오에테르를 형성한다. 티오에테르 형성제는 6-말레이미도카프로산, 2-브로모아세트산, 및 2-요오도아세트산, 4-(N-말레이미도-메틸) 시클로헥산-1-카르복실산의 반응성 에스테르를 포함한다. 카르복실기를 숙신이미드 또는 1-히드록실-2-니트로-4-술폰산, 나트륨염과 합침으로서 활성화시킬 수 있다.
가장 흔하게는, 리신 잔기는 캐리어 단백질 상의 가장 풍부한 아미노산 잔기이고, 이러한 잔기를 가교 결합 시약을 사용하여 변형시켜 친핵성 부위를 생성시킨 다음, 합텐에 커플링시킨다. 이 커플링은 화학적 활성을 갖는 합텐 분자 상에서 임의의 친수성 측쇄를 통해 달성된다. 이들은 아르기닌의 구아니딜 기, 글루타메이트 및 아스파르트산의 카르복실기, 시스테인의 설프히드릴 기 및 리신의 ε-아미노기 등을 포함한다. 현재 단백질이 다른 잔지에 커플링될 수 있도록 단백질을 변형시키는 것은 단백질 캐리어 또는 합텐 분자 상의 임의의 측쇄와 반응하는 가교 결합 시약을 사용하여 수행된다.
본 발명의 한 측면에서, 링커 분자를 갖거나 갖지 않는 캐리어 단백질은 친핵성 기를 도입하도록 추가로 변형될 수 있는 캐리어 단백질 분자에 반응성 부위를 도입시키는 시약을 사용하여 작용기화(유도체화)된다. 한 실시양태에서, 캐리어는 단백질의 아미노산 잔기 상의 다수의 작용기, 예를 들면 시스테인의 설프히드릴 기, 리신 잔기의 1차 ε-아민 기, α-아민의 α 말단, 메티오닌의 티오에테르 및 히스티딘의 이미다조일 측쇄 질소 양쪽 모두(문헌[Gurd, 1967] 참조)와 우선적으로 반응하는 할로아세틸화제와 반응한다. 바람직한 실시양태에서, 캐리어 단백질의 리신 잔기 상의 1차 ε-아민 기는 b N-히드록시숙신이미딜 브로모아세테이트에 의해 유도체화되어 브로모아세틸화된 캐리어를 생성한다. 펩티드 면역원을 함유하는 용액에 활성화된 캐리어를 천천히 첨가함으로써 펩티드 면역원과 활성화된 단백질 캐리어의 컨쥬게이트를 수행하였다.
본 발명의 방법을 사용함으로써, 상기 섹션 B에 논의된 펩티드 면역원은 상기 섹션 A에 논의된 임의의 캐리어에 컨쥬게이트될 수 있다. 본 발명의 방법으로부터 얻어진 컨쥬게이트는 수동/능동 면역치료에 사용시 Aβ의 항체의 생성에 대한 면역원으로서 사용된다. 나아가, 캐리어에 연결된 Aβ 또는 Aβ 단편을 Aβ에 대한 단일클론 항체의 생산시 실험실 동물에 투여할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 컨쥬게이트는 Aβ1-7-CRM197, (Aβ1-7 x 3)-CRM197및 (Aβ1-7 x 5)-CRM197로 이루어진 군에서 선택되는 컨쥬게이트이다. 본 발명의 한 측면에서, 컨쥬게이트는 CRM197-Aβ1-5, CRM197-Aβ1-7, CRM197-Aβ1-9 및 CRM197-Aβ1-12로 이루어진 군에서 선택되는 컨쥬게이트이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 컨쥬게이트는 Aβ1-5-C-CRM197, Aβ1-7-C-CRM197, Aβ1-9-C-CRM197, 및 Aβ1-12-C-CRM197, Aβ16-23-C-CRM197, Aβ17-24-C-CRM197, Aβ18-25-C-CRM197, CRM197-C-Aβ16-23, CRM197-C-Aβ17-24, CRM197-C-Aβ18-25, Aβ16-22-C-CRM197, Aβ17-23-C-CRM197, Aβ18-24-C-CRM197, CRM197-C-A16-22, CRM197-C-Aβ17-23, 및 CRM197-C-Aβ18-24, Aβ1-9-C-CRM197 및 Aβ1-12-C-CRM197로 이루어진 군에서 선택되는 컨쥬게이트이다. 또한, 본 발명의 또 다른 측면에서, 컨쥬게이트는 Aβ1-5-L-C-CRM197, Aβ1-7-L-C-CRM197, Aβ1-9-L-C-CRM197 및 Aβ1-12-L-C-CRM197로 이루어진 군에서 선택되는 컨쥬게이트이다.
캡핑
캐리어 및(또는) 합텐 분자 상의 반응성 아미노산 분자의 측쇄에 반응성 부위를 도입시키는 커플링 시약 사용에 대한 단점은 반응성 부위가 중성화되지 않은 경우 유리되어 시험관내 또는 생체내에서 임의의 원치않는 분자와 반응할 수 있다는 점이다. 본 발명의 방법에서, 미반응 작용기의 캡핑은 반응성 기를 불활성화/캡핑시키는 시약을 사용하여 현수 반응성 기와의 컨쥬게이트를 반응시킴으로써 수행된다. 본 발명의 컨쥬게이트 방법에 사용되는 예시적인 불활성화/캡핑 시약은 시스테아민, N-아세틸시스테아민 및 에탄올아민을 포함한다. 별법으로, 캡핑은 이 중 하나가 할로아세틸 기를 아미노아세틸 기로 전환시키는 암모니아 또는 중탄산암모늄과의 반응에 의해 수행된다. 또한, 캡핑은 할로아세틸 기를 히드록시아세틸 기로 전환시키는 수산화나트륨 또는 탄산나트륨을 사용하여 알칼리 pH(9.0-9.8)에서 수행된다. 시스테아민 유도체, 에탄올아민 등과의 반응과는 달리 할로아세틸 기를 아미노아세틸 또는 히드록시아세틸 기로 전환시키는 데 있어서의 한 가능한 이점은 암모니아 또는 수산화물/탄산화물와의 반응에 의해 비교적 적은 크기의 화학적 작용성이 도입된다는 점이다. 생성되는 캡핑된 작용기, 예를 들면 아미노아세틸 또는 히드록시아세틸은 컨쥬게이트의 캐리어 단백질 부분에 비교적 적은 교란을 제공한다. 캡핑된 펩티드 면역원-캐리어 단백질은 필요에 따라 공지된 방법, 예를 들면 크로마토그래피(겔 여과, 이온 교환, 소수성 상호작용 또는 친화력), 투석, 한외여과-정용여과(ultrafiltration-diafiltration), 황산암모늄 또는 알코올을 사용한 선택적 침전 등을 사용하여 정제된다.
면역원성 컨쥬게이트 및 조성물
캡핑된 펩티드 면역원-캐리어 단백질 컨쥬게이트는 예방 및(또는) 치료 목적으로 면역원성 조성물로 포유류, 특히 인간에 투여되나다. 본 발명의 컨쥬게이트를 사용하여 면역원에 대한 면역 반응을 유도해 내고(내거나) 강화시킨다. 예를 들면, CTL-캐리어 컨쥬게이트는 바이러스 감염, 아밀로이드 생성성(amyloidogenic) 질환, 암 등을 치료하고(치료하거나) 예방하는 데 사용된다. 별법으로, 항체 반응을 유도하는 폴리펩티드 면역원-캐리어 컨쥬게이트도 사용된다.
치료 적용시, 본 발명의 컨쥬게이트를 이미 아밀로이드 생성성 질환, 예를 들면 알츠하이머병을 앓고 있는 개인에게 투여한다. 적합하게는, 질환의 인큐베이션기 또는 급성 기는 본 발명의 컨쥬게이트를 단독으로 또는 다른 치료제와 병용함으로써 치료될 수 있다.
치료 적용시, 본 발명의 면역원성 조성물을 아밀로이드 플라크에 유효한 CTL 반응 또는 체액 반응을 유도해 내고, 질환 진행, 증상 및(또는) 합병증을 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 억류시키기 충분한 양으로 환자에게 투여한다. 이를 수행하기에 적합한 양은 "치료적으로 유효한 투여량"으로 정의된다. 이러한 용도에 유효한 양은 부분적으로 펩티드 조성물, 투여 방식, 치료될 질환의 단계 및 심도, 환자의 체중 및 일반적인 건강 상태 및 의사의 판단에 따라 좌우된다.
일반적으로, 치료적 또는 예방적 투여에 대한 초기 면역화시 본 발명의 면역원성 조성물의 치료적으로 유효한 양은 70 kg 환자의 경우 약 0.1 ㎍ 내지 약 10,000 ㎍, 대개 약 0.1 내지 약 8000 ㎍, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 5000 ㎍, 가장 바람직하게는 0.1 내지 약 1,000 ㎍의 펩티드 범위이다. 이러한 투여 후, 특이적 면역 반응을 측정함으로써 환자의 반응 및 상태에 따라 수 주 내지 수 개월에 걸쳐 추가 접종 계획에 따라 약 0.1 ㎍ 내지 약 1000 ㎍의 펩티드를 추가 투여한다.
또한, 본 발명은 아밀로이드 생성성 질환을 예방적으로 방지하고(방지하거나) 완화시키는 데 사용된다. 유효한 양은 앞서 기재한 바와 같다. 또한, 당업자도 적합하게는, 예를 들면 투여량 및 투여 요법을 높이거나 조정함으로써 어떻게 예방적 치료를 조정하거나 또는 변형시키는지 알 것이다.
치료적 투여는 질환의 제1 징후시 시작할 수 있다. 이 후, 질환 진행이 정지되거나 또는 역전되거나 또는 그 후 일정 기간 동안 증상이 실질적으로 완화될 때까지 추가 투여한다.
치료적 치료 또는 예방적 치료용 본 발명의 면역원성 조성물은 예방적 치료 및(또는) 치료적 치료를 위해 비경구, 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 복막내, 비강내 또는 근육내 수단에 의해 투여될 수 있다. 비록 다른 경로도 동일하게 유효할 수 있지만 면역원성 약제의 한 전형적인 투여 경로는 피하이다. 또 다른 통상의 경로는 근육내 주사이다. 가장 전형적으로, 이러한 유형의 주사는 팔 또는 다리 근육에서 수행된다. 일부 방법에서, 상기 약제를 침착물이 축적되는 특정 조직에 직접 주사, 예를 들면 두개내 주사한다. 근육내 주사 또는 정맥내 주입이 항체 투여에 바람직하다. 일부 방법에서, 특정 치료 항체를 두개에 직접 주사한다. 본 발명의 면역원성 조성물은 투여의 용이성으로 인해 경구 투여에 특히 적합하다. 본 발명은 허용가능한 캐리어, 바람직하게는 수성 캐리어 중에 용해되거나 또는 현탁된 펩티드 또는 컨쥬게이트의 용액을 포함하는 비경구 투여용 면역원성 조성물을 추가로 제공한다.
다양한 희석제, 부형제 및 완충제, 예를 들면 물, 완충수, 포스페이트 완충 식염수, 0.3% 글리신, 히알루론산 등을 사용할 수 있다. 이러한 조성물을 통상적인 공지된 멸균 기술에 의해 멸균시키거나 또는 멸균 여과할 수 있다. 생성되는 수용액을 그 자체로 사용을 위해 팩키징하거나 또는 동결건조시킬 수 있으며, 동결건조된 제제는 투여 전 멸균 용액과 함께 합쳐진다. 조성물은 생리학적 상태에 근접시키는 데 필요로 하는 제약상 허용되는 보조 물질, 예를 들면 완충제, 긴장성 조정제, 습윤화제 등, 예를 들면 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 등을 함유할 수 있다.
고체 조성물의 경우, 통상적인 비독성 고체 캐리어를 사용할 수 있다. 이들은 예를 들면, 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산마그네슘, 삭카린나트륨, 탈크, 셀룰로오스, 글루코오스, 슈크로스, 탄산마그네슘 등의 제약 등급을 포함할 수 있다. 경구 투여의 경우, 제약상 허용되는 비독성 조성물은 임의의 통상 사용되는 부형제, 예를 들면 앞서 나열한 캐리어, 및 일반적으로 10-95%의 활성 성분, 즉 하나 이상의 본 발명의 컨쥬게이트를 더욱 바람직하게는, 25-75%의 농도에서 혼입시킴으로써 형성된다.
제약 제제 중 본 발명의 면역원성 조성물의 농도는 즉, 약 0.1 중량% 미만, 대개 약 2 중량% 이상 내지 20 중량% 내지 50 중량% 이상으로 널리 변할 수 있고, 선택된 특정 투여 방식에 따라 유체 부피, 점도 등에 의해 선택되게 된다.
또한, 본 발명의 컨쥬게이트는 컨쥬게이트를 특정 조직, 예를 들면 림프계 조직에 표적화시키는 데 작용하거나 또는 감염된 세포에 선택적으로 표적화시키는 데 작용할 뿐만 아니라 펩티드 조성물의 반감기를 증가시키는 리포솜을 통해 투여될 수 있다. 리포솜은 에멀션, 발포체, 미셀, 불용성 단층, 액정, 인지질 분산물, 라멜라 층 등을 포함한다. 이들 제제 중에서, 전달되는 조성물은 단독으로 또는 예를 들면, 림프계 세포 사이에 널리 퍼진 수용체에 결합하는 분자와 함께 리포솜의 일부로서 혼입된다. 이러한 분자는 CD45 항원에 결합하거나, 또는 다른 치료제 또는 면역원성 조성물을 사용하여 결합하는 단일클론 항체를 포함하게 된다. 따라서, 본 발명의 원하는 조성물로 충전된 리포솜은 림프계 세포의 부위로 지향될 수 있으며, 이 때 리포솜은 선택된 치료/면역원성 펩티드 조성물을 전달한다. 본 발명에 사용되는 리포솜은 일반적으로 중성 및 음 하전된 인지질 및 스테롤, 예를 들면 콜레스테롤을 포함하는 표준 소포 형성 지질로부터 형성된다. 일반적으로, 지질의 선택은 리포솜 크기, 리포솜의 혈류 중 산 불안정성(lability) 및 안정성을 고려하여 이루어진다. 예를 들면, 문헌[Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioelig. 9: 467 (1980)], 미국 특허 제 4,235,871호, 제 4,501,728호, 제 4,837,028호 및 제 5,019,369호에 기재된 리포솜을 제조하는 다양한 방법들이 이용가능하며, 위 문헌들은 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다.
에어로졸 투여의 경우, 바람직하게는 본 발명의 조성물은 계면활성제 및 추진제와 함께 미립자 형태로 공급된다. 조성물의 전형적인%는 0.01-20 중량%, 바람직하게는 1-10 중량%이다. 계면활성제는 물론 비독성이어야 하고, 바람직하게는 추진제 중에서 가용성이어야 한다. 이러한 약제의 대표예로는 지방족 다가 알코올 또는 그의 시클릭 무수물과 6 내지 22 개의 탄소 원자를 함유하는 지방산, 예를 들면 카프로산, 옥탄산, 라우르산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레스테르산 및 올레산의 에스테르 또는 부분 에스테르가 있다. 혼합된 에스테르, 예를 들면 혼합된 또는 천연 글리세리드를 사용할 수 있다. 계면활성제는 조성물 중 0.1-20 중량%, 바람직하게는 0.25-5%를 구성할 수 있다. 통상 조성물 중 나머지는 추진제이다. 또한, 필요에 따라, 비강내 전달용 레시틴으로서 캐리어도 포함될 수 있다.
임의적으로, 본 발명의 컨쥬게이트는 아밀로이드 질환 및(또는) 그의 증상의 치료 및(또는) 완화에 적어도 부분적으로 유효한 다른 약제와 함께 투여될 수 있다. 뇌에서 아밀로이드 침착물이 발생하는 알츠하이머 및 다운 증후군의 경우, 본 발명의 컨쥬게이트를 본 발명의 약제가 혈액-뇌 장벽을 통과하는 것으로 증가시키는 다른 약제와 함께 투여할 수 있다.
전형적으로, 면역원성 조성물은 에주반트를 함유한다. 에주반트는 면역원 또는 항원과 함께 투여되는 경우 면역 반응을 강화시키는 물질이다. 다수의 사이토카인 또는 림포카인은 면역 조절 활성을 가져, 인터루킨 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12(예를 들면, 미국 특허 제 5,723,127호 참조), 13, 14, 15, 16, 17 및 18(및 그의 돌연변이체 형태), 인터페론-α, 인터페론-β 및 인터페론-γ, 과립백혈구-대식세포 콜로니 자극 인자(colony stimulating factor)(예를 들면, 미국 특허 제 5,078,996호 참조) 대식세포 콜로니 자극 인자, 과립백혈구 콜로니 자극 인자, GSF, 및 종양 괴사 인자 α 및 β를 포함하며 이에 한정되지 않는 에주반트로 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 본 발명에 유용한 또 다른 에주반트는 MCP-1, MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES를 포함하며 이에 한정되지 않는 케모카인을 포함한다. 또한, 접착 분자, 예를 들면 셀렉틴(selectin), 예를 들면 L-셀렉틴, P-셀렉틴 및 E-셀렉틴도 에주반트로 유용할 수 있다. 또 다른 유용한 에주반트는 뮤신-유사(mucin-like) 분자, 예를 들면 CD34, GlyCAM-1 및 MadCAM-1, 인테그린(integrin) 족의 구성원, 예를 들면 LFA-1, VLA-1, Mac-1 및 p150.95, 면역글로불린 슈퍼 패밀리(super family)의 구성원, 예를 들면 PECAM, ICAMs, 예를 들면 ICAM-1, ICAM-2 및 ICAM-3, CD2 및 LFA-3, 공자극성 분자, 예를 들면 CD40 및 CD40L, 혈관 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 표피 성장 인자, B7.2, PDGF, BL-1, 및 혈관 내피 성장 인자를 비롯한 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 및 DR6을 비롯한 수용체 분자를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 또한, 또 다른 에주반트 분자는 카스파제(Caspase)(ICE)를 포함한다. 또한, 국제 특허 출원 W098/17799 및 W099/43839를 참조할 수 있고, 이 문헌들은 모든 목적으로 그 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다.
면역 반응을 강화시키는 데 사용되는 적합한 에주반트는 모든 목적을 위해 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 4,912,094호에 기재되어 있는 MPLTM(3-O-탈아실화 모노포스포릴 지질 A; 몬타나주 헤밀톤 소재의 코릭사(Corixa))을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 또한, 코릭사(몬타나주 헤밀톤 소재)로부터 입수가능하고, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 6,113,918호에 기재되어 있는 합성 지질 A 유사체 또는 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물(AGP), 또는 유도체 또는 그들의 유사체도 에주반트로 사용하기 적합하다. 한 이러한 AGP는 529(RC529로도 공지되어 있음; 코릭사)로 알려진 2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데칸실아미노] 에틸 2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(S)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라데카노일옥시-테트라데카노일-아미노]-b-D-글리코피라노시드이다. 이 529 에주반트는 수성 형태(529 AF) 또는 안정한 에멀션(529SE)으로서 제제화된다.
또한, 또 다른 에주반트는 광유 및 물 에멀션, 칼슘 염, 예를 들면 인산칼슘, 알루미늄 염(백반), 예를 들면 수산화알루미늄, 인산알루미늄 등, 암피겐(Amphigen), 아브리딘(Avridine), L121/스쿠알렌, D-락티드(lactide)-폴리락티드/글리코시드, 플루론산, 폴리올, 뮤라밀(muramyl) 디펩티드, 사멸된 보르데텔라(Bordetella), 사포닌, 예를 들면 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 5,057,540호에 기재된 스티뮬론(STIMULON)TM QS-21(메사추세츠주 프라밍함 소재의 안티젠스(Antigens)), 및 이로부터 생성된 입자, 예를 들면 ISCOMS(면역자극 복합체), 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 박테리아 지질다당류, 합성 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오티드(본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 6,207,646호 참조), 백일해 독소(PT), 또는 에스케리키아 콜라이 이열성 독소(LT), 특히 LT-K63, LT-R72, PT-K9/G129(예를 들면, 모든 목적으로 본 명세서에 참고문헌으로 인용되는 국제 특허 출원 WO 93/13302 및 WO 92/19265 참조)를 포함한다.
또한, 공개된 국제 특허 출원 WO 00/18434(여기서, 아미노산 위치 29의 글루탐산은 또 다른 아미노산(아스파르트산 제외, 바람직하게는 히스티딘)에 의해 치환됨)에 기재된 것들을 비롯한 콜레라 독소 및 그의 돌연변이체도 에주반트로서 유용하다. 유사한 CT 독소 또는 돌연변이체는 공개된 국제 특허 출원 WO 02/098368에 기재되어 있다(여기서, 아미노산 위치 16에서 이소루신이 또 다른 아미노산으로 단독으로 치환되거나 또는 아미노산 위치 68에서 세린이 또 다른 아미노산으로 치환회는 것과 함께 치환되고(치환되거나) 아미노산 위치 72에서 발린이 또 다른 아미노산으로 치환됨). 다른 CT 독소들은 공개된 국제 특허 출원 WO02/098369에 기재되어 있다(여기서, 아미노산 위치 25의 아르기닌이 또 다른 아미노산으로 치환되고(치환되거나) 아미노산이 아미노산 위치 49에서 삽입되고(삽입되거나) 2 개의 아미노산이 아미노산 위치 35 및 36에서 삽입됨).
기재되는 결과를 설명하기 위한 임의의 이론에 대한 본 명세서 전반에 걸쳐 있는 참고 문헌은 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 발명이 기능하는 방법과는 독립적으로, 본 명세서에 기재된 결과 및 이점은 본 발명의 하기 실시예를 참조로 얻을 수 있다.
첨부하는 청구범위의 실시사상 또는 범위로부터 벗어남이 없이 그 안에서 많은 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 점이 당업자에게 명확히 이해될 것이다. 본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 개개의 공보, 특허 또는 특허 출원 각각이 참고 문헌으로 인용되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시되었더라도 동일한 정도로 그 전문이 모든 목적으로 참고 문헌으로 인용된다.
[실시예]
실시예 1
Aβ 펩티드에 대한 CRM 197 의 컨쥬게이트
하기하는 방법(도 1)을 사용하여 39 개의 리신 잔기를 갖는 활성화된 캐리어 CRM197을 현수 티올 기를 갖는 합텐/항원 펩티드에 반응시킴으로써 합텐/항원 펩티드의 컨쥬게이트를 수행하였다. 모든 Aβ 펩티드는 카르복시 말단에서 시스테인 잔기를 함유하여 시스테이닐 설프히드릴 기를 통한 이들 펩티드의 캐리어 단백질로의 컨쥬게이트를 용이하게 하였다. 이러한 펩티드를 고체 상 합성에 의해 제조하였다.
I. 활성화
*CRM197의 유리된 아미노기를 과량의 브로모아세트산 N-히드록시숙신이미드 에스테르(미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co.))(문헌[Bernatowicz and Matsueda, 1986] 참조)와 반응시킴으로써 브로모아세틸화하였다. CRM197 (~ 15 mg)의 얼음 냉각된 용액에 10%(v/v) 1.0 M NaHC03 (pH 8.4)를 첨가하였다. CRM197의 중량과 동일한 브로모아세트산 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 200 ㎕의 디메틸포름아미드(DMF) 중에 용해시키고, CRM197에 천천히 첨가하고, 실온에서 어둠 속에서 1 시간 동안 온화하게 혼합하였다. 생성되는 브로모아세틸화된(활성화된) 단백질을 용리제로서 PBS/1 mM EDTA(pH 7.0)를 사용하여 탈염(P6-DG) 컬럼을 통과시킴으로써 정제하였다. 정제 후, 활성화된 CRM197에 대응하는 분획물을 풀링(pooling)하고, 단백질 농도를 BCA 단백질 분석시험에 의해 평가하였다. 단백질 아미노기를, 브로모아세트산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 처리 전후 양쪽 모두에서 브로모아세틸화의 표시자로 작용하는 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산(TNBSA)과 반응시켰다(문헌[Means et al., 1972] 참조).
II . 컨쥬게이트화
컨쥬게이트화 전, 펩티드를 5,5'-디티오-비스(2-니트로벤조산) [엘만(Ellman's) 시약]과 반응시켜 유리-SH 기의 함량을 확인하였다(62-88% 감소됨). 첫번째 4 개의 Aβ 펩티드(링커를 함유하지 않는 아미노산 1-7, GAGA(서열 번호 10) 링커를 갖는 아미노산 1-12, GAGA(서열 번호 10) 링커를 갖는 아미노산 1-9 및 GAGA(서열 번호 10) 링커를 갖는 아미노산 1-7)의 경우, 대략 8.0-10.0 mg의 펩티드를 멸균 증류수 중에 20 mg/ml의 근사 농도로 용해시켰다. 펩티드를 냉각된 활성화된 CRM197에 1:1 비(w/w)로 천천히 첨가하고, 20-36 ㎕의 1 N NaOH를 첨가하면서 pH를 대략 7.0-7.2로 조정하였다. 생성되는 물질을 밤새 4℃에서 어둠 속에서 온화하게 혼합한 후, pH 7.2에서 두 1 L의 PBS 교체물에 대해 어둠 속에서 투석하였다. 다음의 4 개의 Aβ 펩티드(링커를 갖지 않는 아미노산 1-5, 링커를 갖지 않는 아미노산 1-9, 링커를 갖지 않는 아미노산 1-12, 및 링커를 갖는 아미노산 1-5)의 경우, 엘만 시약과의 반응을 사용하여 유리-SH 기를 확인하였다. CRM197을 브로모아세틸화시키고, 정제시키고, 앞서 기재한 TNBSA와 반응시켰다. 용해된 펩티드의 2.2 배 부피에서 0.1 M NaP04(pH 8.5)를 첨가하면서 각 펩티드의 pH를 7.0로 조정하였다. 펩티드를 냉각 활성화된 CRM197에 1:1 비로 천천히 첨가하고, 밤새 4℃에서 어둠 속에서 반응시켰다. 생성되는 물질을 투석하였다. 최종 대조군 펩티드(역 배향으로 1-12량체)를 상기한 바와 같이 하기 변형을 사용하여 CRM197에 컨쥬게이트시켰다. R펩티드의 pH를 7.0으로 조정하지 않고, 20%(v/v) 0.5 M NaP04 (pH 8.0)를 첨가하면서 활성화된 CRM197의 pH를 대략 7.5로 조정하였다. 투석 후 각 컨쥬게이트를 멸균 15 mL 폴리프로필렌 관으로 옮기고, 알루미늄 박으로 랩핑하고, 4℃에서 저장하였다. 그 다음, 반응성 아미노 잔기의 캐리어에 대한 활성화를 추후 질량 분석법을 사용하여 확인하였다.
컨쥬게이트 면역원성 펩티드
Aβ1-5-C-CRM197 DAEFR-C (서열 번호 1)
Aβ1-7-C-CRM197 DAEFRHD-C (서열 번호 2)
Aβ1-9-C-CRM197 DAEFRHDSG-C (서열 번호 3)
Aβ1-12-C-CRM197 DAEFRHDSGYEV-C (서열 번호 4)
Aβ1-5-L-C-CRM197 DAEFR-GAGA-C (서열 번호 5)
Aβ1-7-L-C-CRM197 DAEFRHD-GAGA-C (서열 번호 6)
Aβ1-9-L-C-CRM197 DAEFRHDSG-GAGA-C (서열 번호 7)
Aβ1-12-L-C-CRM197 DAEFRHDSGYEV-GAGA-C (서열 번호 8)
Aβ12-1-C-CRM197 (-VE CONTROL) VEYGSDHRFEAD-C (서열 번호 9)
L= 링커 (GAGA) (서열 번호 10)
실시예 2
Aβ 펩티드- CRM 197 컨쥬게이트의 제조 및 CRM 197 의 한외여과 브로모아세틸화에 의한 정제
0.01 M 인산나트륨 완충제(0.9% NaCl, pH 7.0) 중의 CRM197 (100 mg)을 브로모아세트산 N-히드록시숙신이미드 에스테르(DMSO 중 20 mg/mL에 용해됨)와 1:1 중량비로 아르곤 분위기 하에서 반응시켰다. 필요에 따라 반응을 적정하여 pH를 7.0에서 유지시켰다. 혼합물을 어둠 속에서 1.5 시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 UF/DF 시스템의 포집 저장소(메사추세츠주 빌러리카 소재의 밀리포어 랩스케일 트에프에프(Millipore Labscale TFF))로 1.2 ㎛ 여과하였다. 0.01 M 인산나트륨 완충제/0.9% NaCl(pH 7.0)에 대해 정용여과(30 배)함으로써 10K 또는 30K UF 막을 사용하여 정제를 수행하였다. 브로모아세틸화된 CRM197을 0.2 ㎛ 필터를 통과시킴으로써 여과하였다. 활성화된 CRM197을 시스테인과 반응시킨 후, 아미노산 분석을 수행하고, 생성되는 카르복시메틸시스테인(CMC)을 정량화함으로써 브로모아세틸화도를 결정하였다.
Aβ의 펩티드 및 브로모아세틸화된 CRM 197 의 컨쥬게이트화 및 N- 아세틸시스테아민에 의한 캡핑
브로모아세틸화된 CRM197 (50 mg)을 반응 용기로 옮겼다. 2-8℃에서 유지된 교반된 용액에 1 M 탄산나트륨/중탄산화물을 첨가하였다. 아르곤 분위기 하에서 적정을 수행하여 9.0의 표적 pH를 얻었다. 별도로, 50 mg의 Aβ의 펩티드의 중량을 재고, 주사용수(WFI) 중에 용해시켜 20 mg/mL로 만들었다. pH 9.0이 얻어질 때까지, 이 용액에 1 M 탄산나트륨/중탄산화물을 첨가하였다. 펩티드 용액을 브로모아세틸화된 CRM197 용액에 첨가하고, 혼합물을 2-8℃에서 14-18 시간 동안 교반하였다. 3-6 시간 동안 2-8℃에서 20 배 몰의 과량의 N-아세틸시스테아민으로 잔여 브로모아세틸 기를 캡핑시켰다.
반응 혼합물을 1.2 ㎛ 필터를 통해 UF/DF 시스템(밀리포어(Millipore) XL)의 포집 저장소로 여과시키고, 컨쥬게이트를 0.01 M 인산나트륨 완충제/0.9% NaCl(pH 7.0)에 대해 정용여과함으로써 10K 또는 30K MWCO 막(밀리포어) 상에서 30 배 정용여과시킴으로써 실온에서 정제하였다. 포집물을 수집하고, 0.2 ㎛ 필터로 여과시키고, 단백질 함량(로리(Lowry) 또는 마이크로-비씨에이(Micro-BCA) 비색 분석시험)에 대해 마우스에서 SDS-PAGE, 아미노산 분석에 의해 분석하고, 면역원성에 대해 분석하였다.
실시예 3
아미노아세틸 기에 대한 미반응 브로모아세틸의 캡핑에 의한 전환
상기 실시예 2에서 기재된 바와 같이 제조된 브로모아세틸화된 CRM197 (50 mg)을 반응 용기로 옮겼다. 2-8℃에서 유지되는 교반된 용액에 1 M 탄산나트륨/중탄산화물을 첨가하였다. 아르곤 분위기 하에서 적정을 수행하여 9.0의 표적 pH를 얻었다. 별도로, 50 mg의 Aβ의 펩티드의 중량을 재고, WFI 중에 용해시켜 20 mg/mL로 만들었다. pH 9.0이 얻어질 때까지, 이 용액에 1 M 탄산나트륨/중탄산화물을 첨가하였다. 펩티드 용액을 브로모아세틸화된 CRM197 용액에 첨가하고, 혼합물을 2-8℃에서 14-18 시간 동안 교반하였다. 4 시간 동안 2-8℃에서 8% 중탄산암모늄 용액을 사용하여 잔여 브로모아세틸 기를 캡핑시켰다.
반응 혼합물을 1.2 ㎛ 필터를 통해 UF/DF 시스템(밀리포어 XL)의 포집 저장소로 여과시키고, 컨쥬게이트를 0.01 M 인산나트륨 완충제/0.9% NaCl(pH 7.0)에 대해 정용여과함으로써 10K 또는 30K MWCO 막 상에서 30 배 정용여과함으로써 실온에서 정제하였다. 포집물을 수집하고, 0.2 ㎛ 필터로 여과시키고, 단백질 함량(로리 또는 마이크로-비씨에이 비색 분석시험)에 대해 마우스에서 SDS-PAGE, 아미노산 분석에 의해 분석하고, 면역원성에 대해 분석하였다.
실시예 4
펩티드 면역원-단백질/폴리펩티드 컨쥬게이트의 캡핑도 및 컨쥬게이트화도의 평가로서 S-카르복시메틸시스테인 및 S-카르복시메틸시스테아민의 정량적 결정
브로모아세틸 활성화 화학을 사용하여 생성된 단백질-펩티드 컨쥬게이트의 산 가수분해는 컨쥬게이트된 부위에서 시스테인으로부터 산 안정 S-카르복시메틸시스테인(CMC)을 형성시키고, 캡핑된 부위에서 시스테아민으로부터 산 안정 S-카르복시메틸시스테아민(CMCA)을 형성시켰다(도 2). 컨쥬게이트된 리신 및 캡핑된 리신 모두를 다시 리신으로 전환시키고, 이와 같이 검출하였다. 가수분해 조건에 의해 파괴되는 트립토판 및 시스테인을 제외한 모든 다른 아미노산을 다시 유리된 아미노산으로 가수분해하였다. 아스파라긴 및 글루타민을 각각 아스파르트산 및 글루탐산으로 전환시켰다.
컨쥬게이트 샘플을 탈이온수로 희석시켜 총 단백질 농도를 1 mg/mL 미만으로 만들었다. 각 컨쥬게이트로 된 2 개의 10 마이크로그램 엘리콧을 건조시키고, 100 ㎕의 6 N HC1 [피어스(Pierce)], 5 ㎕의 용융된 페놀 [시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)], 및 1 ㎕의 2-머캅토에탄올 [시그마-알드리치] 중에서 재현탁하였다. 그 다음, 샘플을 진공 하에서(100 mT) 110℃에서 22 시간 동안 인큐베이션하였다. 생성되는 가수분해물을 건조시키고, 250 ㎕의 벡만(Beckman) Na-S 시트르산나트륨 샘플 희석 완충제(pH 2.2) [캘리포니아주 풀러톤 소재의 벡만 인스트루먼츠, 인크.(Beckman Instruments, Inc.)] 중에 재현탁시키고, 와트만(Whatman) 0.2 ㎛ 나일론 주사기 팁 필터 및 1 mL 주사기를 사용하여 여과하였다.
그 다음, 각 샘플을 벡만 6300 아미노산 분석기 샘플 루프에 로딩하고, 분석기에 넣었다. 이온 교환 크로마토그래피를 사용한 후, 135℃에서 벡만 닌히드린(Ninhydrin) NinRX 용액과 반응시킴으로써 각각의 가수분해된 샘플 및 대조군의 아미노산을 분해하였다. 그 다음, 570 nm 내지 440 nm의 가시 범위에서 유도체화된 아미노산을 검출하였다(표 1 참조). 각 분석 세트에 대한 샘플 및 대주군과 함께 각 아미노산 500 피코몰을 함유하는 아미노산의 표준 세트 [피어스 아미노산 스탠다드(Pierce Amino Acid Standard) H]를 러닝(running)하였다. S-카르복시메틸시스테인 [시그마-알드리치]을 표준에 첨가하였다.
표 1 벡만 6300 아미노산 분석기 상에서 구배 프로그램 1 사용시 아미노산 보유 시간
보유 시간 (분) 아미노산 검출에 사용된 파장
8.3 카르복시메틸시스테인 CMC 570
9.6 아스파르트산 & 아스파라긴 Asx 570
11.3 트레오닌 Thr 570
12.2 세린 Ser 570
15.8 글루탐산 & 글루타민 Glx 570 & 440
18.5 프롤린 Pro 440
21.8 글리신 Gly 570
23.3 알라닌 Ala 570
29.0 발린 Val 570
32.8 메티오닌 Met 570
35.5 이소루신 Ile 570
36.8 루신 Leu 570
40.5 티로신 Tyr 570
42.3 페닐알라닌 Phe 570
45.4 카르복시메틸시스테아민 CMCA 570
48.8 히스티딘 His 570
53.6 리신 Lys 570
70.8 아르기닌 Arg 570
각 표준 피크 면적을 각 샘플의 비례 평가(proportional evaluation)를 위한 정량적 등가량(equivalence)으로 사용하였다. 440 nm로부터 프롤린을 결정하고, 가장 근접한 아미노산인 글루탐산을 사용하여 570 nm에서 등가량으로 전환시켰다.
이들 피코몰 값 각각을, 단백질 중에 존재하는 이론적 리신 값에 리신의 피코몰을 비교함으로써 아미노산 잔기의 몰비로 전환시켰다. 시스테인 및 시스테아민에 대한 그의 공유 결합 및 예상되는 유사한 가수분해를 기준으로 이 평가에 대해 리신을 선택하였다. 그 다음, 생성되는 아미노산의 몰 수를 단백질의 아미노산 조성물의 경우와 비교하고, CMC 및 CMCA에 대한 값과 함께 기록하였다. CMC 값을 사용하여 컨쥬게이트화도를 바로 평가하고, CMCA 값을 사용하여 캡핑도를 바로 평가하였다.
실시예 5
Aβ- CRM 197 펩티드 컨쥬게이트의 특성화 및 최적화
컨쥬게이트를 확인하기 위해, 아미노산 분석 및 메트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight; MALDI-TOF) 질량 분석법에 의해 모든 펩티드-CRM197 컨쥬게이트를 분석하였다. 각 컨쥬게이트에 대해, 아미노산 분석(S-카르복시메틸시스테인 잔기의 수) 및 MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 컨쥬게이트된 펩티드의 몰 대 각각의 CRM197의 몰을 결정하였다. 각각의 방법에 의해 결정된 값들은 일반적으로 일치하였다.
I. 크기별 배제 크로마토그래피:
배치 농축물 샘플을 저장액으로부터 회수하고, 실온으로 가온시켰다. Aβ 펩티드 컨쥬게이트 샘플을 온화하게 혼합하여 제제를 균질하게 하였다. Aβ 펩티드 컨쥬게이트 샘플을 에펜드로프(Eppendorf) 미세 원심분리기에서 회전시켜 임의의 미립자를 제거하였다. 토소하스(TosoHaas) TSK-겔 G3000SW 크로마토그래피(독일 스튜어트 소재의 토소하스)를 위해 상청액을 회수하였다. 토소하스 TSK-겔 G3000SW 컬럼을 HPLC 시스템에 연결하고, 압력 한계를 1.4 MPa로 설정하였다. 컬럼을 30 mL 이상의 PBS(10 mM 인산나트륨, 150 mM NaCl, pH 7.2 ± 0.1)를 사용하여 0.75 mL/min의 유량에서 평형화시켰다. Aβ 펩티드 컨쥬게이트 샘플을 하기 매개변수를 사용하여 토소하스 TSK-겔 G3000SW 컬럼에 로딩하였다.
Aβ 펩티드 컨쥬게이트 샘플의 농도: 1.5 ± 1.0 mg/mL
유량: 0.75 mL/min
샘플 부피: 0.1 mL
운전 시간: 30 분
280 nm 및 210 nm 양쪽 모두에서 흡수성을 모니터링하였다. 장기 저장의 경우, 토소하스 TSK-겔 G3000SW 컬럼을 50 mL 이상의 20% 에탄올을 사용하여 0.5-1.0 mL/min의 유량에서 평형화시켰다.
II. PAGE(폴리아크릴아미드 겔 전기영동):
SDS-겔에 의해 중성 pH를 갖는 NuPAGE 비스-트리스(Bis-Tris) 전기영동(독일 프랑크푸르트 소재의 노벡스(Novex)), 프리-케스트(pre-cast) 폴리아크릴아미드 미니-겔 시스템 및 NuPAGE MES SDS 러닝 버퍼(Running Buffer)를 사용하여 활성화된(브로모아세틸화된) CRM197 및 Aβ 펩티드-CRM197 컨쥬게이트를 검사하였다. 각각의 활성화된 CRM 또는 컨쥬게이트의 8 ㎍의 엘리콧을 환원 샘플 완충제와 혼합시키고, 100℃에서 5 분 동안 가열시켰다. 컨쥬게이트 및 분자량(MW) 표준(캘리포니아주 칼스버드 소재의 인비트로겐(Invitrogen))을 비스-트리스-HCl 완충 시스템 기재의 10%(w/v, 아크릴아미드) NuPage 겔(노벡스)에 로딩하고, MES SDS 러닝 버퍼-PAGE(라엠리(Laemmli))에 러닝하였다. SDS-PAGE 후, 겔을 피어스 겔 코드 블루(Pierce Gel Code Blue)(일리노이주 로클스포드 소재의 피어스)로 염색하였다. Aβ 펩티드-CRM197 컨쥬게이트는 소수 다량체 밴드와 함께 120 kDa 주변의 이량체 밴드 및 본래 CRM의 밴드 위 66 kDa 주변의 주 밴드에 의해 나타났다(데이터는 도시하지 않음).
III . 펩티드- CRM 197 컨쥬게이트의 MALDI - TOF 질량 분석법 분석:
컨쥬게이트화도를 즉시 추정하기 위해 질량 분석법을 사용하였다. 메트릭스로서 3,5-디메톡시-4-히드록시-신남산(시나핀산(sinapinic acid))을 사용하여 MALDI-TOF 질량 분석법에 의해, 활성화된 CRM197 및 컨쥬게이트 샘플의 적합한 엘리콧을 분석하였다. MALDI-TOF 질량 분석법(뉴욕주 린고에스 소재의 피니간 엠에이티 레이저메트 2000 메스 스펙트로미터(Finnigan MAT Lasermat 2000 Mass Spectrometer))에 의해 결정된 활성화된 CRM197의 분자량은 60.5 kDa 주변 중심에 위치하는 것으로 발견되었고, 컨쥬게이트의 경우 컨쥬게이트화도에 따라 65 kDa 내지 74 kDa에서 변화하였다(데이터는 도시하지 않음). CRM197 중 22 개 이하의 리신(~ 50%)이 1:1 비로 변형된 것으로 발견되었다.
IV . 최적화 실험:
활성화도 및 컨쥬게이트화도는 시약:단백질 비, 반응 온도 및 반응 완충제의 pH의 함수이다. 컨쥬게이트화 반응에 대한 재생가능한 방법 조절 매개변수를 갖기 위한 최적 pH 조건을 규명하도록 수행되는 최적 컨쥬게이트화 조건을 하기 일부 실시예에서 예시한다. 그 결과(도 3)는 Aβ 5량체(DAEFRC)(서열 번호 1), 뿐만 아니라 Aβ 7량체(DAEFRHDC)(서열 번호 2)에 대한 컨쥬게이트화 반응이 pH 의존성이고, 반응 조건의 pH가 증가하는 경우 고도의 변형/컨쥬게이트를 제공한다는 점을 보여주었다. 5량체 및 7량체 펩티드의 TFA 염을 사용하여, 펩티드 부하량을 변화시키면서 컨쥬게이트화도를 pH 9.0에서 평가하였다(도 4). 이 결과로부터, 컨쥬게이트 방법 동안 펩티드/활성화된 CRM 비를 변화시킴으로써 CRM 분자 당 정해진 수의 펩티드 카피를 갖는 펩티드 컨쥬게이트를 생성할 수 있다는 점이 입증되었다. Aβ 7량체 펩티드의 아세테이트 염을 사용하여 유사한 실험을 수행하였다.
Aβ1-7/CRM 컨쥬게이트화의 경우, CRM 당 CMCA의 몰 수 대 CRM 당 CMC의 몰 수를 비교함으로써 캡핑 방법을 평가하였다. CMC 및 CMCA의 총량이 시험되는 각 펩티드:CRM 비에 대해 일정하기 때문에, 캡핑 방법이 완결된 것으로 추정하였다(도 5). 컨쥬게이트 중 총 변형물은 브로모아세틸화된 리신의 수와 동등하게 19 내지 21에서 머물렀다(도 5). 이러한 실험들을 펩티드에 대한 반대이온으로서 TFA를 사용하여 수행하였다. TFA 염이 아닌 펩티드의 아세테이트 염을 사용하여 Aβ1-7/CRM 컨쥬게이트화를 반복하였고, 이 데이터를 도 5 및 도 6에 나타낸다. 캡핑 방법은 완결되는 것으로 보였고, 총 CMC 및 CMCA는 각각의 점에 대해 20 내지 22에서 머물렀다. Aβ-CRM 컨쥬게이트화 반응에 대한 조건을 pH 9.0에서 최적화하고, 컨쥬게이트화도를 반응에서 펩티드 대 CRM 비로 조절하였다. 이 비를 0.1 내지 1.5로 변화시킴으로써, 컨쥬게이트화도를 변화시킬 수 있다(도 6).
활성화도 및 컨쥬게이트화도는 시약:단백질 비, 반응 온도 및 반응 완충제의 pH의 함수이다. 활성화된 CRM197의 질량 값에서 각 컨쥬게이트의 질량 값을 차감하고, 컨쥬게이트를 제조하는 데 사용된 펩티드의 질량으로 나눔으로써 각 컨쥬게이트에 대한 변형도(컨쥬게이트화도)를 계산하였다. 모든 컨쥬게이트에 대한 변형도(컨쥬게이트화도)를 하기 표 2에 기재한다.
또한, 컨쥬게이트화도를 CRM197의 몰 당 형성된 S-카르복시메틸시스테인 잔기의 추정된 양에 의해 결정된 값과 비교하였다(또한, 하기 표 2에 나타냄).
Figure 112011068200653-pat00014
실시예 6
Aβ 펩티드 컨쥬게이트의 면역원성 연구
Aβ의 N-말단 잔기 1-5, 1-7, 1-9 및 1-12에 걸쳐 있는(spanning) 펩티드(링커 서열 GAGAC를 갖는 것 및 갖지 않는 것) 및 각각 CRM197에 컨쥬게이트된 아미노산 12로부터 아미노산 1로의 역 순서의(역 순서의 1-12량체) Aβ의 N-말단에 대응하는 펩티드를, 스티뮬론TM QS-21을 사용하여 제제 중에서 비컨쥬게이트된 Aβ 1-12량체 펩티드와 함께 사용하여 마우스를 면역화시켰다. 각각의 마우스 군을 20 ㎍의 에주반트 스티뮬론TM QS-21로 제제화된 30 ㎍ 또는 5 ㎍의 샘플 중 하나의 투여량으로, 연구 개시시(제 0 주) 및 추후 제 3 주 및 제 6 주에 피하로 면역화시켰다. 연구 프로토콜을 하기 표 3에 예시한다.
하기 표 3에 나타낸 바와 같이, Aβ의 N-말단 잔기 1-5, 1-7, 1-9 및 1-12에 걸쳐 있는 펩티드(링커 서열 GAGAC를 갖는 것 및 갖지 않는 것) 및 CRM197에 컨쥬게이트된 아미노산 12로부터 아미노산 1로의 역 순서의(역 순서의 1-12량체) Aβ의 N-말단에 대응하는 펩티드를, QS-21을 사용하여 제제 중에서 비컨쥬게이트된 Aβ 1-12량체 펩티드와 함께 사용하여 마우스를 면역화시켰다. 각각의 마우스 군을 20 ㎍의 에주반트 QS-21로 제제화된 투여량 30 ㎍ 또는 5 ㎍의 샘플 중 하나를 사용하여 연구 개시시(제 0 주) 및 추후 제 3 주 및 제 6 주에 피하로 백신화하였다. 각각의 군에서 5 마리의 마우스를 사용하는 전체 연구에 대해 스위스 웹스터(Swiss Webster) 마우스를 사용하였다.
주사 부피 = 100 ㎕; B = 출혈; V = 백신화; E = 방혈.
상기한 바와 같이, Aβ 및 CRM197에 대해 ELISA에 의해 항-Aβ 역가를 측정하였다. 요약하면, 코스타(Costar) 96 웰 플레이트(#3591)를 멸균 탄산화물/중탄산화물 완충제(pH 9.6) 중에서 2 ㎍/mL Aβ1-42를 사용하여 밤새 실온에서 코팅하였다. 플레이트를 비우고, 2 시간 동안 실온에서 1× PBS/0.05% 트윈(Tween) 20 중 0.05% BSA의 200 ㎕/웰을 사용하여 블로킹(blocking)하였다. 블로킹된 플레이트를 비우고, TBS, 0.1% 브리즈(Brij)-35(아지드 비함유) 세척 완충제를 함유하는 플레이트 세척제로 세척하였다. 모든 1차 항혈청을 0.05% 트윈 20/0.02% 아지드를 함유하는 1× PBS 중의 0.05% BSA로 연속 희석한 다음, 100 ㎕의 각각의 희석물을 적합한 플레이트 웰로 옮기고, 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 플레이트를 상기한 바와 같이 비우고/세척하였다. 써던 바이오테크(Southern Biotech)(도시, 주)로부터의 알칼리 포스파타제 컨쥬게이트 마우스 IgG에 대한 염소(goat anti-mouse IgG) 2차 항체를 0.05% 트윈 20/0.02% 아지드를 함유하는 PBS 중의 0.05% BSA로 1:1000 희석하고, 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 플레이트를 상기한 바와 같이 비우고/세척하고, 마지막으로 실온에서 1 시간 동안 디에탄올아민/MgCl2 (pH 9.8) 중에서 제조된 p-니트로페닐 포스페이트 기질의 1 mg/mL 용액의 100 ㎕/웰을 사용하여 인큐베이션하였다. 3 N NaOH의 50 ㎕/웰을 첨가하여 색상 발현을 정지시켰다. 690 nM을 기준으로 하여 플레이트를 405 nM에서 판독하였다. 0.1 AU의 O.D.에서 종점 역가를 계산하였다.
Figure 112011068200653-pat00015
Figure 112011068200653-pat00016
CRM 197 ELISA
그레이너(Greiner) 96 웰 플레이트(#650011)를 멸균 탄산화물/중탄산화물 완충제(pH 9.6) 중에서 5.0 ㎍/mL(100 ㎕/웰)의 CRM197을 사용하여 37℃에서 90 분 동안 코팅하였다. 플레이트를 비우고, 1× TBS, 0.1% 브리즈-35 세척 완충제를 함유하는 플레이트 세척제로 세척하였다. 모든 1차 항혈청을 0.3% 트윈 20/EDTA를 함유하는 1× PBS로 연속 희석한 다음, 100 ㎕의 각각의 희석물을 적합한 플레이트 웰에 옮기고, 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 상기한 바와 같이 비우고/세척하였다. 써던 바이오테크로부터의 알칼리 포스파타제 컨쥬게이트 마우스 IgG에 대한 염소 2차 항체를 0.05% 트윈 20/0.02% 아지드를 함유하는 1× PBS로 1:1000 희석하고, 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 플레이트를 상기한 바와 같이 비우고/세척하고, 마지막으로 실온에서 1 시간 동안 디에탄올아민/MgCl2 (pH 9.8) 중에서 제조된 p-니트로페닐 포스페이트 기질의 1 mg/mL 용액의 100 ㎕/웰을 사용하여 인큐베이션하였다. 3 N NaOH의 50 ㎕/웰을 첨가하여 발현을 정지시켰다. 690 nM을 기준으로 하여 플레이트를 405 nM에서 판독하였다. 0.1 AU의 O.D.에서 종점 역가를 계산하였다.
하기 표 4-6은 Aβ에 대한 종점 ELISA 역가를 나타낸다. 1 차 면역화 후, 모든 8 개의 컨쥬게이트(음성 대조군 제외)은 측정가능한 항-Aβ IgG 면역 반응을 유도하였다. 그러나, 5 ㎍의 투여량이 아닌 30 ㎍의 투여량의 Aβ는 1 차 면역화 후 3 주에서 양성 반응을 제공하였다. 모든 컨쥬게이트에서, 컨쥬게이트된 링커를 갖지 않는 Aβ1-7 펩티드는 연구된 다른 컨쥬게이트 만큼 우수하거나 더 뛰어난 반응을 유도해 낸 것으로 보인다. 5 ㎍의 투여량에서, Aβ1-5C는 주 8-16에서 더 우수하게 작용하였다. Aβ1-7C는 30 ㎍의 투여량에서 최고였다. 5 ㎍ 또는 30 ㎍의 투여량을 사용한 제2 면역화 및 제3 면역화 후 항체 역가의 분석은 대부분의 컨쥬게이트의 경우 Aβ에 대한 최대 면역 반응이 제2 면역화 후 관찰된다는 점을 시사한다. 적어도 마우스에서, 제3 면역화는 면역 반응을 강화시키는 것으로 보이지 않았다. 그러나, Aβ 펩티드는 펩티드에 대한 최대 면역 반응에 도달하기 위해 30 ㎍의 투여량을 사용한 3차 면역화를 필요로 한다(표 5). 장기간에 걸쳐 있는 항체 붕괴의 경우, 컨쥬게이트로 면역화된 군으로부터의 항체 양은 그 군 내 최고 량에 비해 2 배 내지 3 배 감소되었다. 제 6 주 및 제 8 주로부터의 개개의 샘플을 분석하여 임의의 컨쥬게이트 군이 다른 군보다 실질적으로 우수한지 알아내기 위해 각 군에 대해 Aβ에 대한 GMTs를 계산하였다(표 6). Aβ1-5C, Aβ 1-7C 및 Aβ 1-9C 컨쥬게이트로부터의 제 6 주 역가의 통계 분석은 Aβ1-7 컨쥬게이트가 상당히 높은 역가를 유도한다는 점을 시사하였다. 또한, 이 실험으로부터 링커 서열 GAGAC이 펩티드에 대한 면역 반응을 강화시키는 데 기여하지 않았음이 명백하다.
Figure 112011068200653-pat00017
Figure 112011068200653-pat00018
Figure 112011068200653-pat00019
*표 6: 30 ㎍의 투여량의 아밀로이드-Aβ의 다양한 길이의 N-말단에 걸쳐 있는 펩티드 컨쥬게이트로부터 항혈청을 사용한 Aβ에 대한 제 6 주 및 제 8 주 ELISA 종점 GMTs. 기준: 엘란 초면역 다클론 #592 = 3,073,307. O.D. 0.1 AU에서의 종점. 스위스 웹스터 마우스를 제 0 주, 제 3 주 및 제 6 주에서 20 ㎍의 스티뮬론TM QS-21로 제제화된 30 ㎍의 상기 항원을 사용하여 SC-N으로 면역화시켰다.
a. 터키-크라머(Tukey-Kramer)를 사용한 1-5C, 1-7C 및 1-9C로부터의 제 6 주 역가의 통계 분석은 1-5C와 1-7C 사이의 통계적 차이(statistical difference)만을 나타낸 반면, 스튜던트의(Student's) T-시험을 사용한 분석은 1-5C와 1-7C 및 1-5C와 1-9C의 통계적 차이를 나타낸다.
b. 1-5C, 1-7C 및 1-9C로부터의 제 8 주 역가의 통계 분석은 세 군 사이의 통계적 차이를 나타내지 않는다. 그러나, 1-5C와 1-7C 사이에 차이를 시사할 수 있는 성향이 있는 것으로 보인다.
PDAPP 마우스 뇌 조직 염색
PDAPP 뇌 조직 염색 분석시험은 Aβ 펩티드 컨쥬게이트 및(또는) Aβ 1-42 항혈청의 작용성의 표시를 제공한다. 개개의 마우스 군으로부터의 혈청 샘플을 아밀로이드 펩티드를 함유하는 PDAPP 마우스 뇌 조직 플라크를 인식하는 능력에 대해 별도로 분석하였다. 그 결과를 하기 표 7A 및 표 7B에 나타낸다. Aβ 5량체 컨쥬게이트 항혈청을 제외하고, 플라크를 인식하는 데 있어 투여량-관련 반응이 존재하였다. 링커와는 무관하게, 30 ㎍의 컨쥬게이트-유도 항혈청은 5 ㎍의 컨쥬게이트 항혈청에 비해 우수한 반응성 패턴을 가졌다. 그러나, Aβ 5량체 컨쥬게이트 항혈청을 사용한 경우, 5 ㎍의 군에 대한 반응성과 유사하거나 또는 우수한 것으로 보였다. 이러한 모든 결과를 비교할 때, Aβ1-9량체를 통해 Aβ1-5량체로부터 제조된 컨쥬게이트가 마우스에서 면역 반응을 인식하는 플라크를 유도해 내기에 충분하며, 링커의 존재는 필수적이지 않다는 결론이 얻어진다. 이 연구로부터 다음의 결론이 도출될 수 있다. (a) 모든 펩티드 컨쥬게이트는 비컨쥬게이트된 CRM197 대조군(도시되지 않음)에 비해 동등하거나 또는 약간 높은 양으로 캐리어 단백질 CRM197에 대한 고 역가 항혈청을 유도하였다. (b) GAGAC 링커를 갖는 컨쥬게이트는 링커를 갖지 않는 컨쥬게이트에 비해 면역원성 또는 작용성을 강화시키지 않았다. (c) 면역원성 데이터 및 PDAPP 뇌 조직 염색 (관능적 항체의 초기 표시)은 Aβ1-5량체 및 Aβ1-7량체 컨쥬게이트가 추가 발현에 대한 바람직한 면역원인 것으로 보였다는 점을 나타낸다.
[표 7A]
Figure 112011068200653-pat00020

*염색 절차를 위해 모든 항혈청을 1:1000 희석하였다.
[표 7B]
Figure 112011068200653-pat00021
염색 절차를 위해 모든 항혈청을 1:1000 희석하였다.
실시예 7
원숭이에서의 면역원성 연구
6 마리의 원숭이 군에 제 0 일, 제 29 일 및 제 58 일에 스티뮬론TM QS-21, 백반 또는 RC529 SE 제제로 에주반트 처리된 30 ㎍의 7량체 컨쥬게이트(총 컨쥬게이트)을 투여하였다. 포함된 추가적인 군은 30 ㎍의 5량체 컨쥬게이트와 백반(Al(OH)3) 또는 RC529 SE, 양성 대조군으로서 스티뮬론TM QS-21을 갖는 75 및 300 ㎍의 Aβ였다. 양성 대조군을 2 주마다 면역화시켰다. 제 36 일 및 제 64 일에, 항-Aβ 항체 역가를 결정하였다(도 7-9). 제 36 일에, 스티뮬론TM QS-21, 백반 및 RC529 SE를 구비한 7량체/CRM 컨쥬게이트는 각각 10110, 13330 및 17090의 GMT 역가를 유도해 냈다(도 7). 대조적으로, Aβ 1-42와 스티뮬론TM QS-21은 75 및 300 ㎍의 투여량에서 각각 223 및 1734의 GMTs를 유도해 냈다. Aβ 5량체 컨쥬게이트는 백반을 사용한 경우 2134의 역가를 유도해 내고, RC529 SE를 사용한 경우 15980의 역가를 유도해 냈다. 제 64 일에서, 즉 스티뮬론TM QS21 또는 RC-529 SE를 구비한 컨쥬게이트를 3 회 투여한 경우 제2 투여 후의 역가보다 실질적으로 높은 역가를 유도하였다(7량체/RC-529 SE의 경우 GMTs 69910; Aβ 5량체/RC-529 SE의 경우 21640 및 Aβ 7량체/스티뮬론TM QS-21의 경우 30310)(도 8). 백반을 구비한 컨쥬게이트는 제2 면역화 후에 비해 제3 면역화 후에서 감소된 역가를 유도해 냈다. Aβ 7량체 컨쥬게이트가 Aβ 5량체 컨쥬게이트에 비해 우수한 반응을 유도해 낸 것으로 보인다. 원숭이에서, RC-529 SE 또는 스티뮬론TM QS-21을 사용하여 Aβ 7량체 컨쥬게이트를 에주반 처리한 경우 가장 높은 반응을 유도해 냈다(도 9). 백반을 갖는 Aβ 7량체 컨쥬게이트에 대한 반응은 중등 수준이었고, 스티뮬론TM QS-21을 구비한 300 ㎍의 Aβ 1-42의 경우와 유사하였다.
본 실시예로부터 몇 가지 결론을 도출해낼 수 있다. 먼저, 컨쥬게이트는 양쪽 모두는 영장류 종에서 면역원성이 높다. 두번째, 면역화 제제 중 에주반트의 존재는 면역 반응에 상당한 영향을 미친다. 세번째, 알루미늄 에주반트를 제외하고, RC-529 SE 및 스티뮬론TM QS-21은 적어도 3 회 투여까지 각각의 면역화 투여 후 면역 반응을 강화시킨다(도 9). 전체적으로, Aβ 7량체 컨쥬게이트는 529 후, 스티뮬론TM QS-21의 존재 하에서 더 높은 항체 반응을 유도하였다(도 9 참조).
실시예 8
다중 항원성 펩티드( MAP ) 컨쥬게이트의 제조 및 그들의 면역원성 연구
캐리어에 다중 항원 부위를 생성하는 몇 가지 방법이 이용가능하다. 이전 실시예에서, 각 항원 부위는 정해진 컨쥬게이트 및 캡핑 화학에 의해 캐리어에 별도로 컨쥬게이트된다. 본 실시예에서는, Aβ1-7량체로 된 텐덤 반복체를 고체 상 합성함으로써 다중 항원 부위를 구조화한다. 별법으로, 이러한 텐덤 반복체는 다른 데에서 기재된 바와 같이 리신 코어를 통해 연결되거나 또는 연결됨이 없이 T 세포 에피토프와 커플링될 수 있다. 이러한 다중 항원성 펩티드를, 캐리어 단백질에 컨쥬게이트시키기 위한 추가적인 시스테이닐 잔기를 사용하여 합성하였다. 한 카르복실 끝단에서 추가적인 시스테이닐 잔기와 함께 반복 단위(1-7), 3 개의 반복 단위(1-7)3 및 5 개의 반복 단위(1-7)5를 함유하는 펩티드를 합성하였다. 이 펩티드들을 그들의 C-말단 시스테인 잔기를 통해 밤새 브로모아세틸화된 CRM에 공유 결합시켰다. 하기 표 8에 요약한 바와 같이 첨가되는 펩티드:CRM 비를 사용하여 pH 9.0-9.2에서 반응을 수행하였다. 펩티드와 반응하지 않는 브로모아세틸 기를 N-아세틸시스테아민으로 캡핑시켰다. 이들은 CRM에 컨쥬게이트된 Aβ1-7 펩티드로 된 한 단일 카피, 3 개의 텐덤 카피 및 5 개의 텐덤 카피를 함유하는 컨쥬게이트를 제공하였다. 하기 표 8은 샘플의 성질을 간략히 요약한다.
다중 항원성 펩티드 (MAP) 컨쥬게이트 샘플
컨쥬게이트 펩티드:CRM (w/w) 반응 pH
Ab(1-7)1/CRM 0.37 8.99
Ab(1-7)3/CRM 1.02 8.95
Ab(1-7)5/CRM 1.67 9.17
펩티드 부하(캐리어 당 Aβ1-7 펩티드의 평균 수) 및 캡핑 수(표 9)는 아미노산 분석에 의해 결정된 캐리어 당 유니크 아미노산(CMC 또는 CMCA)의 수이다. CMC 및 CMCA 값은 리신을 기준으로 하였다.
각 컨쥬게이트의 컨쥬게이트화도 및 캡핑도
컨쥬게이트 펩티드 부하 (CMC) 캡핑 (CMCA)
Aβ(1-7)1/CRM 12.5 11.7
Aβ(1-7)3/CRM 10.4 15.2
Aβ(1-7)5/CRM 9.8 15.9
스위스-웹스터 마우스(군 당 10 마리)를 1 또는 0.1 ㎍의 Aβ/CRM 컨쥬게이트된 펩티드를 사용하여 피하로 면역화시켰다. 마우스의 절반을 100 ㎍의 에주반트 Al(OH)3으로 제제화된 조성물로 면역화시키고, 절반을 에주반트 없이 면역화시켰다. 제 0 주 및 제 3 주에 면역화를 예정하였다. 제 0 주, 제 3 주 및 제 6 주에 출혈을 예정하였다. Aβ1-42량체 펩티드에 대한 항체 반응에 대해 혈청 샘플을 분석하였다. 그 결과를 하기 표 10에 나타낸다.
Figure 112011068200653-pat00022
모든 컨쥬게이트는 1 차 면역화 후 항-Aβ1-42 항체 역가를 유도하였고, 그 양은 추가 투여 후 실질적으로 증가하였다. 알루미늄 에주반트의 부재 하에서, 투여 반응의 차이는 제 3 주 및 제 6 주 출혈 양쪽 모두에서 명백하였다. 투여량이 높을 수록 높은 역가의 항체 반응을 유도해 냈다. 알루미늄 에주반트는 에주반트를 처리하지 않은 군에 비해 제 3 주에서 양쪽 모두의 투여량(0.1 및 1 ㎍)에서 실질적으로 더 높은 항체 반응을 유도해 냈다. 2차 면역화 후, 1 ㎍의 투여량에서 제공된 컨쥬게이트는 항체 양의 5 내지 10 배 증가를 유도해 냈다. 이 투여량에서, 3 개 및 5 개의 반복체를 갖는 펩티드 컨쥬게이트는 단일 반복체 함유 컨쥬게이트보다 높은 항체 반응을 유도하였다. 또한, CRM 캐리어에 대한 역가를 결정하였고, 이를 하기 표 11에 나열한다.
Figure 112011068200653-pat00023
표 11의 데이터는 에주반트를 처리하지 않은 군이 1 ㎍, 뿐만 아니라 0.1 ㎍의 투여량 양쪽 모두에서 심지어 2 회 면역화 후에도 매우 낮은 양의 항-CRM 항체 반응을 유도하였음을 시사한다. 그러나, 수산화알루미늄 에주반트를 갖는 컨쥬게이트는 1 ㎍의 투여량에서 실질적인 양의 항-CRM 항체 반응을 유도하였고, 0.1 ㎍의 투여량에서는 반응이 훨씬 적었다. 에주반트의 존재 하에서, CRM 역가는 단일 반복 컨쥬게이트의 경우 가장 높고, 삼중 반복 컨쥬게이트의 경우 중간이고, 사중 반복 컨쥬게이트의 경우 가장 낮았다. 이는, 펩티드 투여량 당 CRM 투여량이 Aβ(1-7)5/CRM의 경우 가장 낮고 Aβ(1-7)1/CRM의 경우에 가장 높기 때문에 예측되는 바와 같았다. 제 6 주에서 0.1 ㎍의 투여량의 경우 차이는 통계적으로만 중요하였다.
본 발명의 목적은 캐리어 단백질에 대한 것이 아니라 항원 합텐에 대한 고 역가 면역원성 반응을 유도해 내는 것이다. 특정한 환경 하에서, 캐리어 단백질에 대해 면역 반응이 거의 없거나 또는 없는 합텐 항원 결정인자에 대해 최적 면역 반응을 유도해 내는 것이 바람직하다. 이러한 경우, 에주반트를 처리하지 않은 제제를 사용한 다중 항원 결정인자의 텐덤 반복체를 갖는 컨쥬게이트가 필요할 것이다.
실시예 9
다양한 캐리어 단백질과 Aβ-펩티드 컨쥬게이트로 된 제제 및 그들의 면역원성
본 실시예는 6 개의 상이한 캐리어 단백질과의 컨쥬게이트의 면역원성을 비교한다. Aβ1-7의 아세테이트 염을 브로모아세틸화된 캐리어에 1:1 중량비로 pH 9에서 첨가하였다. Aβ1-7/rC5ap를 제외한 모든 컨쥬게이트를 N-아세틸시스테아민으로 캡핑시켰다. 모든 별법상의 캐리어는 CRM(디프테리아 유독소), 재조합 C5a 펩티다제(rC5ap; 스트렙토코커스 아갈라스티에(Streptococcus agalactiae)로부터 클로닝됨, D130A 및 S512A 돌연변이 포함), ORF 1224, ORF 1664, ORF 2452(모두 스트렙토코커스 파이오진으로부터 클로닝됨), 및 T367, T858(각각 클라미디아 뉴모니아로부터 클로닝됨)을 비롯한 재조합 세균 단백질이다. 사용된 캐리어의 개요를 하기 표 12에 나타낸다. 이들 캐리어에 대한 각각의 Aβ1-7 컨쥬게이트의 컨쥬게이트화도 및 캡핑도를 하기 표 13에 제공한다.
이 연구는 재조합 C5a 펩티다제 컨쥬게이트가 CRM을 비롯한 시험된 대부분의 다른 캐리어보다 높은 Aβ에 대한 역가를 유도하였음을 보여주었다. 이 차이는 수산화알루미늄을 투여한 군의 제 6 주 역가의 경우 통계적으로 중요하였다. 또한, Aβ1-7/T858 컨쥬게이트는 에주반트의 부재 하의 대부분의 다른 컨쥬게이트보다 상당히 높은 면역원성을 가졌다. CRM 대조군 컨쥬게이트에 비해 수행력이 떨어지는 유일한 컨쥬게이트는 Aβ1-7/T367이었으며, 또한, 이 컨쥬게이트는 웨스턴 블롯에 의할 때 Aβ 특이적 단일클론 항체와 반응하지 않았다. 이 연구는 Aβ 펩티드에 대해 면역화시키는 데에 다수의 다른 캐리어들을 성공적으로 사용할 수 있다는 점을 확인한다.
Figure 112011068200653-pat00024
Figure 112011068200653-pat00025
컨쥬게이트 결과: 펩티드 부하(캐리어 당 Aβ1-7 펩티드의 평균 수) 및 캡핑 수는 아미노산 분석에 의해 결정된 캐리어 당 유니크 아미노산(CMC 또는 CMCA)의 수이다. CMC 및 CMCA 값은 리신을 기준으로 하였다.
면역화 결과
이 연구에서는 각각의 군에 대한 기하 평균 역가를 하기 표 14에 나열한다. 제 3 주에서, 에주반트의 존재와는 무관하게, Aβ1-7/rC5ap는 스트렙토코커스 파이오진 ORF 1224, ORF 1664, ORF 2452, 또는 클라미디아 뉴모니아 ORF T367 및 ORF T858로 제조된 대응하는 컨쥬게이트보다 상당히 높은 항-Aβ 역가를 유도하였다. 또한, 제 3 주에서, 에주반트의 부재 하에서, Aβ1-7/rC5ap는 Aβ1-7/T858을 제외한 모든 다른 컨쥬게이트보다 면역원성이 높았다. Al(OH)3을 함유하지 않는 T858 컨쥬게이트는 ORF1224, ORF1664, ORF2452, 및 에주반트를 함유하지 않는 CRM 컨쥬게이트보다 높은 역가를 유도하였다. Aβ1-7/CRM보다 면역원성이 상당히 낮은 유일한 컨쥬게이트는 Aβ11-7/T367이었다(p < 0.00002). 이 T367 캐리어는 제 3 주 및 제 6 주 양쪽 모두에서 에주반트를 사용한 경우 또는 사용하지 않은 경우 모두 수행력이 떨어졌다. 제 6 주에서, 수산화알루미늄을 갖는 rC5ap 컨쥬게이트는 Aβ 1-7/ORF2452를 제외한 모든 다른 컨쥬게이트보다 면역원성이 높았다(p < 0.04). 에주반트의 부재 하에서, Aβ1-7/rC5ap 및 Aβ1-7/T858은 ORF1224, ORF1664 또는 T367 컨쥬게이트보다 상당히 높은 역가를 유도하였다. 수산화알루미늄을 함유하지 않는 Aβ1-7/CRM은 Aβ1-7/ORF1664 또는 Aβ1-7/T367보다 높은 역가를 유도하였다.
Figure 112011068200653-pat00026
제 0 주 및 제 3 주에서 동물들을 면역화시키고, 제 0 주, 제 3 주 및 제 6 주에 출혈시켰다. 투여량은 컨쥬게이트의 총량을 기준으로 한다. 에주반트: 100 ㎍의 Al(OH)3 또는 없음.
실시예 10
추가적인 Aβ 펩티드-단백질 컨쥬게이트 제조
I. 활성화융해시킨 CRM197 (8 mL, 59.84 mg, 7.48 mg/mL)을 0.1 M 붕산화물 완충제(pH 9,3. 968 mL) 중에 용해시켜 농도를 5 mg/mL로 만들었다. 용액을 얼음조에서 0-5℃로 냉각시켰다. 브로모아세트산 N-히드록시숙신이미드(59.9 mg)(알드리치-시그마((Aldrich-Sigma)))를 DMF(100 ㎕)(알드리치-시그마) 중에 용해시키고, CRM197의 용액에 적가하였다. 브로모아세트산 N-히드록시숙신이미드 첨가시, 침전물을 관찰하였다. pH를 점검한 때에, pH는 6으로 감소하였다. 더 많은 0.1 M 붕산화물 완충제를 첨가함으로써 반응 혼합물의 pH를 다시 pH 9가 되게 하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 온화한 와류를 일으키면서 4℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 정제하고, YM-10 센트리프렙(centriprep) 원심분리 농도를 사용하여 농축시키고, 용리제로서 10 mM 붕산화물을 사용하여 세파덱스(Sephadex) G-25 상에서 재정제하였다. 브라드포드 시약에 양성인 분획물을 풀링하고, 센트리프렙 YM-10을 사용하여 농축시켰다. 브로모아세틸화도를 브라드포드(Bradford) 분석시험(선형)에 의해 결정하였다. 농도는 5.36 mg/mL인 것으로 밝혀졌다(수득량 30 mg). 그 다음, 최종 농도를 5 mg/mL로 조정하고, 추가 사용시까지 냉동고에서 5% 슈크로스 중에서 저장하였다.
II . 컨쥬게이트화
각각의 컨쥬게이트화에 대해, 융해된 브로모아세틸화된 CRM197을 사용하였다. 펩티드를 붕산화물 완충제(0.1 M 붕산화물 완충제 125 mL 중 2.5 mg) 중에 용해시켰다. Aβ 펩티드 KLVFFAEDC(서열 번호 45), CLVFFAEDV(서열 번호 47), CKLVFFAED(서열 번호 48) 및 LVFFAEDC(서열 번호 50) 사용시 약간 용해되지 않음이 관찰되었다. 브로모아세틸화된 CRM197 (5 mg/mL)을 펩티드 용액/현탁액으로 처리하였다. 혼합물 중 펩티드 및 단백질의 비는 1:2였다. 펩티드 KLVFFAEDC(서열 번호 45), CLVFFAEDV(서열 번호 47), CKLVFFAED(서열 번호 48) 및 KLVFFAEDC(서열 번호 45)를 사용한 컨쥬게이트 혼합물 중에서 탁도를 관찰하였다. 그 다음, 혼합물의 pH를 점검하고(pH 9), 천천히 교반하면서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 전, 혼합물의 최종 농도를 3 mg/mL로 만들었다. 펩티드 CLVFFAEDV(서열 번호 47) 및 LVFFAEDC(서열 번호 50)를 구비한 컨쥬게이트 혼합물의 탁도는 인큐베이션 후 사라졌다. 그러나, KLVFFAEDC(서열 번호 45) 및 CKLVFFAED(서열 번호 48)는 여전히 약간 탁하였다. 또한, 가용성 모의체 단백질 컨쥬게이트를 시스테아민을 사용하여 1:1(w/w)의 비로 제조하였다. 합성된 펩티드를 약 95% 순도를 사용하여 BIOSOURCE로부터 얻었다.
옥타머 (octamer):
LVFFAEDVC (서열 번호 44)
KLVFFAEDC (서열 번호 45)
VFFAEDVGC (서열 번호 43)
CLVFFAEDV (서열 번호 47)
CKLVFFAED (서열 번호 48)
CVFFAEDVG (서열 번호 46)
헵타머 (heptamer):
VFFAEDVC (서열 번호 49)
LVFFAEDC (서열 번호 50)
III . 단백질 상의 미반응 리신 기 캡핑 :
미반응한 리신을 1/1(w/w)의 비로 4 시간 동안 4℃에서 와류를 일으키면서 어둠 속에서 N-아세틸시스테아민(CMCA; 알드리치-시그마)으로 캡핑하였다. 밤새(13 시간) PBS 완충제(2 L)에 대해 슬라이드-에이-라이저 카세트(Slide-A-Lyzer cassette)(Mw 컷 오프(cut off) 10,000)(피어스)를 사용하여 투석함으로써 컨쥬게이트로부터 미반응 펩티드 및 캡핑 시약을 제거하였다. 완충제 교환 및 투석을 2 회 수행하였다(2 × 14 시간). 펩티드 KLVFFAEDC(서열 번호 45) 및 CKLVFFAED(서열 번호 48)를 사용한 컨쥬게이트에서 약간 용해되지 않는 것이 관찰되었다. 그 다음, 모든 컨쥬게이트를 냉장고 중 방부제 중에서 4℃에서 저장하였다.
IV . 단백질 캐리어의 특성화:
MALDI-TOF MS를 사용하여 브로모아세틸화된 CRM197의 질량 및 모의체 컨쥬게이트 N-아세틸시스테아민-CRM197의 질량을 결정하였다. CRM197 및 브로모아세틸화된 CRM197의 질량을 기준으로, 11 개의 리신 잔기를 변형시켰다.
(59941.46-58590.29)/122 = 11
상기 식 중;
CRM197의 Mw는 58624.29이고,
브로모아세틸화된 CRM197의 Mw는 59941.46이고,
브로모아세테이트의 Mw는 122이다.
브로모아세틸화도는 28%를 초과하였다. (CRM197 중 총 리신의 수는 39였음). 이러한 11 개의 변형된 리신 잔기로부터, 10 개를 시스테아민과 커플링하였다. 커플링 효능은 90%였다.
(61143-59941)/119 = 10
상기 식 중;
브로모아세틸화된 CRM197의 Mw는 59941.46이고,
모의체 컨쥬게이트의 Mw는 61143이고,
N-아세틸시스테아민의 Mw는 119이다.
(10/11) × 100 = 90
V. 트리스 -트리신 프리케스트 겔을 사용한 SDS - PAGE 웨스턴 블롯 분석에 의한 펩티드-단백질 컨쥬게이트의 특성화:
웨스턴 블롯에 의해 단백질-펩티드 컨쥬게이트를 분석하였다. 레인은 다음과 같다. 마커 (레인 1); L-28375 24/01 (레인 2); L-28375 24/02 (레인 3); L-28375 24/03 (레인 4); L-28375 24/04 (레인 5); L-28375 24/05 (레인 6); L-28375 24/06 (레인 7) L-28375 24/07 (레인 8); L-28375 24/08 (레인 9); L-28375 24/09 (모의체) (레인 10); 및 BrAcCRM197 (레인 11). 마우스로부터의 펩티드 특이적 단일클론 항체 (248-6H9-806 Aβ 17-28)를 1차 항체 (항혈청) (1:3000 희석이 최상인 것으로 밝혀졌음)로 사용하였다. 염소-항 마우스 IgG (H+L)-HPR은 2차 항체 (1:1000 희석)였다. 모든 컨쥬게이트가 모의체 컨쥬게이트 및 활성화된 CRM197을 제외하고 1차 항체에 의해 인식되었음이 관찰되었다. (도 10 참조)
단백질 농도
컨쥬게이트 샘플의 단백질 농도를 피어스 BCA 분석시험에 의해 결정하였다. (하기 표 15 참조)
아미노산 분석
아미노산 분석을 수행하여 컨쥬게이트화도를 결정하였다. 컨쥬게이트 중에서 발견되는 CMCA (카르복시메틸시스테아민) 잔기를 기준으로 컨쥬게이트화도를 계산하였다. CMCA를 사용하여 펩티드를 사용한 컨쥬게이트 후 미반응된 활성화된 부위를 캡핑하였다. (하기 표 15 참조)
Figure 112011068200653-pat00027
모든 비색 분석시험은 마이크로플레이트 분광 광도계(microplate spectrophotometer) 및 SOFTmax Pro를 사용하여 수행하였다.
실시예 11
스위스 웹스터 마우스에서의 Aβ 펩티드 컨쥬게이트의 면역원성 연구
이계 교배된 스위스 웹스터 마우스를 모두 에주반트 RC 529 SE로 제제화되고, 각각 CRM197에 컨쥬게이트된 VFFAEDVG-C(서열 번호 43), LVFFAEDV-C(서열 번호 44), KLVFFAED-C(서열 번호 45), C-VFFAEDVG(서열 번호 46), C-LVFFAEDV(서열 번호 47), C-KLVFFAED(서열 번호 48), VFFAEDV-C(서열 번호 49), LVFFAED-C(서열 번호 50), 또는 Aβ1-7CRM197을 사용하여 면역화시켰다. 한 군 당 10 마리의 동물 중 9 마리의 군을 연구 개시시(제 0 주) 및 추후 제 4 주에 Aβ 펩티드 컨쥬게이트 중 하나를 사용하여 피하로 면역화시켰다. 혈청을 면역화 이전이지만 같은 날에 수집하였다.
동종 교배된 Balb /c 마우스에서의 Aβ 펩티드 컨쥬게이트의 면역원성 연구
동종 교배된 Balb/c 마우스를 상기 단락에서와 같이 면역화시키고, 제 12 주에서 컨쥬게이트 및 에주반트를 사용하여 추가 접종하였다.
결과
Aβ13-28 펩티드 특이적 IgG 항체 역가에 대한 분석을 위해 양쪽 모두의 연구로부터의 혈청을 수집한다. 또한, 제 12 주 추가 접종 전날 및 일주일 후 분석을 위해 Balb/c 마우스로부터의 혈청도 수집한다. 실시예 11에 사용된 동물로부터의 비장 세포를 Aβ1-42, 전 길이 Aβ1-42, CRM197, 또는 다클론 활성화제에 걸쳐 있는 펩티드의 중첩 풀을 사용하여 자극에 대해 시험관내 반응하는 능력에 대해 평가한다. 분석은 인터루킨 4 및 5, 및 인터페론-감마에 대한 엘리스폿 판독(Elispot readout)을 포함한다. 완결시, Aβ 펩티드 컨쥬게이트를 상기한 바와 같이, 실시예 6에 기재된 바와 같이 평가한다.
실시예 12
PSAPP 마우스에서의 Aβ 펩티드 컨쥬게이트의 면역원성 연구
PSAPP 마우스를 VFFAEDVG-C(서열 번호 43), LVFFAEDV-C(서열 번호 44), KLVFFAED-C(서열 번호 45), C-VFFAEDVG(서열 번호 46), C-LVFFAEDV(서열 번호 47), C-KLVFFAED(서열 번호 48), VFFAEDV-C(서열 번호 49), LVFFAED-C(서열 번호 50)를 사용하여 면역화시킨다. 돌연변이체 APP 및 PS1 트랜스진(transgene)을 과발현하는 이중 트랜스제닉 마우스(PSAPP)인 PSAPP 마우스는 문헌[Holcomb, et al. (1998) Nature Medicine 4: 97-11]에 기재되어 있다.
PDAPP 마우스에서의 Aβ 펩티드 컨쥬게이트의 면역원성 연구
PDAPP 마우스를 VFFAEDVG-C(서열 번호 43), LVFFAEDV-C(서열 번호 44), KLVFFAED-C(서열 번호 45), C-VFFAEDVG(서열 번호 46), C-LVFFAEDV(서열 번호 47), C-KLVFFAED(서열 번호 48), VFFAEDV-C(서열 번호 49), LVFFAED-C(서열 번호 50)를 사용하여 면역화시킨다. PDAPP 마우스는 인간 APP(APPV17F)의 돌연변이 형태를 발현시키고, 젊은 연령층의 알츠하이머병을 일으킨다(문헌[Bard, et al. (2000) Nature Medicine 6: 916-919; Masliah E, et al. (1996) J Neurosci. 15; 16 (18): 5795-811] 참조).
결과
Aβ13-28 펩티드-특이적 IgG 항체 역가의 분석을 위해 양쪽 모두의 연구로부터 혈청을 수집한다. 완결시, Aβ 펩티드 컨쥬게이트를 상기한 바와 같이, 실시예 6 및 실시예 11에 기재된 바와 같이, 뿐만 아니라 맥락적 공포 조건화(contextual fear conditioning; CFC) 분석시험으로 평가한다.
맥락적 공포 조건화는 매우 신뢰가능하고 대부분의 동물, 예를 들면 포유류에서 빠르게 습득되는 학습의 통상의 형태이다. 시험 동물들은 회피적 경험과 관련되기 때문에 이전의 중성 자극 및(또는) 환경에 대한 공포를 학습한다. (예를 들면, 문헌[Fanselow, Claim. Learn. Behav. 18: 264-270 (1990); Wehner et al., Nature Genet. 17: 331-334. (1997); Caldarone et al., Nature Genet. 17: 335-337 (1997)] 참조).
맥락적 공포 조건화는 예를 들면, 질환 또는 장애, 예를 들면 신경퇴행성 질환 또는 장애, Aβ-관련 질환 또는 장애, 아밀로이드 생성성 질환 또는 장애, 인지 기능에 영향을 미치는 바람직하지 못한 유전자의 존재(예를 들면, 유전자 돌연변이, 유전자 붕괴 또는 원치않는 유전형) 및(또는) 약제, 예를 들면 Aβ 컨쥬게이트의 인지 능력에 대한 효능의 결과로 발생하는 인지 기능 또는 기능이상을 결정하는 데 특히 유용하다. 따라서, CFC 분석시험은 독립적으로 인지 질환 또는 장애, 특히 뇌 중 하나 이상의 영역, 예를 들면 해마, 해마이행부, 대상 피질, 전전 두피질, 후각주위 피질, 감각성 피질 및 내측두엽에 영향을 미치는 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하기 위한 약제의 치료 효과를 시험하고(시험하거나) 확인하는 방법을 제공한다.
전형적으로, CFC 분석시험은 표준 동물 챔버를 사용하고, 청각(예를 들면, 85 db 백색 소음 기간), 후각(예를 들면, 아몬드 또는 레몬 추출물), 촉각(예를 들면, 우리 바닥 질감) 및(또는) 시각적 신호(빛 섬광)와 짝지워진 온화한 쇼크(예를 들면, 0.35 mA 풋 쇼크(foot shock))를 포함하는 조건화 훈련을 사용하여 수행된다. 전형적으로, 회피적 경험(쇼크)에 대한 반응은 가만히 있는 행동(호흡을 제외한 운동 없음) 중 하나일 뿐만 아니라 선택된 시험 동물에 따라 눈 깜박임 또는 깜박 눈꺼풀 반사의 변화를 포함한다. 대개, 회피적 반응은 비조건화된 공포에 대한 기준을 결정하는 훈련 첫날 특성화되고, 후속 시험일에서의 회피적 반응은 예를 들면, 상황 및(또는) 신호의 존재 하에서 가만히 있는 행동을 유발하며, 회피적 경험의 부재 하에서는 각각 상황 및 신호 조건화 공포로 특성화된다. 신뢰도 개선을 위해, 전형적으로 시험 동물을 독립적인 기술자에 의해 별도로 시험하고, 시간에 따라 점수를 매긴다. 추가적인 실험 디자인 상세는 당업계, 예를 들면 문헌[Crawley, JN, What's Wrong with my Mouse; Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice, Wiley-Liss, NY (2000)]에서 찾을 수 있다.
예시적인 시험 동물(예를 들면, 모델 동물)은 아밀로이드 생성성 장애, 예를 들면 알츠하이머의 특징을 갖는 현저한 증상 또는 병리를 나타내는 포유류(예를 들면, 설치류 또는 비인간 영장류)를 포함한다. 모델 동물은 필요에 따라 선택적 동종 교배에 의해 생성되거나 또는 치매 장애와 관련된 유전자에서의 표적화된 유전자 변화(예를 들면, 유전자 돌연변이, 유전자 붕괴)가 표적화된 유전자를 변종 발현시키거나 또는 비이상적으로 기능하게 하도록 당업계에 공지된 트랜스제닉 기술을 사용하여 유전자 조작될 수 있다. 예를 들면, APP를 과발현시키고, 아밀로이드 플라크 병리를 유발하고(유발하거나) 알츠하이머병에 특징적인 인지력 결핍을 일으키는 몇몇 트랜스제닉 마우스 균주가 이용가능하다(예를 들면, 문헌[Games et al., supra, Johnson-Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1550 (1997); Masliah E and Rockenstein E. (2000) J Neural Transm Suppl.; 59: 175-83] 참조).
별법으로, 모델 동물은 해부학상 뇌 영역(예를 들면, 해마, 편도, 후각주위 피질, 내측 중격 핵, 청반핵, 유두체(mammillary body)) 또는 아밀로이드 생성성 장애의 특징적인 증상 또는 병리와 관련된 특이적 뉴런(예를 들면, 세로토닌성 뉴런, 콜린성 뉴런 또는 도파민성 뉴런)의 정상 기능을 절제시키거나 또는 방해하는 화학적 화합물(예를 들면, 신경독소, 마취제) 또는 수술적 기술(예를 들면, 정위 절제, 악소토미제이션(axotomization), 가로절단, 흡인)을 사용하여 생성될 수 있다. 특정한 바람직한 실시양태에서, 동물 모델은 아밀로이드 생성성 장애와 관련된 신경퇴행성 병리 외에도 학습 또는 기억과 관련된 현저한 인지력 결핍을 나타낸다. 더욱 바람직하게는, 인지력 결핍은 노화에 따라 진행적으로 악화되어, 모델 동물의 질환 진행이 아밀로이드 생성성 장애를 앓는 피험체의 질환 진행과 유사하게 된다.
본 명세서에 기재된 컨쥬게이트의 작용성을 시험하는 맥락적 공포 조건화 및 다른 생체내 분석시험을, 야생형 마우스 또는 기억 장애를 유발하는 특정한 유전자 변이를 갖는 마우스 또는 뇌척수(CSF) 또는 혈장 중에서 상승된 양의 가용성 Aβ를 나타내는 마우스 모델을 비롯한 신경퇴행성 질환, 예를 들면 알츠하이머병을 갖는 마우스 모델을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 알츠하이머병에 대한 동물 모델은 연령 의존성 기억 결핍 및 플라크를 나타내는 인간 아밀로이드 전구체 단백질(hAPPswe; Tg2576)의 "스웨덴식(Swedish)" 돌연변이를 과발현하는 트랜스제닉 마우스를 포함한다(문헌[Hsiao et al. (1996) Science 274: 99-102] 참조). 또한, 본 명세서에 기재된 컨쥬게이트의 생체내 작용성도 문헌[Duff, et al. (1996) Nature 383, 710-713]에 기재된 PS-1 돌연변이체 마우스를 사용하여 시험할 수 있다. 다른 유전적으로 변이된 알츠하이머병을 갖는 트랜스제닉 모델은 문헌[Masliah E and Rockenstein E. (2000) J Neural Transm Suppl. 59: 175-83]에 기재되어 있다.
다양한 측면에서, 본 발명의 방법은 피험체의 인지력을 개선할 수 있는 Aβ 컨쥬게이트를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 Aβ 컨쥬게이트를 적합하게는 피험체에서의 면역치료제 효능을 예측하는 분석시험을 사용하여 확인하였다. 예시적인 실시양태에서, 상기 분석시험은 적합한 대조군에 비하여, 시험용 면역학적 시약을 동물에 투여한 후 맥락적 공포 조건화 연구로부터 결정되는 동물의 인지력을 비교하는 것에 적어도 부분적으로 기초하는 모델 동물 분석시험이다. CFC 분석시험은 가능한 치료 화합물로 치료시 동물(전형적으로, 마우스 또는 쥐)의 인지력의 변화를 평가한다. 특정한 실시양태에서, 이와 같이 평가된 인지력의 변화는 기억 장애 상태를 개선시키거나 또는 기억 결핍을 반전시키는 것이다. 따라서, CFC 분석시험은 인지 질환 또는 장애, 특히 뇌 중 하나 이상의 영역, 예를 들면 해마, 해마이행부, 대상 피질, 전전 두피질, 후각주위 피질, 감각성 피질 및 내측두엽에 영향을 미치는 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하기 위한 약제의 치료 효과를 결정하는 직접적인 방법을 제공한다. 이러한 CFC 분석시험은 2004년 12월 15일 출원된 "Contextual Fear Conditioning for Predicting Immunotherapeutic Efficacy" 표제의 함께 계류중인 미국 특허 출원 60/XXX,XXX (Attorney Docket No. ELN-058-1을 가짐) 및 "Contextual Fear Conditioning for Predicting Immunotherapeutic Efficacy" 표제의 미국 특허 출원 60/XXX,XXX (Attorney Docket No. ELN-058-2를 가짐)에 논의되어 있으며, 이 문헌의 전문은 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된다.
참고 문헌
Figure 112011068200653-pat00028
Figure 112011068200653-pat00029
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Claims (41)

  1. 면역원성 컨쥬게이트를 제조하는 방법으로서,
    (a) 캐리어 단백질의 하나 이상의 작용기를 유도체화하여 캐리어 단백질 상에 활성화된 작용기를 생성하는 단계로서, 캐리어 단백질은 CRM197, 스트렙토코커스 파이오진 (Streptococcus pyogenes) ORF1224, 스트렙토코커스 파이오진 (Streptococcus pyogenes) ORF1664, 스트렙토코커스 파이오진 (Streptococcus pyogenes) ORF2452, 및 클라미디아 뉴모니아 (Chlamydia pneumoniae) ORF T858로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 유도체화 단계와,
    (b) 컨쥬게이트(conjugate)를 형성하는 조건 하에, 단계 (a)의 캐리어 단백질과 Aβ 단편을 포함하는 펩티드 면역원을 반응시키는 단계로서, 상기 펩티드 면역원이 상기 캐리어 단백질 상의 활성화된 작용기에 공유 결합되는 것인 반응 단계; 및
    (c) 단계 (b)의 컨쥬게이트를 캡핑 시약(capping reagent)과 추가 반응시켜, 캐리어 단백질 상의 임의의 남아있는 활성화된 작용기를 불활성화시켜 면역원성 컨쥬게이트를 생성하여, 캐리어가 없으면 발생하지 않을 펩티드 면역원에 대한 원하는 면역 반응을 유발할 수 있는 능력을 유지하도록 캐리어 단백질의 작용기가 보존되도록 하는 추가 반응 단계
    를 포함하며, 상기 컨쥬게이트는
    화학식
    Figure 112012014818379-pat00030

    을 가지며,
    C는 캐리어 단백질이고,
    Xd는 캐리어 단백질의 유도체화된 작용기이며,
    P는 펩티드 면역원이고,
    R은 캡핑 분자이며,
    n은 0 초과 38 이하의 정수이고,
    p는 0 초과 38 이하의 정수인
    면역원성 컨쥬게이트 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Aβ 단편이 Aβ (서열번호 21)의 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 1-28, 3-6, 3-7, 13-28, 15-24, 16-22, 16-23, 17-23, 17-24, 18-24, 18-25, 17-28, 25-35, 33-42, 35-40 및 35-42 잔기로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 펩티드 면역원으로 반응성 기를 도입하는 단계를 더 포함하고, 펩티드 면역원은 상기 반응성 기를 통해 캐리어 단백질의 활성화된 작용기에 공유 결합되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 반응성 기가 말단 시스테인 잔기인 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 말단 시스테인 잔기가 Aβ 단편의 카르복시 말단에 국재화하는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 말단 시스테인 잔기가 Aβ 단편의 아미노 말단에 국재화하는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, Aβ 단편이 Aβ (서열번호 21)의 1-7 잔기인 것인 방법.
  8. 제5항에 있어서, Aβ 단편이 Aβ (서열번호 21)의 16-23 잔기인 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, n이 5 이상 25 이하의 정수인 방법.
  10. 제9항에 있어서, n이 12 이상 20 이하의 정수인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 캡핑 시약이 시스테아민, N-아세틸시스테아민, 에탄올아민, 암모니아, 암모늄 바이카르보네이트, 수산화나트륨 및 탄산나트륨으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 캐리어 단백질이 CRM197인 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, Aβ 단편이 Aβ (서열번호 21)의 1-7 잔기이고, n은 12 또는 14인 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 펩티드 면역원이 DAEFRHD-C (서열번호 2)인 것인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 펩티드 면역원이 KLVFFAED-C (서열번호 45)인 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 캡핑 시약이 N-아세틸시스테아민인 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 캡핑 시약이 N-아세틸시스테아민인 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, Xd는 라이신 잔기의 유도체화된 작용기인 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 캐리어 단백질의 작용기가 할로아세틸화제를 이용하여 유도체화된 것인 방법.
  20. 제3항에 있어서, 펩티드 면역원으로 반응성 기를 도입하는 단계가 상기 반응성 기를 가지는 아미노산 잔기를 추가하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 아미노산 잔기는 반응성 기가 -SH를 포함하는 시스테인 잔기이거나, 또는 상기 아미노산 잔기는 반응성 기가 구아니딜 기를 포함하는 아르기닌 잔기이거나, 또는 상기 아미노산 잔기는 반응성 기가 -COOH를 포함하는 글루타메이트 또는 아스파르테이트 잔기이거나, 또는 상기 아미노산 잔기는 반응성 기가 -NH2를 포함하는 라이신 잔기인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 아미노산 잔기가 펩티드 합성 중에 첨가에 의해 펩티드 면역원에 도입되는 것인 방법.
  23. 제3항에 있어서, 펩티드 면역원에 반응성 기를 도입하는 단계가 티올화 시약에 의해 현수(pendant) 티올기를 생성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 티올화 시약이 N-아세틸호모시스테인 티오락톤을 포함하는 것인 방법.
  25. 면역원성 컨쥬게이트를 제조하는 방법으로서,
    (a) CRM197 캐리어 단백질의 하나 이상의 라이신 잔기를 유도체화하여 캐리어 단백질 상에 활성화된 작용기를 생성하는 단계,
    (b) 컨쥬게이트를 형성하는 조건 하에, Aβ (서열번호 21)의 1-7 잔기 및 C-말단 시스테인 잔기를 갖는 펩티드 면역원을 단계 (a)의 캐리어 단백질과 반응시키는 단계; 및
    (c) 단계 (b)의 컨쥬게이트를 N-아세틸시스테아민과 추가 반응시켜, 캐리어 단백질 상의 임의의 잔류 활성화된 작용기를 불활성화하여 면역원성 컨쥬게이트를 생성하는 단계
    를 포함하며,
    상기 면역원성 컨쥬게이트는
    화학식
    Figure 112011074084245-pat00031

    을 가지며,
    C는 CRM197이고,
    Xd는 CRM197의 유도체화된 라이신 잔기이며,
    P는 카르복시 말단 시스테인 잔기를 통해 유도체화된 라이신 잔기에 공유 결합된 펩티드 면역원이고,
    R은 CRM197의 유도체화된 라이신 잔기에 공유 결합된 단계 (c)의 N-아세틸시스테아민과 컨쥬게이트의 반응에 의해 형성된 캡핑 분자여서, 캐리어가 없으면 발생하지 않을 펩티드 면역원에 대한 원하는 면역 반응을 유발할 수 있는 능력을 유지하도록 캐리어 단백질의 작용기가 보존되고,
    n은 0 초과 38 이하의 정수이고,
    p는 0 초과 38 이하의 정수인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 펩티드 면역원이 DAEFRHD-C (서열번호 2)인 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 면역원성 컨게이트는
    화학식
    Figure 112011068200653-pat00032

    을 가지며,
    n은 0 초과 38 이하의 정수이고,
    p는 0 초과 38 이하의 정수인 방법.
  28. 제27항에 있어서, n이 12, 14 또는 15인 방법.
  29. 제28항에 있어서, n 더하기 p가 20 내지 22인 방법.
  30. 면역원성 컨쥬게이트를 제조하는 방법으로서,
    (a) CRM197 캐리어 단백질의 하나 이상의 라이신 잔기를 유도체화하여 캐리어 단백질 상에 활성화된 작용기를 생성하는 단계,
    (b) 컨쥬게이트를 형성하는 조건 하에, Aβ (서열번호 21)의 16-23 잔기 및 C-말단 시스테인 잔기를 포함하는 펩티드 면역원을 단계 (a)의 캐리어 단백질과 반응시키는 단계; 및
    (c) 단계 (b)의 컨쥬게이트를 N-아세틸시스테아민과 추가 반응시켜, 캐리어 단백질 상의 임의의 남아있는 활성화된 작용기를 불활성화시켜 면역원성 컨쥬게이트를 생성하는 단계를 포함하며,
    상기 면역원성 컨쥬게이트는
    화학식
    Figure 112011074084245-pat00033

    을 가지며,
    상기 식 중,
    C는 CRM197이고,
    Xd는 CRM197의 유도체화된 라이신 잔기이며,
    P는 C- 말단 시스테인 잔기를 통해 유도체화된 라이신 잔기에 공유 결합된 펩티드 면역원이고,
    R은 CRM197의 유도체화된 라이신 잔기에 공유 결합된 단계 (c)의 N-아세틸시스테아민과 컨쥬게이트의 반응에 의해 형성된 캡핑 분자여서, 캐리어가 없으면 발생하지 않을 펩티드 면역원에 대한 원하는 면역 반응을 유발할 수 있는 능력을 유지하도록 캐리어 단백질의 작용기가 보존되고,
    n은 0 초과 38 이하의 정수이고,
    p는 0 초과 38 이하의 정수인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 펩티드 면역원이 KLVFFAED-C (서열번호 45)인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 면역원성 컨쥬게이트가
    화학식
    Figure 112011068200653-pat00034

    을 가지며,
    n은 0 초과 38 이하의 정수이고,
    p는 0 초과 38 이하의 정수인 방법.
  33. 제32항에 있어서, n 더하기 p는 20 내지 22인 것인 방법.
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