KR101171384B1

KR101171384B1 - 유전자의 단계적 발현 네트워크 및 이를 이용한 세포표식방법

Info

Publication number: KR101171384B1
Application number: KR1020060054869A
Authority: KR
Inventors: 나도균; 이도헌
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2006-06-19
Filing date: 2006-06-19
Publication date: 2012-08-10
Also published as: KR20070120297A

Abstract

본 발명은 유전자의 단계적 발현 네트워크 및 이를 이용한 세포 표식방법에 관한 것으로, 구체적으로 전사조절인자나 유전자에 상보적인 RNA를 이용하여 유전자가 순차적으로 발현되게 하는 유전자의 단계적 발현 네트워크 및 이를 이용하여 형광 단백질을 발현시켜 시간에 따라 발현되는 단백질의 종류를 달리함으로써 세포를 표식하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 발현 네트워크는 유전자 발현의 조절을 시간에 따라 가능케 하여 특정 시간에 단백질이 발현되게 하거나, 시간차를 두고 서로 다른 단백질이 발현되게 함으로써 유전자 치료나, 생물 공학 분야에 이용될 수 있고 세포 표식방법은 세포칩 및 제반기기 없이 대량의 세포 실험(high-throughput cell-based assay)을 수행하는데 이용될 수 있다.

유전자 네트워크, 세포 표식, 순차적 단백질 발현, 유전자 치료, 생물공학, 세포칩

Description

유전자의 단계적 발현 네트워크 및 이를 이용한 세포 표식방법{A sequential gene expression network and method to tag cells using it}

도 1은 유전자의 단계적 발현의 예인 3단계의 유전자 네트워크 모식도이고,

도 2는 수학식 1에 제시한 수학적 모델을 시뮬레이션한 결과를 나타낸 그림이고,

도 3은 다양한 전사 속도 상수 값에 따른 단계별 단백질의 발현 결과를 나타낸 그림이고,

도 4는 다양한 상보적 결합을 하는 RNA의 해독 억제 정도에 따른 단계별 단백질의 발현 결과를 나타낸 그림이고,

도 5는 다양한 단백질 반감기에 따른 단계별 단백질의 발현 결과를 나타낸 그림이고,

도 6은 개개의 세포 표식을 위해 개발된 형광단백질 발현을 위한 유전자 네트워크 모식도이고,

도 7은 세포 표식의 생체 내 발현의 수학적 예측 결과를 나타낸 그림이다.

본 발명은 유전자의 단계적 발현 네트워크 및 이를 이용한 세포 표식방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 전사조절인자나 유전자에 상보적인 RNA를 이용하여 유전자가 순차적으로 발현되게 하는 유전자의 단계적 발현 네트워크 및 이를 이용하여 형광 단백질을 발현시켜 시간에 따라 발현되는 단백질의 종류를 달리함으로써 세포를 표식하는 방법에 관한 것이다.

유전자의 발현 조절은 특정 산물의 수율을 높이기 위해서부터 질병 치료를 위한 유전자 치료에까지 다양하게 이용된다. 기존의 발현 조절은 특정 유전자를 과발현, 혹은 억제하는 방법이 주류이었다. 그러나 이와 같은 단순한 접근법은 한계가 있으며, 수율 증가를 위해서 혹은 치료를 위한 정교한 발현의 조절을 위해서는 여럿 유전자의 복잡한 네트워크를 통해서만 가능하며 최근 이런 접근으로 기존 방법보다 수율을 높였다는 보고가 있다 (Farmer, W.R. and Liao, J.C., Nature Biotechnology, 18, 533-537, 2000). 그 외에도 아직 상업적 목적은 아니지만 유전자 네트워크를 인위적으로 구성해 생체 내 시스템을 다양하게 조절하고자 하는 시도가 지속되고 있다(Benner, S.A. and Sismour, A.M., Nature Rev. Genet., 6, 533-543, 2005; Guido, N.J. et al., Nature, 439, 856-860, 2006; Ferber, D., Science, 303, 158-161, 2004; Guido, N.J. et al., Nature, 439, 856-860, 2006). 현재까지 인위적인 유전자 네트워크 구성을 통해 제작된 생체 조절 시스템으로는, 외부 신호 농도에 따라서 두 개 중 하나의 유전자만 주로 발현되어 스위치 형태를 이루는 것(Sprinzak, D. et al., Nature, 438, 443-448, 2005; Kobayashi, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 8414-8419, 2004; Atkinson, M.R. et al., Cell, 113, 597-607, 2003), 발현이 주기적으로 반복되는 것(oscillation)(Atkinson, M.R. et al., Cell, 113, 597-607, 2003; Garcia-Ojalvo, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 10955-10960, 2004; McMillen, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 679-684, 2002; Elowitz, M.B. and Leibler, S., Nature, 403, 335-338, 2000)으로 다양하다. 이런 유전자 네트워크는 직접적으로는 소량으로 존재하는 물질을 감지하는 바이오센서, 약하게 발현되는 유전자의 검출 등의 세포 자체를 이용한 다양한 분야에 응용할 수 있다. 그리고 세포 자체가 논리 연산 및 수학적 연산을 할 수 있게 만든 보고도 있어(Sprinzak, D. and Elowitz, M.B., Nature, 438, 443-448, 2005; Sharma, V., BioTeach. J., 2, 53-60, 2004; Simpson, M.L. et al., Trends in Biotechnology, 19, 317-323, 2001; Guet, C.a.l.C. et al., Science, 296, 1466-1470, 2002), 유전자 네크워크가 이식된 세포 자체만으로 다양한 분야에 응용이 가능할 것이고, 이에 대한 기대 역시 증가하고 있다.

본 발명은, 발현의 다양한 조절 중 시간차를 둔 단백질의 순차적 발현을 가능케 하는 유전자 네트워크를 구성하여 세포내 단백질 발현을 정교하게 조절하기 위함이며, 이 역시 기존의 다른 유전자 네트워크처럼 세포를 유전공학 기법으로 조작함으로써 다양한 산업 분야로 응용 가능케 하는데 이용할 수 있다.

하나의 세포 타입에 대해서만 연구를 하는 실험자의 경우 세포 개개를 구분하고자 하는 필요성은 적지만, 최근 신약 개발이나, 유전체, 단백질체 연구를 위해 대량의 세포 실험(high-throughput cell-based assay)에 대한 필요성은 급격히 증가하는 추세에 있다. 이런 대량 실험의 경우, 다양한 세포 타입을 한 번에 실험하므로 개개의 세포 타입을 구분하는 것은 매우 중요하다. 세포 타입 구분을 위해서는 일반적으로 하나의 웰(well)에 한 종류의 세포만을 넣는 세포칩(cell-chip) 방식이 널리 이용되고 있다. 이 방법의 단점은 세포칩에 세포를 배양하거나, 실험을 진행하기 위해서는 고가의 실험 장치가 필요하다는 점이다. 이와는 달리 세포에 화합물을 이용하여 각각의 세포에 코드를 주입하는 방법이 새로이 고안되었다(Beske, O.E. and Goldbard, S., Drug Discovery Today, 7, S131-S135, 2002). 이 방법을 간단히 설명하면 주로 세포를 화합물이 포함된 배양액 속에서 배양함으로써 해당 화합물을 포함하도록 하는 방법이다. 이런 세포 자체에 표식을 심는 방법은 세포 구분을 위해 웰에 세포를 넣지 않아도 되며, 모든 종료의 세포가 하나의 웰에 섞여 있어도 구분이 가능하다는 장점이 있다. 현재까지 이런 방법을 위해 이용하는 표식은 색을 낼 수 있는 Quantum dot을 세포 내에 주입하거나, Virtual Array 社 에서 이용하는 방법처럼 색으로 이루어진 바코드 물질을 세포 내로 유입시키는 방법이 대표적이다(Beske, O.E. and Goldbard, S., Drug Discovery Today, 7, S131-S135, 2002; Bruchez, M. et al., Science 281, 2013-2015, 1998; Han, M. et al., Nat. Biotechnol. 19, 631-635, 2001; Chan,W. and Nie, S., Science 281, 2016-2018, 1998) 비록 이런 접근 방법이 세포칩(cell-chip)은 필요치 않으나 단 점으로 세포 내부로 세포를 구분 가능하도록 하는 물질을 매번 주입한 후 세포를 혼합해야하는 과정이 존재하는 것과, 색으로 구분 가능한 경우의 수가 매주 적다는 점, 주입된 화합물이 세포에 유해한 경우 사용이 제한되는 점이다. 따라서 현재의 대량의 세포 실험(high-throughput cell-based assay)의 개선을 위해서는 (1) 세포 개개에 표식(코드)을 심는 방법이 필요하며, (2) 표식이 세포에 유해하지 않아야 하며, (3) 다양한 세포의 구분을 위해 구분 가능한 표식의 수가 가능한 많아야 하며 (4) 한번 표식을 이식했을 때 다시 주입할 필요가 없어야한다.

본 발명은 세포 조작을 통한 유전자 발현을 조절함에 있어 단백질의 시간에 따라 발현을 조절하는 게 가능하도록 유전자 조절 네트워크를 설계하고자 하는데 있다. 또한, (1) 대규모 세포 실험(high-throughput cell-based assay)에 필요한 세포칩(cell chip) 및 이를 위한 고가의 제반 시설을 대체하고, (2) 기존의 세포 표식 방법의 단점인 실험시마다 세포 내에 구분을 위한 물질을 주입하는 과정을 없애고, (3) 가능한 다양한 세포 구분을 위한 표식의 다양성이 충분히 넓고, (4) 표식이 세포에 유해하지 않도록 하기 위해 1)의 발명에서 언급한 유전자 네트워크를 응용해 형광 단백질을 발현시키는 네트워크를 세포 내에 영구적으로 도입하여 기존의 단점을 해결하는 것에 있다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 유전자를 순차적으로 발현시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 순차적 발현 네트워크의 단백질 및 RNA 각각을 암호화하는 유전자 세트 또는 발현벡터(expression vector) 세트를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 순차적 유전자 발현방법을 이용한 세포 표식 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

1) 유도인자(inducer)에 의해 첫번째 단계에서 두번째 단계의 표적 단백질(Protein 2, P2)의 전사 조절인자(transcription Factor 1, TF1) 및 P2의 mRNA에 상보적 결합을 하는 RNA(RNA 1)가 생성되는 단계; 및

2) 단계 1의 TF1이 표적 단백질의 전사를 촉진하여 P2가 생성되고 RNA 1이 P2 유전자의 해독을 억제하여 특정 단계에서 인위적으로 P1만이 생성되도록 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자를 순차적으로 발현시키는 방법을 제공한다.

도 1에서는 발명된 유전자 네트워크의 간단한 예로써 3개의 유전자 (P1, P2, P3) 발현으로 설명하였다. 그러나 각각의 발현 과정은 동일한 과정을 반복하므로 여러 전사인자 및 표적 mRNA에 상보적 결합을 하는 RNA를 추가함으로써 3개의 발현이 아니라 이론상 무한히 많은 유전자 순차 발현을 위한 조절 네트워크를 구성할 수 있다. 그리고 도 1에서 P1, P2를 넣지 않고, P3만 넣는다면 처음 외부 요인(inducer)에 의해 일정 시간 후에 P3가 발현되게 할 수도 있다. 혹은, P3와 함께 TF1, P1 유전자의 발현을 촉진 시키는 전사인자를 사용함으로써 전체적인 발현이 순환되도록 구성할 수도 있는 등, 발명된 네트워크는 다양한 형태로 단백질이 발현되도록 응용가능하다.

또한, 본 발명은 상기에서 P1, TF1 및 RNA 1을 각각 암호화하는 유전자 세트 또는 발현벡터세트를 포함하는 단계적 유전자 발현 네트워크를 제공한다.

외부의 발현 촉진 요인(inducer)이 두 종류의 유전자를 전사하는데, 첫 번째는 두 개의 단백질 TF1(transcription factor 1), P1(protein 1)을 발현한다. 그러나 목적에 따라 TF1과 P1은 서로 융합된 형태(fusion protein)를 취할 수도 있으며, 서로 독립적으로 분리되어 발현될 수도 있고 혹은, P1을 발현시키지 않을 수도 있다. P1은 목적하고자 하는 단백질이며, TF1은 다음 단계의 유전자 (각각 TF2과 P2를 코딩하는 유전자) 발현을 촉진시키는 전사인자이다. 두 번째는, 다음 단계에서 전사되는 TF2와 P2의 mRNA와 상보적 결합이 가능한 RNA(RNA1으로 표시)가 외부 요인(inducer)에 의해 전사된다. 이는 다음 단계(TF2, P2)의 mRNA와 결합, 해독(translation)을 방해함으로써 실제 단백질로 발현되는 것을 억제한다. 즉, 외부의 발현 촉진 요인(inducer)이 존재하는 한 TF1, P1, RNA1이 발현되고, 다음 단계의 유전자들은 TF1에 의해 전사는 되나 RNA1에 의해 해독이 방해받음으로써 단백질을 만들어내지는 못한다.

외부의 요인이 자연적이든, 인위적이든 소멸할 경우 세포 내에는 TF1, P1, RNA1만이 존재한다. 그러나 RNA가 단백질보다 반감기가 짧으므로 세포내에서 RNA1이 제일 먼저 소멸될 것이다(Bernstein, J.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 2758-2763, 2004; Bernstein, J.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 9697-9702, 2002; Varshavsky, A., Genes Cells, 2, 13-28, 1997) 그러면 남아있는 TF1에 의해 전사된 TF2, P2의 mRNA는 해독을 정상적으로 진행할 수 있게 된다. 이로 인해 TF2, P2가 발현되기 시작한다.

발현된 TF2는 단백질로 해독되면 바로 P3 유전자를 전사한다. 그러나 TF1에 의해 발현되고 있는 RNA2에 의해 P3 mRNA의 해독이 방해받아 P3 단백질의 생성은 되지 않는다. 즉, 이 시점에서 TF1, P1은 외부 요인이 없으므로 점사 소멸되고 있고, TF2, P2는 발현되기 시작하며, P3는 아직 발현되지 못하는 상태이다. 세포 내에서 TF1이 소멸되면 TF2와 RNA2의 생산은 멈추게 된다. 그러나 앞서 언급했듯 RNA의 반감기가 단백질보타 짧기 때문에 생체 내에서는 RNA2가 먼저 소멸되게 된다. 그러면 남아있는 TF2에 의해 P3는 계속 전사될 것이고, RNA2의 소멸에 의해 P3는 정상적으로 해독이 가능할 것이다. 이 시점에서 TF1은 존재하지 않으며, TF2는 소멸 단계이고, P3는 생성 단계에 있게 된다.

간단히 말해, 본 발명의 네트워크는 전사를 촉진 시키는 전사인자와 동시에 해독을 억제하려는 mRNA와 상보적 결합이 가능한 RNA를 전사함으로써 유전자들이 순차적으로 겹치지 않으면서 발현될 수 있게 한다. 상기에서 표적 단백질 및 전사인자의 수는 발현단계에 비례하여 증가 가능하다.

아울러, 본 발명은

1) P1을 표지 단백질과 연결하여 발현; 및

2) 표지 단백질의 순차적 발현에 의해 세포를 각각 구분하는 것을 특징으로 하는 세포 표식방법을 제공한다.

본 발명에서는 도 6에 나타난 바와 같이. 세포 표식을 위한 네트워크 설계에서 3개의 형광 단백질이 3단계로 발현되도록 하였다. 아무런 색도 나타내지 경우도 존재하므로 이는 4× 4× 4=64개의 서로 다른 표식을 만들어낸다. 이에 따라, 64 종류의 서로 다른 세포를 구분할 수 있다. 이는 3자리수로 이루어진 4진수 바코드와 동일한 개념이다. 그러나 이는 본 세포 표식 발명의 한 예일 뿐, 발현의 단계를 확장하거나, 각 단계에서 2개 이상의 단백질이 발현되도록 하거나, 다양한 형광단백질을 이용함으로써 구분 가능한 세포의 수도 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 5가지 형광 단백질을 6단계로 발현시킨다면 이는 6진수로 이루어진 6자리 바코드와 동일하므로 이는 6⁶=46,656가지 서로 다른 세포를 구분할 수 있다. 만약 5가지 형광 단백질을 6단계로 발현시키되, 각 단계에서 2가지 형광단백질을 발현시킨다면 ₆H₂× ₆H₂× ₆H₂× ₆H₂× ₆H₂× ₆H₂= 21⁶ = 85,766,121의 서로 다른 수의 표식(바코드)을 만들어낼 수 있다. H는 중복조합을 의미한다. 그러므로 본 세포표식 발명은 더욱 더 많은 표식에 응용할 수 있다.

위와 같은 방법으로 개개의 세포를 구분하는 표식(바코드)을 형광단백질의 순차적 발현을 이용한 방법으로 구현할 수 있다. 이렇게 제작된 표식을 포함한 세포는, (1)세포를 구분하는 게 간편하여 간단하게 실험할 수 있으며 기존의 세포칩(cell chip) 방식과 달리 고가의 장비를 필요치 않으며 (2) 영구적으로 유전자를 내포하므로 기존의 세포 자체에 색으로 표식을 하는 물질을 삽입하는 방법과 달리 한번 표식을 이식하면 영구히 표식이 유지되므로 실험시마다 삽입하는 전 처리 과정이 필요치 않으며 (3) 5개의 형광단백질을 이용하여 6단계로 발현시키는 경우라도 약 4만여 개로, 효모의 돌연변이형 전체가 6천여 개, E. coli 돌연변이형이 3천여 개인 것을 감안한다면, 거의 대부분의 세포 종류를 구분하는데 부족함이 없는 장점이 있다.

상기에서, 표지 단백질은 형광 단백질, 호르몬 단백질, 특정 치료용 화합물은 생성하는 효소 등이 가능하며, 단백질의 발현을 위한 프로모터는 lac 프로모터 이외에, 박테리오파지(bacteriophage)의 RNAP/T7 프로모터, cI/P_RM,cII/P_RE, 혹은 미생물간의 신호 전달 물질을 바탕으로 한 개체밀도인식(quorum sensing)에 관여하는 LasR, LuxR, RhlR 등의 전사 유도 단백질 및 lux box를 포함하는 프로모터를 사용될 수 있다. 그러나 그 외에도 전사를 활성화시키는 전사 조절 인자는 어떤 것이라도 사용 가능하다.

이하, 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 한정하지는 않는다.

<실시예 1> E. coli 에 해당하는 매개변수를 이용한 수학식 1의 시뮬레이션

도 1에 나타난 본 발명의 유전자 네트워크가 단백질을 순차적으로 발현할 것인지에 대해 수학적인 모델을 세워 시뮬레이션을 하였다. 수학적 모델은 수학식 1에 나타냈다. 해당 모델의 세뮬레이션 결과는 도 2에 나타냈다.

각각의 수학식은 미분방정식으로 구성되어있고, 각각의 변수는 다음과 같다. m1, m2, m3는 각 단계에서 발현되는 전사 조절 인자의 mRNA의 수를 나타내며, r1, r2는 각각 m2, m3와 상보적 결합을 하는 안티센스 RNA이다. A는 외부에서 최초로 공급하는 외부 인자(inducer)이며, p1, p2, p3은 각 단계에서 발현되는 표식 단백질을 나타낸다. 계산의 복잡성을 줄이기 위해 각 단계에 발현되는 전사조절인자 와 표식 단백질의 수는 동일하다고 가정한다.

수학식 1에 나타난 수학 모델에서 A 는 외부 요인(inducer), m 은 각 단계에 있는 단백질의 mRNA, r 은 다음 단계의 mRNA와 상보적 결합을 하는 RNA 서열, p 는 각 단계의 단백질(편의를 위해 전사인자와 단백질은 융합 형태로 가정)을 나타낸다. 그 외에 수학식에 존재하는 매개변수인 a는 전사 속도 상수, b는 RNA의 분해 속도 상수, c는 RNA의 상보적 결합 속도 상수, d ₀ 는 외부 요인의 분해 속도 상수, d는 각 단백질의 분해 속도 상수이다.

각각의 식을 살펴보면,

첫번째 단계의 TF1, P1 mRNA 발현 식은 아래와 같다. TF1과 P1의 수가 모두 동일하게 생성된다고 가정했으므로 하나의 식으로 나타냈다. mRNA 발현 속도 식에서 a 는 최대 전사 속도 상수를 나타내며, 최초 유도 인자인 A의 농도에 비례해서 전사 속도는 증가한다. 그러나 선형적인 증가가 아니라 A양이 많아지면서 포화되는 곡선을 그리게 되므로, 일반적으로 이용되는 Hill 함수를 사용했다. mRNA 분해속도는 반감기를 갖는 일반적인 지수적 감소 패턴을 따른다. 식에서 b 는 mRNA의 분해 속도 상수를 나타낸다.

두번째 및 세번째 단계의 단백질 발현 식은 아래의 형태를 갖는다.

첫번째 단계 식과의 차이점은 이전 단계에서 생성된 안티센스 RNA에 의해 mRNA 수가 감소한다는 점이다. mRNA와 안티센스 RNA의 상보적인 결합은 각 각의 수에 비례하므로, 반응 속도 상수 c 를 갖는 식으로 표시하였다.

상보적 결합을 하는 안티센스 RNA는 제일 마지막 단계를 제외하고는 각 단계에서 생성되며, 다음 단계의 mRNA와 결합하여 해독(translation)을 막는다.

최초의 전사 유도 인자인 A는 생성되지 않고 분해만 되므로 그 식에는 분해 속도만 존재하며, 분해 속도 상수는 d ₀ 이다.

각 단백질은 mRNA에서 해독되면서 생성되며, 다른 것들과 마찬가지로 반감기를 가지며 동일한 지수적 감소를 한다. mRNA로부터 해독은 해독 속도 상수 e 에 비례하며, 분해 속도 상수 d 에 비례해서 감소한다.

이상의 것들은 바탕으로 수학식 1이 도출되었다.

시뮬레이션의 유효성을 높이기 위해 각 매개변수 값들은 E. coli 내에 존재하는 RNA 및 단백질들의 일반적인 값들을 이용하였고, 그 내용은 각각을 설명 시 언급하기로 한다. 그러나 본 발명이 E. coli에 대해 국한되지 않음을 미리 언급한다. 사용된 값들은 a=5 mRNA/min [단백질 발현에 이용되는 프로모터/전사인자의 전사 속도 상수가 0.1-20 사이임을 감안(Gralla, J. D. et al., Biochemistry, 19, 5864-5869.; Elowitz, M.B. et al., Nature, 403(6767), 335-338, 2000; Nucleic Acids Res. 1997 25;1203-1210;Hilla G, 1990, J. Mol. Biol. 213, 109-121; Madeline A. Shea, 1985, J. Mol. Biol. 181,211-230; J. Bacteriology 1993 175(17) 5648-5654), n=2(일반적인으로 알려진 Hill Coefficient 값), b=0.347 /min(RNA 평균 반감기는 2분이며 최대 10분 이내임 Bernstein, J.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 2758-2763, 2004; Bernstein, J.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 9697-9702, 2002), c=0.12 /(RNAㆍmin)(상보적 결합 속도 상수는 0.012/(RNAㆍmin)이라 보고된 적이 있다; Thisted, T. et al., EMBO J. 13(8), 1960-1968, 1994). 그러나 동일한 수의 mRNA와 안티센스가 존재할 경우 상보적 결합 빈도가 낮다. 따라서 충분히 많은 안티센스 RNA를 전사하기 위해 안티센스 RNA가 포함된 유전자는 플라스미드 카피수(copy number)가 TF가 포함된 플라스미드의 카피수보다 많은 것을 사용할 경우 가능하다.

예를 들어, TF 관련 유전자는 염색체 속에 하나만 존재하게 할 수 있고, 안티센스 RNA가 있는 유전자는 카피수가 큰 플라스미드를 사용할 경우 그 수를 쉽게 조절할 수 있다. 따라서 여기서는 카피수가 10배 많은 플라스미드를 사용했다고 가 정한다], e=10 /min[e는 전사된 mRNA가 리보솜에 단백질을 생성하는 해독과정에서의 속도 상수로서, mRNA와 주변 환경에 따라 다양하지만 여기서는 해독(translation)에서 상보적 결합을 하는 RNA 외에는 아무런 저해 요소가 없다고 가정, (Chen W. et al., Biotech Bioeng 38:679-687, 1991), d ₀ 및 d=0.017 /min 이다(단백질의 반감기는 세포내 상황에 따라 10분 이하부터 10시간 이상까지 다양하나 단백질의 C 말단에 짧은 특정 펩타이드를 부착하는 경우 반감기를 조절할 수 있다. 그래서 이렇게 조작된 형광 단백질(GFP)의 경우 40분의 반감기를 가지며, 여기서도 동일한 형광 단백질을 사용할 수 있으므로 반감기를 40분으로 설정하였다; Bernstein, J.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 9697-9702, 2002).

이상의 매개변수를 바탕으로 수학식 1에 나열된 미분식을 적분하였다. 식과 매개 변수가 많아 이를 수식으로 바로 풀 수 없기에 일반적으로 사용되는 수치 근사 법을 사용하여 적분하였다. 4차 Runge-Kutta 방법이다 (Cartwright, J. H. E., et al., Int. J. Bifurcation and Chaos, 2, 427-449, 1992).

최초 유도 인자의 수를 A =50으로 주입했을 때 결과를 도2에 나타냈다. 도 2에서 보듯, 각 단백질들은 시간차를 두고 발현되고 있고 각 단계의 단백질들이 약 300분에서 400분 정도 지속된 후 다음 단계의 단백질 발현으로 이어지는 것을 알 수 있다.

<실시예 2> 매개변수 변화에 따른 수학식 1의 시뮬레이션

수학식 1의 모델은 일반적으로 알려진 E. coli의 경우를 시뮬레이션한 결과이다. 그러나 다양한 유전자, 단백질을 이용하더라도 해당 네트워크가 기능을 제대로 하는지 여부를 알아보기 위해 수학적 방법에서 이용되는, 매개변수 변경을 통해 다양한 변화에서도 순차적인 발현이 유지되는지 예측하였다. 이는 수학 모델의 강인성(robustness)을 확인하는 일반적인 방법이다. 매개변수 변경은 실제로 세포내에서 각 단계에 속한 단백질의 반감기나, 해독 억제를 위해 전사되는 RNA의 대상 mRNA와의 결합 정도를 서열을 바꿈으로써 가능한데, 이로 인해 각 단계의 단백질이 지속되는 시간을 조율할 수 있는 장점이 있다. 수학식 1의 모델에서 중요한 매개변수는 전사에 관련된 a, 상보적 결합에 관련된 c, 단백질의 반감기 d 이다. 따라서 이들 매개 변수를 변화시켜가면서 단백질의 순차적 발현이 유지되는지 확인한다.

<2-1> 매개변수 a 변화에 따른 시뮬레이션

전사에 관련된 a의 값을 다양하게 변경시킨 후 수학식 1에 있는 모델을 4차 Runge-Kutta 방법으로 적분하여 그 결과를 도 3에 시간에 따라 나타내었다. 일반적으로 알려진 a값의 범위는 전사가 잘 일어나지 않는 0.1에서부터 매우 많은 양의 mRNA를 만드는 20까지 다양하다(Gralla, J. D. et al., Biochemistry, 19, 5864-5869.; Elowitz, M.B. et al., Nature, 403(6767), 335-338, 2000; Nucleic Acids Res (1997) 25;1203-1210; Hilla G, (1990), J. Mol. Biol. 213, 109-121; Madeline A. Shea, 1985, J. Mol. Biol. 181,211-230; J Bacteriology 1993 175(17) 5648-5654). 그러므로 a 값 역시 0.1-20 사이의 값으로 다양하게 변화시킨 후 그 결과를 예측하였다. a=10, a=20인 경우 도 3의 (A)에 나타내었고, a=0.1인 경우 다른 경우와 구분하기 어려워 확대한 것을 도 3 (B)에 별도로 나타내었다. 도 3에 보면 전사가 거의 일어나지 않는 경우라 할지라도 순차적인 발현 현상은 나타남을 알 수 있다. 다만, 다른 단계의 단백질이 그 단계에서 발현되는 단백질 양의 90% 이상을 차지한다. 이는 안티센스 RNA 역시 매우 적은 양으로 발현되기 때문에 mRNA와 충분히 상보적인 결합을 하지 못하기 때문이라 생각된다. 따라서 전사가 충분히 일어날 정도의 전사인자를 사용한다면(1 분에 수개 이상, a>1), a값의 변화는 단백질의 실제 발현 양에만 영향을 줄 뿐이지 시간차를 두고 발현되는 패턴에는 영향을 주지 않음을 알 수 있다.

<2-2> 매개변수 c 변화에 따른 시뮬레이션

다음으로 상보적 결합에 관련된 매개변수 c를 c=0.012, 0.12, 1.2로 변화시켜 보았다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 상보적 결합에 의한 RNA가 완벽히 mRNA의 해독을 억제하지 못하기 때문에 약간의 mRNA는 단백질로 해독될 확률이 있다. 이 확률만큼, 다음 단계의 단백질이 이전 단계에서 소량 발현되는데, c값이 클수록, 즉 RNA가 다음 단계의 mRNA의 해독을 잘 억제할수록 각 단계의 단백질은 해당 단계에서만 나타나며 약간의 발현은 차단될 수 있다. 도 4에 나타난 결과에 의하면, 안티센스 RNA의 양을 mRNA보다 약 100배 이상 많이 발현시킬 때, 각 단계에 다른 단계의 단백질이 발현되는 것을 효과적으로 막을 수 있음을 알 수 있다.

<2-3> 매개변수인 단백질 반감기 변화에 따른 시뮬레이션

마지막으로 본 발명의 네트워크에 영향을 주는 매개변수는 단백질의 반감기이다. E. coli의 경우 단백질의 반감기는 10분에서 몇 시간으로 다양한데, 여기서는 일반적인 단백질의 반감기로 40분을 사용했다. 단백질의 반감기가 단백질 발현에 주는 영향을 보기 위해 d값을 0.07 (반감기 10분)에서 0.006 (2시간)까지 변화시켜 보았다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5를 보면, 단백질의 반감기가 클수록, 즉 단백질의 분해속도가 낮을수록 각 단계가 지속되는 시간이 증가됨을 알 수 있다. 반감기가 2시간인 경우 각 단계가 1500분 정도 지속됨을 알 수 있고, 반감기가 10분인 경우 200분 정도임을 알 수 있다. 즉, 이 결과는 단백질의 반감기를 조절하더라도 전체 단백질의 순차적 발현은 유지됨을 말해준다. 그리고 단백질의 반감기를 조절함으로써 각 단계의 지속시간을 조절할 수 있다는 것 역시 말해준다.

<실시예 3> 순차적 유전자 발현을 이용한 세포 표식

본 발명자들은 상기 실시예에서 나타낸 유전자 발현 네트워크를 이용하여 개개의 세포를 구분할 수 있는 표식을 제작하기 위해 각각의 표적 단백질을 색이 다른 형광 단백질로 표지하여 형광 단백질이 순차적으로 발현되도록 설계하였다.

구체적으로, 세포 표식을 E. coli에 적용하기 위해 E. coli내에서 작동 가능한 전사인자와 형광 단백질, 그리고 프로모터를 이용하였다. 도 6에 있는 것은 많 은 세포 표식 중에서 Green-Yellow-Cyan의 경우를 나타낸 것이다. 이 설계에는 형광단백질인 GFP, YFP, CFP를 이용하였고, 전사인자와 이것이 작용하는 프로모터로는 cI/P_RM, cII/P_RE를 이용하였다. cI, cII는 E. coli를 숙주로 하는 박테리오파지 람다(λ)에서 유래한 전사인자이며, P_RM/P_RE 역시 해당 박테리오파지에서 유래한 cI, cII가 작용하는 프로모터이다.

1 단계는 락토오즈(lactose) 혹은 IPTG에 의해 발현이 유도되는 lac 프로모터를 이용하였고, 2단계 발현을 위해 1 단계에서는 GFP-cI 융합 단백질을 발현시켰다. GFP(green fluorescence protein)는 녹색 형광 단백질로 초록색을 띄는 형광단백질이다. 그리고 락토오스 혹은 IPTG에 의해 다음 단계에 있는 유전자인 yfp-cII의 해독과정을 억제하기 위해 이에 상보적 결합을 하는 RNA를 같이 전사한다. 2단계에서는 마지막 단계의 발현을 촉진시키는 cII와 융합된 형광단백질이 같이 발현되며, 이는 P_RE 프로모터를 인지하여 마지막 단계에 있는 CFP 단백질을 발현시킨다.

E. coli에서 적용 가능하도록 설계된 유전자 네트워크의 유효성을 수학적인 기법으로 조사하였다. 수학적 모델은 수학식 1을 이용하였고, 매개변수 값은 아래와 같다. a = 5, b = 0.347, c = 0.12, d = 0.017, e = 10, n = 2 (Mateus, C. and Avery, S.V., Yeast, 16, 1313-1323, 2000; Andersen, J. B., et al., Appl. Environ. Microbiol., 64, 2240-2246, 1998; Arkin, A. et al., Genetics, 149, 1633-1648, 1998).

시뮬레이션 결과는 도 7에 나타난 바와 같이, 각 단계의 형광 단백질이 순차적으로 뚜렷하게 나타남을 알 수 있다. 본 시뮬레이션에서는 반감속도가 40분인 형광단백질(gfp 이외의 단백질은 약 1시간 정도이나 단백질의 반감기를 조절하는 펩타이드를 C 말단에 붙여서 조절 가능하다)을 사용하였으나(Mateus, C. and Avery, S.V., Yeast, 16, 1313-1323, 2000; Andersen, J. B. et al., Appl. Environ. Microbiol., 64, 2240-2246, 1998), 이를 더 줄인다면 형광색이 나타나는 속도는 더욱 빨라질 것이고 이는 세포를 구분하는데 걸리는 시간이 더 감소할 것임을 말한다.

상기와 같이, 본 발명의 단계적 유전자 발현 네트워크는 시간에 따라 형광 단백질을 순서대로 발현하게 되므로 이 각각의 형광색이 세포 표식(바코드)으로 이용된다. 이와 같은 세포 표식은 여러 종류의 다른 세포가 혼재하는 경우 각각의 세포를 구분 가능케 한다. 그러므로 대표적인 이용 가능한 사례로 세포칩 기술의 대체를 들 수 있다. 일반적으로 다양한 세포에 대한 대량 실험은 세포칩을 이용한다. 세포칩에는 각 각의 웰에 한 종류의 세포만을 넣은 후, 칩에 있는 모든 세포에 대해 실험을 행하고, 그 결과를 파악하는 것이다. 결국 세포칩은 개개의 서로 다른 세포를 구분하고자 하는 목적으로 물리적인 웰을 사용하는 것이다. 그러나 발명된 세포 표식을 이용하는 경우 이런 물리적인 장치 없이 쉽게 세포를 구분할 수 있으므로 세포칩의 사용이 필요치 않는다. 게다가 여러 세포가 섞인 상태에서 실험을 행할 수 있기에 전체적인 실험 과정이 간략화 되며, 적은 세포로도 분석이 용이하다는 장점이 있는 것이다.

본 발명의 유전자의 시간차를 둔 순차적 발현 네트워크는 세포내 단백질의 발현 조절을 통해 특정 물질의 생산하기 위한 수율을 증대시키는 공학적인 응용에서부터 질병을 지료하기 위한 유전자 치료에까지 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 네트워크의 일례로, 발현되는 단백질에 각기 다른 색의 형광단백질을 표지한 유전자 발현 네트워크는 발현되는 단백질에 따라 개개의 세포를 구분할 수 있게 함으로써 대량의 세포실험(high-throughput cell-based assay)을 간편하고, 정확하게 측정할 수 있게 한다. 따라서, 세포 실험을 주 대상으로 하는 제약산업이나, 효모이중잡종화법(yeast two-hybrid)의 대량실험을 위한 라이브러리 제작 등 다양한 세포 실험에 응용할 수 있다.

Claims

1) 유도인자(inducer)에 의하여 발현이 유도되는 전사조절인자에 작동가능하도록 연결된 n차 표적 단백질(Pn) 및 n차 전사인자(TFn)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 n+1차 표적 단백질(Pn+1) 및 n+1차 전사인자(TFn+1)의 유전자와 상보결합하는 안티센스 RNAn을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 유전자 컨스트럭트를 제작하는 단계;

2) n+1차 표적 단백질(Pn+1) 및 n+1차 전사인자(TFn+1)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 n+2차 표적 단백질(Pn+1) 및 n+2차 전사인자(TFn+2)의 유전자와 상보결합하는 안티센스 RNAn+1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 유전자 컨스트럭트를 제작하는 단계;

3) 단계 1) 및 2)에서 제작한 유전자 컨스트럭트로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; 및

4) 단계 3)에서 형질전환된 숙주세포에 유도인자를 처리하는 단계를 포함하는 표적 단백질을 순차적으로 발현시키는 방법.

제 1항에 있어서, 단계 1) 및 2)의 유전자 컨스트럭트는 각각 독립된 유전자 로 분리되거나 하나의 벡터에 모두 포함되는 것을 특징으로 하는 표적 단백질을 순차적으로 발현시키는 방법.

제 1항에 있어서, 단계 1) 및 2)에서 차수를 1 씩 증가시켜 반복하는 단계를 단계 3)이전에 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 단백질을 순차적으로 발현시키는 방법.

삭제

1) n차 표적단백질을 표지 단백질과 연결하여 발현시키는 단계; 및

2) 제 1항의 방법에 의하여 표지 단백질을 순차적으로 발현시켜 세포를 각각 구분하는 것을 특징으로 하는 세포 표식방법.

제 8항에 있어서, 표지 단백질은 형광 단백질, 호르몬 또는 치료용 화합물을 생성하는 효소인 것을 특징으로 하는 세포 표식방법.

제 8항에 있어서, n차 표적단백질의 발현을 위한 프로모터는 lac 프로모터, 박테리오파지의 RNAP/T7 프로모터, cI/P_RM,cII/P_RE, lux box를 포함하는 프로모터 또는 LasR, LuxR 또는 RhlR의 전사 유도 단백질에 의해 유도되는 프로모터인 것을 특징으로 하는 세포 표식방법.