KR101106668B1 - The preparing method for natural GABA using serial fermentation of plant originated lactic acid bacteria with GABA-producing ability and protease-producing ability - Google Patents

The preparing method for natural GABA using serial fermentation of plant originated lactic acid bacteria with GABA-producing ability and protease-producing ability Download PDF

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Abstract

본 발명은 가바(gamma-aminobutyric acid, GABA, 감마아미노부티르산) 함유 발효물의 제조방법 및 그를 포함하는 식품 또는 음료에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a gama (gamma-aminobutyric acid, GABA, gamma aminobutyric acid) -containing fermentation, and a food or beverage comprising the same.

상기와 같은 본 발명은 기본적으로, 프로테아제 생성능 및 가바 생성능을 가진 식물성 유산균의 이단 발효를 이용하여 천연가바(GABA) 함유 발효물을 제조하는 것을 특징으로 한다.As described above, the present invention is characterized in that natural GABA-containing fermented products are prepared using two-stage fermentation of vegetable lactic acid bacteria having protease generating ability and Gaba generating ability.

본 발명에 따르면 글루탐산을 함유하는 단백질이 포함된 각종 소재를 주원료로 하여 프로테아제 활성을 보유한 유산균과 글루타메이트 디카르복실라아제 활성을 보유한 식물성 유산균을 이용하여 천연적으로 가바 함량이 증가된 발효물을 제조할 수 있다.According to the present invention, fermented products having a naturally increased Gaba content are prepared using lactic acid bacteria having protease activity and vegetable lactic acid bacteria having glutamate decarboxylase activity, using various materials including glutamic acid-containing proteins as main ingredients. can do.

가바(GABA), 글루탐산, 프로테아제 유산균, 식물성 유산균 GABA, glutamic acid, protease lactic acid bacteria, vegetable lactic acid bacteria

Description

프로테아제 생성능 및 가바 생성능을 가진 식물성 유산균의 이단 발효를 이용한 천연가바 함유 발효물의 제조방법{The preparing method for natural GABA using serial fermentation of plant originated lactic acid bacteria with GABA-producing ability and protease-producing ability}The preparing method for natural GABA using serial fermentation of plant originated lactic acid bacteria with GABA-producing ability and protease-producing ability}

본 발명은 가바(gamma-aminobutyric acid, GABA, 감마아미노부티르산) 함유 발효물의 제조방법 및 그를 포함하는 식품 또는 음료에 관한 것이다. 본 발명은 더욱 상세하게는, 토마토나 미강 등과 같이 글루탐산을 다량 함유하고 있는 천연 소재를 주 발효원으로 하여 그 발효원 내의 단백질 등을, 프로테아제 활성을 갖고 있는 유산균을 이용하여 글루탐산으로 전환시킨 후, 전환된 글루탐산을 GABA(gamma-aminobutyric acid)로 전환시키는 유산균을 이용하여 순차적으로 배양함으로써, 외부에서 글루탐산의 첨가 없이 천연가바가 함유된 토마토 발효물 혹은 미강 발효물 등을 생산하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a gama (gamma-aminobutyric acid, GABA, gamma aminobutyric acid) -containing fermentation, and a food or beverage comprising the same. More specifically, the present invention is a natural fermentation source containing a large amount of glutamic acid, such as tomato and rice bran as the main fermentation source, and then converted into glutamic acid using a lactic acid bacterium having protease activity, By sequentially culturing the lactic acid bacteria convert the converted glutamic acid to gamma-aminobutyric acid (GABA), and relates to a method for producing tomato fermented products or rice bran fermented products containing natural Gaba without the addition of glutamic acid from the outside.

이렇게 생산된 발효물은 가바는 물론 유산균 발효에 의한 각종 생리활성 물질 및 유기산을 포함하고 있다.The fermented product thus produced contains various bioactive substances and organic acids by fermenting lactic acid bacteria as well as Gaba.

가바는 비단백질 구성 아미노산으로서 뇌에서 신경전달물질로서의 역할뿐 아니라 뇌기능 촉진, 정신안정작용, 혈압저하작용, 이뇨작용, 간 기능 개선 작용, 비만 방지 작용, 알코올대사 촉진작용 및 소취작용 등 매우 다양한 생리기능을 갖는다. 특히 의약품으로 등록되어 뇌졸중 또는 뇌동맥 후유증에 의한 두통, 이명 및 의욕저하 등의 치료에 사용되고 있다.Gaba is a non-protein constituent amino acid, which is not only a neurotransmitter in the brain, but also a variety of functions such as brain function, mental stability, blood pressure lowering, diuresis, liver function improvement, obesity prevention, alcohol metabolism and deodorization. Has physiological function In particular, it is registered as a medicine and is used for the treatment of headache, tinnitus and decreased motivation caused by stroke or cerebral artery sequelae.

GABA는 각종 야채, 과일, 쌀, 콩 등에 널리 분포되어 있는 것으로 알려져 있으나 그 함량이 낮아 생리작용을 나타내지 못하는데, 최근 일본에서는 GABA 함량을 높인 녹차, 쌀배아, 발아현미 등이 판매되면서 식품업계와 소비자의 관심이 고조되고 있다.GABA is known to be widely distributed in various vegetables, fruits, rice and soybeans, but its low content does not show physiological effects. Recently, in Japan, the GABA-rich green tea, rice germ, germinated brown rice, etc. are sold to the food industry and consumers. Interest is rising.

최근 연구에 의하면 찻잎을 N2 가스에 6~8시간 동안 혐기처리하여 생산한, GABA가 다량 함유된 차를 고혈압환자에게 음용시키는 임상실험 결과, 혈압을 낮출 수 있을 뿐 아니라 체내에 축적되지 않고 분해되기 때문에 부작용이 전혀 없는 자연 건강음료로서 사용할 수 있다는 사실이 입증되었다. 또한 GABA 함량을 높인 쌀 배아, 발아현미제품의 생리기능 및 응용실험 결과에 의하면 뇌혈류를 증가시켜 산소 공급량을 많게 하며 뇌세포 대사 기능을 활발하게 함으로써 자율신경 실조증, 중풍 및 치매를 예방하고, 기억력 증진 및 불면 등에 효과가 있으며, 혈압저하 작용이 있어 순환기 질환 개선효과가 우수하고, 간 기능 활성 및 알코올 대사 촉진 기능이 있어 숙취제거 기능도 있는 것으로 밝혀졌다. 이처럼 GABA는 근래 생리활성기능이 매우 우수한 소재로서 각광을 받고 있어 그 응용 여부에 따라 무한한 시장성을 확보할 수 있는 기능성 소재라고 하겠다.According to a recent study, a study in which tea leaves were produced by anaerobic treatment of tea leaves with N 2 gas for 6 to 8 hours to drink high-GABA-containing teas in patients with high blood pressure, not only lowered blood pressure but also did not accumulate in the body. It has been proven that it can be used as a natural health drink with no side effects. In addition, the results of physiological function and application experiments of rice germ and germinated brown rice product with high GABA content showed that it increases brain blood flow to increase oxygen supply and activates brain cell metabolism to prevent autonomic ataxia, stroke and dementia. It is effective in promoting and insomnia, blood pressure lowering effect is excellent in circulatory disease improvement effect, liver function and alcohol metabolism promoting function has also been found to have a hangover removal function. As such, GABA is attracting attention as a material having excellent physiological activity in recent years, and thus, it is a functional material that can secure infinite marketability depending on its application.

본 발명에서는 위와 같은 우수성을 지닌 GABA를, 유산균을 이용하여 토마토 등의 소재를 이단 발효시킴으로써 천연물질로서 생산해내는 기술을 안출하였다.In the present invention, a technology for producing GABA having the above-described superiority as a natural substance by two-stage fermentation of materials such as tomatoes using lactic acid bacteria.

유산균(lactic acid bacteria: LAB)은 치즈, 발효유 및 유산균음료 등의 발효 유제품을 비롯하여 각종 발효 식품의 제조에 전 세계적으로 광범위하게 응용되고 있는 산업적으로 중요한 미생물이다. 특히, 국내에서 시판되는 대부분의 발효유는 살아 있는 유산균을 용이하게 섭취할 수 있도록 제조된 대표적인 식품이라 할 수 있다.Lactic acid bacteria (LAB) is an industrially important microorganism that is widely applied worldwide for the production of various fermented food products, including fermented dairy products such as cheese, fermented milk and lactic acid bacteria beverages. In particular, most of the fermented milk marketed in Korea can be said to be a representative food prepared to easily consume live lactic acid bacteria.

발효유 등을 통해 섭취된 유산균은 장내 유용균의 증식을 촉진하는 반면, 유해균의 증식을 억제하여 유익균이 우위를 차지하도록 장내 균총의 균형을 개선하며, 그 결과, ① 장관 감염과 식중독의 방지, ② 장내 부패억제, ③ 장의 운동 촉진에 의한 변비방지, ④ 면역력 증가, ⑤ 발암 억제 및 ⑥ 비타민 B군의 생산 등 여러 가지 생리적 기능을 가지는 것으로 밝혀지고 있다. 따라서 유럽 등 서구에서는 요구르트, 유산균 음료와 분말, 과립 및 정제 형태의 유산균 생균 제품이 기능성 식품으로서 가장 큰 시장을 형성하고 있다.Lactic acid bacteria ingested through fermented milk promote the growth of intestinal useful bacteria, while improving the balance of the intestinal flora so that beneficial bacteria take the lead by inhibiting the growth of harmful bacteria, resulting in ① prevention of intestinal infections and food poisoning, ② intestines It has been found to have various physiological functions, including anti-corruption, ③ prevention of constipation by promoting bowel movement, ④ increased immunity, ⑤ inhibition of carcinogenesis, and ⑥ production of vitamin B group. Therefore, in the West, such as Europe, yogurt, lactic acid bacteria beverages and probiotic products in the form of powders, granules and tablets form the largest market as functional foods.

최근에는 이렇게 우유 및 치즈 등에서 분리된 유산균과는 별도로 식물성 유산균의 장점이 부각되고 있다. 식물성 유산균은 POLAB(Plant Originated Lactic Acid Bacteria)으로 지칭되어 일반 유산균과 차별적으로 취급되고 있으며 동양에서 예로부터 섭취하던 절임류, 김치 등의 식물 원료의 발효 식품에서 분리된 유산균을 말한다. 식물성 유산균은 일반 동물성 유산균과 비교하여 그 종류가 10배 이상 많을 뿐 아니라 외부 환경에 대한 적응력이 뛰어나다. 즉 절임류와 같이 염분 농도가 높고 pH가 낮은 환경이나, 김치와 같이 마늘 등의 항균물질이 많은 환경에서도 생육이 가능한 균주이다. 한국의 김치는 고염분, 낮은 pH 및 천연 항균물질의 함량이 높은 상태이기 때문에 김치에서 분리되는 각종 균은 대표적인 식물성 유산균이며 따라서 잘 숙성된 김치는 식물성 유산균(POLAB)의 대표적인 보고라 할 수 있다.Recently, apart from the lactic acid bacteria isolated from milk and cheese, the advantages of vegetable lactic acid bacteria have been highlighted. Plant Lactobacillus is called POLAB (Plant Originated Lactic Acid Bacteria) and is treated differently from general lactic acid bacteria and refers to lactic acid bacteria isolated from fermented foods of plant raw materials such as pickles and kimchi that have been ingested in the Orient. Vegetable lactic acid bacteria are more than 10 times more varieties than general animal lactic acid bacteria and have excellent adaptability to the external environment. That is, it is a strain that can grow in an environment with high salt concentration and low pH, such as pickles, or in an environment with many antibacterial substances such as garlic, such as kimchi. Kimchi in Korea has high salt content, low pH, and high content of natural antibacterial substances. Therefore, various kinds of bacteria isolated from kimchi are representative vegetable lactic acid bacteria, and thus, mature kimchi is a representative report of vegetable lactic acid bacteria (POLAB).

이러한 특징을 가진 식물성 유산균을 섭취할 경우에는 동물성 유산균과 달리 위산에 대한 저항성이 강하여 위에서의 생존율이 높고, 장까지 생존상태로 도달하는 수가 많다. 또한 척박한 환경에서 생육하기 때문에 각종 생리활성 물질의 생산력이 뛰어난 경우가 많다. 그 대표적인 물질로는 항균펩타이드, 면역증강물질 및 가바(GABA) 등을 꼽을 수 있다.In the case of ingesting vegetable lactic acid bacteria having such characteristics, unlike animal lactic acid bacteria, resistance to gastric acid is high, the survival rate in the stomach is high, and the intestine survives in many cases. In addition, because they grow in a harsh environment, the productivity of various bioactive substances is often excellent. Representative materials include antimicrobial peptides, immune enhancing substances and GABA.

유산균은 일반적으로 효소의 생산을 위해서 사용하는 미생물은 아니며 대부분의 효소는 바실러스나 곰팡이를 이용하여 생산되어진다. 특히 프로테아제의 활성을 강하게 나타내는 균주는 된장 및 청국장에서 분리된 바실러스 sp.가 대표적으로 알려져 있다. 그러나 바실러스 속 균주의 발효 도중 생산되는 프로테아제를 이용한 발효식품의 제조에는 문제점이 있다. 우선 프로테아제에 의하여 단백질이 분해되어 생성되는 향기 성분이 매우 독특하여 식품에 적용시키기 어렵다는 것이다. 물론 된장 또는 청국장의 경우 고유의 냄새를 이용하여 섭취하는 제품으로 큰 문제가 되고 있지 않았지만 최근 들어 청국장의 일반화를 위하여 냄새가 적게 발생하는 균주를 적용시키기 위한 연구가 진행되고 있다. 그러나 냄새가 적은 청국장의 경우 발효 시간을 줄임으로써 생성된 프로테아제의 작용을 적게 하는 공정이 대부분이며 프로테인의 분해를 진행하면서도 향이 적은 균주를 개발, 적용한 경우는 많지 않다고 할 수 있다. 따라서 바실러스를 이용한 발효제품은 아직 향에서 발생하는 문제를 완전히 해결하지 못하고 있다.Lactic acid bacteria are generally not microorganisms used to produce enzymes, and most enzymes are produced using Bacillus or mold. In particular, strains showing strong protease activity are known as Bacillus sp. Isolated from Doenjang and Cheonggukjang. However, there is a problem in the production of fermented foods using protease produced during fermentation of Bacillus strains. First of all, the fragrance component produced by the breakdown of protein by protease is very unique and difficult to apply to food. Of course, in the case of Doenjang or Cheonggukjang, it is not a big problem as a product ingested by using the inherent smell, but recently, research is being conducted to apply strains that generate less smell for generalization of Cheonggukjang. However, in the case of Cheonggukjang, which has a low odor, most of the processes reduce the action of the produced protease by reducing the fermentation time. Therefore, fermented products using Bacillus have not yet completely solve the problem that occurs in the fragrance.

또한 국내의 소비자들의 생균섭취와 관련된 제품은 그 대부분을 유산균에 초점을 맞추어 생각하고 있다고 할 수 있다. 이는 국내에서 최초로 음용하는 생균제품이 요구르트를 기본으로 하여 시장에 정착을 하였기 때문이다. 실제로 된장 및 청국장, 심지어는 김치를 통하여 음용하게 되는 생균은 크게 인식하지 못하고 있다.In addition, most of the products related to the intake of live bacteria of domestic consumers focus on lactic acid bacteria. This is because the first probiotic product to drink in Korea has settled in the market based on yogurt. In fact, the live bacteria that are consumed through doenjang, cheonggukjang, and even kimchi are not widely recognized.

따라서 프로테아제를 생산하는 유산균을 이용하여 기능성을 갖는 제품을 개발한다면 국내는 물론 세계적으로 가치를 인정받을 것이다. 본 발명자들은 이전의 연구 과정을 통하여 글루탐산을 가바로 전환시키는 식물성 유산균을 이미 확보한 상태이다. 또한 국내의 젓갈류를 탐색한 결과 프로테아제 활성을 나타내는 유산균을 확보할 수 있었다.Therefore, the development of a functional product using lactic acid bacteria that produce protease will be recognized as a value domestically and globally. The present inventors have already secured the plant lactic acid bacteria that convert glutamic acid to Gabba through the previous research process. In addition, as a result of searching for domestic salted fish, lactic acid bacteria showing protease activity could be obtained.

가바와 관련된 특허는 많지만 대부분이 건조방법에 의하여 차의 가바 함량을 증가시키는 방법(등록번호 10-0235110 및 10-0367055) 및 가바의 각종 효능과 관련된 특허(출원번호 10-2001-0009589 및 10-2000-0086507)가 대부분이고, 가바의 생산과 관련된 특허는 발아 조건을 조절하여 현미의 가바 함량을 증가시키는 방법(출 원번호 10-2003-0020882 및 10-2001-0037685) 등과 단일 유산균을 이용하여 외부에서 첨가된 글루탐산을 가바로 전환시키는 방법(출원번호 10-2002-0027264) 등에 국한되어 있다. 따라서 두 가지 기능을 갖는 유산균을 이용하여 천연적으로 가바를 생성하는 본 발명에서 추구하고자 하는 바와는 구성이나 기능면에서 많은 차이가 있다고 할 수 있다.There are many patents related to GABA, but most of them are methods for increasing the GABA content of tea by drying methods (Registration Nos. 10-0235110 and 10-0367055) and patents relating to various efficacy of GABA (Application Nos. 10-2001-0009589 and 10- 2000-0086507), and patents related to the production of Gabba use a single lactic acid bacterium, such as controlling germination conditions to increase the Gabb content of brown rice (Application Nos. 10-2003-0020882 and 10-2001-0037685). It is limited to the method of converting externally added glutamic acid to Gabba (application number 10-2002-0027264). Therefore, it can be said that there are many differences in terms of configuration and function from those intended to be pursued in the present invention, which naturally produce Gabba using lactic acid bacteria having two functions.

위에 적은 바에 의하여 어느 정도 암시되었지만 본 발명의 목적은 프로테아제 생성능과 가바 생성능을 보유한 식물성 유산균을 이용하여 가바를 포함하는 발효물을 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.Although somewhat implied by the above, it is an object of the present invention to provide a method for producing a fermentation product comprising Gabba using a plant lactic acid bacterium having protease producing ability and Gaba producing ability.

본 발명의 다른 목적은 외부로부터의 글루탐산 첨가 없이 천연가바를 포함하는 발효물을 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for producing a fermentation product comprising natural gaba without addition of glutamic acid from the outside.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법에 따라 제조된 가바 함유 발효물을 포함하는 식품 또는 음료를 제공하는 데 있다.Still another object of the present invention is to provide a food or beverage comprising a Gaba-containing fermented product prepared according to the above production method.

본 발명자들은 프로테아제 생성능과 가바 생성능을 보유한 식물성 유산균을 이용하여 천연가바의 생산시스템을 구축하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 단백질 구성 성분에 글루탐산을 포함하는 원료를 주성분으로 하여 천연적으로 가바 성분을 포함하는 발효물의 제조방법을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors made diligent research efforts to build a natural gaba production system using plant lactic acid bacteria having protease generating ability and gaba generating ability. As a result, this invention was completed by confirming the manufacturing method of the fermentation product which naturally contains a Gaba component using the raw material containing glutamic acid as a protein component as a main component.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 기본적으로, 프로테아제 생성능 및 가바 생성능을 가진 식물성 유산균의 이단 발효를 이용하여 천연가바(GABA) 함유 발효물을 제조하는 것을 특징으로 한다.The present invention for achieving the above object is basically characterized in that the production of natural GABA (GABA) -containing fermentation using two-stage fermentation of vegetable lactic acid bacteria having protease and ability to produce Gaba.

구체적으로 본 발명은 다음과 같은 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.Specifically, the present invention is characterized by including the following steps.

(a) 글루탐산을 함유하는 원료를 포함하는 배지를 준비하는 단계;(a) preparing a medium comprising a raw material containing glutamic acid;

(b) 상기 배지에 프로테아제 생성능을 가진 유산균을 접종시키는 단계;(b) inoculating the medium with lactic acid bacteria having protease-producing ability;

(c) 상기 유산균을 배양하여 글루탐산을 함유하는 발효물을 생산하는 단계;(c) culturing the lactic acid bacteria to produce a fermentation product containing glutamic acid;

(d) 상기 발효물에 가바 생성능을 가진 식물성 유산균을 접종시키는 단계; 및(d) inoculating the fermented product with the vegetable lactic acid bacteria having the ability to produce Gabba; And

(e) 상기 유산균을 배양하여 가바를 함유하는 발효물을 생산하는 단계.(e) culturing the lactic acid bacteria to produce a fermentation product containing gabba.

이때 상기 배지의 제조 단계 (a)에서 글루탐산을 함유하는 원료는 글루탐산을 구성성분으로 하는 단백질이 함유된 소재인 것을 특징으로 한다. 더 구체적으로 글루탐산을 구성성분으로 하는 단백질이 함유된 소재는 토마토 또는 미강인 것을 특징으로 한다.At this time, the raw material containing glutamic acid in the production step (a) of the medium is characterized in that the raw material containing a protein containing glutamic acid as a component. More specifically, the material containing a protein comprising glutamic acid is characterized in that the tomato or rice bran.

또한 상기 단계 (b)에 접종되는 유산균은 락토바실러스 속 균주인 것을 특징으로 한다. 이 균주는 바람직하게는, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 호모히오치(Lactobacillus homohiochii), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 또는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 중의 어느 하나이다.In addition, the lactic acid bacteria inoculated in step (b) is characterized in that the strain of the genus Lactobacillus . This strain is preferably a Lactobacillus para casei (Lactobacillus paracasei), Lactobacillus casei (Lactobacillus casei), Lactobacillus helveticus carcass (Lactobacillus helveticus), Lactobacillus Homo Hi Ochi (Lactobacillus homohiochii), Lactobacillus pento suspension is any of (Lactobacillus pentosus), Lactobacillus Planta room (Lactobacillus plantarum), Lactobacillus momentum spread (Lactobacillus fermentum) or Lactobacillus brevis (Lactobacillus brevis).

또한 상기 단계 (d)에 접종되는 식물성 유산균은 락토바실러스 속과 비피도박테리움 속 중의 어느 하나에 속하는 균주인 것을 특징으로 한다. 이 균주는 바람직하게는, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 브크너리(Lactobacillus buchneri),락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 또는 락토코코스 코코스 (Lactococcus lactis) 중의 어느 하나인 것을 특징으로 한다.In addition, the plant lactic acid bacteria inoculated in step (d) belong to any one of the genus Lactobacillus and Bifidobacterium It is characterized in that the strain. This strain is preferably a Lactobacillus four K (Lactobacillus sakei), Lactobacillus para casei (Lactobacillus paracasei), Lactobacillus beukeu Nourishing (Lactobacillus buchneri), Lactobacillus brevis (Lactobacillus brevis) or Lactobacillus Coconut Cocos (Lactococcus lactis) It is characterized in that any one of.

본 발명은 또한 위의 제조방법에 따라 제조된 천연가바를 포함하는 식품 또는 음료인 것을 특징으로 한다.The present invention is also characterized in that the food or beverage containing natural gabar prepared according to the above manufacturing method.

본 발명의 발명자들은 천연적으로 가바가 함유된 발효물을 개발하고자 여러 가지 방법을 시도해 보았다. 그 결과 프로테아제 생성능과 가바 생성능을 갖는 유산균을 이용하여 글루탐산을 구성 성분으로 하는 원료를 발효하는 경우에 천연가바를 효율적으로 획득할 수 있음을 확인하였다.The inventors of the present invention have tried various methods to develop fermented products naturally containing Gabba. As a result, it was confirmed that natural gaba can be efficiently obtained when fermenting a raw material comprising glutamic acid using a lactic acid bacterium having a protease generating ability and a gaba generating ability.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.The features and advantages of the present invention are summarized as follows.

(1) 본 발명은 글루탐산을 함유하는 단백질이 포함된 각종 소재를 주원료로 하여 프로테아제 활성을 보유한 유산균과 글루타메이트 디카르복실라아제 활성을 보유한 식물성 유산균을 이용하여 천연적으로 가바 함량이 증가된 발효물을 제조하는 방법을 제공한다.(1) The present invention is a fermentation product of which the content of Gaba is naturally increased by using lactic acid bacteria having protease activity and vegetable lactic acid bacteria having glutamate decarboxylase activity using various materials including glutamic acid-containing protein as main ingredients. It provides a method of manufacturing.

(2) 본 발명의 방법에 의해 수득한 발효물은 식물성 유산균이 생산하는 유기산 및 가바를 함유함으로써 유산균 발효물의 장점뿐 아니라 가바라는 생리활성 물질이 함유된 새로운 개념의 발효 제품이라고 할 수 있다. (2) The fermented product obtained by the method of the present invention can be said to be a fermentation product of a new concept that contains not only the advantages of the lactic acid bacteria fermentation, but also the bioactive substance called gabara, by containing the organic acid and gava produced by the vegetable lactic acid bacteria.

실시예를 기술하기에 앞서 본 발명의 방법을 각각의 단계에 따라 상세하게 설명하면 다음과 같다.Prior to describing the embodiments, the method of the present invention will be described in detail with each step.

단계 (a) : 배지의 제조Step (a): Preparation of Medium

본 발명의 방법에 따르면, 글루탐산을 구성성분으로 포함하는 단백질을 함유한 성분을 이용하여 프로테아제 생성 유산균이 성장할 수 있는 배지를 제조한다.According to the method of the present invention, a medium capable of growing a protease-producing lactic acid bacteria is prepared using a component containing a protein including glutamic acid as a component.

본 발명에서 배지를 제조하는 데 이용되는 소재는 글루탐산이 함유된 소재라면 모두 사용할 수 있다. 토마토 등의 과채류, 미강 등의 원료를 모두 사용할 수 있는데 수분함량이 많은 경우는 그냥 사용이 가능하고 미강 등의 원료는 물로 추출하여 사용하면 된다.Any material used to prepare a medium in the present invention can be used as long as the material containing glutamic acid. Raw materials such as tomatoes and other vegetables and rice bran can be used. If there is a lot of water, it can be used. Raw materials such as rice bran can be extracted with water.

주원료 이외에 프로테아제 생성 유산균의 생육을 위하여 탄소원, 질소원, 미량원소 등을 추가적으로 혼합할 수 있다. 본 발명의 배지에서 탄소원으로 이용 가능한 것은, 글루코오스, 수크로오스, 말토오스, 프럭토오스, 락토오스, 자일로오스, 갈락토오스, 아라비노오스 또는 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, 바람직하게는, 수크로스, 프럭토스, 글루코스, 갈락토스, 아라비노스 및 락토스이 고, 보다 바람직하게는 수크로스, 프럭토스 및 글루코스이며, 가장 바람직하게는 수크로스와 글루코스이다. 탄소원의 사용량은 바람직하게는, 상기 천연성분의 1-20 중량%이고, 보다 바람직하게는 1-10 중량%이며, 가장 바람직하게는 1-4 중량%이다.In addition to the main raw material, for the growth of protease-producing lactic acid bacteria, carbon sources, nitrogen sources, trace elements, etc. may be additionally mixed. Available as a carbon source in the medium of the present invention is selected from the group consisting of glucose, sucrose, maltose, fructose, lactose, xylose, galactose, arabinose or a combination thereof, preferably sucrose, fructose Toxins, glucose, galactose, arabinose and lactose, more preferably sucrose, fructose and glucose, most preferably sucrose and glucose. The amount of carbon source used is preferably 1-20% by weight of the natural component, more preferably 1-10% by weight, most preferably 1-4% by weight.

본 발명의 배지에서 질소원으로 이용 가능한 것은, 효모추출물, 소이톤(soytone), 펩톤, 비프추출물 (beef extract), 트립톤, 카시톤 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 효모추출물, 펩톤, 트립톤 및 소이톤이고, 보다 바람직하게는 효모추출물 및 소이톤이고, 가장 바람직하게는 효모추출물이다. 질소원의 사용량은 바람직하게는, 상기 천연성분의 1-20 중량%이고, 보다 바람직하게는 1-10 중량%이며, 가장 바람직하게는 1-4 중량%이다.Usable as a nitrogen source in the medium of the present invention is selected from the group consisting of yeast extract, soytone, peptone, bee extract, tryptone, cachetone and combinations thereof, preferably yeast extract, Peptone, tryptone and soyton, more preferably yeast extract and soytone, most preferably yeast extract. The amount of the nitrogen source is preferably 1-20% by weight of the natural component, more preferably 1-10% by weight, most preferably 1-4% by weight.

본 발명의 배지에서 미량원소로 이용 가능한 것은, 마그네슘 설페이트, 소듐아세테이트, 망가닉 설페이트, 페릭 설페이트, 칼슘 클로라이드, 폴리 소르베이트, 포타슘 포스페이트 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 미량원소의 사용량은 바람직하게는, 상기 천연성분의 0.001-1 중량%이고, 보다 바람직하게는 0.01-1 중량%이며, 가장 바람직하게는 0.03-0.5 중량%이다.Usable as trace elements in the medium of the present invention are selected from the group consisting of magnesium sulfate, sodium acetate, manganese sulfate, ferric sulfate, calcium chloride, polysorbate, potassium phosphate and combinations thereof. The amount of the trace element used is preferably 0.001-1% by weight of the natural component, more preferably 0.01-1% by weight, most preferably 0.03-0.5% by weight.

주원료 및 부원료가 혼합된 배지는 살균 공정을 거치게 된다. 살균은 바람직하게는 60-130℃, 보다 바람직하게는 80℃-121℃ 범위에서 바람직하게는 5-40분, 보다 바람직하게는 5-30분 동안 실시된다. The medium mixed with the main and subsidiary materials is subjected to a sterilization process. Sterilization is preferably carried out in the range 60-130 ° C., more preferably 80 ° C.-121 ° C., preferably for 5-40 minutes, more preferably 5-30 minutes.

단계 (b) : 글루탐산 함유 배지에 유산균 접종Step (b): Lactobacillus Inoculation into Glutamic Acid-Containing Medium

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기의 단계에서 제조되어 살균이 끝 배지에 유산균을 접종하게 되는데 본 발명에서 사용될 수 있는 유산균은 프로테아제를 이용하여 배지 중의 프로테인을 분해하여 글루탐산을 생산할 수 있는 한 제한은 없으며, 바람직하게는 락토바실러스 속 균주이고, 가장 바람직하게는 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei), 락토바실러스 헬베티커스 (Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 호모히오치 (Lactobacillus homohiochii), 락토바실러스 펜토서스 (Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 플라타룸 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the lactic acid bacteria which are prepared in the above step and sterilized are inoculated into the medium, and the lactic acid bacteria which can be used in the present invention are limited as long as they can produce glutamic acid by decomposing the protein in the medium using a protease. is not, preferably a Lactobacillus spp, and most preferably Lactobacillus para casei (Lactobacillus paracasei), Lactobacillus casei (Lactobacillus casei), Lactobacillus helveticus carcass (Lactobacillus helveticus), Lactobacillus Homo Hi Ochi (Lactobacillus homohiochii), a Lactobacillus pento suspension (Lactobacillus pentosus), Lactobacillus Plastic tarum (Lactobacillus plantarum), Lactobacillus momentum spread (Lactobacillus fermentum) and Lactobacillus brevis (Lactobacillus brevis).

접종균을 종균 배양하는 배지로는 MRS 브로스 배지가 적당하며 30℃에서 16-48시간 배양하면 원하는 균의 활성을 얻을 수 있다. 배지에 접종되는 유산균의 접종량은 접종 후의 초기 균수가 105-109 cfu/g 또는 105-109 cfu/ml가 되게 하는 것이 바람직한데, 그 이하의 균수에서는 프로테아제를 생성하는데 많은 시간이 소요되어 제품 생산을 위한 배양시간이 길어지며 그 이상의 균을 접종하기 위해서는 종균의 생산에 부담이 된다. As a medium for spawning the inoculating bacteria, MRS broth medium is suitable, and the desired bacterial activity can be obtained by incubating at 30 ° C. for 16-48 hours. The amount of lactic acid bacteria inoculated into the medium should be 10 5 -10 9 cfu / g or 10 5 -10 9 cfu / ml after the inoculation, but a lower number of bacteria takes a long time to produce protease. As a result, the incubation time for the production of the product is long, and inoculation of more bacteria is a burden on the production of the spawn.

단계 (c): 글루탐산 함유 발효물의 생산Step (c): Production of Glutamic Acid-Containing Fermentation

접종이 끝난 배지는 골고루 혼합되어 20-40℃에서 발효를 진행시키는데 그 이하의 온도에서는 발효가 쉽게 일어나지 않으며, 그 이상의 온도에서는 열에 약한 유산균이 생육하지 못함으로써 원하는 발효물을 생산할 수 없다. 유산균을 배양하는 시간은 8-90시간이 바람직하고, 보다 바람직하게는 12-72시간이고, 가장 바람직하게는 16-48시간이다.The inoculated medium is evenly mixed and the fermentation proceeds at 20-40 ° C., but fermentation does not easily occur at a temperature below that, and the lactic acid bacteria that are weak in heat cannot be grown to produce a desired fermentation product. The time for culturing the lactic acid bacteria is preferably 8-90 hours, more preferably 12-72 hours, and most preferably 16-48 hours.

단계 (d): 글루탐산 함유 발효물에 식물성 유산균을 접종하는 단계 Step (d): inoculating the vegetable lactic acid bacteria into the glutamic acid-containing fermentation product

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 글루탐산이 포함된 발효물에 유산균을 접종하게 되는데 본 발명에서 사용될 수 있는 식물성 유산균은 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase)를 이용하여 발효물에 함유되어 있는 글루탐산(glutamate)을 가바로 전환시킬 수 있는 능력을 갖는 것이다. 본 발명에 이용되는 유산균은 글루타메이트 디카르복실라아제를 발현하는 한 제한은 없으며, 바람직하게는 락토바실러스 속과 비피도박테리움 균주이고, 가장 바람직하게는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 브크너리(Lactobacillus buchneri),락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 및 락토코코스 코코스 (Lactococcus lactis)이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the lactic acid bacteria are inoculated into the fermentation product containing glutamic acid. The vegetable lactic acid bacteria that can be used in the present invention are glutamic acid contained in the fermentation product using glutamate decarboxylase. It has the ability to convert glutamate to gabba. The lactic acid bacteria used in the present invention are not limited as long as they express glutamate decarboxylase, and are preferably of the genus Lactobacillus and Bifidobacterium . Strain, and most preferably Lactobacillus four K (Lactobacillus sakei), Lactobacillus para casei (Lactobacillus paracasei), Lactobacillus beukeu Nourishing (Lactobacillus buchneri), Lactobacillus brevis (Lactobacillus brevis) and Lactobacillus Coconut Cocos (Lactococcus lactis) to be.

접종균을 종균 배양하는 배지로는 MRS 브로스 배지가 적당하며 30℃에서 16-48시간 배양하면 원하는 균의 활성을 얻을 수 있다. As a medium for spawning the inoculating bacteria, MRS broth medium is suitable, and the desired bacterial activity can be obtained by incubating at 30 ° C. for 16-48 hours.

글루탐산 함유 발효물에 접종되는 식물성 유산균의 접종량은 접종 후의 초기 균수가 107-109cfu/g 또는 107-109cfu/ml가 되게 하는 것이 바람직한데, 그 이하의 균수에서는 발효물에 함유된 프로테아제 생산 유산균에 의한 간섭에 의하여 2단계 의 발효가 진행되지 않을 수 있다. The inoculum of vegetable lactic acid bacteria inoculated into glutamic acid-containing fermentation should be 10 7 -10 9 cfu / g or 10 7 -10 9 cfu / ml after inoculation. Due to interference by the protease-producing lactic acid bacteria, the second stage of fermentation may not proceed.

단계 (e): 가바 함유 발효물의 생산단계Step (e): Production Step of Gaba-Containing Fermentation

2단계의 접종이 끝난 발효물은 골고루 혼합되어 20-40℃에서 발효를 진행시키는데 그 이하의 온도에서는 발효가 쉽게 일어나지 않으며, 그 이상의 온도에서는 열에 약한 유산균이 생육하지 못함으로써 원하는 발효물을 생산할 수 없다. 유산균을 배양하는 시간은 12-120시간이 바람직하고, 보다 바람직하게는 24-100시간이고, 가장 바람직하게는 48-90시간이다.The fermented product after the two-stage inoculation is mixed evenly and proceeds to fermentation at 20-40 ℃, and fermentation does not easily occur at temperatures below that, and at a higher temperature, lactic acid bacteria that are weak to heat do not grow to produce a desired fermentation product. none. The time for culturing the lactic acid bacteria is preferably 12-120 hours, more preferably 24-100 hours, and most preferably 48-90 hours.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 배지 중에 생성된 글루탐산의 50-100%의 가바 전환율, 보다 바람직하게는 70-100%, 보다 더 바람직하게는 80-100%, 가장 바람직하게는 90-100%의 가바 전환율을 나타낸다.According to a preferred embodiment of the invention, the Gabba conversion of 50-100% of the glutamic acid produced in the medium, more preferably 70-100%, even more preferably 80-100%, most preferably 90-100% Represents Gaba conversion of.

본 발명에 의해 제조된 가바함유 발효물은 유산균이 생산하는 유기산을 포함하며 제품의 풍미 및 산미에 가장 많은 영향을 미치며 여러 가지 생리활성을 나타낸다.Gaba-containing fermented product prepared by the present invention includes the organic acid produced by lactic acid bacteria and has the most influence on flavor and acidity of the product and shows various physiological activities.

이하 본 발명을 실시예와 함께 설명한다. 아래의 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described with examples. The following examples are only for illustrating the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. will be.

토마토를 사용하여 가바가 함유된 토마토 발효물을 제조하는 과정을 예로 들면 다음과 같은 과정을 밟는다. 각종 토마토 → 분쇄 → 살균 → (부원료 첨가) → 프로테아제 생성 유산균 접종 → 혼합 및 배양 → 식물성 유산균 추가 접종 → 혼합 및 배양.For example, the process of preparing tomato fermented tomato fermented products using tomato is as follows. Various tomatoes → crushing → sterilization → (additional ingredients) → protease-producing lactic acid bacteria inoculation → mixing and incubation → further inoculation of vegetable lactic acid bacteria → mixing and culture.

실시예 1: 토마토를 이용한 배지의 제조Example 1 Preparation of Media Using Tomato

농협에서 구매한 토마토를 이용하여 냉수에 3회 세척하여 표면에 묻은 먼지 및 이물질을 제거하였다. 세척이 끝난 토마토 1 kg을 분쇄기를 사용하여 5분간 분쇄한 후 탄소원으로 토마토 무게의 2%의 sucrose를 첨가한 후 80℃에서 30분간 살균을 진행하여 토마토 배지를 완성하였다. 토마토에는 많은 양의 글루탐산이 유리된 형태, 또는 단백질의 구성성분으로 존재하기 때문에 천연가바의 생산 원료로 많은 장점을 갖는다. Using the tomato purchased from the Agricultural Cooperatives three times in cold water to remove dirt and foreign matter on the surface. After 1 kg of washed tomatoes were pulverized using a grinder for 5 minutes, 2% sucrose of tomato weight was added as a carbon source, followed by sterilization at 80 ° C. for 30 minutes to complete the tomato medium. Tomato has a number of advantages as a raw material for the production of natural gaba because a large amount of glutamic acid is present in a free form, or as a component of protein.

실시예 2: 미강을 이용한 배지의 제조Example 2: Preparation of Medium Using Rice Bran

농협 직영 도정 공장(RPC)으로부터 구입한 미강 1 kg을 3 L의 냉수에 세척한 후 10 L의 물에 침지하여 30 rpm으로 교반하면서 60℃에서 12시간 동안 추출하였다. 추출이 끝난 미강 추출액을 원심분리하여 고형분을 제거한 후 수크로오스 3%, 효모추출물 2%를 첨가하고 121℃에서 15분간 살균하여 가바를 생산할 수 있는 배지를 제조하였다. 1 kg of rice bran purchased from Nonghyup direct mill (RPC) was washed in 3 L of cold water and then immersed in 10 L of water and extracted at 60 ° C. for 12 hours while stirring at 30 rpm. The extracted rice bran extract was centrifuged to remove solids, and then 3% sucrose and 2% yeast extract were added and sterilized at 121 ° C. for 15 minutes to prepare a medium capable of producing Gabba.

실시예 3. 글루탐산 함유 토마토 발효물의 생산 Example 3 Production of Glutamic Acid-Containing Tomato Fermentation

실시예 1에서와 같은 방법으로 준비된 2개의 토마토 배지를 삼각플라스크에 1 kg씩 담고 18시간 동안 MRS 브로스(deMan Rogosa Sharpe broth)에서 배양한 락토바실러스 카제이를 최종 균 농도가 5 × 108 cfu/g 되도록 접종한 후 72시간 동안 배양하면서 배양물 중의 pH변화, protease 활성, cell 수 및 글루탐산 함량 변화를 살펴보았다. Two tomato medium prepared in the same manner as in Example 1 in a Erlenmeyer flask each containing 1 kg of Lactobacillus casei incubated in MRS broth (deMan Rogosa Sharpe broth) for 18 hours to a final bacterial concentration of 5 × 10 8 cfu / After inoculation to g, incubation for 72 hours was carried out to examine the pH change, protease activity, cell number and glutamic acid content in the culture.

프로테아제 활성 측정은 쿤니즈법 (Kunitz method)를 변형하여 사용하였다. 프로테아제 활성을 갖는 유산균을 MRS 배지에서 배양한 후 그 상등액을 취하여 조효소액으로 사용하고, 단백질 기질로는 0.5% 카제인 용액을 사용하여, 조효소액과 카제인 용액을 혼합한 후 37℃에서 1시간 동안 반응 한 후 15% 트리클로로아세틱산을 첨가하여 반응을 종결 한 후 그 상등액을 취하여 280nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다. Protease activity measurement was used by modifying the Kunitz method. After lactic acid bacteria having protease activity were cultured in MRS medium, the supernatant was taken and used as a coenzyme solution, and 0.5% casein solution was used as a protein substrate. The coenzyme solution and casein solution were mixed and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After completion of the reaction by adding 15% trichloroacetic acid, the supernatant was taken and analyzed by measuring absorbance at 280 nm.

글루탐산의 함량은 RP-HPLC 법을 변형한 아미노산 분석법을 이용하였다. 우선 시료를 8000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후 상등액을 membrane filter로 여과하여 적정 농도로 희석하였다. 이렇게 준비된 시료는 o-phthaldialdehyde (OPA)를 이용한 유도체화 과정 후 RP-HPLC에 적용되었다. HPLC column으로는 XTerra column(Waters: RP18 5 m x 4.6 mm x 150 mm)을 사용하였으며, 이동상으로는 0.05 M sodium acetate(pH 7.2)를 용매 A로, 그리고 0.1 M sodium acetate, acetonitrile(HPLC grade) 그리고 methanol(HPLC grade)이 각각 46:44:10(v/v)으로 섞인 것(pH 7.2)을 용매 B로 사용하였다. 이동상의 농도 구배는 용매 A를 100%로 하여 분석을 시작해서 30분 경과 후에는 용매 B가 100%가 되고, 40분 경과 후까지 용매 B가 100%, 45분 경과 후까지는 다시 용매 A가 100%가 되게 하였으며, 60분 후까지 용매 A가 100%가 되도록 조절하였다. 이동상의 유속은 1 mL/min로 고정하였고, 358 nm의 U.V. detector로 클루탐산을 검출하였다.The content of glutamic acid was determined using an amino acid assay modified from RP-HPLC. First, the sample was centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes, and then the supernatant was filtered through a membrane filter and diluted to an appropriate concentration. The prepared samples were subjected to RP-HPLC after derivatization with o- phthaldialdehyde (OPA). As an HPLC column, an XTerra column (Waters: RP18 5 mx 4.6 mm x 150 mm) was used.For mobile phase, 0.05 M sodium acetate (pH 7.2) was added as solvent A, and 0.1 M sodium acetate, acetonitrile (HPLC grade) and methanol. (HPLC grade) mixed at 46:44:10 (v / v) (pH 7.2) was used as solvent B. The concentration gradient of the mobile phase was 100% of solvent A. After 30 minutes, solvent B became 100%. After 40 minutes, solvent B was 100%. After 45 minutes, solvent A was 100 again. % And solvent A was adjusted to 100% until 60 minutes later. The flow rate of the mobile phase was fixed at 1 mL / min and clotamic acid was detected by a UV detector at 358 nm.

<표 1> 시간에 따른 세포 수, pH 및 글루탐산 함량의 변화 측정Table 1 Measurement of changes in cell number, pH and glutamic acid content over time

발효시간Fermentation time 세포수(cfu/ml)Cell number (cfu / ml) 발효 후 pHPH after fermentation Protease 활성
(mg/mg-protein)
Protease Activity
(mg / mg-protein)
글루탐산 함량
(%, w/w)
Glutamic acid content
(%, w / w)
12시간12 hours 3.7×109 3.7 × 10 9 4.64.6 0.0090.009 0.250.25 24시간24 hours 3.6×109 3.6 × 10 9 4.54.5 0.0130.013 0.330.33 36시간36 hours 3.3×109 3.3 × 10 9 4.54.5 0.0130.013 0.410.41 48시간48 hours 2.5×109 2.5 × 10 9 4.54.5 0.0050.005 0.420.42 72시간72 hours 2.3×109 2.3 × 10 9 4.54.5 0.0010.001 0.410.41

프로테아제 활성은 트립신 활성으로 표현하였다. Protease activity is expressed as trypsin activity.

[트립신 1mg/mL : 1800 BAEE U/mg (BAEE : N-Benzoyl-L-Arginine-Ethyl-Ester)]Trypsin 1mg / mL: 1800 BAEE U / mg (BAEE: N-Benzoyl-L-Arginine-Ethyl-Ester)

표 1에서 보듯이, 접종한 유산균의 생육은 24시간이면 거의 최고값을 나타내며 pH의 변화도 24시간 이후에는 거의 나타나지 않는다. pH는 토마토에 함유된 글루탐산이 유리되면서 초기에는 감소하는 경향을 보이나 유기산에 의하여 일단 pH가 낮아진 상태에서 큰 변화는 나타내지 않는다. 글루탐산 함량의 경우 발효 후 36시간까지 계속 상승하다 그 이후에는 증가하지 않는데 이는 프로테아제의 활성이 발효 36시간 까지 증가하여 토마토배지의 글루탐산을 생성한 후 이후 autolysis 등에 의하여 프로테아제 활성이 감소하고 또한 원료내의 글루탐산이 대부분 유리되었기 때문으로 생각된다.As shown in Table 1, the growth of the inoculated lactic acid bacteria showed almost the highest value after 24 hours, and the change in pH hardly appeared after 24 hours. The pH tends to decrease initially as the glutamic acid contained in the tomato is released, but does not show a large change when the pH is lowered by the organic acid. The content of glutamic acid continues to increase until 36 hours after fermentation, but does not increase after that. The activity of protease increases up to 36 hours of fermentation to produce glutamic acid in tomato medium, after which the protease activity decreases by autolysis and the glutamic acid in the raw material. I think this is because most of them are free.

실시예 4. 가바 함유 토마토 발효물의 생산 Example 4 Production of Gaba-Containing Tomato Fermentation

실시예 3에서와 같은 방법으로 36시간 발효가 진행된 토마토 발효물에 18시간 동안 MRS 브로스에서 배양한 락토바실러스 사케이(KFCC-11321)를 최종 균 농도가 3×108 cfu/g 되도록 접종한 후 72시간 배양한 후 발효물의 pH 변화 및 가바 함량을 살펴보았다(표 2). After inoculating the tomato fermentation product subjected to 36 hours fermentation in the same manner as in Example 3, Lactobacillus sakei (KFCC-11321) cultured in MRS broth for 18 hours so that the final bacterial concentration is 3 × 10 8 cfu / g After 72 hours of incubation, the pH change and the Gaba content of the fermentation were examined (Table 2).

가바의 함량은 RP-HPLC 법을 변형한 아미노산 분석법을 이용하여 글루탐산의 분석과 동일한 방법을 사용하였다.The content of Gaba was the same as the analysis of glutamic acid using an amino acid method modified from the RP-HPLC method.

<표 2> 유산균 추가 접종 이후의 토마토 발효물의 GABA 생성량 <Table 2> GABA Production of Tomato Fermentation after Lactic Acid Bacteria Supplementation

추가 발효시간(hrs)Additional fermentation time (hrs) pHpH GABA함량
(%, w/v)
GABA content
(%, w / v)
00 4.64.6 0.000.00 88 4.64.6 0.010.01 1616 4.334.33 0.050.05 2424 4.264.26 0.140.14 3636 4.504.50 0.260.26 4848 4.904.90 0.380.38 6060 4.954.95 0.400.40 7272 4.954.95 0.400.40

표 2에서 보듯이 프로테아제 생산 유산균에 의하여 토마토에 천연적으로 생성된 글루탐산이 추가적으로 접종한 가바 전환균주에 의하여 가바로 전환되는 것을 알 수 있었다. 토마토에 천연적으로 포함되어 있는 글루탐산은 균의 생육이 이루어진 후 발효 16시간 이후부터 가바 생산이 대수적으로 증가함을 볼 수 있으며, 가바의 생성이 이루어짐에 따라 pH가 상승함을 확인할 수 있었다. As shown in Table 2, it was found that glutamic acid naturally produced in tomatoes by protease-producing lactic acid bacteria was converted to Gabba by additionally inoculated Gaba conversion strains. Glutamic acid naturally contained in tomatoes can be seen that the production of Gaba increases logarithmically after 16 hours of fermentation, and the pH increases as the production of Gaba occurs.

실시예 5. 글루탐산 함유 미강 발효물의 생산 Example 5 Production of Glutamic Acid-Containing Rice Bran Ferment

실시예 2에서와 같은 방법으로 준비된 2개의 미강 배지를 삼각플라스크에 1 kg씩 담고 18시간 동안 MRS 브로스(deMan Rogosa Sharpe broth)에서 배양한 락토바실러스 카제이를 최종 균 농도가 5 × 108 cfu/g 되도록 접종한 후 72시간 동안 배양하면서 배양물 중의 pH변화, protease 활성, cell 수 및 글루탐산 함량 변화를 살펴보았다. Lactobacillus casei incubated in MRS broth (deMan Rogosa Sharpe broth) for 18 hours containing 1 kg of two rice bran medium prepared in the same manner as in Example 2 in a Erlenmeyer flask, the final bacterial concentration was 5 × 10 8 cfu / After inoculation to g, incubation for 72 hours was carried out to examine the pH change, protease activity, cell number and glutamic acid content in the culture.

<표 3> 시간에 따른 세포 수, pH 및 글루탐산 함량의 변화 측정TABLE 3 Determination of changes in cell number, pH and glutamic acid content over time

발효시간Fermentation time 세포수(cfu/ml)Cell number (cfu / ml) 발효 후 pHPH after fermentation Protease 활성
(mg/mg-protein)
Protease Activity
(mg / mg-protein)
글루탐산 함량
(%, w/w)
Glutamic acid content
(%, w / w)
12시간12 hours 3.5×109 3.5 × 10 9 4.54.5 0.0050.005 0.300.30 24시간24 hours 3.4×109 3.4 × 10 9 4.34.3 0.0100.010 1.331.33 36시간36 hours 3.5×109 3.5 × 10 9 4.34.3 0.0140.014 1.851.85 48시간48 hours 3.0×109 3.0 × 10 9 4.44.4 0.0040.004 1.851.85 72시간72 hours 2.5×109 2.5 × 10 9 4.34.3 0.0010.001 1.861.86

프로테아제 활성은 트립신 활성으로 표현하였다. Protease activity is expressed as trypsin activity.

[트립신 1mg/mL : 1800 BAEE U/mg (BAEE : N-Benzoyl-L-Arginine-Ethyl-Ester)]Trypsin 1mg / mL: 1800 BAEE U / mg (BAEE: N-Benzoyl-L-Arginine-Ethyl-Ester)

표 3 에서 보듯이, 접종한 유산균의 생육은 24시간이면 거의 최고값을 나타 내며 pH의 변화도 24시간 이후에는 거의 나타나지 않는다. 이러한 결과는 실시예3에서와 같은 결과로, 유기산에 의하여 pH가 낮아진 상태에서 큰 변화는 나타내지 않는다. 글루탐산 함량의 경우 발효 후 36시간까지 계속 상승하다 그 이후에는 증가하지 않았다. As shown in Table 3, the growth of the inoculated lactic acid bacteria showed the highest value after 24 hours, and the change in pH hardly appeared after 24 hours. This result is the same as in Example 3, and does not show a large change in the pH lowered by the organic acid. The content of glutamic acid continued to rise up to 36 hours after fermentation and did not increase thereafter.

실시예 6. 가바 함유 미강 발효물의 생산Example 6 Production of Gaba-containing Rice Bran Fermentation

실시예 5에서와 같은 방법으로 36시간 발효가 진행된 미강 발효물에 18시간 동안 MRS 브로스에서 배양한 락토바실러스 사케이(KFCC-11321)를 최종 균 농도가 3×108 cfu/g 되도록 접종한 후 72시간 배양한 후 발효물의 pH 변화 및 가바 함량을 살펴보았다(표 4). After inoculating the rice bran fermentation product which had been fermented for 36 hours in the same manner as in Example 5, lactobacillus sakei (KFCC-11321) incubated in MRS broth for 18 hours so that the final bacterial concentration was 3 × 10 8 cfu / g. After 72 hours of incubation, the pH change and the Gaba content of the fermentation were examined (Table 4).

<표 4> 추가 접종에 따른 미강 발효물의 GABA 생성량 <Table 4> GABA Production of Rice Bran Fermentation by Additional Inoculation

발효시간Fermentation time pHpH GABA함량
(%, w/v)
GABA content
(%, w / v)
00 4.424.42 0.000.00 88 4.404.40 0.010.01 1616 4.204.20 0.060.06 2424 4.194.19 0.340.34 3636 4.204.20 0.710.71 4848 4.354.35 1.001.00 6060 4.384.38 1.011.01 7272 4.404.40 1.001.00

표 4에서 보듯이 미강에 천연적으로 포함되어 있는 글루탐산은 접종된 락토바실러스 사케이 균의 생육이 대수증식기 말기에 이르렀을 때 대수적으로 가바로 전환되어 가바 함량이 증가하였으며, 가바 함량이 증가함에 따라 배양액 중 pH가 증가함을 확인하였다. As shown in Table 4, glutamic acid, which is naturally contained in rice bran, was converted to Gabba algebraically when the growth of inoculated Lactobacillus Sakei bacteria reached the end of logarithmic growth, and the Gabba content increased. It was confirmed that the pH in the culture solution increased.

위에서 본 실시예로부터, 본 발명과 같이 프로테아제 생성능 및 가바 생성능을 가진 식물성 유산균의 이단 발효 방식을 이용하여, 글루탐산을 함유하는 단백질이 포함된 각종 소재를 주원료로 하여 천연적으로 가바 함량이 증가된 발효물을 효과적으로 제조할 수 있음이 실증되었다고 하겠다.From the above embodiment, using a two-stage fermentation method of vegetable lactic acid bacteria having protease generating ability and gaba generating ability as in the present invention, fermentation of naturally increased Gaba content with a variety of materials containing glutamic acid as a main raw material It is demonstrated that water can be produced effectively.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Therefore, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.

Claims (9)

다음의 단계를 포함하는, 프로테아제 생성능 및 가바 생성능을 가진 식물성 유산균의 이단 발효를 이용한 천연가바(GABA) 함유 발효물의 제조방법.A method for producing a natural GABA-containing fermented product using two-stage fermentation of vegetable lactic acid bacteria having protease-generating ability and gaba-forming ability, comprising the following steps. (a) 글루탐산을 함유하는 원료로서 토마토 또는 미강을 포함하는 배지를 준비하는 단계;(a) preparing a medium containing tomato or rice bran as a raw material containing glutamic acid; (b) 상기 배지에 프로테아제 생성능을 가진 유산균으로서 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 호모히오치(Lactobacillus homohiochii), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 또는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 중의 어느 하나를 접종하는 단계;(b) Lactobacillus para casei (Lactobacillus paracasei), Lactobacillus casei (Lactobacillus casei), Lactobacillus helveticus carcass (Lactobacillus helveticus), Lactobacillus Homo Hi Ochi (Lactobacillus homohiochii) as a lactic acid bacteria with a protease producing ability in the medium the step of immunization of any one of Lactobacillus pento suspension (Lactobacillus pentosus), Lactobacillus Planta room (Lactobacillus plantarum), Lactobacillus momentum spread (Lactobacillus fermentum) or Lactobacillus brevis (Lactobacillus brevis); (c) 상기 유산균을 배양하여 글루탐산을 함유하는 발효물을 생산하는 단계;(c) culturing the lactic acid bacteria to produce a fermentation product containing glutamic acid; (d) 상기 발효물에 가바 생성능을 가진 식물성 유산균으로서 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 브크너리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 또는 락토코코스 코코스(Lactococcus lactis) 중의 어느 하나를 접종하는 단계; 및(d) Lactobacillus four K (Lactobacillus sakei) a vegetable lactic acid bacteria with the GABA producing ability to the fermentation, Lactobacillus para casei (Lactobacillus paracasei), Lactobacillus beukeu Nourishing (Lactobacillus buchneri), Lactobacillus brevis (Lactobacillus brevis), or Inoculating any one of Lactococcus lactis ; And (e) 상기 유산균을 배양하여 가바를 함유하는 발효물을 생산하는 단계.(e) culturing the lactic acid bacteria to produce a fermentation product containing gabba. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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