KR101085203B1 - Phospholipid nanoparticles for delivery of drugs - Google Patents

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KR101085203B1
KR101085203B1 KR1020110030122A KR20110030122A KR101085203B1 KR 101085203 B1 KR101085203 B1 KR 101085203B1 KR 1020110030122 A KR1020110030122 A KR 1020110030122A KR 20110030122 A KR20110030122 A KR 20110030122A KR 101085203 B1 KR101085203 B1 KR 101085203B1
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오유경
박다의
유용희
최현우
변영로
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서울대학교산학협력단
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Abstract

PURPOSE: A cationic phospholipids liposome containing 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethyl phosphocholine(DOPC) and sterol compounds is provided to enhance drug delivery efficiency and to remarkably reduce cytotoxicity. CONSTITUTION: A composition for lung-specific drug delivery comprises a cationic phospholipids nanoparticles containing 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethyl phosphocholine(DOPC) and sterol compounds. The sterol compounds are 3b-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-cabamyl]cholesterol(DC-Chol), stigmasterol, campesterol, sitosterol, ergosterol, lanosterol, dinosterol, gorgosterol, avenasterol, saringosterol, or fucosterol. The drug is anticancer drug.

Description

의약 전달용 인지질 나노입자{Phospholipid nanoparticles for delivery of drugs}Phospholipid nanoparticles for delivery of drugs

본 발명은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 이하 'EDOPC'라 함) 및 스테롤(sterol)계 화합물을 포함하는 양이온성 인지질 나노입자, 상기 인지질 나노입자에 약물이 도입되어 있는 인지질 나노입자-약물 복합체, 상기 인지질 나노입자-약물 복합체를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, hereinafter referred to as 'EDOPC') and sterols A cationic phospholipid nanoparticle comprising a compound, a phospholipid nanoparticle-drug complex into which a drug is introduced into the phospholipid nanoparticle, and a pharmaceutical composition comprising the phospholipid nanoparticle-drug complex.

폐암은 치사율이 가장 높은 암이며, 흡연 인구의 증가로 점점 많아지는 추세이다. 종류에는 전이와 성장속도에 따라 크게 2가지로 분류되며, 소세포 폐암과 비소세포 폐암이 있다. 현재 폐암 치료의 방법으로는 항암제 투여가 많이 사용되고 있다. 최근 폐암 치료에 있어 항암제의 단독투여 방법을 보완하여 유전자 치료법과 항암제의 복합투여 방법을 이용한 항암 치료를 위해 제안되고 있다. 그 중 작은 간섭 리보핵산 (siRNA), 안티센스 올리고 핵산 (antisense oligonucleic acids), 플라스미드 데옥시리보 핵산 등은 최근 핵산 소재 의약으로서 산업적 중요성이 부각되고 있다. Lung cancer is the cancer with the highest mortality rate and is increasing due to an increase in the smoking population. There are two types according to metastasis and growth rate, and there are small cell lung cancer and non-small cell lung cancer. Currently, anticancer drugs are widely used as a method for treating lung cancer. Recently, in the treatment of lung cancer, it has been proposed for the anticancer treatment using a gene therapy method and a combination administration method of the anticancer agent by supplementing the chemotherapy alone method. Among them, small interfering ribonucleic acid (siRNA), antisense oligonucleic acids, plasmid deoxyribonucleic acid, and the like, have recently gained industrial importance as a medicine for nucleic acid.

핵산 물질의 경우 의약품으로 개발되기 위해서는 세포 또는 조직으로의 효율적인 전달(delivery)이 가장 먼저 해결되어야 할 과제이다. 핵산 물질의 세포 내 전달을 위해서는 바이러스성 벡터 또는 고분자나 나노 입자를 이용한 비바이러스성 벡터가 연구되고 있다. 이 중 바이러스성 벡터는 비 바이러스성 벡터보다 높은 유전자 전달효율을 가지는 장점이 있으나 바이러스 사용시의 안전성 문제로 사람에의 적용은 매우 제한되어 있다. 따라서 바이러스성 벡터보다 안전한 대안으로 비 바이러스성 벡터에 대한 개발이 진행 중이다. In the case of nucleic acid materials, efficient delivery to cells or tissues is the first task to be developed as a pharmaceutical. For intracellular delivery of nucleic acid material, viral vectors or nonviral vectors using polymers or nanoparticles have been studied. Among these, viral vectors have the advantage of having higher gene transfer efficiency than non-viral vectors, but their application to humans is very limited due to safety issues when using viruses. Thus, development of non-viral vectors is underway as a safer alternative than viral vectors.

상기 비바이러스성 벡터 중 양이온성 나노입자 또는 양이온성 고분자들은 구조적인 특징에 의한 양하전으로 유전자의 음하전과 결합하여 복합체를 형성하는 특징이 있어 유전자 전달체로서 연구되어 왔다. 이러한 합성 물질을 이용한 유전자 전달 방법은 렌티 바이러스나 아데노 바이러스 등을 사용한 바이러스성 유전자 수송체에 비하여 제조방법이 간편하고, 전달하려는 유전자의 크기가 제한을 받지 않으며, 바이러스 캡시드 단백질에 의한 반복투여시의 면역부작용이 적고, 바이러스 자체가 소유하는 유전자에 의한 체내 안전성 문제가 제기되지 않으며, 제조 비용이나 시간에 있어서도 상업적으로 유리한 장점이 있다.Cationic nanoparticles or cationic polymers among the non-viral vectors have been studied as gene carriers because they have a characteristic of forming complexes by combining negative charges of genes with positive charges due to structural features. Gene delivery methods using such synthetic materials are simpler to manufacture than viral gene transporters using lentiviruses or adenoviruses, and are not limited in size to the genes to be delivered, and are repeatedly administered by viral capsid proteins. Less immune side effects, no safety problems caused by genes owned by the virus itself, there is a commercially advantageous advantage in terms of manufacturing cost or time.

종래에 개발된 양이온성 인지질 나노입자를 대상으로 하여 유전자 전달 효율의 증가를 연구한 예가 다양한 세포 주들을 대상으로 보고되어 왔다. 그러나, 이들 유전자 전달체는 세포 독성이나 세포 내 유전자 전달 효율 면에서 아직 보완되어야 할 점이 많다. Previously developed cationic phospholipid nanoparticles have been reported in various cell lines to study the increase in gene transfer efficiency. However, these gene carriers still need to be supplemented in terms of cytotoxicity and intracellular gene transfer efficiency.

따라서 비바이러스성 수송체를 사용하여 세포 독성이 작으면서도 세포 내로 효율적으로 플라스미드 유전자나 작은 간섭 리보핵산 등의 핵산을 세포 내로 전달하는 기술과 폐암 치료에 있어 폐 조직 특이적으로 항암제와 유전자 전달 효율이 높이는 기술은 당 분야에서 절대적으로 필요한 기술이라 할 것이다.Therefore, non-viral transporter has low cytotoxicity and efficient cell delivery of nucleic acid such as plasmid gene or small interfering ribonucleic acid into cell and lung tissue specific anticancer agent and gene delivery efficiency in the treatment of lung cancer. Heightening skills will be called an absolutely necessary skill in the art.

또한 폐암 치료에 있어 항암제의 투여 경로가 정맥주사 또는 구강 투여방법으로 수행되는데, 이 같은 경우 폐 조직에만 약물이 전달 되는 것이 아니라, 전신으로 약물이 전달되기 때문에 탈모나, 체중감소 같은 부작용이 많이 발생하고 있다. 따라서 폐 조직 특이적으로 약물의 전달 효율을 높이는 기술이 당 분야에서 절대적으로 필요한 기술이라 할 것이다.In addition, in the treatment of lung cancer, the route of administration of the anticancer agent is administered by intravenous injection or oral administration. In this case, the drug is not delivered only to the lung tissue, but because the drug is delivered to the whole body, many side effects such as hair loss and weight loss occur. Doing. Therefore, a technique for increasing drug delivery efficiency specifically to lung tissue will be called an absolutely necessary technique in the art.

이에 본 발명자들은 핵산 등의 세포 내 전달 효율을 증가시키기 위하여 다양한 조성의 양이온성 인지질 나노입자를 이용하여 예의 노력한 결과, EDOPC 및 스테롤계 화합물을 일정 조성으로 포함하는 양이온성 인지질 나노입자의 경우 사람 및 쥐의 종양 세포주에서 약물 전달 효율을 현저히 증가시킬 뿐만 아니라 세포 독성도 현저하게 감소시키며, 특히 폐 조직에 대해 특이적으로 약물 전달 효율이 높다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
Accordingly, the present inventors have made diligent efforts using cationic phospholipid nanoparticles of various compositions to increase the intracellular delivery efficiency of nucleic acids, and the like, in the case of cationic phospholipid nanoparticles containing EDOPC and a sterol-based compound in a certain composition, In addition to significantly increasing drug delivery efficiency in rat tumor cell lines, rats also significantly reduced cytotoxicity, and in particular, the drug delivery efficiency was specifically confirmed for lung tissue, and the present invention was completed.

본 발명은 약물 전달 효율이 높고 세포독성이 낮은 양이온성 인지질 나노입자, 상기 인지질 나노입자에 약물이 도입된 인지질 나노입자-약물 복합체, 이러한 인지질 나노입자-약물 복합체를 포함하는 의약 조성물을 제공하고자 한다.
The present invention provides a cationic phospholipid nanoparticle having high drug delivery efficiency and low cytotoxicity, a phospholipid nanoparticle-drug complex in which a drug is introduced into the phospholipid nanoparticle, and a pharmaceutical composition comprising the phospholipid nanoparticle-drug complex .

본 발명은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, EDOPC) 및 스테롤(Sterol)계 화합물을 포함하는 양이온성 인지질 나노입자에 있어서, 상기 EDOPC는 양이온성 인지질 나노입자를 구성하는 총 물질 100 중량부에 대해 57 내지 95 중량부로 포함되는 것인 양이온성 인지질 나노입자를 제공한다. The present invention is a cation comprising 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, EDOPC) and a sterol-based compound For sex phospholipid nanoparticles, the EDOPC provides cationic phospholipid nanoparticles that comprise 57 to 95 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the total material constituting the cationic phospholipid nanoparticles.

종래에 공지된 양이온성 인지질 나노입자에서도 EDOPC 및/또는 스테롤계 화합물을 구성성분으로 포함하고 있으나, 본 발명에서는 이들의 구성 비율을 특정함으로써 핵산의 전달 효율을 현저히 증가시키는 동시에 세포 독성을 현저히 감소시킬 수 있으며, 나아가 폐 조직에 특이적으로 약물 전달능이 있음을 밝혔다. EDOPC가 나노입자를 구성하는 총 물질 100 중량부에 대해 57 내지 95 중량부, 바람직하게는 60 내지 90 중량부로 포함될 때 핵산 전달 효율, 세포 독성, 조직 타겟팅 능력의 측면에서 우수한 효과를 발휘하는 것으로 나타났다. 본 발명의 양이온성 인지질 나노입자가 이와 같은 효과를 발휘함에 있어 가장 중요한 것은 나노입자의 총 중량에 대한 EDOPC의 함량이며, EDOPC 이외의 성분들은 적절한 범위로 함량의 조절이 가능하다. Conventionally known cationic phospholipid nanoparticles also contain EDOPC and / or sterol-based compounds as constituents, but in the present invention, by specifying their constituent ratios, they significantly increase the delivery efficiency of nucleic acids and significantly reduce cytotoxicity. It is further shown that there is a specific drug delivery ability in lung tissue. When EDOPC is included 57 to 95 parts by weight, preferably 60 to 90 parts by weight based on 100 parts by weight of the total material constituting the nanoparticles, it has been shown to exert an excellent effect in terms of nucleic acid delivery efficiency, cytotoxicity, and tissue targeting ability . In the cationic phospholipid nanoparticles of the present invention, the most important thing is the content of EDOPC with respect to the total weight of the nanoparticles, and components other than EDOPC can be controlled in an appropriate range.

본 발명의 나노입자에 포함되는 스테롤계 화합물로는 양이온성 나노입자의 구성을 위해 사용되는 공지의 스테롤계 화합물을 사용할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 스테롤계 화합물은 콜레스테롤, 3b-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바밀}콜레스테롤 (3b-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-cabamyl]cholesterol, DC-Chol), 스티그마스테롤(stigmasterol), 캄페스테롤(campesterol), 시토스테롤(sitosterol), 에르고스테롤(ergosterol), 라노스테롤(lanosterol), 디노스테롤(dinosterol), 고르고스테롤(gorgosterol), 아베나스테롤(avenasterol), 사린고스테롤(saringosterol) 및 퓨코스테롤(fucosterol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분일 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이, 본 발명의 양이온성 인지질 나노입자에서 가장 중요한 것은 나노입자의 총 중량에 대한 EDOPC의 함량이므로, 스테롤계 화합물은 추가적으로 도입될 수 있는 세포 융합성 인지질이나 지질 유도체의 포함 여부 또는 이들의 함량 범위에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 스테롤계 화합물은 양이온성 인지질 나노입자를 구성하는 총 물질 100 중량부에 대해 5 내지 43 중량부, 바람직하게는 10 내지 40 중량부의 비율로 포함될 수 있다. As the sterol-based compound included in the nanoparticles of the present invention, a known sterol-based compound used for the construction of the cationic nanoparticles can be used. Although not limited thereto, the sterol compound may be cholesterol, 3b- [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) -carbamyl} cholesterol (3b- [N- (N', N'-dimethylaminoethane)- cabamyl] cholesterol, DC-Chol), stigmasterol, campesterol, camposterol, sitosterol, ergosterol, lanosterol, dinoosterol, gorosteroster, It may be one or more components selected from the group consisting of avenasterol, saringosterol and fucosterol. As described above, the most important thing in the cationic phospholipid nanoparticles of the present invention is the content of EDOPC relative to the total weight of the nanoparticles, so that the sterol-based compound includes additionally cell fusion phospholipids or lipid derivatives that can be introduced or these It can be appropriately adjusted according to the content range of. Although not limited thereto, the sterol-based compound may be included in a ratio of 5 to 43 parts by weight, preferably 10 to 40 parts by weight based on 100 parts by weight of the total material constituting the cationic phospholipid nanoparticles.

상기 양이온성 인지질 나노입자는 세포 융합성 인지질을 추가로 포함할 수 있다. 세포 융합성 인지질은 세포 외부를 구성하는 지질과의 상호작용 및 융합을 유도하여 세포 내부로 의약 물질을 효과적으로 전달하는 역할을 한다. 세포 융합성 인지질로서는 인지질 나노입자의 구성을 위해 사용되는 공지의 세포 융합성 인지질을 사용할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 세포 융합성 인지질은 포스파티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine, DOPE), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DPhPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DSPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DPPE) 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분일 수 있다. The cationic phospholipid nanoparticles may further comprise cell fusion phospholipids. Cell fusion phospholipids induce interaction and fusion with lipids constituting the outside of the cell and serve to effectively deliver the drug substance inside the cell. As cell fusion phospholipids, known cell fusion phospholipids used for the construction of phospholipid nanoparticles can be used. The cell fusion phospholipids include, but are not limited to, dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE), 1,2-dipitanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (1,2-Diphytanoyl-sn- glycero-3-phosphoethanolamine (DPhPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DSPE), 1,2 di-palmitoyl -sn- glycero-3-phospho-ethanolamine (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero -3-phosphoethanolamine, DPPE) and 1, 2-diol Leo one-sn-glycero-3-phosphonic by Forcoline (1,2-dioleoyl sn -glycero-3-phosphocholine, DOPC) may be one or more components selected from the group consisting of.

이에 제한되는 것은 아니나, 세포 융합성 인지질은 양이온성 인지질 나노입자를 구성하는 총 물질 100 중량부에 대해 1 내지 15 중량부로 포함될 수 있다. Although not limited thereto, the cell-fusion phospholipid may be included in an amount of 1 to 15 parts by weight based on 100 parts by weight of the total material constituting the cationic phospholipid nanoparticles.

또한, 본 발명의 양이온성 인지질 나노입자는 세레브로시드, 1,2-디스테아로일-sn-글리세롤-3포스포에탄올아민-N-[폴레이트(폴리에틸렌 글리콜)-2000], (1,2-디아실-sn-글리세롤-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-1000] 및 (1,2-디스테아로일-sn-글리세롤-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 유도체를 추가적할 수 있다. 이들 지질 유도체는 혈중에서 약물이 제거되는 현상을 억제하여 약효의 지속 효과를 증대시켜 줌으로써, 결과적으로 약물의 투여 횟수를 줄이고 독성을 감소시켜주는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 필요에 따라 이들 지질 유도체를 본 발명의 양이온성 인지질 나노입자에 포함시킴으로써 약물의 혈중 농도를 조절하는데 사용할 수 있다. 이에 제한 되는 것은 아니나, 상기 지질 유도체는 양이온성 인지질 나노입자를 구성하는 총 물질 100 중량부에 대해 1 내지 10 중량부로 포함될 수 있다.In addition, the cationic phospholipid nanoparticles of the present invention are cerebromide, 1,2-distearoyl-sn-glycerol-3phosphoethanolamine-N- [folate (polyethylene glycol) -2000], (1, 2-diacyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethylene glycol) -1000] and (1,2-distearoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine- It is possible to add one or more lipid derivatives selected from the group consisting of N- [methoxy (polyethylene glycol) -2000] These lipid derivatives increase the sustained effect of the drug by inhibiting the removal of drugs from the blood. As a result, it is known to play a role in reducing the frequency of drug administration and reducing toxicity, so that these lipid derivatives may be included in the cationic phospholipid nanoparticles of the present invention as needed to control the blood concentration of the drug. Yes, But are not to be, the lipid derivatives may be included an amount of 1 to 10 parts by weight based on 100 parts total weight of material constituting the cationic phospholipid nanoparticles.

본 발명에 있어서, 상기 양이온성 인지질 나노입자는 리포좀(liposome), 미셀(micelle), 에멀젼(emulsion) 및 고형 지질 나노입자(solid lipid nanoparticle)로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있다. 상기 제형을 갖는 지질 나노입자를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.In the present invention, the cationic phospholipid nanoparticles may have a formulation selected from the group consisting of liposomes, micelles, emulsions, and solid lipid nanoparticles. Methods of preparing lipid nanoparticles with such formulations are well known in the art.

예를 들어, 리포좀 제형은 지질-필름 수화 기술에 의하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 EDOPC 및 스테롤계 화합물을 적당한 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 디메틸설폭시드, 클로로포름 또는 이들의 혼합물 등에 용해시킨 다음, 이들 유기 용매를 제거시켜 얇은 박막 필름을 형성한다. 상기 용매를 제거시키는 방법은 로터리 증발 및 질소 유출 등을 포함하나, 이에 국한되지 않는 임의 방법을 이용하여 제거할 수 있다. 이후 박막 필름에 수성 배지를 첨가하고 수화시켜 본 발명에 따른 양이온성 인지질 리포좀을 제조할 수 있다.For example, liposome formulations can be prepared by lipid-film hydration techniques. Specifically, the EDOPC and sterol compounds are dissolved in a suitable organic solvent, such as methanol, ethanol, dimethylsulfoxide, chloroform or a mixture thereof, and then these organic solvents are removed to form a thin thin film. The method of removing the solvent may be removed using any method including, but not limited to, rotary evaporation and nitrogen leakage. Then, an aqueous medium may be added to the thin film and hydrated to prepare a cationic phospholipid liposome according to the present invention.

한편, 본 발명에 따른 양이온성 인지질 나노입자의 크기는 특별히 제한되지 않는다. 한 구체예에서, 상기 양이온성 인지질 나노입자는 10 내지 500nm 크기의 입자경을 가지는 것일 수 있다. 일반적으로 약 10 nm 내지 500 nm, 바람직하게는 50 nm 내지 300 nm의 입자 직경(diameter) 범위 에서 실질적으로 균등한 크기를 갖는 나노입자로 만들 수 있다. 예를 들어, 리포좀의 경우 30 nm 내지 200 nm, 일반적으로는 50 nm, 100 nm 또는 200 nm의 범위로 선택된 균일한 막공 크기(membrane pore size)를 갖는 일련의 폴리카보네이트 막을 통하여 리포좀의 수성 현탁액을 압출(extrusion) 시킴으로써 균등한 크기를 갖는 리포좀 나노입자를 제조할 수 있다. 막공의 크기는 막을 통한 압출에 의해 생성된 평균 입도의 리포좀에 대략 상응하며, 특히 제조된 리포좀의 크기를 균질화 하기 위하여 동일한 막공 크기의 막여과지 (membrane filter)를 통하여 수회, 예를 들어 3회 이상 압출시킨다. 또한, 균질화 방법은 일정 크기 미만, 바람직하게는 300 nm 미만의 크기로 리포좀의 입자크기를 조절하는데 유용하게 사용할 수 있다(Martin, F.J.,in SPECIALIZED DRUG DELIVERY SYSTEMS-MANUFACTURING AND PRODUCTION TECHNOLOGY, (P. Tyle, Ed.) Marcel Dekker, New York, pp. 267-316(1990)).On the other hand, the size of the cationic phospholipid nanoparticles according to the present invention is not particularly limited. In one embodiment, the cationic phospholipid nanoparticles may have a particle diameter of 10 to 500nm size. Generally it can be made of nanoparticles having a substantially uniform size in the particle range of about 10 nm to 500 nm, preferably 50 nm to 300 nm. For example, for liposomes, an aqueous suspension of liposomes is passed through a series of polycarbonate membranes having a uniform membrane pore size selected in the range of 30 nm to 200 nm, typically 50 nm, 100 nm or 200 nm. By extrusion, liposome nanoparticles having a uniform size can be prepared. The size of the membrane pores roughly corresponds to the average particle size liposomes produced by extrusion through the membrane, in particular several times, for example three or more times through a membrane filter of the same membrane pore size to homogenize the size of the prepared liposomes. Extrude. In addition, the homogenization method can be usefully used to control the particle size of the liposome to less than a certain size, preferably less than 300 nm (Martin, FJ, in SPECIALIZED DRUG DELIVERY SYSTEMS-MANUFACTURING AND PRODUCTION TECHNOLOGY, (P. Tyle , Ed.) Marcel Dekker, New York, pp. 267-316 (1990)).

본 발명에 따른 상기 양이온성 인지질 나노입자는 약물 전달을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 양이온성 인지질 나노입자를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.The cationic phospholipid nanoparticles according to the invention can be used for drug delivery. Accordingly, the present invention provides a composition for drug delivery comprising the cationic phospholipid nanoparticles.

한 구체예에서, 상기 양이온성 인지질 나노입자는 폐 조직 특이적 약물 전달을 위한 것일 수 있다. In one embodiment, the cationic phospholipid nanoparticles can be for lung tissue specific drug delivery.

하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 양이온성 인지질 나노입자는 특히 폐 조직에 대해 조직 특이적으로 약물을 전달하는 능력이 우수하다. 따라서, 예를 들어 폐암의 유전자 치료 또는 약물 치료를 위해 본 발명에 따른 양이온성 인지질 나노입자를 약물전달체로서 유용하게 사용할 수 있다.As can be seen in the examples below, the cationic phospholipid nanoparticles according to the present invention are particularly excellent in their ability to deliver drugs specifically for lung tissue. Thus, for example, cationic phospholipid nanoparticles according to the present invention can be usefully used as drug carriers for gene therapy or drug treatment of lung cancer.

본 발명은 또한 앞서 설명한 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, EDOPC) 및 스테롤(Sterol)계 화합물을 포함하는 양이온성 인지질 나노입자에 약물이 도입되어 있는 인지질 나노입자-약물 복합체를 제공한다.The present invention also relates to 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (EDOPC)) and a sterol-based compound described above. It provides a phospholipid nanoparticle-drug complex in which a drug is introduced into the cationic phospholipid nanoparticles.

앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 양이온성 인지질 나노입자는 약물전달체로서 이용할 수 있다. 따라서, 상기 양이온성 인지질 나노입자에 원하는 약물을 도입하여 인지질 나노입자-약물 복합체를 형성한 후 질환의 치료를 위해 사용할 수 있다. As described above, the cationic phospholipid nanoparticles according to the present invention can be used as drug carriers. Therefore, the desired drug may be introduced into the cationic phospholipid nanoparticles to form a phospholipid nanoparticle-drug complex and then used for the treatment of a disease.

본 발명에 따른 양이온성 인지질 나노입자에 도입될 수 있는 약물의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 약물은 소수성 결합을 통해 본 발명에 따른 양이온성 인지질 나노입자에 도입될 수 있다. 다르게는, 나노입자의 내부에는 약물을 담지할 수 있는 공간이 존재하므로 이 내부 공간에 약물을 로딩하여 인지질 나노입자-약물 복합체를 형성할 수도 있다. The type of drug that can be introduced into the cationic phospholipid nanoparticles according to the present invention is not particularly limited. The drug can be introduced into the cationic phospholipid nanoparticles according to the invention via hydrophobic bonds. Alternatively, since there is a space for supporting a drug inside the nanoparticles, the drug may be loaded into the internal space to form a phospholipid nanoparticle-drug complex.

한 구체예에서, 상기 약물은 핵산일 수 있다. 약물이 핵산일 경우 단순한 혼합에 의해서도 인지질 나노입자-핵산 복합체 형성이 가능하다. 본 발명에 있어서, 핵산은 리보핵산(RNA), 작은 간섭 리보핵산(small interfering RNA), 안티센스 올리고핵산(antisense oligonucleotide), 데옥시리보 핵산(DNA), 플라스미드 데옥시리보 핵산, 앱타머(aptamer) 등을 포함한다. 바람직하게는 5 내지 200개의 염기(base pair)로 구성된 작은 간섭 리보핵산, 안티센스 핵산, 또는 핵산 앱타머 (aptamer)를 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 양이온성 인지질 나노입자를 이용할 경우 종래 핵산 전달체와 비교할 때, 작은 간섭 리보핵산 및 안티센스 핵산과 같은 5 내지 200 bp 크기 올리고핵산의 경우에도 효율적인 세포 내 전달이 가능함을 실시예를 통해 확인할 수 있었다. In one embodiment, the drug may be a nucleic acid. If the drug is a nucleic acid, phospholipid nanoparticle-nucleic acid complex formation is possible by simple mixing. In the present invention, the nucleic acid is ribonucleic acid (RNA), small interfering RNA (small interfering RNA), antisense oligonucleotide (antisense oligonucleotide), deoxyribonucleic acid (DNA), plasmid deoxyribonucleic acid, aptamer (aptamer) And the like. Preferably, small interfering ribonucleic acids, antisense nucleic acids, or nucleic acid aptamers consisting of 5 to 200 base pairs can be used. When using the cationic phospholipid nanoparticles according to the present invention compared to conventional nucleic acid carriers, it is confirmed through the examples that efficient intracellular delivery is possible even in the case of 5 to 200 bp oligonucleotides such as small interfering ribonucleic acid and antisense nucleic acid Could.

한편, 핵산은 핵산 구조 중의 인산부, 에스테르부, 리보오스환 등에 포함되는 산소 원자 등이, 예컨대 황 원자 또는 불소 원자 등의 다른 원자나 메틸기 등의 알킬기로 치환된 유도체를 포함한다.On the other hand, the nucleic acid includes a derivative in which an oxygen atom or the like contained in a phosphoric acid moiety, an ester moiety, a ribose ring, or the like in the nucleic acid structure is substituted with another atom such as a sulfur atom or a fluorine atom or an alkyl group such as a methyl group.

다른 구체예에서, 상기 약물은 항암제일 수 있다. 항암제로는 단백질 또는 화학적 약물을 이용할 수 있다. 본 발명의 나노입자에 도입될 수 있는 항암제의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 항암제는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 트라스투주맙, 제피티닙, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 로무스틴 및 카르무스틴으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 약물일 수 있다. 본 발명의 양이온성 인지질 나노입자는 폐 조직 특이적인 약물 전달에 유리하므로 바람직하게는 상기 항암제는 폐암 치료를 위한 것일 수 있다.In another embodiment, the drug may be an anticancer agent. As an anticancer agent, a protein or a chemical drug can be used. The kind of anticancer agent that can be introduced into the nanoparticles of the present invention is not particularly limited. For example, anticancer agents include nitrogen mustard, imatinib, oxaliplatin, rituximab, erlotinib, trastuzumab, zefitinib, bortezomib, sunitinib, carboplatin, sorafenib, bevacizumab, cisplatin, cetuxet Simab, biscumalbum, asparaginase, tretinoin, hydroxycarbamide, dasatinib, estramastine, gemtuzumab ozogamycin, ibritumab tucetan, heptaplatin, methylaminolevulinic acid, amsacrine , Alemtuzumab, procarbazine, alprostadil, holmium nitrate chitosan, gemcitabine, doxyfluidine, pemetrexed, tegapur, capecitabine, gimerasine, oteracyl, azacytidine, methotrexate , Uracil, cytarabine, fluorouracil, fludagabine, enositabine, decitabine, mercaptopurine, thioguanine, cladribine, carmofer, raltitrexed, docetaxel, paclitaxel, irinotecan, velotecan, topote , Vinorelbine, etoposide, vincristine, vinblastine, teniposide, doxorubicin, idarubicin, epirubicin, mitoxantrone, mitomycin, bleomycin, daunorubicin, dactinomycin, pyrarubicin Sin, aclarubicin, pepromycin, temozolomide, busulfan, ifosfamide, cyclophosphamide, melfaran, altretmin, dacarbazine, chiotepa, nimustine, chlorambucil, mitolactol, It may be one or more drugs selected from the group consisting of romustine and carmustine. Since the cationic phospholipid nanoparticles of the present invention are advantageous for lung tissue specific drug delivery, the anticancer agent may be preferably for treating lung cancer.

상기 인지질 나노입자-약물 복합체는 약물로서 핵산과 항암제를 동시에 포함할 수도 있다. 이 경우, 예를 들어, 핵산은 나노입자의 표면에, 단백질이나 화학적 화합물의 형태의 항암제는 나노입자 내부에 위치하는 복합체의 형태를 취할 수 있다.The phospholipid nanoparticle-drug complex may include a nucleic acid and an anticancer agent simultaneously as a drug. In this case, for example, the nucleic acid may take the form of a complex located on the surface of the nanoparticle and the anticancer agent in the form of a protein or chemical compound.

한 구체예에서, 상기 인지질 나노입자-약물 복합체는 폐 조직 특이적 약물 전달을 위한 것일 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 양이온성 인지질 나노입자는 폐 조직에 대해 특이적으로 약물을 전달하는 효과가 현저하므로 이들 관련 질환에 유용하게 사용할 수 있다. In one embodiment, the phospholipid nanoparticle-drug complex may be for lung tissue specific drug delivery. As described above, the cationic phospholipid nanoparticles according to the present invention can be useful in these related diseases because the effect of delivering drugs specifically to lung tissue is remarkable.

본 발명은 또한 상기 인지질 나노입자-약물 복합체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 의약 조성물, 의약의 제조를 위한 상기 인지질 나노입자-약물 복합체의 용도, 치료상 유효량의 상기 인지질 나노입자-약물 복합체를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체의 질환의 치료 방법을 제공한다. The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising the phospholipid nanoparticle-drug complex and a pharmaceutically acceptable carrier, the use of the phospholipid nanoparticle-drug complex for the manufacture of a medicament, a therapeutically effective amount of the phospholipid nanoparticle-drug complex Provided is a method of treating a disease in a subject comprising administering to the subject.

본 발명의 의약 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들어 하나 이상의 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트린, 글리세롤, 에탄올뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 이러한 조성물은 투여 후 활성 성분의 빠른 방출, 또는 지속적이거나 지연된 방출을 제공하도록 제제화 될 수 있다. Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the invention include, for example, one or more water, saline, phosphate buffered saline, dextrin, glycerol, ethanol, as well as combinations thereof. Such compositions may be formulated to provide fast release, or sustained or delayed release of the active ingredient after administration.

약제학적으로 허용가능한 담체는 당업자에게 잘 알려진 여러 가지 인자에 따라 제조될 수 있는데, 예를 들면 이용된 특정 생리활성물질, 이의 농도, 안정성 및 의도된 생체이용성; 인지질 나노입자-약물 복합체로 치료하고자 하는 질환 및 질병 또는 상태; 치료받을 개체, 나이, 크기 및 일반적인 상태; 조성물을 투여하는데 이용되는 경로, 예를 들어 비강, 구강, 안구, 국소, 경피 및 근육 등의 요인을 고려해야 하나, 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로 경구 투여 경로 이외의 생리활성물질 투여에 이용되는 약제학적으로 이용가능한 담체에는 D5W, 덱스트로즈 및 생리학적 염을 용적의 5% 이내로 포함하는 수용액을 포함한다. 또한 약제학적으로 이용가능한 담체에는 보존제 및 항산화제와 같은 활성 성분들의 안정성을 보강시킬 수 있는 추가 성분들을 포함할 수 있다.Pharmaceutically acceptable carriers can be prepared according to a variety of factors well known to those of skill in the art, including, for example, the particular bioactive agent used, its concentration, stability, and intended bioavailability; Diseases and conditions or conditions to be treated with phospholipid nanoparticle-drug complexes; The subject to be treated, age, size and general condition; Factors such as, but not limited to, the route used to administer the composition, such as nasal, oral, ocular, topical, transdermal and muscular, should be considered. Pharmaceutically available carriers which are generally used for the administration of physiologically active substances other than the oral route of administration include aqueous solutions comprising D5W, dextrose and physiological salts within 5% of the volume. Pharmaceutically available carriers may also include additional ingredients that can enhance the stability of the active ingredients such as preservatives and antioxidants.

또한, 본 발명의 의약 조성물의 투여량은 의도하는 치료에 유효한 용량으로 투여된다. 특정의 의학적 질환을 치료하거나 또는 이의 진행을 억제시키는데 요구되는 치료상 유효량은 의학 분야에 공지된 예비임상 연구 및 임상 연구를 이용하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명에서 상기 사용된 용어, "치료상 유효량"은 임상의 또는 연구자가 목적하는, 특정 조직, 시스템, 및 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유발시키는 활성 성분의 양을 말한다.In addition, the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is administered at a dose effective for the intended treatment. The therapeutically effective amount required to treat or inhibit the progress of a particular medical disease can be readily determined by one skilled in the art using preclinical and clinical studies known in the medical arts. As used herein, the term “therapeutically effective amount” refers to the amount of active ingredient that elicits a biological or medical response in a particular tissue, system, and animal or human, as desired by a clinician or investigator.

본 발명의 의약 조성물의 투여 경로는 적합한 모든 투여 경로가 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 인지질 나노입자-약물 복합체는 양전하를 띠고 있으므로 세포 또는 조직막의 음전하와 인력이 작용하여 세포 또는 조직막에 부착되어 엔도사이토시스(endocytosis)에 의해 세포 내부로 유입될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 본 발명의 의약 조성물은 기도 또는 정맥을 통해 투여될 수 있다.
As the route of administration of the pharmaceutical composition of the present invention, any suitable route of administration may be used. Since the phospholipid nanoparticle-drug complex according to the present invention has a positive charge, the negative charge and attraction force of the cell or tissue membrane may be attached to the cell or tissue membrane and introduced into the cell by endocytosis. For example, but not limited to, the pharmaceutical composition of the present invention may be administered through the airways or veins.

본 발명에 따른 EDOPC 및 스테롤계 화합물을 포함하는 양이온성 인지질 나노입자는 세포 내 약물 수송 효율을 증가시킬 뿐만 아니라 세포 독성도 현저하게 감소시키고, 또한 폐 조직에 대해 특이적으로 약물을 전달시킬 수 있으므로, 작은 간섭 리보핵산, 안티센스 핵산 등의 올리고 핵산 물질을 이용한 치료요법 및 항암제를 이용한 치료요법에 효과적으로 사용 가능하다. 또한, 본 발명의 양이온성 인지질 나노입자는 제조 공정이 간편하여 대량 생산시의 경제성이 높다.
The cationic phospholipid nanoparticles comprising the EDOPC and sterol compounds according to the present invention not only increase the intracellular drug transport efficiency but also significantly reduce the cytotoxicity, and can also deliver drugs specifically to lung tissue. It can be effectively used for the therapy using oligonucleotide materials such as small interfering ribonucleic acid and antisense nucleic acid and the therapy using anticancer agent. In addition, the cationic phospholipid nanoparticles of the present invention have a simple manufacturing process and high economical efficiency in mass production.

도 1은 쥐의 흑색종인 B16F10 에서 EDOPC 및 콜레스테롤을 조성으로 하는 양이온성 리포좀의 작은 간섭 리보핵산 전달능을 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 2는 사람의 폐암 세포인 A549 에서 EDOPC 및 콜레스테롤을 조성으로 하는 양이온성 리포좀의 비특이적 세포 독성을 MTT 염색법을 사용하여 확인한 결과이다.
도 3은 EDOPC 및 콜레스테을 조성으로 하는 양이온성 리포좀을 이용하여 VEGF 발현 억제 siRNA에 의해 매개된 VEGF 전사체 발현 억제 효능을 B16F10 세포주에서 역전사 중합효소 연쇄반응을 통해 확인한 결과를 보여준다.
도 4는 EDOPC 및 스티그마스테롤을 조성으로 하는 양이온성 리포좀을 이용하여 VEGF 발현 억제 siRNA에 의해 매개된 VEGF 전사체 발현 억제 효능을 Calu-6 세포주에서 역전사 중합효소 연쇄반응을 통해 확인한 결과를 보여준다.
도 5는 EDOPC 및 콜레스테롤을 조성으로 하는 양이온성 리포좀을 이용하여 서바이빈 발현 억제 siRNA에 의해 매개된 서바이빈 전사체 발현 억제 효능을 A549 세포주에서 역전사 중합효소 연쇄반응을 통해 확인한 결과를 보여준다.
도 6은 EDOPC 및 콜레스테롤을 조성으로 하는 양이온성 리포좀을 이용하여 서바이빈 발현 억제 siRNA에 의해 매개된 서바이빈 전사체 발현 억제 효능을 LLC1 세포주에서 역전사 중합효소 연쇄반응을 통해 확인한 결과를 보여준다.
도 7은 EDOPC 및 DC-Chol을 조성으로 하는 파클리탁셀 함유 양이온성 리포좀에 의한 암세포 사멸 효능을 MTT (tetrazolium 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 염색법을 사용하여 B16F10 세포주에서 확인한 결과이다.
도 8은 EDOPC, 콜레스테롤 및 DPhPE를 조성으로 하는 도세탁셀 함유 양이온성 리포좀에 의한 암세포 사멸 효능을 MTT 염색법을 사용하여 LLC1 세포주에서 확인한 결과이다.
도 9는 EDOPC 및 CHEMS를 조성으로 하는 제피티닙 함유 양이온성 리포좀에 의한 암세포 사멸 효능을 MTT 염색법을 사용하여 A549 세포주에서 확인한 결과이다.
도 10은 쥐의 흑색종인 B16F10-유래 설치류 폐암 모델에서의 EDOPC 및 DC-Chol을 조성으로 하는 양이온성 리포좀의 작은 간섭 리보핵산 전달능을 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 11은 쥐의 흑색종인 B16F10-유래 설치류 폐암 모델에서의 EDOPC 및 스티그마스테롤을 조성으로 하는 양이온성 리포좀의 비특이적 생체 독성을 개체 생존율 분석 방법을 통해 확인한 결과이다.
도 12는 EDOPC, 콜레스테롤 및 DOPE를 조성으로 하는 양이온성 리포좀을 기도 내 주입방식을 통해 서바이빈 발현 억제 siRNA에 의해 매개된 서바이빈 전사체 발현 억제 효능을 쥐의 폐암 세포인 LLC1-유래 설치류 폐암 모델에서 역전사 중합효소 연쇄반응을 통해 확인한 결과를 보여준다.
도 13은 EDOPC, 콜레스테롤 및 DOPE를 조성으로 하는 양이온성 리포좀을 기도 내 주입방식을 통해 서바이빈 발현 억제 siRNA에 의해 매개된 서바이빈 단백질 발현 억제 효능을 쥐의 폐암 세포인 LLC1-유래 설치류 폐암 모델에서 웨스턴 블랏 (western blot)을 통해 확인한 결과를 보여준다.
도 14는 쥐의 흑색종인 B16F10-유래 설치류 폐암 모델에서 정맥주사를 통해 폐조직으로의 EDOPC 및 DC-Chol 기반 양이온성 리포좀의 작은 간섭 리보핵산의 전달능을 형광 이미징 분석기인 Image Station 4000MM Digital Imaging System (Eastman Kodak Company, USA)을 사용하여 분석한 결과이다.
1 is a result of analyzing the small interfering ribonucleic acid transfer capacity of cationic liposomes composed of EDOPC and cholesterol in B16F10, a mouse melanoma using a fluorescence flow cytometer (FACS).
FIG. 2 shows the results of nonspecific cytotoxicity of cationic liposomes composed of EDOPC and cholesterol in human lung cancer cells A549 using MTT staining.
Figure 3 shows the results confirmed by reverse transcriptase polymerase chain reaction in the B16F10 cell line using the cationic liposomes composed of EDOPC and cholesterol in the B16F10 cell line.
Figure 4 shows the results confirmed by reverse transcriptase polymerase chain reaction in the Calu-6 cell line using the cationic liposomes composed of EDOPC and stigmasterol to inhibit the expression of VEGF transcripts mediated by siRNA.
Figure 5 shows the results of confirming the inhibitory effect of survivin transcript expression mediated by survivin expression siRNA mediated by the reverse transcription polymerase chain reaction in the A549 cell line using cationic liposomes composed of EDOPC and cholesterol.
Figure 6 shows the results of confirming the inhibitory effect of survivin transcriptome expression mediated by survivin expression siRNA mediated by reverse transcription polymerase chain reaction in LLC1 cell line using cationic liposomes composed of EDOPC and cholesterol.
FIG. 7 shows MTC (tetrazolium 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide) staining effect of cancer cell death by paclitaxel-containing cationic liposomes composed of EDOPC and DC-Chol. Using the B16F10 cell line.
FIG. 8 shows the results of confirming cancer cell death by docetaxel-containing cationic liposomes composed of EDOPC, cholesterol, and DPhPE in the LLC1 cell line using MTT staining.
9 shows the results of cancer cell killing effect by zephytinib-containing cationic liposomes composed of EDOPC and CHEMS in the A549 cell line using MTT staining.
FIG. 10 shows the results of analyzing the small interfering ribonucleic acid transfer capacity of cationic liposomes composed of EDOPC and DC-Chol in the B16F10-derived rodent lung cancer model, which is a mouse melanoma using a fluorescence flow cytometer (FACS).
FIG. 11 shows the results of non-specific biotoxicity of cationic liposomes composed of EDOPC and stigmasterol in a B16F10-derived rodent lung cancer model, a mouse melanoma.
12 shows the effect of inhibiting the expression of survivin transcript mediated by survivin transcript siRNA mediated by airway injection of cationic liposomes composed of EDOPC, cholesterol and DOPE. Lung cancer model shows the results confirmed by reverse transcriptase polymerase chain reaction.
Figure 13 shows the effect of inhibiting survivin protein expression mediated by survivin expression siRNA mediated by airway injection of cationic liposomes consisting of EDOPC, cholesterol, and DOPE. Show the results confirmed by Western blot in the model.
FIG. 14 is a fluorescence imaging analyzer Image Station 4000MM Digital Imaging System for the delivery of small interfering ribonucleic acid of EDOPC and DC-Chol based cationic liposomes to intrapulmonary tissue via intravenous injection in a rat B16F10-derived rodent lung cancer model (Eastman Kodak Company, USA).

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.Advantages and features of the present invention and methods for achieving them will be apparent with reference to the embodiments described below in detail. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below, but may be implemented in various forms. It is provided to fully convey the scope of the invention to those skilled in the art, and the present invention is defined only by the scope of the claims.

하기 실시예들에서는 본 발명에 따른 양이온성 인지질 나노입자를 다양한 형태로 제조하고, 이들 나노입자의 세포 내로의 핵산 수송 능력을 구체적으로 측정하기 위하여 형광 표식이 붙어있는 이중나선 리보핵산 시판품 Block-ITTM (Invitrogen, USA)과 나노입자 간의 복합체를 형성시켜 세포 내에 전달하고 이를 형광 현미경으로 관찰하였다. 또한 상기 복합체의 세포 독성을 평가하기 위하여 tetrazolium 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide을 이용한 발색 방법 (MTT)을 사용하였다.
In the following examples, the cationic phospholipid nanoparticles according to the present invention are prepared in various forms, and commercially available double-stranded ribonucleic acid block-IT with fluorescent labeling to specifically measure the nucleic acid transport ability of the nanoparticles into cells. Complexes between TM (Invitrogen, USA) and nanoparticles were formed and transferred into cells and observed by fluorescence microscopy. In addition, in order to evaluate the cytotoxicity of the complex, the color development method using tetrazolium 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) was used.

<지질 나노입자의 제조><Production of Lipid Nanoparticles>

실시예Example 1.  One. EDOPCEDOPC 및 콜레스테롤 함유  And cholesterol 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

양이온성 인지질인 EDOPC (Avanti Polar Lipid Inc., USA) 및 콜레스테롤(cholesterol, Sigma, USA)을 각각 1 ml의 클로로포름에 녹인 후, 구성 지질의 총 중량을 기준으로 각각 60% 및 40%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 (PYREX, USA) 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 질소 환경에서 모든 클로로포름이 증발될 때까지 낮은 속도로 회전 증발시켜 지질 박막 필름으로 제조하였다. 지질 다층형 소구체 (multilamella vesicle)를 제조하기 위하여 이 박막필름에 인산완충용액 1 ml을 첨가하고 바이알을 37 ℃로 하여 밀봉 후 3 분간 교반(vortexing)하였다. 균일한 크기를 만들기 위해 이를 입자 균질화 제조기 (extruder, Northern Lipid Inc., Canada)를 사용하여 0.2 μm 폴리카보네이트 막을 3 번 통과시켜 제조하였다. 얻어진 양이온성 인지질 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
Cationic phospholipids EDOPC (Avanti Polar Lipid Inc., USA) and cholesterol (cholesterol, Sigma, USA) were dissolved in 1 ml of chloroform, respectively, and then weight ratios of 60% and 40%, respectively, based on the total weight of the constituent lipids. The mixture was taken in a Pyrex (PYREX, USA) 10 ml glass diaphragm vial, mixed, and spun at low speed until all chloroform evaporated in a nitrogen environment to prepare a lipid thin film. To prepare lipid multilamellar vesicles, 1 ml of phosphate buffer solution was added to the thin film, and the vial was sealed at 37 ° C., and then stirred (vortexing) for 3 minutes. To make a uniform size, it was prepared by passing a 0.2 μm polycarbonate membrane three times using a particle homogenizer (extruder, Northern Lipid Inc., Canada). The resulting cationic phospholipid liposomes were stored at 4 ° C. until use.

실시예Example 2.  2. EDOPCEDOPC  And DCDC -- CholChol 함유  contain 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

EDOPC 및 3b-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바밀}콜레스테롤 (3b-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-cabamyl]cholesterol, Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'DC-Chol'이라 함)을 총 중량을 기준으로 각각 65% 및 35%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 양이온성 인지질 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 인지질 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
EDOPC and 3b- [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) -carbamyl} cholesterol (3b- [N- (N', N'-dimethylaminoethane) -cabamyl] cholesterol, Avanti Polar Lipid Inc., USA (Hereinafter, referred to as 'DC-Chol') in a weight ratio of 65% and 35%, respectively, based on the total weight, and mixed in a Pyrex 10 ml glass diaphragm vial, followed by cationic phospholipid liposomes in the same manner as in Example 1. Prepared. The resulting cationic phospholipid liposomes were stored at 4 ° C. until use.

실시예Example 3.  3. EDOPCEDOPC 및 콜레스테롤 함유  And cholesterol 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

EDOPC 및 콜레스테롤을 총 중량을 기준으로 각각 80% 및 20%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 양이온성 인지질 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 인지질 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
Cationic phospholipid liposomes were prepared in the same manner as in Example 1 after EDOPC and cholesterol were taken in a weight ratio of 80% and 20%, respectively, based on the total weight, and mixed in a Pyrex 10 ml glass septum vial. The resulting cationic phospholipid liposomes were stored at 4 ° C. until use.

실시예Example 4.  4. EDOPCEDOPC  And 스티그마스테롤Stigmasterol 함유  contain 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

EDOPC 및 스티그마스테롤 (Stigmasterol, Avanti Polar Lipid Inc., USA)을 총 중량을 기준으로 각각 85% 및 15%의 중량 비율로 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후, 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 양이온성 인지질 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 인지질 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
EDOPC and Stigmasterol (Stigmasterol, Avanti Polar Lipid Inc., USA) were taken at 85% and 15% by weight, respectively, based on total weight, dissolved in 1 ml of chloroform, and then mixed in a Pyrex 10 ml glass septum vial and mixed. After the cationic phospholipid liposome was prepared in the same manner as in Example 1. The resulting cationic phospholipid liposomes were stored at 4 ° C. until use.

실시예Example 5.  5. EDOPCEDOPC 및 콜레스테롤 함유  And cholesterol 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

EDOPC 및 콜레스테롤을 총 중량을 기준으로 각각 92% 및 8%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 양이온성 인지질 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 인지질 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
Cationic phospholipid liposomes were prepared in the same manner as in Example 1 after mixing EDOPC and cholesterol in a weight ratio of 92% and 8% based on the total weight, respectively, into a Pyrex 10 ml glass septum vial and mixed. The resulting cationic phospholipid liposomes were stored at 4 ° C. until use.

실시예Example 6.  6. EDOPCEDOPC , 콜레스테롤 및 , Cholesterol and DOPEDOPE 함유  contain 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

EDOPC, 콜레스테롤 및 세포 융합성 인지질인 DOPE (Avanti Polar Lipid Inc., USA)를 총 중량을 기준으로 각각 70%, 20% 및 10%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 양이온성 인지질 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 인지질 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
EDOPC, cholesterol and cell fusion phospholipids, DOPE (Avanti Polar Lipid Inc., USA) were taken at a weight ratio of 70%, 20% and 10%, respectively, based on the total weight, mixed in a Pyrex 10 ml glass septum vial and mixed Cationic phospholipid liposomes were prepared in the same manner as in Example 1. The resulting cationic phospholipid liposomes were stored at 4 ° C. until use.

비교예Comparative example 1.  One. EDOPCEDOPC 및 콜레스테롤 함유  And cholesterol 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

EDOPC, DC-Chol 및 세포 융합성 인지질인 DPhPE (Avanti Polar Lipid Inc., USA)를 총 중량을 기준으로 각각 40%, 40% 및 20%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 양이온성 인지질 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 인지질 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
EDOPC, DC-Chol, and cell-combining phospholipids DPhPE (Avanti Polar Lipid Inc., USA) are taken in Pyrex 10 ml glass diaphragm vials at 40%, 40% and 20% by weight, respectively, based on total weight. Then cationic phospholipid liposomes were prepared in the same manner as in Example 1. The resulting cationic phospholipid liposomes were stored at 4 ° C. until use.

비교예Comparative example 2.  2. EDOPCEDOPC 함유  contain 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

EDOPC를 100% 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후, 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 양이온성 인지질 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 인지질 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
100% of EDOPC was taken, dissolved in 1 ml of chloroform, mixed in a Pyrex 10 ml glass septum vial, and then cationic phospholipid liposomes were prepared in the same manner as in Example 1. The resulting cationic phospholipid liposomes were stored at 4 ° C. until use.

비교예Comparative example 3.  3. DOTAPDOTAP  And 스티그마스테롤Stigmasterol 함유  contain 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

양이온성 인지질인 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄프로판 (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane, Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'DOTAP'라 함) 및 스티그마스테롤을 총 중량을 기준으로 각각 85% 및 15%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 양이온성 인지질 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 인지질 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
Cationic phospholipids 1,2-dioleoyl-3-trimethylammoniumpropane (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane, Avanti Polar Lipid Inc., USA, hereinafter referred to as 'DOTAP') and stigmasterol Cationic phospholipid liposomes were prepared in the same manner as in Example 1 after mixing in a weight ratio of 85% and 15% by weight, respectively, into a Pyrex 10 ml glass septum vial and mixed. The resulting cationic phospholipid liposomes were stored at 4 ° C. until use.

비교예Comparative example 4.  4. DOTAPDOTAP 및 콜레스테롤 함유  And cholesterol 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

DOTAP 및 콜레스테롤을 총 중량을 기준으로 각각 60% 및 40%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 양이온성 인지질 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 인지질 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
Cationic phospholipid liposomes were prepared in the same manner as in Example 1 after mixing DOTAP and cholesterol in a weight ratio of 60% and 40%, respectively, based on the total weight and placing them in a Pyrex 10 ml glass septum vial. The resulting cationic phospholipid liposomes were stored at 4 ° C. until use.

비교예Comparative example 5.  5. DDABDDAB , 콜레스테롤 및 , Cholesterol and DOPEDOPE 함유  contain 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

양이온성 지질인 디메틸디옥타데실아모늄 (Dimethyldioctadecylammonium, Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'DDAB'라 함), 콜레스테롤 및 DOPE를 총 중량을 기준으로 각각 70%, 20% 및 10%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 양이온성 인지질 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 인지질 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
Weight ratio of dimethyldioctadecylammonium (Dimethyldioctadecylammonium, Avanti Polar Lipid Inc., USA, hereinafter referred to as DDAB), cholesterol and DOPE based on the total weight of the cationic lipids, respectively, by 70%, 20% and 10% After taking into a Pyrex 10 ml glass diaphragm vial and mixed, a cationic phospholipid liposome was prepared in the same manner as in Example 1. The resulting cationic phospholipid liposomes were stored at 4 ° C. until use.

비교예Comparative example 6.  6. DDABDDAB 및 콜레스테롤 함유  And cholesterol 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

DDAB 및 콜레스테롤을 각각 총 중량을 기준으로 각각 92% 및 8%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 양이온성 인지질 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 인지질 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
Cationic phospholipid liposomes were prepared in the same manner as in Example 1 after mixing DDAB and cholesterol in a ratio of 92% and 8%, respectively, based on the total weight, and mixing them in a Pyrex 10 ml glass diaphragm vial. The resulting cationic phospholipid liposomes were stored at 4 ° C. until use.

비교예Comparative example 7.  7. DDABDDAB  And DCDC -- CholChol 함유  contain 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

DDAB 및 DC-Chol을 총 중량을 기준으로 각각 65% 및 35%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 양이온성 인지질 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 인지질 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
Cationic phospholipid liposomes were prepared in the same manner as in Example 1 after DDAB and DC-Chol were taken in a weight ratio of 65% and 35%, respectively, based on the total weight, and mixed in a Pyrex 10 ml glass septum vial. The resulting cationic phospholipid liposomes were stored at 4 ° C. until use.

비교예Comparative example 8.  8. DOTMADOTMA  And 스티그마스테롤Stigmasterol 함유  contain 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

양이온성 지질인 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄프로판 (1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane, Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'DOTMA'라 함) 및 스티그마스테롤을 총 중량을 기준으로 각각 85% 및 15%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 양이온성 인지질 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 인지질 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
Cationic lipid 1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane (1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane, Avanti Polar Lipid Inc., USA, hereinafter referred to as 'DOTMA' And stigmasterol in a weight ratio of 85% and 15%, respectively, based on the total weight, and mixed in a Pyrex 10 ml glass diaphragm vial to prepare a cationic phospholipid liposome in the same manner as in Example 1. The resulting cationic phospholipid liposomes were stored at 4 ° C. until use.

비교예Comparative example 9.  9. DOTMADOTMA 및 콜레스테롤 함유  And cholesterol 양이온성Cationic 리포좀의 제조 Preparation of Liposomes

DOTMA 및 콜레스테롤을 총 중량을 기준으로 각각 60% 및 40%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 양이온성 인지질 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 인지질 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
Cationic phospholipid liposomes were prepared in the same manner as in Example 1 after mixing DOTMA and cholesterol in a weight ratio of 60% and 40%, respectively, based on the total weight and placing them in a Pyrex 10 ml glass septum vial. The resulting cationic phospholipid liposomes were stored at 4 ° C. until use.

비교예Comparative example 10.  10. DOTMADOTMA 및 콜레스테롤 함유  And cholesterol 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

DOTMA 및 콜레스테롤을 총 중량을 기준으로 각각 80% 및 20%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 양이온성 인지질 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 인지질 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
Cationic phospholipid liposomes were prepared in the same manner as in Example 1 after mixing DOTMA and cholesterol in a weight ratio of 80% and 20%, respectively, based on the total weight and placing them in a Pyrex 10 ml glass septum vial. The resulting cationic phospholipid liposomes were stored at 4 ° C. until use.

비교예Comparative example 11.  11. DODAPDODAP , 콜레스테롤 및 , Cholesterol and DOPEDOPE 함유  contain 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

양이온성 인지질인 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판 (1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane, Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'DODAP'라 함), 콜레스테롤 및 DOPE를 총 중량을 기준으로 각각 70%, 20% 및 10%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 양이온성 인지질 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 인지질 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
Cationic phospholipid 1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane (1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane, Avanti Polar Lipid Inc., USA, hereinafter referred to as 'DODAP'), cholesterol and DOPE Was taken in a weight ratio of 70%, 20% and 10%, respectively, based on the total weight, and mixed in a Pyrex 10 ml glass diaphragm vial to prepare a cationic phospholipid liposome in the same manner as in Example 1. The resulting cationic phospholipid liposomes were stored at 4 ° C. until use.

비교예Comparative example 12.  12. DODAPDODAP 및 콜레스테롤 함유  And cholesterol 양이온성Cationic 리포좀의 제조 Preparation of Liposomes

DODAP 및 콜레스테롤을 총 중량을 기준으로 각각 92% 및 8%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 양이온성 인지질 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 인지질 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
Cationic phospholipid liposomes were prepared in the same manner as in Example 1 after mixing DODAP and cholesterol in a weight ratio of 92% and 8%, respectively, based on the total weight and placing them in a Pyrex 10 ml glass septum vial. The resulting cationic phospholipid liposomes were stored at 4 ° C. until use.

비교예Comparative example 13.  13. DODAPDODAP  And DCDC -- CholChol 함유  contain 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

DODAP 및 DC-Chol을 각각 총 중량을 기준으로 각각 65% 및 35%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 양이온성 인지질 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 인지질 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
Cationic phospholipid liposomes were prepared in the same manner as in Example 1 after mixing DODAP and DC-Chol in a weight ratio of 65% and 35%, respectively, based on the total weight, and putting them in a Pyrex 10 ml glass septum vial. The resulting cationic phospholipid liposomes were stored at 4 ° C. until use.

비교예Comparative example 14.  14. DOGSDOGS 및 콜레스테롤 함유  And cholesterol 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

양이온성 지질인 디옥타데실아미도글리실스퍼민 (dioctadecylamidoglycylspermine, Promega, USA, 이하 'DOGS'라 함) 및 콜레스테롤을 총 중량을 기준으로 각각 80% 및 20%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 양이온성 인지질 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 인지질 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
Pyrex 10 ml glass diaphragm, taking cationic lipids dioctadecylamidoglycylspermine, Promega, USA (hereinafter referred to as 'DOGS') and cholesterol in a weight ratio of 80% and 20%, respectively, based on total weight Cationic phospholipid liposomes were prepared in the same manner as in Example 1 after mixing into vials. The resulting cationic phospholipid liposomes were stored at 4 ° C. until use.

<약물이 <Drug 봉입된Enclosed 리포좀의Liposome 제조> Manufacturing>

실시예Example 7.  7. 파클리탁셀이Paclitaxel 봉입된Enclosed 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

EDOPC, DC-Chol 및 항암제인 파클리탁셀 (paclitaxel, Sigma, USA)을 총 중량을 기준으로 각각 60%, 39.9% 및 0.1%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 파클리탁셀 양이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 파클리탁셀 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
Example 1 after mixing EDOPC, DC-Chol and the anticancer agent paclitaxel (paclitaxel, Sigma, USA) in a weight ratio of 60%, 39.9% and 0.1%, respectively, based on the total weight in a Pyrex 10 ml glass diaphragm vial and mixed Paclitaxel cationic liposomes were prepared in the same manner as described above. The resulting paclitaxel cationic liposomes were stored at 4 ° C. until use.

실시예Example 8.  8. 도세탁셀이Docetaxel 봉입된Enclosed 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

EDOPC, 콜레스테롤, DOPE 및 항암 의약인 도세탁셀 (docetaxel, Sigma, USA)을 총 중량을 기준으로 각각 75%, 14.9%, 10% 및 0.1%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 도세탁셀 양이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 도세탁셀 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
EDOPC, cholesterol, DOPE and docetaxel (docetaxel, Sigma, USA), which are anticancer drugs, were taken in Pyrex 10 ml glass diaphragm vials at 75%, 14.9%, 10% and 0.1% by weight, respectively. Then docetaxel cationic liposome was prepared in the same manner as in Example 1. The docetaxel cationic liposomes obtained were stored at 4 ° C. until use.

실시예Example 9.  9. 제피티닙이Gefitinib 봉입된Enclosed 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

EDOPC, 콜레스테릴 헤미썩씨네이트 (cholesteryl hemisuccinate, Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'CHEMS'라 함) 및 분자표적 항암제인 제피티닙 (gefitinib, Selleck Chemicals, USA)을 총 중량을 기준으로 각각 85%, 14.9% 및 0.1%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 제피티닙 양이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 제피티닙 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
EDOPC, cholesteryl hemisuccinate, Avanti Polar Lipid Inc., USA (hereinafter referred to as CHEMS) and gefitinib (gefitinib, Selleck Chemicals, USA), a molecular target anticancer agent Zephytinib cationic liposomes were prepared in the same manner as in Example 1 after mixing in a weight ratio of 85%, 14.9% and 0.1%, respectively, into a Pyrex 10 ml glass septum vial and mixing. The resulting zephytinib cationic liposomes were stored at 4 ° C. until use.

비교예Comparative example 15.  15. 파클리탁셀이Paclitaxel 봉입된Enclosed 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

DOTAP, DC-Chol 및 항암제인 파클리탁셀을 총 중량을 기준으로 각각 60%, 39.9% 및 0.1%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 파클리탁셀 양이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 파클리탁셀 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
Paclitaxel, a DOTAP, DC-Chol and anticancer agent, was taken in a weight ratio of 60%, 39.9% and 0.1%, respectively, based on the total weight, mixed in a Pyrex 10 ml glass septum vial and mixed in the same manner as in Example 1 Liposomes were prepared. The resulting paclitaxel cationic liposomes were stored at 4 ° C. until use.

비교예Comparative example 16.  16. 파클리탁셀이Paclitaxel 봉입된Enclosed 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

DOTMA, DC-Chol 및 항암제인 파클리탁셀을 총 중량을 기준으로 각각 60%, 39.9% 및 0.1%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 파클리탁셀 양이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 파클리탁셀 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
DOTMA, DC-Chol and the anticancer agent paclitaxel were taken in a weight ratio of 60%, 39.9% and 0.1%, respectively, based on the total weight, and mixed in a Pyrex 10 ml glass septum vial and mixed in the same manner as in Example 1 Liposomes were prepared. The resulting paclitaxel cationic liposomes were stored at 4 ° C. until use.

비교예Comparative example 17.  17. 도세탁셀이Docetaxel 봉입된Enclosed 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

DDAB, 콜레스테롤, DPhPE 및 항암 의약인 도세탁셀을 총 중량을 기준으로 각각 75%, 14.9%, 10% 및 0.1%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 도세탁셀 양이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 도세탁셀 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
DDAB, Cholesterol, DPhPE and Docetaxel, an anticancer drug, were taken at a weight ratio of 75%, 14.9%, 10% and 0.1%, respectively, based on the total weight, and mixed in a Pyrex 10 ml glass septum vial and mixed in the same manner as in Example 1. Docetaxel cationic liposomes were prepared. The docetaxel cationic liposomes obtained were stored at 4 ° C. until use.

비교예Comparative example 18.  18. 도세탁셀이Docetaxel 봉입된Enclosed 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

DOGS, 콜레스테롤, DPhPE 및 항암 의약인 도세탁셀을 총 중량을 기준으로 각각 75%, 14.9%, 10% 및 0.1%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 도세탁셀 양이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 도세탁셀 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
DOGS, cholesterol, DPhPE and docetaxel, an anticancer drug, were taken in a weight ratio of 75%, 14.9%, 10% and 0.1%, respectively, based on the total weight, and mixed in a Pyrex 10 ml glass septum vial and mixed in the same manner as in Example 1. Docetaxel cationic liposomes were prepared. The docetaxel cationic liposomes obtained were stored at 4 ° C. until use.

비교예Comparative example 19.  19. 제피티닙이Gefitinib 봉입된Enclosed 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

DODAP, CHEMS 및 분자표적 항암제인 제피티닙을 총 중량을 기준으로 각각 85%, 14.9% 및 0.1%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 제피티닙 양이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 제피티닙 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
Zephytinib, a DODAP, CHEMS and molecular target anticancer agent, was taken in a weight ratio of 85%, 14.9% and 0.1%, respectively, based on the total weight, mixed in a 10 ml glass diaphragm vial and mixed in the same manner as in Example 1. Pitinib cationic liposomes were prepared. The resulting zephytinib cationic liposomes were stored at 4 ° C. until use.

비교예Comparative example 20.  20. 제피티닙이Gefitinib 봉입된Enclosed 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 제조 Produce

DOGS, CHEMS 및 분자표적 항암제인 제피티닙을 총 중량을 기준으로 각각 85%, 14.9% 및 0.1%의 중량 비율로 취하여 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 제피티닙 양이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 제피티닙 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
DOGS, CHEMS, and gefitinib, a molecular target anticancer agent, were taken in a weight ratio of 85%, 14.9% and 0.1%, respectively, based on the total weight, and mixed in a Pyrex 10 ml glass diaphragm vial and mixed in the same manner as in Example 1. Pitinib cationic liposomes were prepared. The resulting zephytinib cationic liposomes were stored at 4 ° C. until use.

<< 작은간섭Small interference 리보핵산과 지질 나노입자의 복합체 제조> Preparation of Complexes of Ribonucleic Acid and Lipid Nanoparticles>

실시예Example 10.  10. 실시예Example 1의  1 of 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 형광 표지된 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Preparation of Complexes of Fluorescently Labeled Small Interfering Ribonucleic Acids

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, 형광 마커로 표지된 작은 간섭 리보핵산 물질인 Block-iTTM Fluorescent Oligo (Invitrogen, USA) 6 pmole 및 실시예 1에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 1.5 ㎕를 각각 첨가하였다. 미디어에 포함된 작은 간섭 리보핵산의 최종 농도는 20 nM이 되게 맞추었다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 리포좀과 작은 간섭 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was placed in an Eppendorf tube and Block-iT , a small interfering ribonucleic acid labeled with a fluorescent marker 6 pmole of Fluorescent Oligo (Invitrogen, USA) and 1.5 μl of cationic phospholipid liposomes prepared in Example 1 were added, respectively. The final concentration of small interfering ribonucleic acid contained in the media was set to 20 nM. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of liposomes and small interfering ribonucleic acid.

실시예Example 11.  11. 실시예Example 5의  5 of 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 형광 마커로  With fluorescent marker 표지된Labeled 이중나선 리보핵산의 복합체 제조 Complex preparation of double helix ribonucleic acid

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, 형광 표지화 이중나선 리보 핵산인 Block-iTTM Fluorescent Oligo 6 pmole 및 실시예 5에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 1.5 ㎕를 각각 첨가하였다. 미디어에 포함된 이중나선 리보핵산의 최종 농도는 20 nM이 되게 맞추었다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 양이온성 리포좀과 형광 표지화 이중 나선 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
Insert 50 μl of serum-free medium into an Eppendorf tube and block-iT , a fluorescently labeled double-stranded ribonucleic acid. 6 pmole of Fluorescent Oligo and 1.5 μl of cationic phospholipid liposomes prepared in Example 5 were added, respectively. The final concentration of double helix ribonucleic acid in the media was set to 20 nM. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of a cationic liposome and a fluorescently labeled double helix ribonucleic acid.

실시예Example 12.  12. 실시예Example 2의  2 of 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 형광 표지된 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Preparation of Complexes of Fluorescently Labeled Small Interfering Ribonucleic Acids

에펜도르프 튜브에 Cy-5 형광 마커로 표지된 비활성 작은 간섭 리보핵산 (Cy5-siGL2, ST Pharm Co, 한국) 100 pmole 및 실시예 2에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 23 ㎕를 각각 첨가하여, 복합체의 최종 부피가 25 ㎕가 되게 맞추었다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 리포좀과 작은 간섭 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
100 pmole of inactive small interfering ribonucleic acid (Cy5-siGL2, ST Pharm Co, Korea) labeled with a Cy-5 fluorescent marker was added to an Eppendorf tube and 23 μl of cationic phospholipid liposomes prepared in Example 2, respectively. The final volume was adjusted to 25 μl. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of liposomes and small interfering ribonucleic acid.

실시예Example 13.  13. 실시예Example 3의  3 of 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 비활성 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Complex Preparation of Inert Small Interfering Ribonucleic Acids

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, 비활성 작은 간섭 리보핵산 (siGL2) 4 pmole 및 실시예 3에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 1 ㎕를 각각 첨가하였다. 약리활성이 없는 비활성 작은 간섭 리보핵산 (siGL2)은 루시퍼라아제 (luciferase)의 발현을 저해하는 서열로서 삼천리제약 (ST Pharm Co, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 리포좀과 작은 간섭 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was placed in an Eppendorf tube, 4 pmole of inactive small interfering ribonucleic acid (siGL2) and 1 μl of cationic phospholipid liposomes prepared in Example 3 were added, respectively. Inactive small interfering ribonucleic acid (siGL2) with no pharmacological activity was purchased from ST Pharm Co, Korea as a sequence that inhibits the expression of luciferase. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of liposomes and small interfering ribonucleic acid.

실시예Example 14.  14. 실시예Example 4의  4 of 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 비활성 서열 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Preparation of Complexes of Inactive Sequence Small Interfering Ribonucleic Acids

에펜도르프 튜브에 siGL2 100 pmole 및 실시예 4에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 23 ㎕를 각각 첨가하여, 복합체의 최종 부피가 25 ㎕가 되게 맞추었다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 리포좀과 작은 간섭 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
100 pmole of siGL2 and 23 μl of cationic phospholipid liposomes prepared in Example 4 were added to the Eppendorf tube to bring the final volume of the complex to 25 μl. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of liposomes and small interfering ribonucleic acid.

실시예Example 15.  15. 실시예Example 1의  1 of 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and vascularvascular endothelialendothelial growthgrowth factor ( factor ( VEGFVEGF )의 발현을 억제하는 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조Preparation of small interfering ribonucleic acid inhibiting the expression of

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, VEGF의 발현을 선택적으로 억제하는 작은 간섭 리보핵산 (siVEGF) 6 pmole 및 실시예 1에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 1.5 ㎕를 각각 첨가하였다. siVEGF는 혈관 내피세포 증식촉진 인자 (vascular endothelial growth factor)의 발현을 저해하는 서열로서 바이오니아 (Bioneer Co., Korea)에서 구입하여 사용하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 리포좀과 작은 간섭 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was placed in an Eppendorf tube, and 6 pmole of small interfering ribonucleic acid (siVEGF) selectively inhibiting the expression of VEGF and 1.5 μl of the cationic phospholipid liposome prepared in Example 1 were added, respectively. siVEGF was purchased from Bioneer Co., Korea as a sequence that inhibits the expression of vascular endothelial growth factor. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of liposomes and small interfering ribonucleic acid.

실시예Example 16.  16. 실시예Example 4의  4 of 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and VEGFVEGF 의 발현을 억제하는 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조Preparation of Small Interfering Ribonucleic Acids That Inhibit the Expression of

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, siVEGF 6 pmole 및 실시예 4에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 1.5 ㎕를 각각 첨가하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 리포좀과 작은 간섭 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was added to the Eppendorf tube, and siVEGF 6 pmole and 1.5 μl of the cationic phospholipid liposome prepared in Example 4 were added. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of liposomes and small interfering ribonucleic acid.

실시예Example 17.  17. 실시예Example 5의  5 of 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and survivinsurvivin 의 발현을 억제하는 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조Preparation of Small Interfering Ribonucleic Acids That Inhibit the Expression of

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, survivin의 발현을 선택적으로 억제하는 작은 간섭 리보핵산 (siSurvivin) 6 pmole 및 실시예 5에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 1.5 ㎕를 각각 첨가하였다. siSurvivin은 삼천리제약 (ST Pharm Co, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 리포좀과 작은 간섭 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was placed in an Eppendorf tube, and 6 pmole of small interfering ribonucleic acid (siSurvivin) selectively inhibiting the expression of survivin and 1.5 μl of cationic phospholipid liposomes prepared in Example 5 were added, respectively. siSurvivin was purchased from Samchully Pharmaceutical (ST Pharm Co, Korea). After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of liposomes and small interfering ribonucleic acid.

실시예Example 18.  18. 실시예Example 6의  6 of 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and survivinsurvivin 의 발현을 억제하는 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조Preparation of Small Interfering Ribonucleic Acids That Inhibit the Expression of

에펜도르프 튜브에 siSurvivin 100 pmole 및 실시예 6에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 23 ㎕를 각각 첨가하여, 복합체의 최종 부피가 25 ㎕가 되게 맞추었다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 리포좀과 작은 간섭 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
SiSurvivin 100 pmole and 23 μl of cationic phospholipid liposomes prepared in Example 6 were each added to an Eppendorf tube to bring the final volume of the complex to 25 μl. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of liposomes and small interfering ribonucleic acid.

실시예Example 19.  19. 실시예Example 7의  7's 파클리탁셀Paclitaxel 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 비활성 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Complex Preparation of Inert Small Interfering Ribonucleic Acids

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, 비활성 작은간섭 리보핵산인 siGL2 4 pmole 및 실시예 7에서 제조된 파클리탁셀 양이온성 리포좀 1 ㎕를 각각 첨가하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 리포좀과 작은 간섭 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was placed in an Eppendorf tube, and 4 μl of inactive small interfering ribonucleic acid and 1 μl of paclitaxel cationic liposomes prepared in Example 7 were added, respectively. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of liposomes and small interfering ribonucleic acid.

실시예Example 20.  20. 실시예Example 8의  8's 도세탁셀Docetaxel 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 비활성 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Complex Preparation of Inert Small Interfering Ribonucleic Acids

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, siGL2 4 pmole 및 실시예 8에서 제조된 도세탁셀 양이온성 리포좀 1 ㎕를 각각 첨가하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 도세탁셀 리포좀과 작은 간섭 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was added to the Eppendorf tube, and 4 μl of siGL2 and 1 μl of the docetaxel cationic liposome prepared in Example 8 were added thereto. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of docetaxel liposome and small interfering ribonucleic acid.

실시예Example 21.  21. 실시예Example 9의  9's 제피티닙Zefitinib 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 비활성 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Complex Preparation of Inert Small Interfering Ribonucleic Acids

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, siGL2 4 pmole 및 실시예 9에서 제조된 제피티닙 양이온성 리포좀 1 ㎕를 각각 첨가하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 제피티닙 양이온성 리포좀과 작은 간섭 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was added to the Eppendorf tube, and 4 μl of siGL2 and 1 μl of zephytinib cationic liposome prepared in Example 9 were added. After slowly pipetting and mixing, the mixture was allowed to stand at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of zephytinib cationic liposome and small interfering ribonucleic acid.

비교예Comparative example 21.  21. 비교예Comparative example 1의  1 of 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 형광 마커로  With fluorescent marker 표지된Labeled 이중나선 리보핵산의 복합체 제조 Complex preparation of double helix ribonucleic acid

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, 형광 표지화 이중나선 리보 핵산인 Block-iTTM Fluorescent Oligo 6 pmole 및 비교예 1에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 1.5 ㎕를 각각 첨가하였다. 미디어에 포함된 이중나선 리보핵산의 최종 농도는 20 nM이 되게 맞추었다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 양이온성 리포좀과 형광 표지화 이중 나선 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
Insert 50 μl of serum-free medium into an Eppendorf tube and block-iT , a fluorescently labeled double-stranded ribonucleic acid. 1.5 μl of Fluorescent Oligo 6 pmole and cationic phospholipid liposomes prepared in Comparative Example 1 were added, respectively. The final concentration of double helix ribonucleic acid in the media was set to 20 nM. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of a cationic liposome and a fluorescently labeled double helix ribonucleic acid.

비교예Comparative example 22.  22. 비교예Comparative example 4의  4 of 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 형광 마커로  With fluorescent marker 표지된Labeled 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Complex preparation of small interfering ribonucleic acid

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, Block-iTTM Fluorescent Oligo 6 pmole 및 비교예 4에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 1.5 ㎕를 각각 첨가하였다. 미디어에 포함된 작은 간섭 리보핵산의 최종 농도는 20 nM이 되게 맞추었다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 양이온성 리포좀과 형광 표지화 이중 나선 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
Insert 50 μl of serum-free medium into the Eppendorf tube and block-iT TM 1.5 μl of Fluorescent Oligo 6 pmole and cationic phospholipid liposomes prepared in Comparative Example 4 were added, respectively. The final concentration of small interfering ribonucleic acid contained in the media was set to 20 nM. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of a cationic liposome and a fluorescently labeled double helix ribonucleic acid.

비교예Comparative example 23.  23. 비교예Comparative example 9의  9's 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 형광 마커로  With fluorescent marker 표지된Labeled 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Complex preparation of small interfering ribonucleic acid

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, Block-iTTM Fluorescent Oligo를 6 pmole 및 비교예 9에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 1.5 ㎕를 각각 첨가하였다. 미디어에 포함된 작은 간섭 리보핵산의 최종 농도는 20 nM이 되게 맞추었다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 양이온성 리포좀과 형광 표지화 이중 나선 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
Insert 50 μl of serum-free medium into the Eppendorf tube and block-iT TM Fluorescent Oligo was added to 6 pmole and 1.5 μl of cationic phospholipid liposomes prepared in Comparative Example 9, respectively. The final concentration of small interfering ribonucleic acid contained in the media was set to 20 nM. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of a cationic liposome and a fluorescently labeled double helix ribonucleic acid.

비교예Comparative example 24.  24. 비교예Comparative example 7의  7's 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 형광 마커로  With fluorescent marker 표지된Labeled 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Complex preparation of small interfering ribonucleic acid

에펜도르프 튜브에 Cy5-siGL2 100 pmole 및 비교예 7에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 23 ㎕를 각각 첨가하여, 복합체의 최종 부피가 25 ㎕가 되게 맞추었다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 양이온성 리포좀과 형광 표지화 이중 나선 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
100 pmole of Cy5-siGL2 and 23 μl of cationic phospholipid liposomes prepared in Comparative Example 7 were added to the Eppendorf tube to bring the final volume of the complex to 25 μl. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of a cationic liposome and a fluorescently labeled double helix ribonucleic acid.

비교예Comparative example 25.  25. 비교예Comparative example 13의  13's 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 형광 마커로  With fluorescent marker 표지된Labeled 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Complex preparation of small interfering ribonucleic acid

에펜도르프 튜브에 Cy5-siGL2 100 pmole 및 비교예 13에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 23 ㎕를 각각 첨가하여, 복합체의 최종 부피가 25 ㎕가 되게 맞추었다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 양이온성 리포좀과 형광 표지화 이중 나선 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
To the Eppendorf tube, Cy5-siGL2 100 pmole and 23 μl of cationic phospholipid liposomes prepared in Comparative Example 13 were each added to bring the final volume of the complex to 25 μl. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of a cationic liposome and a fluorescently labeled double helix ribonucleic acid.

비교예Comparative example 26.  26. 비교예Comparative example 1의  1 of 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 비활성 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Complex Preparation of Inert Small Interfering Ribonucleic Acids

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, siGL2 4 pmole 및 비교예 1에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 1 ㎕를 각각 첨가하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 양이온성 리포좀과 비활성 이중 나선 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was added to the Eppendorf tube, and 4 μl of siGL2 and 1 μl of the cationic phospholipid liposome prepared in Comparative Example 1 were added. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of a cationic liposome and an inactive double helix ribonucleic acid.

비교예Comparative example 27.  27. 비교예Comparative example 2의  2 of 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 비활성 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Complex Preparation of Inert Small Interfering Ribonucleic Acids

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, siGL2 4 pmole 및 비교예 2에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 1 ㎕를 각각 첨가하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 양이온성 리포좀과 비활성 이중 나선 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was added to the Eppendorf tube, and 4 μl of siGL2 and 1 μl of the cationic phospholipid liposome prepared in Comparative Example 2 were added. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of a cationic liposome and an inactive double helix ribonucleic acid.

비교예Comparative example 28.  28. 비교예Comparative example 10의  10 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 비활성 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Complex Preparation of Inert Small Interfering Ribonucleic Acids

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, siGL2 4 pmole 및 비교예 10에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 1 ㎕를 각각 첨가하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 양이온성 리포좀과 비활성 이중 나선 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was added to the Eppendorf tube, and 4 μl of siGL2 and 1 μl of the cationic phospholipid liposome prepared in Comparative Example 10 were added. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of a cationic liposome and an inactive double helix ribonucleic acid.

비교예Comparative example 29.  29. 비교예Comparative example 14의  14 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 비활성 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Complex Preparation of Inert Small Interfering Ribonucleic Acids

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, siGL2 4 pmole 및 비교예 14에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 1 ㎕를 각각 첨가하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 양이온성 리포좀과 비활성 이중 나선 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was added to the Eppendorf tube, and 4 μl of siGL2 and 1 μl of the cationic phospholipid liposome prepared in Comparative Example 14 were added. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of a cationic liposome and an inactive double helix ribonucleic acid.

비교예Comparative example 30.  30. 비교예Comparative example 3의  3 of 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 비활성 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Complex Preparation of Inert Small Interfering Ribonucleic Acids

에펜도르프 튜브에 siGL2 100 pmole 및 비교예 3에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 23 ㎕를 각각 첨가하여, 복합체의 최종 부피가 25 ㎕가 되게 맞추었다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 양이온성 리포좀과 비활성 이중 나선 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
100 pmole of siGL2 and 23 μl of cationic phospholipid liposomes prepared in Comparative Example 3 were added to the Eppendorf tube to bring the final volume of the complex to 25 μl. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of a cationic liposome and an inactive double helix ribonucleic acid.

비교예Comparative example 31.  31. 비교예Comparative example 8의  8's 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 비활성 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Complex Preparation of Inert Small Interfering Ribonucleic Acids

에펜도르프 튜브에 siGL2 100 pmole 및 비교예 8에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 23 ㎕를 각각 첨가하여, 복합체의 최종 부피가 25 ㎕가 되게 맞추었다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 양이온성 리포좀과 비활성 이중 나선 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
Sipp2 100 pmole and 23 μl of cationic phospholipid liposomes prepared in Comparative Example 8 were each added to the Eppendorf tube to bring the final volume of the complex to 25 μl. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of a cationic liposome and an inactive double helix ribonucleic acid.

비교예Comparative example 32.  32. 비교예Comparative example 4의  4 of 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and VEGFVEGF 의 발현을 억제하는 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조Preparation of Small Interfering Ribonucleic Acids That Inhibit the Expression of

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, siVEGF 6 pmole 및 비교예 4에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 1.5 ㎕를 각각 첨가하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 양이온성 리포좀과 siVEGF의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was placed in an Eppendorf tube, and 1.5 μl of siVEGF 6 pmole and cationic phospholipid liposomes prepared in Comparative Example 4 were added. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of cationic liposomes and siVEGF.

비교예Comparative example 33.  33. 비교예Comparative example 9의  9's 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and VEGFVEGF 의 발현을 억제하는 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조Preparation of Small Interfering Ribonucleic Acids That Inhibit the Expression of

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, siVEGF 6 pmole 및 비교예 9에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 1.5 ㎕를 각각 첨가하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 양이온성 리포좀과 siVEGF의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was placed in an Eppendorf tube, and 1.5 μl of siVEGF 6 pmole and cationic phospholipid liposomes prepared in Comparative Example 9 were added. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of cationic liposomes and siVEGF.

비교예Comparative example 34.  34. 비교예Comparative example 3의  3 of 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and VEGFVEGF 의 발현을 억제하는 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조Preparation of Small Interfering Ribonucleic Acids That Inhibit the Expression of

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, siVEGF 6 pmole 및 비교예 3에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 1.5 ㎕를 각각 첨가하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 양이온성 리포좀과 siVEGF의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was added to the Eppendorf tube, and 1.5 μl of siVEGF 6 pmole and cationic phospholipid liposomes prepared in Comparative Example 3 were added. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of cationic liposomes and siVEGF.

비교예Comparative example 35.  35. 비교예Comparative example 8의  8's 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and VEGFVEGF 의 발현을 억제하는 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조Preparation of Small Interfering Ribonucleic Acids That Inhibit the Expression of

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, siVEGF 6 pmole 및 비교예 8에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 1.5 ㎕를 각각 첨가하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 양이온성 리포좀과 siVEGF의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was added to the Eppendorf tube, and 1.5 μl of siVEGF 6 pmole and cationic phospholipid liposomes prepared in Comparative Example 8 were added. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of cationic liposomes and siVEGF.

비교예Comparative example 36.  36. 비교예Comparative example 6의  6 of 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and SurvivinSurvivin 의 발현을 억제하는 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조Preparation of Small Interfering Ribonucleic Acids That Inhibit the Expression of

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, siSurvivin 6 pmole 및 비교예 6에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 1.5 ㎕를 각각 첨가하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 양이온성 리포좀과 siSurvivin의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was added to the Eppendorf tube, and 1.5 μl of siSurvivin 6 pmole and cationic phospholipid liposomes prepared in Comparative Example 6 were added. These were slowly pipetted, mixed, and allowed to stand at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of cationic liposomes and siSurvivin.

비교예Comparative example 37.  37. 비교예Comparative example 12의  12 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and SurvivinSurvivin 의 발현을 억제하는 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조Preparation of Small Interfering Ribonucleic Acids That Inhibit the Expression of

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, siSurvivin 6 pmole 및 비교예 12에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 1.5 ㎕를 각각 첨가하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 양이온성 리포좀과 siSurvivin의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was added to the Eppendorf tube, and siSurvivin 6 pmole and 1.5 μl of the cationic phospholipid liposome prepared in Comparative Example 12 were added. These were slowly pipetted, mixed, and allowed to stand at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of cationic liposomes and siSurvivin.

비교예Comparative example 38.  38. 비교예Comparative example 5의  5 of 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and SurvivinSurvivin 의 발현을 억제하는 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조Preparation of Small Interfering Ribonucleic Acids That Inhibit the Expression of

에펜도르프 튜브에 siSurvivin 100 pmole 및 비교예 5에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 23 ㎕를 각각 첨가하여, 복합체의 최종 부피가 25 ㎕가 되게 맞추었다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 양이온성 리포좀과 siSurvivin의 복합체를 제조하였다.
SiSurvivin 100 pmole and 23 μl of cationic phospholipid liposomes prepared in Comparative Example 5 were each added to an Eppendorf tube to bring the final volume of the complex to 25 μl. These were slowly pipetted, mixed, and allowed to stand at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of cationic liposomes and siSurvivin.

비교예Comparative example 39.  39. 비교예Comparative example 11의  Of 11 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and SurvivinSurvivin 의 발현을 억제하는 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조Preparation of Small Interfering Ribonucleic Acids That Inhibit the Expression of

에펜도르프 튜브에 siSurvivin 100 pmole 및 비교예 11에서 제조된 양이온성 인지질 리포좀 23 ㎕를 각각 첨가하여, 복합체의 최종 부피가 25 ㎕가 되게 맞추었다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 양이온성 리포좀과 siSurvivin의 복합체를 제조하였다.
SiSurvivin 100 pmole and 23 μl of cationic phospholipid liposomes prepared in Comparative Example 11 were each added to an Eppendorf tube to bring the final volume of the complex to 25 μl. These were slowly pipetted, mixed, and allowed to stand at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of cationic liposomes and siSurvivin.

비교예Comparative example 40.  40. 비교예Comparative example 15의  15's 파클리탁셀Paclitaxel 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 비활성 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Complex Preparation of Inert Small Interfering Ribonucleic Acids

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, siGL2 4 pmole 및 비교예 15에서 제조된 파클리탁셀 양이온성 리포좀 1 ㎕를 각각 첨가하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 양이온성 리포좀과 비활성 이중 나선 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was placed in an Eppendorf tube, and 4 μl of siGL2 and 1 μl of paclitaxel cationic liposomes prepared in Comparative Example 15 were added thereto. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of a cationic liposome and an inactive double helix ribonucleic acid.

비교예Comparative example 41.  41. 비교예Comparative example 16의  16 파클리탁셀Paclitaxel 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 비활성 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Complex Preparation of Inert Small Interfering Ribonucleic Acids

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, siGL2 4 pmole 및 비교예 16에서 제조된 파클리탁셀 양이온성 리포좀 1 ㎕를 각각 첨가하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 파클리탁셀 양이온성 리포좀과 비활성 이중 나선 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was added to an Eppendorf tube, and 4 μl of siGL2 and 1 μl of paclitaxel cationic liposomes prepared in Comparative Example 16 were added thereto. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of paclitaxel cationic liposomes and inactive double helix ribonucleic acid.

비교예Comparative example 42.  42. 비교예Comparative example 17의  17's 도세탁셀Docetaxel 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 비활성 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Complex Preparation of Inert Small Interfering Ribonucleic Acids

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, siGL2 4 pmole 및 비교예 17에서 제조된 도세탁셀 양이온성 리포좀 1 ㎕를 각각 첨가하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 도세탁셀 양이온성 리포좀과 비활성 이중 나선 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was added to the Eppendorf tube, and 4 μl of siGL2 and 1 μl of the docetaxel cationic liposome prepared in Comparative Example 17 were added thereto. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of docetaxel cationic liposome and inactive double helix ribonucleic acid.

비교예Comparative example 43.  43. 비교예Comparative example 18의  18 도세탁셀Docetaxel 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 비활성 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Complex Preparation of Inert Small Interfering Ribonucleic Acids

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, siGL2 4 pmole 및 비교예 18에서 제조된 도세탁셀 양이온성 리포좀 1 ㎕를 각각 첨가하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 도세탁셀 양이온성 리포좀과 비활성 이중 나선 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was added to an Eppendorf tube, and 4 μl of siGL2 and 1 μl of the docetaxel cationic liposome prepared in Comparative Example 18 were added thereto. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of docetaxel cationic liposome and inactive double helix ribonucleic acid.

비교예Comparative example 44.  44. 비교예Comparative example 19의  19's 제피티닙Zefitinib 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 비활성 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Complex Preparation of Inert Small Interfering Ribonucleic Acids

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, siGL2 4 pmole 및 비교예 19에서 제조된 제피티닙 양이온성 리포좀 1 ㎕를 각각 첨가하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 제피티닙 양이온성 리포좀과 비활성 이중 나선 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was added to the Eppendorf tube, and 4 μl of siGL2 and 1 μl of zephytinib cationic liposome prepared in Comparative Example 19 were added. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of zephytinib cationic liposomes and inactive double helix ribonucleic acid.

비교예Comparative example 45.  45. 비교예Comparative example 20의  20's 제피티닙Zefitinib 양이온성Cationic 리포좀과Liposomes and 비활성 작은 간섭 리보핵산의 복합체 제조 Complex Preparation of Inert Small Interfering Ribonucleic Acids

에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕를 넣고, siGL2 4 pmole 및 비교예 20에서 제조된 제피티닙 양이온성 리포좀 1 ㎕를 각각 첨가하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하여 제피티닙 양이온성 리포좀과 비활성 이중 나선 리보핵산의 복합체를 제조하였다.
50 μl of serum-free medium was added to an Eppendorf tube, and 4 μl of siGL2 and 1 μl of zephytinib cationic liposome prepared in Comparative Example 20 were added. After slowly pipetting and mixing, the mixture was left at room temperature for 20 minutes to prepare a complex of zephytinib cationic liposomes and inactive double helix ribonucleic acid.

[[ 실험예Experimental Example ]]

세포 배양Cell culture

사람의 폐암 세포인 A549 및 Calu-6 세포주, 쥐의 폐암 세포인 LLC1, 쥐의 흑색종 세포인 B16F10 세포주는 ATCC (American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하여 사용하였다. A549 및 Calu-6 세포주는 RPMI (Gibco, USA), LLC1 및 B16F10 세포주는 DMEM (Dulbecco's modified eagles medium, Gibco, USA)에 10% 우태아 혈청 w/v (HyClone laboratories Inc, USA)와 100 unit/ml 페니실린 또는 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 포함하여 배양하였다.
Human lung cancer A549 and Calu-6 cell lines, rat lung cancer cells LLC1, and mouse melanoma cells B16F10 cell lines were purchased from ATCC (American Type Culture Collection, USA). A549 and Calu-6 cell lines were RPMI (Gibco, USA), LLC1 and B16F10 cell lines in DMEM (Dulbecco's modified eagles medium, Gibco, USA) with 10% fetal bovine serum w / v (HyClone laboratories Inc, USA) and 100 unit / Incubation was performed with ml penicillin or 100 μg / ml streptomycin.

실험예Experimental Example 1. B16F10 세포주에서의 작은 간섭 리보핵산의 전달 효율 평가:  1.Evaluation of delivery efficiency of small interfering ribonucleic acid in B16F10 cell line: FACSFACS 분석 analysis

B16F10 세포주를 실험 전날 24 웰 플레이트에 웰 당 8×10⁴개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70%정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 21, 22, 23, 실시예 10 및 실시예 11의 제조된 리포좀-작은 간섭 리보핵산의 복합체들을 웰 플레이트에 첨가하여 37 ℃의 CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2번 세척하였다. 비교예 21, 22, 23, 실시예 10 및 실시예 11에서 사용된 리포좀-작은 간섭 리보핵산 복합체들은 모두 형광 표지된 작은 간섭 리보핵산을 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR (BD Bioscience, USA)를 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 내 작은 간섭 리보핵산의 전달 효율을 분석하였고, 이를 도 1에 나타내었다.B16F10 cell lines were seeded 8 × 10 μL per well in 24 well plates the day before the experiment. When the cells of each plate were grown uniformly by 60-70%, the prepared liposome-small interfering ribonucleic acid complexes of Comparative Examples 21, 22, 23, 10 and 11 were added to the well plate at 37 ° C. The incubator was incubated for 24 hours. The cultured cells were collected and washed twice with phosphate buffer solution. The liposome-small interfering ribonucleic acid complexes used in Comparative Examples 21, 22, 23, Example 10, and Example 11 all contained fluorescently labeled small interfering ribonucleic acids as components, and the BD FACS CALIBUR (BD) Bioscience, USA) was used to analyze the transfer efficiency of small interfering ribonucleic acid in cells by shifting the fluorescence intensity peak, which is shown in FIG. 1.

도 1A의 세포에 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 도 1B는 비교예 21의 양이온성 리포좀, 도 1C는 비교예 22의 양이온성 리포좀, 도 1D는 비교예 23의 양이온성 리포좀, 도 1E는 실시예 10의 신규한 양이온성 리포좀, 도 1F는 실시예 11의 신규한 양이온성 리포좀으로 도 1B는 57.2%, 도 1C는 45.7%, 도 1D는 27.4%의 세포 내부로 형광으로 표지된 작은 간섭 리보핵산이 전달되었다. 반면, 본 발명의 실시예 10 및 실시예 11의 EDOPC 및 콜레스테롤 기반 리포좀 조성 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 각각 92.0%와 95.7%를 나타내어 비교예 21, 22, 23의 양이온성 리포좀 처리군에 비하여 세포 내 작은 간섭 리보핵산의 전달 효율이 현저히 높음을 알 수 있다.
The untreated group, which was not treated to the cells of Figure 1A did not shift the peak to the control group, Figure 1B is a cationic liposome of Comparative Example 21, Figure 1C is a cationic liposome of Comparative Example 22, Figure 1D is a cation of Comparative Example 23 Sex liposomes, FIG. 1E shows the novel cationic liposomes of Example 10, FIG. 1F shows the novel cationic liposomes of Example 11, 57.2% of FIG. 1B, 45.7% of FIG. 1C, and 27.4% of FIG. 1D. Fluorescently labeled small interfering ribonucleic acid was delivered. On the other hand, in the EDOPC and cholesterol-based liposome composition treatment group of Examples 10 and 11 of the present invention, the proportion of cells labeled with fluorescence was 92.0% and 95.7%, respectively, so that the cationic liposomes of Comparative Examples 21, 22, and 23 were shown. Compared to the treatment group, the intracellular delivery efficiency of small interfering ribonucleic acid is significantly higher.

실험예Experimental Example 2. A549 세포주에서의 작은 간섭 리보핵산 전달체의 세포 독성 평가:  2. Cytotoxicity Assessment of Small Interfering Ribonucleic Acid Carriers in A549 Cell Line: MTTMTT 분석법  Analysis method

본 발명의 EDOPC 및 스테롤계의 물질로 구성되는 양이온성 인지질 리포좀의 비특이적 세포 독성에 관한 평가를 하기 위하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다. 전달체에 의해 발생하는 비특이적 세포 독성을 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 시약에 의한 방법으로 세포 생존율을 측정하여 평가하였다. A549 세포를 웰 당 2×104 세포가 되도록 48 웰에 분주(seeding)하고 12시간 배양한 후, 세포에 비교예 26, 27, 28, 29의 제조된 리포좀-작은 간섭 리보핵산의 복합체와 실시예 13에서 제조된 EDOPC 및 콜레스테롤 기반 리포좀 복합체를 각각 웰 플레이트에 첨가하여 37 ℃의 CO₂세포배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 MTT 용액(Sigma, USA)을 배지의 10%가 되도록 가하고, 4시간 더 배양한 다음 상층액을 제거하고 0.04 N 염산 이소프로판올 용액을 첨가한 후에 엘라이져 리더 (ELISA reader, Sunrise-Basic TECAN, Switzerland)를 이용하여 570 nm에서 그 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포가 사용되었다.In order to evaluate the non-specific cytotoxicity of the cationic phospholipid liposome consisting of the EDOPC and sterol-based material of the present invention, the experiment was performed as follows. Nonspecific cytotoxicity caused by the carrier was assessed by measuring cell viability by the method of 3- (4,5-dimethylthiazole-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) reagent. A549 cells were seeded in 48 wells to be 2 × 10 4 cells per well and incubated for 12 hours, and then the cells were prepared with the complexes of prepared liposome-small interfering ribonucleic acids of Comparative Examples 26, 27, 28, and 29. EDOPC and cholesterol-based liposome complexes prepared in Example 13 were each added to well plates and incubated in a CO 2 cell incubator at 37 ° C. for 24 hours. Then MTT solution (Sigma, USA) was added to 10% of the medium, incubated for 4 hours more, the supernatant was removed and 0.04 N isopropanol solution was added, followed by ELISA reader, Sunrise-Basic TECAN, Its absorbance was measured at 570 nm. As a control, cells treated with nothing were used.

도 2는 상기의 비활성 작은 간섭 리보핵산과 복합체를 이룬 리포좀 제형들의 비특이적 세포 독성을 평가한 결과로 비교예 26, 27, 28, 29의 양이온성 리포좀 처리군에 비하여 실시예 13의 EDOPC, 콜레스테롤 및 DOPE 기반 양이온성 리포좀 처리조성이 더 적은 비특이적 세포 독성 효과를 나타낸다는 것을 보여준다.
FIG. 2 shows the results of evaluating the nonspecific cytotoxicity of liposome formulations complexed with the inactive small interfering ribonucleic acid, compared to the cationic liposome treatment groups of Comparative Examples 26, 27, 28 and 29. DOPE based cationic liposome treatment compositions show less nonspecific cytotoxic effects.

실험예Experimental Example 3. B16F10 세포주에서의 작은 간섭 리보핵산 전달 효능 평가:  3.Evaluation of small interfering ribonucleic acid delivery efficacy in B16F10 cell line: 역전사Reverse transcription 효소 중합 반응에 의한  By enzyme polymerization mRNAmRNA 발현 변화 분석  Expression change analysis

B16F10 세포주를 실험 전날 24 웰 플레이트에 웰 당 세포를 8×10⁴개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때, The B16F10 cell line was seeded 8 × 10 cells per well in a 24 well plate the day before the experiment. When the cells of each plate grow uniformly by 60-70%,

비교예 32, 33 및 실시예 15의 제조된 리포좀-작은 간섭 리보핵산의 복합체들을 웰 플레이트에 첨가하여 37 ℃의 CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 미디어에 포함된 siVEGF의 최종 농도는 20 nM이 되게 맞추었다. 24시간 후 Trizol 시약 (Invitrogen, USA)을 사용하여 세포 내에 존재하는 전체 리보핵산(RNA)을 분리하였으며, 이 RNA는 AccuPowerRT PreMix (Bioneer, Korea)를 사용하여 cDNA로 역전사 하였다. 중합효소연쇄반응은 95℃에서 5분간 주형 DNA를 전변성화시킨 후, 95℃/1분; 60℃/1분; 및 72℃/1분을 한 사이클로 하여 최종 30회 반복한 다음, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시키는 조건으로 수행하였다. VEGF에 특이적인 프라이머의 서열은 5'-TCCCACAGGTGTCCCGGCAA-3'(정방향), 5'-TCTCTGCCTCCGTGAGGGGC-3'(역방향)이며 중합효소연쇄반응 생성물의 크기는 266 염기쌍이었다. VEGF 유전자 발현의 정도는 1 % 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 VEGF 특이적인 연쇄반응 생성물의 밴드 밀도를 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 증폭하여 나타나는 밴드 밀도로 보정하여 정량적인 발현의 변화를 측정하였다.Complexes of prepared liposome-small interfering ribonucleic acids of Comparative Examples 32, 33 and Example 15 were added to well plates and incubated for 24 hours in a CO 2 incubator at 37 ° C. The final concentration of siVEGF contained in the media was set to 20 nM. After 24 hours, total ribonucleic acid (RNA) present in the cells was isolated using Trizol reagent (Invitrogen, USA), and the RNA was reverse transcribed into cDNA using AccuPowerRT PreMix (Bioneer, Korea). The polymerase chain reaction was performed by denature the template DNA for 5 minutes at 95 ℃, 95 ℃ / 1 minutes; 60 ° C./1 min; And 72 ° C./1 min in one cycle, the final 30 times were repeated, and finally, the reaction was carried out at 72 ° C. for 5 minutes. The sequences of primers specific for VEGF were 5'-TCCCACAGGTGTCCCGGCAA-3 '(forward), 5'-TCTCTGCCTCCGTGAGGGGC-3' (reverse) and the size of the polymerase chain reaction product was 266 base pairs. The degree of VEGF gene expression was quantitatively changed by performing 1% agarose gel electrophoresis and correcting the band density of VEGF-specific chain reaction products by amplifying the band density of amplified glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene. Was measured.

도 3은 각각의 조성을 처리한 경우 B16F10 세포내에서 타겟 유전자인 VEGF의 전사체 발현을 밴드의 밀도로 비교한 것이다. 대조군은 VEGF 특이적인 작은 간섭 리보핵산이 세포 내로 전달되지 않아 VEGF 유전자의 발현에 변화가 없었고, 비교예 32, 33의 양이온성 리포좀과 리보핵산의 복합체 처리군에 비하여 실시예 15의 EDOPC 및 콜레스테롤 기반 양이온성 리포좀과 VEGF 특이적 작은 간섭 리보핵산의 복합체 처리군의 경우 세포 내에서 VEGF 유전자 발현이 현저히 억제되었다. 실시예 15에서 VEGF 유전자의 mRNA 수준의 발현 억제능이 가장 증가한 것은 세포 내로 VEGF 특이적인 작은 간섭 리보핵산을 전달하는 효율이 가장 높은 결과 나타나는 현상으로 해석된다.
FIG. 3 compares the transcript expression of VEGF, a target gene in B16F10 cells, by the density of bands, when the respective compositions were treated. In the control group, VEGF-specific small interfering ribonucleic acid was not delivered into the cell, and thus the expression of the VEGF gene was not changed. In the complex treated group of cationic liposomes and VEGF-specific small interfering ribonucleic acid, expression of VEGF gene was significantly inhibited in cells. In Example 15, the greatest increase in the mRNA expression level of the VEGF gene is interpreted as a phenomenon that results in the highest efficiency of delivering VEGF-specific small interfering ribonucleic acid into cells.

실험예Experimental Example 4.  4. CaluCalu -6 세포주에서의 작은 간섭 리보핵산 전달 효능 평가: Evaluation of Small Interfering Ribonucleic Acid Delivery Efficacy in -6 Cell Lines: 역전사Reverse transcription 효소 중합 반응에 의한  By enzyme polymerization mRNAmRNA 발현 변화 분석  Expression change analysis

Calu-6 세포주를 실험 전날 24 웰 플레이트에 웰 당 세포를 8×10⁴개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때, Calu-6 cell line was seeded 8 × 10 cells per well in 24 well plates the day before the experiment. When the cells of each plate grow uniformly by 60-70%,

비교예 34, 35 및 실시예 16의 제조된 리포좀-작은 간섭 리보핵산의 복합체들을 웰 플레이트에 첨가하여 37 ℃의 CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 미디어에 포함된 siVEGF의 최종 농도는 20 nM이 되게 맞추었다. 24시간 후 Trizol 시약을 사용하여 세포 내에 존재하는 전체 RNA를 분리하였으며, 이 RNA는 AccuPowerRT PreMix를 사용하여 cDNA로 역전사 하였다. 중합효소연쇄반응은 95℃에서 5분간 주형 DNA를 전변성화시킨 후, 95℃/1분; 60℃/1분; 및 72℃/1분을 한 사이클로 하여 최종 30회 반복한 다음, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시키는 조건으로 수행하였다. VEGF에 특이적인 프라이머의 서열은 5'-AGGAGGGCAGAATCATCACG-3'(정방향), 5'-CAAGGCCCACAGGGATTTTCT-3'(역방향)이며 중합효소연쇄반응 생성물의 크기는 342 염기쌍이었다. VEGF 유전자 발현의 정도는 1 % 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 VEGF 특이적인 연쇄반응 생성물의 밴드 밀도를 GAPDH 유전자를 증폭하여 나타나는 밴드 밀도로 보정하여 정량적인 발현의 변화를 측정하였다.Complexes of prepared liposome-small interfering ribonucleic acids of Comparative Examples 34, 35 and Example 16 were added to a well plate and incubated for 24 hours in a CO 2 incubator at 37 ° C. The final concentration of siVEGF contained in the media was set to 20 nM. After 24 hours, the total RNA present in the cells was isolated using Trizol reagent, and the RNA was reverse transcribed into cDNA using AccuPowerRT PreMix. The polymerase chain reaction was performed by denature the template DNA for 5 minutes at 95 ℃, 95 ℃ / 1 minutes; 60 ° C./1 min; And 72 ° C./1 min in one cycle, the final 30 times were repeated, and finally, the reaction was carried out at 72 ° C. for 5 minutes. The primers specific for VEGF were 5'-AGGAGGGCAGAATCATCACG-3 '(forward), 5'-CAAGGCCCACAGGGATTTTCT-3' (reverse), and the size of the polymerase chain reaction product was 342 base pairs. The degree of VEGF gene expression was measured by 1% agarose gel electrophoresis to correct the band density of the VEGF-specific chain reaction product by the band density appearing by amplifying the GAPDH gene.

도 4는 각각의 조성을 처리한 경우 Calu-6 세포내에서 타겟 유전자인 VEGF의 전사체 발현을 밴드의 밀도로 비교한 것이다. 대조군은 VEGF 특이적인 작은 간섭 리보핵산이 세포 내로 전달되지 않아 VEGF 유전자의 발현에 변화가 없었고, 비교예 34, 35의 양이온성 리포좀과 리보핵산의 복합체 처리군에 비하여 실시예 16의 EDOPC 및 스티그마스테롤 기반 양이온성 리포좀과 VEGF 특이적 작은 간섭 리보핵산의 복합체 처리군의 경우 세포 내에서 VEGF 유전자 발현이 현저히 억제되었다. 실시예 16에서 VEGF 유전자의 mRNA 수준의 발현 억제능이 가장 증가한 것은 세포 내로 siVEGF를 전달하는 효율이 가장 높은 결과 나타나는 현상으로 해석된다.
FIG. 4 compares the transcript expression of VEGF, a target gene, in the density of bands in Calu-6 cells when each composition is treated. In the control group, VEGF-specific small interfering ribonucleic acid was not delivered into the cells, and thus the expression of the VEGF gene was not changed. VEGF gene expression was significantly inhibited in the cell-treated group of the base cationic liposomes and the VEGF-specific small interfering ribonucleic acid. In Example 16, the most increased inhibitory ability of mRNA expression of the VEGF gene is interpreted as a phenomenon that results in the highest efficiency of siVEGF delivery into cells.

실험예Experimental Example 5. A549 세포주에서의 작은 간섭 리보핵산 전달 효능 평가:  5.Evaluation of small interfering ribonucleic acid transfer efficacy in A549 cell line: 역전사Reverse transcription 효소 중합 반응에 의한  By enzyme polymerization mRNAmRNA 발현 변화 분석  Expression change analysis

A549 세포주를 실험 전날 24 웰 플레이트에 웰 당 세포를 8×10⁴개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때, The A549 cell line was seeded 8 × 10 ⁴ cells per well in 24 well plates the day before the experiment. When the cells of each plate grow uniformly by 60-70%,

비교예 36, 37 및 실시예 17의 제조된 리포좀-작은 간섭 리보핵산의 복합체들을 웰 플레이트에 첨가하여 37 ℃의 CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 미디어에 포함된 siSurvivin의 최종 농도는 20 nM이 되게 맞추었다. 24시간 후 Trizol 시약을 사용하여 세포 내에 존재하는 전체 RNA를 분리하였으며, 이 RNA는 AccuPowerRT PreMix를 사용하여 cDNA로 역전사 하였다. 중합효소연쇄반응은 95℃에서 5분간 주형 DNA를 전변성화시킨 후, 95℃/1분; 57℃/1분; 및 72℃/1분을 한 사이클로 하여 최종 32회 반복한 다음, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시키는 조건으로 수행하였다. 서바이빈에 특이적인 프라이머의 서열은 5'-GGACCACCGCATCTCTACAT-3'(정방향), 5'-CTTTCTCCGCAGTTTCCTCA-3'(역방향)이며 중합효소연쇄반응 생성물의 크기는 347 염기쌍이었다. 서바이빈 유전자 발현의 정도는 1 % 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 서바이빈 특이적인 연쇄반응 생성물의 밴드 밀도를 GAPDH 유전자를 증폭하여 나타나는 밴드 밀도로 보정하여 정량적인 발현의 변화를 측정하였다.Complexes of prepared liposome-small interfering ribonucleic acids of Comparative Examples 36, 37 and Example 17 were added to a well plate and incubated for 24 hours in a CO 2 incubator at 37 ° C. The final concentration of siSurvivin in the media was set to 20 nM. After 24 hours, the total RNA present in the cells was isolated using Trizol reagent, and the RNA was reverse transcribed into cDNA using AccuPowerRT PreMix. The polymerase chain reaction was performed by denature the template DNA for 5 minutes at 95 ℃, 95 ℃ / 1 minutes; 57 ° C./1 min; And 72 ° C./1 min in one cycle, repeating the final 32 times, and finally performing the reaction at 72 ° C. for 5 minutes. The primers specific for survivin were 5'-GGACCACCGCATCTCTACAT-3 '(forward), 5'-CTTTCTCCGCAGTTTCCTCA-3' (reverse), and the size of the polymerase chain reaction product was 347 base pairs. The degree of survivin gene expression was measured by 1% agarose gel electrophoresis, and the band density of the survivin-specific chain reaction product was corrected by the band density appearing by amplifying the GAPDH gene.

도 5는 각각의 조성을 처리한 경우 A549 세포내에서 타겟 유전자인 서바이빈의 전사체 발현을 밴드의 밀도로 비교한 것이다. 대조군은 서바이빈 특이적인 작은 간섭 리보핵산이 세포 내로 전달되지 않아 서바이빈 유전자의 발현에 변화가 없었고, 비교예 36, 37의 양이온성 리포좀과 리보핵산의 복합체 처리군에 비하여 실시예 17의 EDOPC 및 콜레스테롤 기반 양이온성 리포좀과 서바이빈 특이적 작은 간섭 리보핵산의 복합체 처리군의 경우 세포 내에서 서바이빈 유전자 발현이 현저히 억제되었다. 실시예 17에서 서바이빈 유전자의 mRNA 수준의 발현 억제능이 가장 증가한 것은 세포 내로 서바이빈 특이적인 작은 간섭 리보핵산을 전달하는 효율이 가장 높은 결과 나타나는 현상으로 해석된다.
FIG. 5 compares the expression of transcripts of survivin, a target gene, in A549 cells by the density of bands in the treatment of each composition. In the control group, survivin-specific small interfering ribonucleic acid was not delivered into the cell, so there was no change in the expression of the survivin gene, and compared to the complex treatment group of the cationic liposome and ribonucleic acid of Comparative Examples 36 and 37. In the complex treated group of EDOPC and cholesterol-based cationic liposomes with survivin-specific small interfering ribonucleic acid, survivin gene expression was significantly inhibited in cells. In Example 17, the greatest increase in the ability of the survivin gene to suppress the expression of mRNA is interpreted as a phenomenon that results in the highest efficiency of delivering survivin-specific small interfering ribonucleic acid into cells.

실험예Experimental Example 6.  6. LLC1LLC1 세포주에서의 작은 간섭 리보핵산 전달 효능 평가:  To evaluate the efficacy of small interfering ribonucleic acid delivery in cell lines: 역전사Reverse transcription 효소 중합 반응에 의한  By enzyme polymerization mRNAmRNA 발현 변화 분석  Expression change analysis

LLC1 세포주를 실험 전날 24 웰 플레이트에 웰 당 세포를 8×10⁴개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때, The LLC1 cell line was seeded 8 × 10 ⁴ cells per well in 24 well plates the day before the experiment. When the cells of each plate grow uniformly by 60-70%,

비교예 36, 37 및 실시예 17의 제조된 리포좀-작은 간섭 리보핵산의 복합체들을 웰 플레이트에 첨가하여 37 ℃의 CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 미디어에 포함된 siSurvivin의 최종 농도는 20 nM이 되게 맞추었다. 24시간 후 Trizol 시약을 사용하여 세포 내에 존재하는 전체 RNA를 분리하였으며, 이 RNA는 AccuPowerRT PreMix를 사용하여 cDNA로 역전사 하였다. 중합효소연쇄반응은 95℃에서 5분간 주형 DNA를 전변성화시킨 후, 95℃/1분; 57℃/1분; 및 72℃/1분을 한 사이클로 하여 최종 32회 반복한 다음, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시키는 조건으로 수행하였다. 서바이빈에 특이적인 프라이머의 서열은 5'-ATCCACTGCCCTACCGAGAA-3'(정방향), 5'-CTTGGCTCTCTGTCTGTCCAGTT-3'(역방향)이며 중합효소연쇄반응 생성물의 크기는 200 염기쌍이었다. 서바이빈 유전자 발현의 정도는 1 % 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 서바이빈 특이적인 연쇄반응 생성물의 밴드 밀도를 GAPDH 유전자를 증폭하여 나타나는 밴드 밀도로 보정하여 정량적인 발현의 변화를 측정하였다.Complexes of prepared liposome-small interfering ribonucleic acids of Comparative Examples 36, 37 and Example 17 were added to well plates and incubated for 24 hours in a CO 2 incubator at 37 ° C. The final concentration of siSurvivin in the media was set to 20 nM. After 24 hours, the total RNA present in the cells was isolated using Trizol reagent, and the RNA was reverse transcribed into cDNA using AccuPowerRT PreMix. The polymerase chain reaction was performed by denature the template DNA for 5 minutes at 95 ℃, 95 ℃ / 1 minutes; 57 ° C./1 min; And 72 ° C./1 min in one cycle, repeating the final 32 times, and finally performing the reaction at 72 ° C. for 5 minutes. The primers specific for survivin were 5'-ATCCACTGCCCTACCGAGAA-3 '(forward), 5'-CTTGGCTCTCTGTCTGTCCAGTT-3' (reverse), and the size of the polymerase chain reaction product was 200 base pairs. The degree of survivin gene expression was measured by 1% agarose gel electrophoresis, and the band density of the survivin-specific chain reaction product was corrected by the band density appearing by amplifying the GAPDH gene.

도 6는 각각의 조성을 처리한 경우 LLC1 세포내에서 타겟 유전자인 서바이빈의 전사체 발현을 밴드의 밀도로 비교한 것이다. 대조군은 서바이빈 특이적인 작은 간섭 리보핵산이 세포 내로 전달되지 않아 서바이빈 유전자의 발현에 변화가 없었고, 비교예 36, 37의 양이온성 리포좀과 리보핵산의 복합체 처리군에 비하여 실시예 17의 EDOPC 및 콜레스테롤 기반 양이온성 리포좀과 서바이빈 특이적 작은 간섭 리보핵산의 복합체 처리군의 경우 세포 내에서 서바이빈 유전자 발현이 현저히 억제되었다. 실시예 17에서 서바이빈 유전자의 mRNA 수준의 발현 억제능이 가장 증가한 것은 세포 내로 서바이빈 특이적인 작은 간섭 리보핵산을 전달하는 효율이 가장 높은 결과 나타나는 현상으로 해석된다.
FIG. 6 compares the transcript expression of survivin, a target gene, in the density of bands in LLC1 cells when the respective compositions were treated. In the control group, survivin-specific small interfering ribonucleic acid was not delivered into the cell, so there was no change in the expression of the survivin gene, and compared to the complex treatment group of the cationic liposome and ribonucleic acid of Comparative Examples 36 and 37. In the complex treated group of EDOPC and cholesterol-based cationic liposomes with survivin-specific small interfering ribonucleic acid, survivin gene expression was significantly inhibited in cells. In Example 17, the greatest increase in the ability of the survivin gene to suppress the expression of mRNA is interpreted as a phenomenon that results in the highest efficiency of delivering survivin-specific small interfering ribonucleic acid into cells.

실험예Experimental Example 7. B16F10 세포주에서의  7. In the B16F10 Cell Line 파클리탁셀Paclitaxel 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 항암 효능 평가:  Anticancer efficacy evaluation: MTTMTT 분석 analysis

B16F10 세포에 비교예 40, 41의 파클리탁셀이 봉입된 파클리탁셀 양이온성 리포좀과 실시예 19의 EDOPC 및 DC-Chol 조성을 기반으로 한 파클리탁셀 양이온성 리포좀을 각각 처리하고 세포 내로 전달된 항암제에 의한 암세포의 생존율을 평가하였다. 항암 효능은 MTT 시약에 의한 방법으로 세포 생존율을 측정하여 평가하였다.Survival of cancer cells by treatment of paclitaxel cationic liposomes containing Paclitaxel of Comparative Examples 40 and 41 and paclitaxel cationic liposomes based on EDOPC and DC-Chol composition of Example 19, respectively, and delivered into the B16F10 cells. Evaluated. Anticancer efficacy was evaluated by measuring cell viability by the method with MTT reagent.

B16F10 세포를 웰 당 2×104 세포가 되도록 48 웰에 분주(seeding)하고 12시간 배양한 후 비교예 40, 41의 파클리탁셀이 봉입된 양이온성 리포좀 복합체, 실시예 19의 EDOPC 및 DC-Chol 조성을 기반으로 한 파클리탁셀 양이온성 리포좀 복합체를 각각 웰 플레이트에 첨가하여 37 ℃의 CO₂세포배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 MTT 용액을 배지의 10%가 되도록 가하고, 4시간 더 배양한 다음 상층액을 제거하고 0.04 N 염산 이소프로판올 용액을 첨가한 후에 엘라이져 리더를 이용하여 570 nm에서 그 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포가 사용되었다. 도 7은 상기의 파클리탁셀이 봉입된 리포좀 제형들의 항암 효능을 평가한 결과로 비교예 40, 41의 파클리탁셀 함유 양이온성 리포좀 복합체 보다 실시예 19의 EDOPC 및 DC-Chol 조성을 기반으로 한 파클리탁셀 양이온성 리포좀 복합체가 더 증강된 암세포 사멸효과를 나타낸다는 것을 보여준다. 이러한 도 17의 항암 효능 결과로부터 실시예 19의 EDOPC 및 DC-Chol 조성을 기반으로 한 파클리탁셀 양이온성 리포좀 복합체의 경우 B16F10 세포주 내부에 보다 효과적으로 파클리탁셀을 전달하여 증강된 항암 효능을 나타내는 것을 추론할 수 있다.
B16F10 cells were seeded in 48 wells for 2 × 10 4 cells per well and incubated for 12 hours, and then cationic liposome complexes containing Paclitaxel of Comparative Examples 40 and 41, EDOPC and DC-Chol composition of Example 19 were prepared. Based on the paclitaxel cationic liposome complex was added to each well plate and incubated for 24 hours in a CO 2 cell incubator at 37 ℃. The MTT solution was then added to 10% of the medium, incubated for another 4 hours, the supernatant was removed, and the absorbance was measured at 570 nm using an ELISA reader after addition of 0.04 N isopropanol solution. As a control, cells treated with nothing were used. FIG. 7 shows paclitaxel cationic liposome complexes based on the EDOPC and DC-Chol compositions of Example 19 as compared with the paclitaxel-containing cationic liposome complexes of Comparative Examples 40 and 41 as a result of evaluating the anticancer efficacy of the paclitaxel-encapsulated liposome formulations. Shows a more enhanced cancer cell killing effect. From the anticancer efficacy results of FIG. 17, it can be inferred that paclitaxel cationic liposome complexes based on the EDOPC and DC-Chol compositions of Example 19 exhibited enhanced anticancer efficacy by more effectively delivering paclitaxel into the B16F10 cell line.

실험예Experimental Example 8.  8. LLC1LLC1 세포주에서의  In cell lines 도세탁셀Docetaxel 양이온성Cationic 리포좀의 항암 효능 평가:  Assessment of anticancer efficacy of liposomes: MTTMTT 분석 analysis

LLC1 세포에 비교예 42, 43의 도세탁셀이 봉입된 도세탁셀 양이온성 리포좀과 실시예 20의 EDOPC, 콜레스테롤 및 DPhPE 조성을 기반으로 한 도세탁셀 양이온성 리포좀을 각각 처리하고 세포 내로 전달된 항암제에 의한 암세포의 생존율을 평가하였다. 항암 효능은 MTT 시약에 의한 방법으로 세포 생존율을 측정하여 평가하였다.The survival rate of cancer cells by treatment with docetaxel cationic liposomes containing the docetaxel of Comparative Examples 42 and 43 and the docetaxel cationic liposomes based on the composition of EDOPC, cholesterol and DPhPE of Example 20, respectively, was delivered to the LLC1 cells. Evaluated. Anticancer efficacy was evaluated by measuring cell viability by the method with MTT reagent.

LLC1 세포를 웰 당 2×104 세포가 되도록 48 웰에 분주(seeding)하고 12시간 배양한 후 비교예 42, 43의 도세탁셀이 봉입된 양이온성 리포좀 복합체, 실시예 20의 EDOPC, 콜레스테롤 및 DPhPE 조성을 기반으로 한 도세탁셀 양이온성 리포좀 복합체를 각각 웰 플레이트에 첨가하여 37 ℃의 CO₂세포배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 MTT 용액을 배지의 10%가 되도록 가하고, 4시간 더 배양한 다음 상층액을 제거하고 0.04 N 염산 이소프로판올 용액을 첨가한 후에 엘라이져 리더를 이용하여 570 nm에서 그 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포가 사용되었다. 도 8은 상기의 도세탁셀이 봉입된 리포좀 제형들의 항암 효능을 평가한 결과로 비교예 42, 43의 도세탁셀 함유 양이온성 리포좀 복합체 보다 실시예 20의 EDOPC, 콜레스테롤 및 DPhPE 조성을 기반으로 한 도세탁셀 양이온성 리포좀 복합체가 더 증강된 암세포 사멸효과를 나타낸다는 것을 보여준다. 이러한 도 8의 항암 효능 결과로부터 실시예 20의 EDOPC, 콜레스테롤 및 DPhPE 조성을 기반으로 한 도세탁셀 양이온성 리포좀 복합체의 경우 LLC1 세포주 내부에 보다 효과적으로 도세탁셀을 전달하여 증강된 항암 효능을 나타내는 것을 추론할 수 있다.
The LLC1 cells were seeded in 48 wells to be 2 × 10 4 cells per well and incubated for 12 hours, and the cationic liposome complexes containing the docetaxel of Comparative Examples 42 and 43, and the EDOPC, cholesterol, and DPhPE compositions of Example 20 were prepared. Based docetaxel cationic liposome complexes were added to each well plate and incubated for 24 hours in a CO 2 cell incubator at 37 ° C. The MTT solution was then added to 10% of the medium, incubated for another 4 hours, the supernatant was removed, and the absorbance was measured at 570 nm using an ELISA reader after addition of 0.04 N isopropanol solution. As a control, cells treated with nothing were used. 8 is a result of evaluating the anticancer efficacy of the docetaxel-embedded liposome formulations as compared to the docetaxel-containing cationic liposome complexes of Comparative Examples 42 and 43, and the docetaxel cationic liposome complexes based on the EDOPC, cholesterol and DPhPE compositions of Example 20. Shows a more enhanced cancer cell killing effect. From the anticancer efficacy results of FIG. 8, it can be inferred that the docetaxel cationic liposome complexes based on the EDOPC, cholesterol, and DPhPE compositions of Example 20 exhibited enhanced anticancer efficacy by delivering docetaxel more effectively into the LLC1 cell line.

실험예Experimental Example 9. A549 세포주에서의  9.A549 cell line 제피티닙Zefitinib 양이온성Cationic 리포좀의Liposome 항암 효능 평가:  Anticancer efficacy evaluation: MTTMTT 분석 analysis

A549 세포에 비교예 44, 45의 제피티닙이 봉입된 제피티닙 양이온성 리포좀과 실시예 21의 EDOPC 및 CHEMS 조성을 기반으로 한 제피티닙 양이온성 리포좀을 각각 처리하고 세포 내로 전달된 항암제에 의한 암세포의 생존율을 평가하였다. 항암 효능은 MTT 시약에 의한 방법으로 세포 생존율을 측정하여 평가하였다.The A549 cells were treated with zephytinib cationic liposomes containing Zephytinib of Comparative Examples 44 and 45 and Zephytinib cationic liposomes based on the EDOPC and CHEMS compositions of Example 21, respectively, and were delivered by an anticancer agent delivered into the cells. The survival rate of cancer cells was evaluated. Anticancer efficacy was evaluated by measuring cell viability by the method with MTT reagent.

A549 세포를 웰 당 2×104 세포가 되도록 48 웰에 분주(seeding)하고 12시간 배양한 후 비교예 44, 45의 제피티닙이 봉입된 양이온성 리포좀 복합체, 실시예 21의 EDOPC 및 CHEMS 조성을 기반으로 한 제피티닙 양이온성 리포좀 복합체를 각각 웰 플레이트에 첨가하여 37 ℃의 CO₂세포배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 MTT 용액을 배지의 10%가 되도록 가하고, 4시간 더 배양한 다음 상층액을 제거하고 0.04 N 염산 이소프로판올 용액을 첨가한 후에 엘라이져 리더를 이용하여 570 nm에서 그 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포가 사용되었다. 도 9는 상기의 제피티닙이 봉입된 리포좀 제형들의 항암 효능을 평가한 결과로 비교예 44, 45의 제피티닙 함유 양이온성 리포좀 복합체 보다 실시예 21의 EDOPC 및 CHEMS 조성을 기반으로 한 제피티닙 양이온성 리포좀 복합체가 더 증강된 암세포 사멸효과를 나타낸다는 것을 보여준다. 이러한 도 9의 항암 효능 결과로부터 실시예 21의 EDOPC 및 CHEMS 조성을 기반으로 한 제피티닙 양이온성 리포좀 복합체의 경우 A549 세포주 내부에 보다 효과적으로 제피티닙을 전달하여 증강된 항암 효능을 나타내는 것을 추론할 수 있다.
The A549 cells were seeded in 48 wells to be 2 × 10 4 cells per well, and cultured for 12 hours, followed by cationic liposome complexes containing Zephytinib of Comparative Examples 44 and 45, and EDOPC and CHEMS compositions of Example 21. Zephytinib cationic liposome complexes based on each were added to well plates and incubated for 24 hours in a CO 2 cell incubator at 37 ° C. The MTT solution was then added to 10% of the medium, incubated for another 4 hours, the supernatant was removed, and the absorbance was measured at 570 nm using an ELISA reader after addition of 0.04 N isopropanol solution. As a control, cells treated with nothing were used. FIG. 9 shows the results of evaluating the anticancer efficacy of the above-described liposome formulations containing zephytinib. Zephytinib based on the EDOPC and CHEMS composition of Example 21 than the zephytinib-containing cationic liposome complexes of Comparative Examples 44 and 45 It shows that cationic liposome complexes show more enhanced cancer cell killing effect. From the anticancer efficacy results of FIG. 9, it can be inferred that the zephytinib cationic liposome complexes based on the EDOPC and CHEMS compositions of Example 21 exhibited enhanced anticancer efficacy by delivering zephytinib more effectively inside the A549 cell line. have.

실험예Experimental Example 10. B16F10-유래 설치류 폐암 모델에서의 작은 간섭 리보핵산의 전달 효율 평가:  10.Evaluation of small interfering ribonucleic acid transfer efficiency in B16F10-derived rodent lung cancer model: FACSFACS 분석 analysis

B16F10 세포주를 인산 완충 용액 50 ㎕에 1×106 개씩 희석한 후, 7주령 된 쥐의 꼬리 정맥 혈관에 주입(injection)하여 B16F10-유래 설치류 폐암 모델을 유도하였다. 4일 후, 비교예 24, 25 및 실시예 12의 제조된 리포좀-작은 간섭 리보핵산의 복합체들을 마이크로스프레이어 (MicroSprayer, Penn-century Inc., USA)를 통해 기도 내 주입(intra-tracheal injection) 방식으로 주입하고, 4시간 이후 폐조직을 적출하였다. 각각의 폐조직을 40 ㎛ 직경의 세포 여과기 (Cell Strainer, SPL Life Sciences, Korea)를 통해 균질화한 이후 적혈구 용해 완충 용액 1 ㎖ 상에서 5분 간 방치하였다. 이 후 세포를 수집하고 인산완충용액으로 2번 세척하였다. 비교예 24, 25 및 실시예 12에서 사용된 리포좀-작은 간섭 리보핵산 복합체들은 모두 형광으로 표지된 작은 간섭 리보핵산을 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR를 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 내 작은 간섭 리보핵산의 전달 효율을 분석하였고, 이를 도 10에 나타내었다.The B16F10 cell line was diluted 1 × 10 6 in 50 μl of phosphate buffer solution and then injected into the tail vein blood vessels of 7 week old mice to induce a B16F10-derived rodent lung cancer model. After 4 days, intra-tracheal injection of the prepared liposome-small interfering ribonucleic acids of Comparative Examples 24, 25 and Example 12 via MicroSprayer, Penn-century Inc., USA And injected into the lung tissue after 4 hours. Each lung tissue was homogenized through a 40 μm diameter cell strainer (Cell Strainer, SPL Life Sciences, Korea) and then left on 1 ml of erythrocyte lysis buffer solution for 5 minutes. Cells were then collected and washed twice with phosphate buffer solution. The liposome-small interfering ribonucleic acid complexes used in Comparative Examples 24, 25 and Example 12 all contained fluorescently labeled small interfering ribonucleic acids as constituents of the fluorescence intensity peak using a BD FACS CALIBUR, a fluorescent flow cytometer. The transfer efficiency of intracellular small interfering ribonucleic acid by migration was analyzed and shown in FIG. 10.

도 10A의 세포에 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 점 분포가 이동하지 않았고, 도 10B는 비교예 24의 양이온성 리포좀, 도 10C는 비교예 25의 양이온성 리포좀, 도 10D는 실시예 12의 EDOPC 및 DC-Chol 조성을 기반으로 한 양이온성 리포좀 복합체로서, 도 10B는 23.9%, 도 10C는 39.4%의 세포 내부로 형광으로 표지된 작은 간섭 리보핵산이 전달되었다. 반면, 본 발명의 실시예 12의 EDOPC 및 DC-Chol 기반 리포좀 조성 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 87.1% 를 나타내어 비교예 24, 25의 양이온성 리포좀 처리군에 비하여 폐조직 세포 내 작은 간섭 리보핵산의 전달 효율이 현저히 높음을 알 수 있다.
In the untreated group, which was not treated in the cells of FIG. 10A, the point distribution did not shift to the control group, FIG. 10B is the cationic liposome of Comparative Example 24, FIG. 10C is the cationic liposome of Comparative Example 25, and FIG. As a cationic liposome complex based on EDOPC and DC-Chol composition, small interfering ribonucleic acid labeled with fluorescence was delivered to cells 23.9% in FIG. 10B and 39.4% in FIG. 10C. On the other hand, in the EDOPC and DC-Chol-based liposome composition treatment group of Example 12 of the present invention, the percentage of cells labeled with fluorescence was 87.1%, compared to the cationic liposome treatment groups of Comparative Examples 24 and 25 in lung tissue cells. It can be seen that the transfer efficiency of small interfering ribonucleic acid is remarkably high.

실험예Experimental Example 11. B16F10-유래 설치류 폐암 모델에서의 작은 간섭 리보핵산 전달체의 생체 독성 평가: 개체 생존율 분석 11. Biotoxicity Assessment of Small Interfering Ribonucleic Acid Carriers in a B16F10-Derived Rodent Lung Cancer Model: Individual Viability Analysis

B16F10 세포주를 인산 완충 용액 50 ㎕에 1×106 개씩 희석한 후, 7주령 된 쥐의 꼬리 정맥 혈관에 주입(injection)하여 B16F10-유래 설치류 폐암 모델을 유도하였다. 4일 후, 비교예 30, 31 및 실시예 14의 제조된 리포좀-작은 간섭 리보핵산의 복합체들을 마이크로스프레이어를 통해 기도 내 주입 방식으로 주입하였다. 3시간 이후 생존을 확인하고 생존한 개체에 위와 동일한 방법으로 다시 복합체를 주입하였다. 3회 반복 후 개체의 생존을 확인하고 이를 통해 양이온성 리포좀의 생체 독성을 평가하였고, 이를 도 11에 나타내었다. The B16F10 cell line was diluted 1 × 10 6 in 50 μl of phosphate buffer solution and then injected into the tail vein blood vessels of 7 week old mice to induce a B16F10-derived rodent lung cancer model. After 4 days, the complexes of the prepared liposome-small interfering ribonucleic acids of Comparative Examples 30, 31 and Example 14 were injected via a microspray in an intraperitoneal injection manner. Survival was confirmed after 3 hours, and the surviving individuals were injected with the complex again in the same manner as above. After three iterations, the survival of the individual was confirmed, and the biotoxicity of the cationic liposome was evaluated through this, which is shown in FIG. 11.

도 11은 상기의 비활성 작은 간섭 리보핵산과 복합체를 이룬 리포좀 제형들의 비특이적 생체 독성을 평가한 결과로 비교예 30, 31의 양이온성 리포좀 처리군에 비하여 실시예 14의 EDOPC 및 스티그마스테롤 기반 양이온성 리포좀 처리조성이 더 적은 비특이적 생체 독성 결과를 나타낸다는 것을 보여준다.
11 shows the non-specific biotoxicity of liposome formulations complexed with the inactive small interfering ribonucleic acid as described above, compared to the cationic liposome treatment groups of Comparative Examples 30 and 31, and the cationic liposomes based on EDOPC of Example 14 It is shown that the treatment composition shows less nonspecific biotoxicity results.

실험예Experimental Example 12.  12. LLC1LLC1 -유래 설치류 폐암 모델에서의 작은 간섭 리보핵산 전달 효능 평가: -Evaluation of small interfering ribonucleic acid transfer efficacy in derived rodent lung cancer model: 역전사Reverse transcription 효소 중합 반응에 의한  By enzyme polymerization mRNAmRNA 발현 변화 분석  Expression change analysis

LLC1 세포주를 인산 완충 용액 50 ㎕에 1×106 개씩 희석한 후, 7주령 된 쥐의 꼬리 정맥 혈관에 주입(injection)하여 LLC1-유래 설치류 폐암 모델을 유도하였다. 4일 후부터 이틀 간격으로 siSurvivin 단독, 비교예 38, 39 및 실시예 18의 제조된 리포좀-작은 간섭 리보핵산의 복합체들을 마이크로스프레이어를 통해 기도 내 주입 방식으로 4회 주입하였다. 복합체의 마지막 주입이 끝난 익일에 폐조직을 적출하고 인산완충용액으로 세척한 후, 폐조직의 일부를 Trizol 시약을 사용하여 세포 내에 존재하는 전체 RNA를 분리하였으며, 실험예 6과 동일한 방법으로 역전사 효소 중합 반응을 통해 서바이빈 전사체 발현을 분석하였다.The LLC1 cell line was diluted 1 × 10 6 in 50 μl of phosphate buffer solution, and then injected into the tail vein blood vessels of 7-week-old mice to induce LLC1-derived rodent lung cancer model. Four days later, the complexes of siSurvivin alone, the prepared liposome-small interfering ribonucleic acids of Comparative Examples 38, 39 and Example 18, were injected four times by means of intra-airway injection via a microspray. On the next day after the last injection of the complex, the lung tissue was extracted and washed with phosphate buffer solution, and a part of the lung tissue was isolated from the total RNA present in the cells using Trizol reagent. Survivin transcript expression was analyzed via polymerization.

도 12는 각각의 조성을 LLC1-유래 설치류 폐암 모델에 주입한 경우 폐조직 세포내에서 타겟 유전자인 서바이빈의 전사체 발현을 밴드의 밀도로 비교한 것이다. 대조군과 siSurvivin 단독 처리군은 서바이빈 특이적인 작은 간섭 리보핵산이 세포 내로 전달되지 않아 서바이빈 유전자의 발현에 변화가 없었고, 비교예 38, 39의 양이온성 리포좀과 리보핵산의 복합체 처리군에 비하여 실시예 18의 EDOPC, 콜레스테롤 및 DOPE 기반 양이온성 리포좀과 서바이빈 특이적 작은 간섭 리보핵산의 복합체 처리군의 경우 세포 내에서 서바이빈 유전자 발현이 현저히 억제되었다. 실시예 18에서 서바이빈 유전자의 mRNA 수준의 발현 억제능이 가장 증가한 것은 기도 내 주입 방식으로 폐조직에 리포좀-작은 간섭 리보핵산 복합체를 전달 하였을 경우, 폐조직 세포 내로 서바이빈 특이적인 작은 간섭 리보핵산을 전달하는 효율이 가장 높은 결과 나타나는 현상으로 해석된다.
FIG. 12 compares the transcript expression of survivin, a target gene, in the lung tissue cells by density of bands when each composition is injected into an LLC1-derived rodent lung cancer model. The control group and siSurvivin alone group did not transfer survivin-specific small interfering ribonucleic acid into the cell, resulting in no change in the expression of survivin gene, and compared to the cationic liposomes and ribonucleic acid complexes of Comparative Examples 38 and 39. Compared to the EDOPC, cholesterol, and DOPE-based cationic liposomes of Example 18 and the survivin-specific small interfering ribonucleic acid complex, survivin gene expression was significantly suppressed in cells. In Example 18, the expression of survivin gene mRNA was suppressed the most when the liposome-small interfering ribonucleic acid complex was delivered to lung tissue by intra-intracheal injection. It is interpreted as a phenomenon that results in the highest efficiency of nucleic acid delivery.

실험예Experimental Example 13.  13. LLC1LLC1 -유래 설치류 폐암 모델에서의 작은 간섭 리보핵산 전달 효능 평가: -Evaluation of small interfering ribonucleic acid transfer efficacy in derived rodent lung cancer model: westernwestern blotblot 에 의한 표적 단백질 발현 변화 분석 Analysis of target protein expression by

실험예 12의 적출한 폐조직의 일부를 세포 용해 완충 용액을 사용하여 세포 내에 존재하는 전체 단백질을 분리하였으며 western blot 방법을 이용하여 타겟 단백질의 생성 여부를 분석하였다. 서바이빈 단백질은 서바이빈 항체 (Abcam, USA)를 사용하여 검출하였고 밴드 밀도를 β-actin 단백질을 검출하여 나타나는 밴드 밀도를 통해 정성적으로 발현의 변화를 추정하였다.Some of the extracted lung tissues of Experimental Example 12 were isolated from the whole proteins in cells using a cell lysis buffer solution and analyzed for the production of target proteins using western blot method. Survivin protein was detected using a survivin antibody (Abcam, USA), and the band density was estimated qualitatively through the band density indicated by detecting the β-actin protein.

도 13은 각각의 조성을 LLC1-유래 설치류 폐암 모델에 주입한 경우 폐조직 세포내에서 타겟 단백질인 서바이빈의 발현을 밴드의 밀도로 비교한 것이다. 대조군과 siSurvivin 단독 처리군은 서바이빈 특이적인 작은 간섭 리보핵산이 세포 내로 전달되지 않아 서바이빈 단백질의 발현에 변화가 없었고, 비교예 38, 39의 양이온성 리포좀과 리보핵산의 복합체 처리군에 비하여 실시예 18의 EDOPC, 콜레스테롤 및 DOPE 기반 양이온성 리포좀과 서바이빈 특이적 작은 간섭 리보핵산의 복합체 처리군의 경우 세포 내에서 서바이빈 단백질 발현이 현저히 억제되었다. 실시예 18에서 서바이빈 단백질 수준의 형성 억제능이 가장 증가한 것은 기도 내 주입 방식으로 폐조직에 리포좀-작은 간섭 리보핵산 복합체를 전달하였을 경우, 폐조직 세포 내로 서바이빈 특이적인 작은 간섭 리보핵산을 전달하는 효율이 가장 높은 결과 나타나는 현상으로 해석된다.
FIG. 13 compares the expression of survivin, a target protein, in the density of bands in lung tissue cells when each composition is injected into an LLC1-derived rodent lung cancer model. In the control group and siSurvivin alone group, no survivin-specific small interfering ribonucleic acid was delivered into the cell, so there was no change in the expression of survivin protein, and compared to the cationic liposomes and ribonucleic acid complexes of Comparative Examples 38 and 39. Compared with the EDOPC, cholesterol, and DOPE-based cationic liposomes of Example 18 and the survivin-specific small interfering ribonucleic acid complex, survivin protein expression was significantly inhibited in cells. In Example 18, the greatest increase in the ability to inhibit the formation of survivin protein levels was obtained by injecting the survivin-specific small interfering ribonucleic acid into the lung tissue when the liposome-small interfering ribonucleic acid complex was delivered to the lung tissue by intra-airway injection. It is interpreted as a phenomenon that results in the highest transmission efficiency.

실험예Experimental Example 14. B16F10-유래 설치류 폐암 모델에서의 정맥주사를 통한  14. Via Intravenous Injection in B16F10-Derived Rodent Lung Cancer Models 폐조직Lung tissue 내로의 작은 간섭 리보핵산의 전달 효능 평가: 형광  Evaluation of the Delivery Efficacy of Small Interfering Ribonucleic Acids Into: Fluorescence 이미징Imaging 기법에 의한 각 장기별 분포량 분석  Analysis of distribution by each organ by technique

B16F10 세포주를 인산 완충 용액 50 ㎕에 1×106 개씩 희석한 후, 7주령 된 쥐의 꼬리 정맥 혈관에 주입(injection)하여 B16F10-유래 설치류 폐암 모델을 유도하였다. 4일 후, 비교예 24, 25 및 실시예 12의 제조된 리포좀-작은 간섭 리보핵산의 복합체들을 정맥 혈관 주입(intravenous injection) 방식으로 주입하고, 4시간 이후 폐, 간, 신장 및 비장 조직을 적출하였고, 각각의 조직을 인산완충용액으로 세척하였다. 비교예 24, 25 및 실시예 12에서 사용된 리포좀-작은 간섭 리보핵산 복합체들은 모두 형광으로 표지된 작은 간섭 리보핵산을 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 이미징 분석기인 Image Station 4000MM Digital Imaging System (Eastman Kodak Company, USA)을 사용하여 장기별 상대적 형광 강도 세기에 의한 폐조직으로의 작은 간섭 리보핵산의 전달 효율을 분석하였고, 이를 도 14에 나타내었다.The B16F10 cell line was diluted 1 × 10 6 in 50 μl of phosphate buffer solution and then injected into the tail vein blood vessels of 7 week old mice to induce a B16F10-derived rodent lung cancer model. After 4 days, the complexes of prepared liposome-small interfering ribonucleic acids of Comparative Examples 24, 25 and Example 12 were injected by intravenous injection, and lung, liver, kidney and spleen tissues were extracted after 4 hours. Each tissue was washed with phosphate buffer solution. The liposome-small interfering ribonucleic acid complexes used in Comparative Examples 24, 25 and Example 12 all contain fluorescently labeled small interfering ribonucleic acid as components and are a fluorescence imaging analyzer Image Station 4000MM Digital Imaging System (Eastman Kodak Company). , USA) was used to analyze the transfer efficiency of small interfering ribonucleic acid to lung tissue by the relative fluorescence intensity intensity for each organ, which is shown in FIG. 14.

도 14A의 세포에 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 모든 장기에서 형광이 검출되지 않았고, 도 14B는 Cy5-siGL2 단독 처리군, 도 14C는 비교예 24의 양이온성 리포좀 복합체 처리군, 도 14D는 비교예 25의 양이온성 리포좀 복합체 처리군, 도 14E는 실시예 12의 EDOPC 및 DC-Chol 조성을 기반으로 한 양이온성 리포좀 복합체 처리군으로서, 본 발명의 실시예 12의 EDOPC 및 DC-Chol 기반 리포좀 조성 처리군의 경우 폐조직에서의 형광 검출량이 Cy5-siGL2 단독 처리군, 비교예 24의 양이온성 리포좀 복합체 처리군, 비교예 25의 양이온성 리포좀 복합체 처리군에 비하여 현저하게 높음을 알 수 있다. 실시예 12의 폐조직에서 형광 검출량이 가장 증가한 것은 정맥 혈관 주입 방식으로 생체 내에 리포좀-작은 간섭 리보핵산 복합체를 전달하였을 경우, 폐조직 세포 내로 EDOPC 및 DC-Chol 기반 리포좀이 형광으로 표지된 작은 간섭 리보핵산을 전달하는 효율이 가장 높은 결과 나타나는 현상으로 해석된다.
In the untreated group treated with no cells in FIG. 14A, no fluorescence was detected in all organs as a control group, FIG. 14B is a Cy5-siGL2 alone group, FIG. 14C is a cationic liposome complex treatment group of Comparative Example 24, and FIG. Cationic liposome complex treatment group of Comparative Example 25, Figure 14E is a cationic liposome complex treatment group based on the EDOPC and DC-Chol composition of Example 12, EDOPC and DC-Chol-based liposome composition of Example 12 of the present invention In the treatment group, the amount of fluorescence detection in lung tissue was significantly higher than that of the Cy5-siGL2 treatment group, the cationic liposome complex treatment group of Comparative Example 24, and the cationic liposome complex treatment group of Comparative Example 25. The greatest increase in the amount of fluorescence detection in the lung tissues of Example 12 was that when the liposome-small interfering ribonucleic acid complex was delivered in vivo by intravenous vascular infusion, the small interference in which the EDOPC and DC-Chol-based liposomes were fluorescently labeled into the lung tissue cells It is interpreted as a phenomenon that results in the highest efficiency of delivering ribonucleic acid.

Claims (18)

1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, EDOPC) 및 스테롤(Sterol)계 화합물을 포함하는 양이온성 인지질 나노입자를 포함하며,
상기 스테롤계 화합물은 콜레스테롤, 3b-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바밀}콜레스테롤 (3b-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-cabamyl]cholesterol, DC-Chol), 스티그마스테롤(stigmasterol), 캄페스테롤(campesterol), 시토스테롤(sitosterol), 에르고스테롤(ergosterol), 라노스테롤(lanosterol), 디노스테롤(dinosterol), 고르고스테롤(gorgosterol), 아베나스테롤(avenasterol), 사린고스테롤(saringosterol) 및 퓨코스테롤(fucosterol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분이고,
상기 EDOPC가 양이온성 인지질 나노입자를 구성하는 총 물질 100 중량부에 대해 57 내지 95 중량부로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 폐 조직 특이적으로 약물을 전달하기 위한 약물전달체 조성물.
Cationic phospholipid nano including 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, EDOPC) and sterol-based compounds Contains particles,
The sterol compound is cholesterol, 3b- [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) -carbamyl} cholesterol (3b- [N- (N', N'-dimethylaminoethane) -cabamyl] cholesterol, DC- Chol, stigmasterol, campesterol, sitosterol, ergosterol, lanosterol, dinoosterol, gorosteroster, avenasterol At least one component selected from the group consisting of saringosterol and fucosterol,
The drug delivery composition for delivering a drug specifically to lung tissue, characterized in that the EDOPC is contained 57 to 95 parts by weight based on 100 parts by weight of the total material constituting the cationic phospholipid nanoparticles.
제1항에 있어서,
상기 양이온성 인지질 나노입자는 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine, DOPE), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DPhPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DSPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DPPE) 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포 융합성 인지질을 추가로 포함하는 것인 폐 조직 특이적으로 약물을 전달하기 위한 약물전달체 조성물.
The method of claim 1,
The cationic phospholipid nanoparticles are dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE), 1,2-dipitanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (1,2-Diphytanoyl-sn-glycero- 3-phosphoethanolamine (DPhPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DSPE), 1,2-di palmitoyl -sn- glycero-3-phospho-ethanolamine (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero -3-phosphoethanolamine, DPPE) and 1, 2-diol Leo days - sn - glycero-3-phosphocholine (1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-phosphocholine, DOPC) further comprising at least one cell fusion phospholipid selected from the group consisting of drug delivery composition for delivering the drug to the lung tissue specific.
제2항에 있어서,
상기 세포 융합성 인지질은 양이온성 인지질 나노입자를 구성하는 총 물질 100 중량부에 대해 1 내지 15 중량부로 포함되는 것인 폐 조직 특이적으로 약물을 전달하기 위한 약물전달체 조성물.
The method of claim 2,
The cell fusion phospholipid is 1 to 15 parts by weight based on 100 parts by weight of the total material constituting the cationic phospholipid nanoparticles drug delivery composition for delivering a drug specifically to lung tissue.
제1항에 있어서,
상기 양이온성 인지질 나노입자는 세레브로시드, 1,2-디스테아로일-sn-글리세롤-3-포스포에탄올아민-N-[폴레이트(폴리에틸렌 글리콜)-2000], (1,2-디아실-sn-글리세롤-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-1000] 및 (1,2-디스테아로일-sn-글리세롤-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 유도체를 추가적으로 포함하는 것인 폐 조직 특이적으로 약물을 전달하기 위한 약물전달체 조성물.
The method of claim 1,
The cationic phospholipid nanoparticles include cerebroside, 1,2-dstearoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine-N- [folate (polyethylene glycol) -2000], (1,2-dia Sil-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethylene glycol) -1000] and (1,2-distaroyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine-N- [ Methoxy (polyethylene glycol) -2000] further comprises at least one lipid derivative selected from the group consisting of.
제4항에 있어서,
상기 지질 유도체는 양이온성 인지질 나노입자를 구성하는 총 물질 100 중량부에 대해 1 내지 10 중량부로 포함되는 것인 폐 조직 특이적으로 약물을 전달하기 위한 약물전달체 조성물.
The method of claim 4, wherein
The lipid derivative is 1 to 10 parts by weight based on 100 parts by weight of the total material constituting the cationic phospholipid nanoparticles drug delivery composition for delivering a drug specifically to lung tissue.
제1항에 있어서,
상기 양이온성 인지질 나노입자가 리포좀(liposome), 미셀(micelle), 에멀젼(emulsion) 및 고형 지질 나노입자(solid lipid nanoparticle)로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 가진 것인 폐 조직 특이적으로 약물을 전달하기 위한 약물전달체 조성물.
The method of claim 1,
The cationic phospholipid nanoparticles have a formulation selected from the group consisting of liposomes, micelles, emulsions and solid lipid nanoparticles to deliver drug specifically to lung tissue. Drug delivery composition for.
제1항에 있어서,
상기 양이온성 인지질 나노입자는 10 내지 500nm 크기의 입자경을 가지는 것인 폐 조직 특이적으로 약물을 전달하기 위한 약물전달체 조성물.
The method of claim 1,
The cationic phospholipid nanoparticles have a particle diameter of 10 to 500nm size drug delivery composition for delivering drugs specifically to lung tissue.
제1항에 있어서,
상기 양이온성 인지질 나노입자는 약물이 도입되어 있어 인지질 나노입자-약물 복합체를 이루고 있는 것인 폐 조직 특이적으로 약물을 전달하기 위한 약물전달체 조성물.
The method of claim 1,
The cationic phospholipid nanoparticle is a drug carrier composition for delivering the drug to the lung tissue specific drug is introduced to form a phospholipid nanoparticle-drug complex.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약물은 핵산인 폐 조직 특이적으로 약물을 전달하기 위한 약물전달체 조성물.
The method according to any one of claims 1 to 8,
The drug is a drug delivery composition for delivering the drug to the lung tissue specific nucleic acid.
제9항에 있어서,
상기 핵산은 리보핵산(RNA), 작은 간섭 리보핵산(small interfering RNA), 안티센스 올리고핵산(antisense oligonucleotide), 데옥시리보 핵산(DNA) 또는 앱타머(aptamer)인 폐 조직 특이적으로 약물을 전달하기 위한 약물전달체 조성물.
10. The method of claim 9,
The nucleic acid delivers drugs specifically to lung tissue, such as ribonucleic acid (RNA), small interfering RNA, antisense oligonucleotide, deoxyribonucleic acid (DNA), or aptamer. Drug delivery composition for.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약물은 항암제인 폐 조직 특이적으로 약물을 전달하기 위한 약물전달체 조성물.
The method according to any one of claims 1 to 8,
The drug is a drug delivery composition for delivering the drug to the lung tissue specific anti-cancer agent.
제11항에 있어서,
상기 항암제는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 트라스투주맙, 제피티닙, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 로무스틴 및 카르무스틴으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 약물인 폐 조직 특이적으로 약물을 전달하기 위한 약물전달체 조성물.
The method of claim 11,
The anticancer agent is nitrogen mustard, imatinib, oxaliplatin, rituximab, erlotinib, trastuzumab, zefitinib, bortezomib, sunitinib, carboplatin, sorafenib, bevacizumab, cisplatin, cetuximab, Biscumalbum, asparaginase, tretinoin, hydroxycarbamide, dasatinib, estramastine, gemtuzumab ozogamycin, ibritumab tucetan, heptaplatin, methylaminolevulinic acid, amsacrine, alemtu Zumab, procarbazine, alprostadil, holmium nitrate chitosan, gemcitabine, doxyfluidine, pemetrexed, tegapur, capecitabine, gimerasine, oterasyl, azacytidine, methotrexate, uracil, Cytarabine, Fluorouracil, Fludagabine, Enositabine, Decitabine, Mercaptopurine, Thioguanine, Cladribine, Carmofer, Raltitrexed, Docetaxel, Paclitaxel, Irinotecan, Velotecan, Topotecan, Vino Lelvin, etoposide, vincristine, vinblastine, teniposide, doxorubicin, idarubicin, epirubicin, mitoxantrone, mitomycin, bleomycin, daunorubicin, dactinomycin, pyrarubicin, Aclarubicin, pepromycin, temozolomide, busulfan, ifosfamide, cyclophosphamide, melfaran, altretmin, dacarbazine, chiotepa, nimustine, chlorambucil, mitolactol, romustine And a drug delivery composition for delivering a drug specifically to lung tissue which is at least one drug selected from the group consisting of carmustine.
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