KR101037178B1 - 비뉴클레오시드 계열의 ｃ형 간염 치료 또는 예방제 - Google Patents

비뉴클레오시드 계열의 ｃ형 간염 치료 또는 예방제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 C형 간염의 치료 또는 예방에 유용한 비뉴클레오티드 계열의 신규 화합물 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염, 이들을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물 및 이들의 C형 간염 치료 또는 예방 용도에 관한 것이다.
C형 간염, 비뉴클레오시드, 중합효소, 저해제

Description

비뉴클레오시드 계열의 Ｃ형 간염 치료 또는 예방제{Non-nucleoside agent for treating or preventing hepatitis C}
본 발명은 뉴클레오시드 계열이 아닌 비뉴클레오시드 계열의 C형 간염 예방 및/또는 치료제에 관한 것이다.
C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus, HCV)는 국내 만성 간질환의 중요한 원인 중 하나이다. 현재 세계적으로 약 3억 명 정도의 C형 간염 환자가 있다. 간염 바이러스의 만성화율은 대단히 높아 70-80%에 달하고, 일단 만성으로 되면 자연 치유되는 일은 거의 없다. 만성 간염 환자 중 B형과 C형의 비율이 2:1 내지 3:1 정도로 B형이 더 많지만, 미국, 서유럽, 일본 등에서는 B형보다 C형이 더 많고, 국내의 경우 B형 간염은 백신과 치료제의 보급으로 그 비중이 점차 줄어들고 있지만 C형 간염의 경우 백신이 없고 적당한 치료제가 없는 실정이다.
현재 만성화된 C형 간염 보균자들의 경우 10-20년 정도의 긴 잠복기를 거친 후에는 증상이 악화하여 말기 간질환 혹은 간경화로 발전할 것으로 예상된다. 현재 PEG 부착 인터페론 병용 치료(Pegylated interferon combination therapy)가 유일한 치료법이지만 가장 일반적인 유전자형인 HCV 유전형(genotype) 1 환자의 50%에 서만 효과가 입증되었고, 그 이외의 환자에 대해서는 효능이 입증되지 않고 있다. 인터페론으로 장기간 치료할 경우 독성도 문제가 되고 있다.
항바이러스제는 주로 바이러스 생환주기의 주요 단백질들과 결합하여 그 기능을 억제하는 기작을 가진다. 바이러스의 핵산 중합효소, 프로테아제, 숙주세포로의 침입과 관계된 외피 당단백질 등이 바이러스의 생환주기에서 공통적으로 발견되는 항바이러스제 표적 효소/단백질들이다. 이중 바이러스 핵산 중합효소는 바이러스의 생환주기에서 핵심적인 역할을 담당하며, 숙주에서 유사 기능을 가진 효소가 없기 때문에 생체 독성을 쉽게 피할 수 있다는 이유로 헤르페스 치료제인 아시클로버(acyclovir)의 개발 이래 가장 활발하게 연구되어 온 대표적인 항바이러스제 표적 효소이다. 현재 사용되고 있는 대부분의 AIDS 치료제(AZT, 3TC, ddI, ddC, d4T, abacavir, tenofovir, FTC) 및 B형 간염 치료제(3TC, adefovir, entecavir)는 핵산 중합효소의 기질인 핵산과 구조적으로 유사한 뉴클레오시드계 저해제이다.
그러나, HIV나 B형 간염 바이러스와는 달리 RNA를 유전자로 갖는 C형 간염 바이러스는 DNA 유도체로는 잘 저해되지 않는 어려움이 있고, 또한 RNA 유도체는 RNA와 지나치게 구조가 흡사하여 HCV의 RNA-의존성 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)를 저해하는 것은 물론 사람의 핵산 중합효소마저 저해하여 독성을 일으키기 쉬우므로 항바이러스제로 개발하기에 상당한 부담이 따른다.
따라서 HCV RdRp의 활성화 자리에 선택적으로 결합할 수 있는 비뉴클레오시드계 저해제 개발이 절실히 요구되고 있다.
따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 부작용이 적어 안전하면서도 C형 간염 바이러스 저해 효과가 뛰어난 비뉴클레오시드 계열의 치료 또는 예방제를 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 이들을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 C형 간염 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다
<화학식 1>
Figure 112009017081640-pat00001
상기 화학식 1에서, R1 내지 R5는 서로 독립적으로 수소 또는 -R6-(CH2)n-R7이며, R6는 O 또는 NH이고, n은 1 내지 3의 정수이며, R7은 페닐 또는 하나 이상의 할로겐으로 치환된 페닐임.
본 발명은 또한 상기 화학식 1 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염의 C형 간염 치료 또는 예방 용도를 제공하며, 따라서 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양을 치료 또는 예방이 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 C형 간염의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
바람직하게, 본 발명은 상기 화학식 1에 있어 R1이 수소인 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 C형 간염 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
보다 바람직하게, 본 발명은 4-(4-벤질옥시-페닐)-2-하이드록시-4-옥소-부트-2-에노익 산(화합물 13), 4-[4-(4-클로로-벤질옥시)-페닐]-2-하이드록시-4-옥소-부트-2-에노익 산(화합물 14), 4-(3-벤질옥시-페닐)-2-하이드록시-4-옥소-부트-2-에노익 산(화합물 15), 4-[3-(4-클로로-벤질옥시)-페닐]-2-하이드록시-4-옥소-부트-2-에노익 산(화합물 16), 4-(2-벤질옥시-페닐)-2-하이드록시-4-옥소-부트-2-에노익 산(화합물 17), 4-[2-(4-클로로-벤질옥시)-페닐]-2-하이드록시-4-옥소-부트-2-에노익 산(화합물 18), 4-(3-벤질아미노-페닐)-2-하이드록시-4-옥소-부트-2-에노익 산(화합물 19), 4-[3-(4-클로로-벤질아미노)-페닐]-2-하이드록시-4-옥소-부트-2-에노익 산(화합물 20) 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 C형 간염 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
더욱더 바람직하게, 본 발명은 4-(3-벤질아미노-페닐)-2-하이드록시-4-옥소-부트-2-에노익 산(화합물 19), 4-[3-(4-클로로-벤질아미노)-페닐]-2-하이드록시-4- 옥소-부트-2-에노익 산(화합물 20) 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 C형 간염 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하며, 가장 바람직하게, 본 발명은 4-[3-(4-클로로-벤질아미노)-페닐]-2-하이드록시-4-옥소-부트-2-에노익 산(화합물 20) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 C형 간염 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 여러 화합물 중 화합물 19와 20의 효과가 가장 뛰어났으며, 화합물 20의 효과가 가장 바람직하였다.
본 발명에 따른 화학식 1에 있어, 용어 "할로겐"은 플루오린, 클로린, 브로민 또는 아이오딘 원자를 의미한다.
본 발명의 "약학적으로 허용 가능한 염"은 본 발명의 화합물 내에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 그룹의 염들을 의미한다. 본 발명의 화합물 내의 염기성 그룹은 다양한 무기 및 유기산과 아주 다양한 염을 형성할 수 있다. 이러한 염기성 화합물의 약학적으로 허용되는 염을 제조하기 위해 사용될 수 있는 산은 아세테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 비카르보네이트, 비타르트레이트, 브로마이드, 에데테이트, 캄실레이트, 카보네이트, 클로라이드, 아이오다이드, 시트레이트, 디하이드로클로라이드, 에데테이트, 에디실레이트, 에스토레이트, 에실레이트, 퓨마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루타메이트, 글리콜일아르사니레이트(glycollylarsanilate), 헥실레소르시네이트, 하디드라바민, 하이드록시나프쏘에이트, 이세티오네이트, 락테이트, 락토비오네이트, 말레이트, 말레에이트, 만델레 이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 뮤스케이트, 나프실레이트, 니트레이트, 판토쎄네이트, 포스페이트/디포스페이트, 폴리갈락튜로네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 석씨네이트, 설페이트, 탄네이트, 타르트레이트, 테오크레이트(teoclate), 트리에티오다이트, 파모에이트(즉, 1,1-메틸렌-비스-(2-하이드록시-3-나프쏘에이트) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 아미노 부분을 포함하는 본 발명의 화합물은 또한 다양한 아미노산 및 상기 언급된 산들과 약학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 본 발명의 화합물 내의 산성 그룹은 약학적으로 허용되는 다양한 양이온과 염기 염을 형성할 수 있다. 그러한 염기의 예로는 알칼리 금속 또는 알칼린 토금속 염 그리고 특히 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 리튬, 아연 및 철 염을 포함하며, 또한 디에틸아민 등의 유기 아미노로 이루어진 염도 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명 화합물의 염기(base) 부가 염들은 충분한 양의 원하는 염기와 적당한 비활성(inert) 용매로 그러한 화합물의 중성 형태를 접촉하여 얻을 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화합물의 수화물 형태를 포함하며, 용매화된 형태뿐만 아니라 비-용매화된(unsolvated) 형태도 포함한다. 또한 본 발명의 상기 화합물은 결정형 또는 무정형 형태로 존재할 수 있으며, 이러한 모든 물리적 형태는 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명은 또한 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 단독으로 혹은 어떤 편리한 운반체, 부형제 등과 함께 혼합하여 투여될 수 있고, 그러한 투여 제형은 단회투여 또는 반복투여 제형일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 고형 제제 또는 액상 제제일 수 있다. 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 제제에는 부형제, 착향제, 결합제, 방부제, 붕해제, 활택제, 충진제 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 액상 제제로는 물, 프로필렌 글리콜 용액 같은 용액제, 현탁액제, 유제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제 등을 첨가하여 제조할 수 있다.
예를 들어, 산제는 본 발명의 화합물과 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 화합물; 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제; 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 활택제화 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 치료해야 할 질환 및 개체의 상태에 따라 경구제, 주사제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, 정맥주사, 주입(infusion), 피하주사, 임플란트), 흡입제, 비강투여제, 질제, 직장투여제, 설하제, 트랜스더말제, 토피칼제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여경로에 따라 통상적으로 사용되고 비독성인, 약제학적으로 허용되는 운반체, 첨가제, 비히클을 포함하는 적당한 투여 유닛 제형으로 제제화될 수 있다. 일정 시간 동안 약물을 지속적으로 방출할 수 있는 데포(depot) 제형 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
C형 간염의 치료를 위한 사용에 있어 본 발명의 화합물은 매일 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 g/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 g/kg의 1일 투여 용량이 바람직하다. 그러나 상기 투여량은 환자의 상태(연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성, 사용된 화합물 등에 따라 다양할 수 있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량이 나누어지고 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다.
본 발명은 부작용이 적어 안전하면서도 C형 간염 바이러스 저해 효과가 뛰어난 비뉴클레오시드 계열의 신규 치료 또는 예방제, 이들을 포함하는 약학 조성물 및 이들을 투여하는 것을 포함하는 C형 간염의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석돼서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 2-하이드록시-4-옥소-4-페닐부트-2-에노익 산((Z)-2-hydroxy-4- oxo-4-phenylbut-2-enoic acid) 유도체의 합성
하기 반응식 1 및 2에 따라 2-하이드록시-4-옥소-4-페닐부트-2-에노익 산 유도체들을 합성하였다.
Figure 112009017081640-pat00002
출발물질인 아세토페논 유도체와 1.5 당량의 벤질브로마이드 혹은 4-염소-벤질브로마이드를 디메틸포름아미드 혹은 아세톤 용매(0.05 M 농도)에 넣어 녹인 후 약 60℃에서 24시간 가열 교반하였다. 반응물질을 상온으로 냉각한 후, 고체를 걸러서 얻은 용액을 감압증류하여 농축시켰고, 이후 실리카겔 컬럼크로마토그래피(헥산 : 아세트산에틸에스테르 = 5 : 1)로 정제하여 흰색 또는 연한 노란색의 고체 화합물 5-12를 60-80%의 수율로 얻었다.
1-(4- Benzyloxy - phenyl )- ethanone (5) 1H NMR (400 MHz) δ 2.55 (s, 3H), 5.14 (s, 2H), 7.01 (dd, J = 6.9, 2.0 Hz, 2H), 7.44-7.34 (m, 5H), 7.94 (dd, J = 6.9, 2.0 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz) δ 197.1, 163.0, 157.5, 136.6, 131.0, 129.1, 128.7, 127.9, 115.0, 70.6, 26.7.
1-[4-(4-Chloro-benzyloxy)-phenyl]-ethanone (6) 1H NMR (400 MHz): δ 2.55 (s, 3H), 5.09 (s, 2H), 6.99 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.37(s, 4H), 7.94(d, J = 8.9 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz) δ 197.0, 162.9, 157.2, 136.4, 132.5, 120.3, 128.5, 127.6, 115.2, 70.6, 26.7.
1-(3- Benzyloxy - phenyl )- ethanone (7) 1H NMR (400 MHz) δ 2.59 (s, 3H), 5.12 (s, 2H), 7.19 (dd, J = 7.4, 1.8 Hz, 1H), 7.46-7.34 (m, 6H), 7.58-7.55 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz) δ 198.2, 159.4, 139.0, 136.9, 130.0, 129.0, 128.5, 128.0, 121.7, 120.7, 114.0, 70.6, 27.1.
1-[3-(4- Chloro - benzyloxy )- phenyl ]- ethanone (8) 1H NMR (400 MHz) δ 2.59 (s, 3H), 5.08 (s, 2H), 7.16 (dd, J = 8.4, 2.6 Hz, 1H), 7.42-7.34 (m, 5H), 7.56 (d, J = 6.6Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz) δ 198.2, 159.2, 139.0, 135.5, 134.4, 130.1, 129.2, 122.0, 120.7, 113.9, 69.8, 27.1.
1-(2- Benzyloxy - phenyl )- ethanone (9) 1H NMR (400 MHz) δ 2.60 (s, 3H), 5.17 (s, 2H), 7.03 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.47-7.30 (m, 6H), 7.75 (dd, J = 7.6, 1.7 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz) δ 199.9, 158.0, 136.3, 133.6, 130.5, 128.8, 128.7, 128.3, 127.6, 120.9, 112.9, 70.7, 32.1.
1-[2-(4-Chloro-benzyloxy)-phenyl]-ethanone (10) 1H NMR (400 MHz) δ 2.58 (s, 3H), 5.12 (s, 2H), 7.00 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 7.37 (s, 4H), 7.44 (td, J = 7.4, 1.8 Hz, 1H), 7.74 (dd, J = 7.7, 1.8 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz) δ 200.1, 158.1, 135.1, 134.5, 134.0, 130.9, 129.3, 129.2, 121.5, 113.2, 99.0, 70.3, 32.4.
1-(3- Benzylamino - phenyl )- ethanone (11) 1H NMR (400 MHz) δ 2.50 (s, 3H), 4.33 (s, 2H), 6.78 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.35-7.19 (m, 8H); 13C NMR (100 MHz) δ 199.0, 148.8, 139.4, 138.6, 129.8, 129.1, 127.9, 127.8, 118.3, 117.9, 112.2, 48.6, 27.1.
1-[3-(4- Chloro - benzylamino )- phenyl ]- ethanone (12) 1H NMR (400 MHz) δ 2.54 (s, 3H), 4.34 (s, 2H), 6.78 (ddd, J = 7.9, 2.4, 0.9 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.24 (s, 1H), 7.32-7.25 (m, 5H); 13C NMR (100 MHz) δ 199.2, 148.6, 139.5, 138.4, 131.5, 129.6, 129.0, 127.6, 118.5, 117.7, 112.0, 48.6, 27.1.
Figure 112009017081640-pat00003
반응식 1에서 얻은 아세토페논 유도체 화합물 5-12를 무수 테트라히드로퓨란(0.05 M 농도)에 녹인 후, 1.5-2 당량의 NaOMe를 첨가하고 상온에서 30분간 교반하였다. 그 후, 반응물질에 3-5 당량의 디메틸옥살산을 첨가한 후 3시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응물질을 1N 염산 수용액으로 중화한 후, 에틸아세테이트를 이용하여 추출하였다. 추출액을 감압증류하여 농축시킨 후, 물과 테트라히드로퓨란의 1:1 용액에 녹이고 수산화나트륨을 1.5 당량 가하였다. 반응물질을 상온에서 3시간 교반한 후, 감압증류하여 용액의 부피를 반으로 감소시켜 농축시켰다. 반응물질을 물로 희석시키고 희석된 수용액을 디에틸에테르로 두세 번 씻어준 후, 수용액에 1N 염산 수용액을 가하여 전체 용액의 산도를 1 내지 2로 맞추어 흰색 침전물을 생성하였다. 수용액을 에틸아세테이트로 3 내지 4회 추출한 후, 합쳐진 유기층에 황산 마그네슘을 가하여 수분을 제거하였다. 유기층을 감압증류하면 흰색 혹은 연한 노란 색의 순수한 고체 화합물 13-20을 40-60%의 수율로 얻을 수 있었다.
4-(4-Benzyloxy-phenyl)-2-hydroxy-4-oxo-but-2-enoic acid (13) 1H NMR (400 MHz) δ 5.33 (s, 2H), 7.16 (s, 1H), 7.26 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.40-7.49 (m, 3H), 7.56 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 8.16 (d, J = 9.0 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz) δ 191.2, 164.7, 163.4, 137.6, 131.2, 129.4, 128.9, 128.6, 116.2, 115.8, 115.5, 98.0, 71.0.
4-[4-(4- Chloro - benzyloxy )- phenyl ]-2- hydroxy -4- oxo - but -2- enoic acid (14) 1H NMR (400 MHz) δ 5.15 (s, 2H), 7.08 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.37 (q, J = 8.5 Hz, 4H), 7.65 (s, 1H), 7.99 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz) δ 190.5, 169.1, 164.4, 163.9, 135.6, 134.4, 130.7, 129.3, 129.1, 128.6, 115.6, 69.9, 60.9.
4-(3- Benzyloxy - phenyl )-2- hydroxy -4- oxo - but -2- enoic acid (15) 1H NMR (400 MHz) δ 5.14 (s, 2H), 7.15 (s,1H), 7.24(d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.47-7.34 (m, 6H), 7.61 (dd, J = 4.3, 2.3 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz) δ 192.0, 163.1, 159.6, 134.9, 130.6, 129.1, 128.7, 128.0, 121.8, 121.1, 114.0, 95.7, 70.8.
4-[3-(4- Chloro - benzyloxy )- phenyl ]-2- hydroxy -4- oxo - but -2- enoic acid (16) 1H NMR (400 MHz) δ 5.08 (s, 2H), 7.16 (s, 1H), 7.32 (dd, J = 8.4, 2.5 Hz, 1H), 7.34-7.42 (m, 5H), 7.75 (dd, J = 7.6, 1.7 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz) δ 198.4, 163.1, 141.0, 135.7, 134.8, 130.3, 129.5, 122.1, 120.5, 113.7, 95.7, 69.7.
4-(2- Benzyloxy - phenyl )-2- hydroxy -4- oxo - but -2- enoic acid (17) 1H NMR (400 MHz) δ 5.24 (s, 2H), 7.11-7.08 (m, 2H), 7.37 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.42 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 7.55-7.48 (m, 3H), 7.60 (s, 1H), 8.00 (dd, J = 8.1, 1.8 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz) δ 190.4, 162.3, 159.1, 135.9, 135.5, 131.3, 129.2, 128.8, 127.9, 123.3, 121.6, 113.6, 101.1, 71.4.
4-[2-(4- Chloro - benzyloxy )- phenyl ]-2- hydroxy -4- oxo - but -2- enoic acid (18) 1H NMR (400 MHz) δ 5.35 (s, 2H), 7.15 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.44 (d, J = 9.3 Hz, 3H), 7.65-7.58 (m, 3H), 7.93 (dd, J = 7.8, 1.7 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz) δ 191.5, 171.4, 163.8, 160.0, 137.7, 136.1, 131.7, 130.8, 129.2, 126.2, 122.3, 115.0, 104.4, 71.9.
4-(3- Benzylamino - phenyl )-2- hydroxy -4- oxo - but -2- enoic acid (19) 1H NMR (400 MHz) δ 4.33 (s, 2H), 6.98 (s,1H), 7.16 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.39-7.55 (m, 8H); 13C NMR (100 MHz) δ 199.2, 163.1, 150.0, 139.4, 138.5, 129.6, 128.9, 127.5, 127.6, 118.5, 117.5, 112.2, 95.7, 48.7.
4-[3-(4- Chloro - benzylamino )- phenyl ]-2- hydroxy -4- oxo - but -2- enoic acid (20) 1H NMR (400 MHz) δ 4.34 (s, 2H), 6.98 (s,1H), 7.16 (ddd, J = 7.9, 2.5, 0.9 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.44 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.45-7.52 (m, 5H); 13C NMR (100 MHz) δ 119.0, 163.0, 148.3, 139.4, 138.0, 131.2, 129.4, 128.6, 127.3, 118.6, 117.4, 112.0, 95.5, 48.3.
<실험예 1> 활성 평가
NS5B 중합효소 분석
RNA 의존형 RNA 중합효소 분석(RNA dependent RNA polymerase assay)을 하였다. Poly A를 템플레이트(template)로 이용하였고, 올리고 디티(oligo dT)를 프라이머로 사용하였으며, 동위원소로 표지된 올리고 디티(oligo dT)가 중합효소(polymerase)에 의해 중합(polymerization)되는 것을 측정하였다. 중합(Polymerization) 정도는 아가로스겔(agarose gel) 상에서 동위원소를 포함하는 중합된 밴드를 확인하고 그 양을 측정하였으며, 이를 통하여 효소의 활성을 결정하였다. 즉, 저해제를 처리하지 않은 중합효소 활성을 100%로 설정하고, 10 uM 농도의 저해제를 처리한 후 중합 정도를 상대적으로 측정하여 저해제의 효과를 확인하였다.
화합물 13 내지 20의 8가지 화합물에 대한 저해 능력을 확인하기 위하여 10마이크로몰 농도의 시험 화합물과 폴리머레이즈 및 올리고머를 함께 처리한 후, 저해제를 처리하지 않은 폴리머레이즈(polymerase) 활성을 100%로 정하고 폴리머리제 이션(polymerization) 정도를 상대적으로 측정하여 저해제의 효과를 확인하였다. 그 결과를 하기 도 1 및 2에 나타내었다.
저해제의 IC50 값을 측정하기 위하여 5~6가지의 서로 다른 농도의 저해제를 처리한 후 효소의 활성을 위와 같은 방법으로 측정하였다. 측정 결과를 이용하여 효소의 농도와 활성에 대한 비선형피팅(non-linear fitting)을 통해 IC50 값을 얻었다.
웨스턴 ( Western ) 실험
시험 화합물들의 저해 효과에 의해 바이러스의 증식이 억제되는 것을 확인하기 위하여 NS5B 단백질의 양의 변화를 NS5B 단백질의 항체를 이용한 웨스턴 방법을 통해 확인하였다. 0.1 마이크로몰과 1 마이크로몰 2가지 농도에서 18번과 20번 화합물의 효과를 측정한 결과 18번 및 20번의 경우 1 마이크로몰을 투여할 경우 NS5B의 양이 줄어드는 것을 확인할 수 있었으며, 화합물 20의 효과가 화합물 18의 효과보다 더 뛰어났다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
레플리콘 분석( Replicon assay )
HCV 레플리콘(replicon)이 들어 있는 huh-7 세포는 G418 선택 배지(selection media)인 파이루베이트 함유 DMEM, 5% FBS(또는 FCS), 0.01% 페니실린/스테렙토마이신(penicillin/streptomycin, 500 ug/ml G418 디소디움 염)을 사용하여 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 세포의 증식도(confluency)가 80% 되었을 때 10 uM 농도의 저해제(시험 화합물)를 처리하고, 24시간 배양한 후 세포의 생존 력(viability)을 측정하였다.
세포의 생존력(viability)은 루시페라아제(luciferase)를 이용한 셀티터-글로 키트(Celltiter-Glo kit, Promega, USA)로 측정하였다.
일반세포에 대한 독성을 확인하기 위하여 293T 세포주를 배양한 후 10 uM 농도의 저해제를 처리하고, 24시간 후 세포의 생존력(viability)을 측정하였다.
그 결과를 도 4 내지 6에 나타내었다. 화합물 13 내지 20의 8가지 화합물에 대한 시험관 내(in vitro) 효소 저해 테스트와 세포 기반 레플리콘(cell based replicon)의 생존력(viability) 측정을 통한 저해제의 활성 테스트를 수행하였다. 그 결과 20번 화합물이 IC50 값이 204 nM(도 4 참조)로 가장 효과가 좋았으며, 레플리콘(replicon)을 저해하는 능력도 뛰어났고(도 5 참조), 정상세포에 대한 독성도 없는 것으로 확인되었다(도 6 참조).
<실험예 2> 약물의 독성 특성 분석
개발된 약물이 생체 내에서 독성을 나타내는 경우를 사전에 방지하기 위해서는 약물의 독성 여부를 판단할 수 있는 실험을 수행하였다. 이러한 독성 예측 실험으로 약물대사효소 저해와 약물이송 단백질 저해에 대한 검증을 수행하였다.
인간 간 마이크로솜(microsome)을 이용하여 CYP에 대한 약물대사 연구를 수행하였다. 칵테일 배양 및 LC-MS/MS를 이용한 동시 다중 분석 기술을 이용하여 20번 화합물의 CYP 동효소 활성의 저해가능성을 확인하여 동효소를 약하게 저해하거 나 저해하지 않음을 확인하였다(도 7). 화합물 20의 경우는 CYP1A2 동효소의 저해를 빼고는 다른 4종의 CYP 동효소에 대해서는 저해 활성을 보이지 않았다. 또한 CYP1A2 저해능 또한 8.5 M 정도로 아주 강력하지는 않은 것으로 판단된다. 이러한 결과로부터 20번 화합물이 생체 내에서 약물대사효소의 저해 기전을 통한 약물상호작용 가능성이 낮을 것이라고 예측할 수 있다.
실험은 칵테일(cock-tail) 기질로 아세트아미노펜, OH-오메프라졸, OH-미다졸람(midazolam), OH-톨부타미드(tolbutamide), 및 덱스트로판(Dextrorphan)을 사용하였고, 표준물질로 클로로프로파미드(chlorpropamide)를 사용하였다. 기질과 인간 간 마이크로솜, 시험 화합물, 및 기질을 섞고 15분간 반응시킨 후 표준물질을 포함한 아세토나이트릴을 넣어주어 반응을 정지시킨 후 잘 섞고 원심분리하여 LC/MS/MS를 이용하여 분석한 결과이다.
또한 약물수송단백 저해능의 경우 20번 화합물이 p-당단백(glycoprotein)을 저해하지 않는 것을 규명함으로써 독성이 적을 것이라는 확인하였다. 그 결과는 도 8에 나타내었다.
도 1은 8가지 화합물의 폴리머레이즈 활성 저해능 확인 실험의 결과이다.
도 2는 폴리머레이즈 활성 저해능 실험 결과를 정량화한 그래프이다.
도 3은 저해제 중에서 18번과 20번 화합물에 의한 바이러스 증식 억제 효과로 세포 내 폴리머레이즈 양의 변화를 확인한 웨스턴 실험 결과이다.
도 4는 화합물 20의 폴리머레이즈(Polymerase) 저해 IC50 값을 나타낸 그래프이다.
도 5는 선별된 화합물들의 레플리콘(Replicon) 저해능 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 선별된 화합물들의 정상세포 사멸 가능성 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 화합물의 독성을 예측하기 위해서 사이토크롬(Cytochrome) P450에 대한 저해효과를 측정하여 약물대사효소의 저해 기전을 통한 약물상호작용 알아보기 위한 실험 결과이다.
도 8은 화합물의 독성을 예측하기 위해서 약물수송단백질인 P-당단백(glycoprotein)에 대한 저해효과를 알아보기 위한 실험 결과이다.

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 C형 간염 치료 또는 예방용 약학 조성물:
    <화학식 1>
    Figure 112009017081640-pat00005
    상기 화학식 1에서, R1 내지 R5는 서로 독립적으로 수소 또는 -R6-(CH2)n-R7이며, R6는 O 또는 NH이고, n은 1 내지 3의 정수이며, R7은 페닐 또는 하나 이상의 할로겐으로 치환된 페닐임.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 R1은 수소인 것을 특징으로 하는 C형 간염 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 화합물은 4-(4-벤질옥시-페닐)-2-하이드록시-4-옥소-부트-2-에노익 산, 4-[4-(4-클로로-벤질옥시)-페닐]-2-하이드록시-4-옥소-부트-2-에노익 산, 4-(3-벤질옥시-페닐)-2-하이드록시-4-옥소-부트-2-에노익 산, 4-[3-(4-클로로-벤질옥시)-페닐]-2-하이드록시-4-옥소-부트-2-에노익 산, 4-(2-벤질옥시-페닐)-2-하이드록시-4-옥소-부트-2-에노익 산, 4-[2-(4-클로로-벤질옥시)-페닐]-2-하이드록시-4-옥소-부트-2-에노익 산, 4-(3-벤질아미노-페닐)-2-하이드록시-4-옥소-부트-2-에노익 산 및 4-[3-(4-클로로-벤질아미노)-페닐]-2-하이드록시-4-옥소-부트 -2-에노익 산으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 C형 간염 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 화합물은 4-(3-벤질아미노-페닐)-2-하이드록시-4-옥소-부트-2-에노익 산, 4-[3-(4-클로로-벤질아미노)-페닐]-2-하이드록시-4-옥소-부트-2-에노익 산 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 C형 간염 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 화합물은 4-[3-(4-클로로-벤질아미노)-페닐]-2-하이드록시-4-옥소-부트-2-에노익 산인 것을 특징으로 하는 C형 간염 치료 또는 예방용 약학 조성물.
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