KR100945104B1 - Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends - Google Patents

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Abstract

The invention relates to the therapeutic use of oligonucleotides as immunostimulatory agents in immunotherapy applications. More particularly, the invention provides immunomers for use in methods for generating a immune response or for treating a patient in need of immunostimulation. The immunomers of the invention comprise at least two oligonucleotides linked at their 3' ends, internucleoside linkages or functionalized nucleobase or sugar to a non-nucleotidic linker, at least one of the oligonucleotides being an immunostimulatory oligonucleotide and having an accessible 5' end.

Description

5' 말단의 최적 제공에 의한 올리고뉴클레오티드-기초 화합물의 면역자극 특성의 조절{MODULATION OF IMMUNOSTIMULATORY PROPERTIES OF OLIGONUCLEOTIDE-BASED COMPOUNDS BY OPTIMAL PRESENTATION OF 5' ENDS} 5 'oligonucleotide by the optimum provision of the terminal nucleotide-regulation of the immune stimulation properties of the basic compound {MODULATION OF IMMUNOSTIMULATORY PROPERTIES OF OLIGONUCLEOTIDE-BASED COMPOUNDS BY OPTIMAL PRESENTATION OF 5' ENDS}

본 발명은 면역자극제로서 올리고뉴클레오티드를 사용하는 면역학 및 면역요법 분야에 관한 것이다. The present invention relates to immunology and immunotherapy field of oligonucleotide using nucleotides as immunostimulants.

올리고뉴클레오티드는 진단용 프로브 방법으로부터 PCR에서 유전자 발현의 안티센스 억제 및 면역요법 분야에 이르기까지 광범위한 기법에 사용되는, 현대 분자 생물학에서는 없어서는 안되는 도구가 되어왔다. The oligonucleotides should not have been an indispensable tool in modern molecular biology, being used in a wide variety of techniques ranging from antisense inhibition of gene expression in the field of immunotherapy and PCR probes from the diagnostic methods. 올리고뉴클레오티드의 이러한 광범위한 사용은 올리고뉴클레오티드를 합성하는 신속하고 효과적이면서도 값싼 방법에 대한 요구가 증가하는 추세를 낳았다. Such widespread use of oligonucleotides has led to a tendency to raise rapidly increasing demand for effective and cheap way to synthesize nucleotides.

안티센스 및 진단적 적용을 위한 올리고뉴클레오티드의 합성은 현재 일상적으로 이루어질 수 있다 ( Methods in Molecular Biology , Vol. 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs pp.165-189 (S. Agrawal, ed., Humana Press, 1993) ; Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach , pp.87-108 (F. Eckstein, ed., 1991); 및 Uhlmann & Peyman, supra; Agrawal and lyer, Curr. Op. in Biotech. 6:12 (1995); 및 Antisense Research and Applications (Crooke and Lebleu, eds., CRC Press, Boca Raton, 1993)). Oligo synthesis of oligonucleotides for antisense and diagnostic application may be made in the current routine (Methods in Molecular Biology, Vol 20 :.. Protocols for Oligonucleotides and Analogs pp.165-189 (S. Agrawal, ed, Humana Press, 1993 );. Oligonucleotides and analogues, A Practical Approach, pp.87-108 (F. Eckstein, ed, 1991);. and Uhlmann & Peyman, supra;.. Agrawal and lyer, Curr Op in Biotech 6:12 (1995) ; and Antisense Research and Applications (. Crooke and Lebleu, eds, CRC Press, Boca Raton, 1993)). 초기의 합성 방법은 포스포디에스테르 및 포스포트리에스테르 화학을 포함하였다. Synthesis of the initial included the phosphodiester and phosphotriester chemistry. 예컨대 코라나 등은 올리고뉴클레오티드 합성에 대한 포스포디에스테르 화학을 개시하였다 (Khorana et al., J. Molec. Biol. 72:209 (1972)). E.g. nose Rana et al discloses raising the phosphodiester chemistry for oligonucleotide synthesis (Khorana et al, J. Molec Biol 72:... 209 (1972)). 리스는 문헌에서 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 합성을 위한 포스포트리에스테르 화학을 개시하였다 (Reese, Tetrahedron Lett. 34:3143-3179 (1978)). Less raises the literature discloses a phosphotriester chemistry for synthesis of oligonucleotides and polynucleotides (Reese, Tetrahedron Lett 34:. 3143-3179 (1978)). 이들 초기 방법은 합성에 대한 보다 효율적인 포스포라미다이트 및 H-포스포네이트 방법에 대한 길을 대대적으로 열어주었다. The initial approach was massive, open the way for more efficient POS Fora midayi agent and H- phosphonate methods for the synthesis. 예를 들어 뷰케이지와 카루테르는 폴리뉴클레오티드 합성에서 데옥시리보뉴클레오시드 포스포라미다이트를 사용하는 것에 대해 개시하였다 (Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 (1981)). For example, the cage and the view Karu Terre were disclosed for the use of oxy-ribo nucleosides force Fora midayi agent having a polynucleotide synthesis (Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett 22 :. 1859-1862 (1981)). 아그라월과 잠멕닉은 미국 특허 제 5,149,798호 (1992)에서 H-포스포네이트 방법에 의한 올리고뉴클레오티드의 최적화된 합성을 개시하였다. Agra month and sleep meknik was disclosed an optimized synthesis of oligonucleotides by the H- phosphonate method in U.S. Patent No. 5,149,798 (1992). 이들 현대적인 방법 둘 모두는 다양한 변형된 뉴클레오티드간 연결을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해 사용되었다. Both of these modern methods is raised with the connections between the various modified nucleotides were used to synthesize the oligonucleotide. 아그라월과 굿차일드는 포스포라미다이트 화학을 사용하는 올리고뉴클레오티드 메틸포스포네이트의 합성을 문헌에서 교시하였다 (Agrawal and Goodchild, Tetrahedron Lett. 28:3539-3542 (1987)). Agra month and Goodchild is the synthesis of oligonucleotide methyl phosphonates using the force Fora midayi chemical agent was taught in the literature (Agrawal and Goodchild, Tetrahedron Lett 28 :. 3539-3542 (1987)). 커널리 등은 포스포라미다이트 화학을 사용하는 올리고뉴클레오티드 포스포로티오에이트의 합성을 개시하였다 (Connolly et al., Biochem. 23:3443 (1984)). Lee such kernels is raised using a phosphine Fora midayi chemical agent was added to initiate the synthesis of the oligonucleotide phosphorothioate (Connolly et al, Biochem 23: .. 3443 (1984)). 제이거 등은 포스포라미다이트 화학을 사용하는 올리고뉴클레오티드 포스포라미데이트의 합성을 개시하였다 (Jager et al., Biochem. 27:7237 (1988)). The oligonucleotide used for this, such as is force Fora midayi chemical agent was added to initiate the synthesis of the nucleotide phosphodiesterase lamina date (Jager et al, Biochem 27:.. 7237 (1988)). 아그라월 등은 H-포스포네이트 화학을 사용하는 올리고뉴클레오티드 포스포라미데이트 및 포스포로티오에이트의 합성을 개시하였다 (Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:7079-7083 (1988)). Agra May et H- phosphonate oligonucleotide using the carbonate chemistry nucleotide phosphodiesterase lamina date and phosphorothioate synthesis was initiated (Agrawal et al, Proc Natl Acad Sci (USA) 85 of the:.... 7079- 7083 (1988)).

보다 최근에 이르러, 여러 연구자들에 의해 면역요법 분야에서 면역자극제로서의 올리고뉴클레오티드의 사용의 타당성이 입증되었다. More recently it came to the oligonucleotide as immune stimulant in the field of immunotherapy by many researchers the validity of the use of oligonucleotides has been demonstrated. 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 면역 자극을 유도할 수 있다는 관찰은 이러한 부수 효과를 치료적 도구로서 개발하는 데에 있어서 관심을 불러 일으켰다. Phosphodiester and phosphorothioate oligonucleotide observed that oligonucleotides can induce immune stimulation has raised interest in developing this side effect as a therapeutic tool. 이런 노력들은 디뉴클레오티드 천연 CpG를 함유하고 있는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 초점이 모아졌다. These efforts have raised dinucleotide CpG containing natural force that Tio Eight prisoners were gathered in the focus nucleotides. 구라모토 등은 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 팔린드롬 (palindrome)을 함유하고 있는 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드가 인터페론-알파 및 감마 합성을 유도하고 천연 킬러 활성을 증강시킬 수 있다고 교시하고 있다 (Kuramoto et al., Jpn. J. Cancer Res. 83:1128-1131 (1992)). Kuramoto et oligonucleotide phosphodiester containing the selling drop (palindrome) including the CpG dinucleotide nucleotide is interferon and induces alpha and gamma synthesis and teach that may enhance the natural killer activity (Kuramoto et al,. . Jpn J. Cancer Res 83:. 1128-1131 (1992)). 크리그 등은 포스포로티오에이트 CpG-함유 올리고뉴클레오티드가 면역자극성이라는 것을 개시하였다 (Krieg et al., Nature 371:546-549 (1995)). Cri the like are phosphorothioate CpG- containing oligonucleotide was disclosed that the immunostimulatory oligonucleotide (Krieg et al, Nature 371: . 546-549 (1995)). 리앙 등은 그러한 올리고뉴클레오티드가 사람 B 세포를 활성화시킨다고 설명하였다 (Liang et al., J. Clin. Invest. 98:1119-1129 (1996)). Liang et al. Such oligonucleotides have been described sikindago nucleotide activates human B cells (Liang et al, J. Clin Invest 98:... 1119-1129 (1996)). 몰도베뉴 등은 CpG-함유 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 증강시킨다고 교시하였다 (Moldoveanu et al., Vaccine 16:1216-124 (1998)). New mol Tobe et containing phosphorothioate oligonucleotide was teachings sikindago nucleotides that enhance the immune response to the influenza virus (Moldoveanu et al, Vaccine 16. : 1216-124 (1998)) CpG-. 맥클러스키와 데이비스는 CpG-함유 올리고뉴클레오티드가 강력한 보조제로서 작용하여 B형 간염 표면 항원에 대한 면역 반응을 증강시킨다고 교시하였다 (McCluskie and Davis, J. Immunol. 161: 4463-4466 (1998)). Maekkeulreoseuki and Davis CpG- containing oligonucleotide was teachings sikindago nucleotides is to enhance the immune response to the hepatitis B surface antigen act as potent adjuvants (McCluskie and Davis, J. Immunol 161 :. 4463-4466 (1998)).

CpG-함유 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 다른 변형도 면역 반응의 조절제로서 작용하는 이들의 능력에 또한 영향을 줄 수 있다 (참조: Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182; Zhao et al., Biochem Pharmacol. (1996) 52:1537-1544; Zhao et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (l997) 7:495-502; Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (1999) 9:3453-3458; Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:1051-1054; Yu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:2585-2588; Yu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2001) 11:2263-2267; 및 Kandimalla et al., Bioorg. Med. Chem. (2001) 9:807-813). CpG- containing phosphorothioate oligonucleotide further variant of the nucleotide may also have an influence also on their ability to act as modulators of the immune response (see: Zhao et al, Biochem Pharmacol ( 1996) 51:... 173-182 ; Zhao et al, Biochem Pharmacol ( 1996) 52:.. 1537-1544; Zhao et al, Antisense Nucleic Acid Drug Dev (l997) 7:...... 495-502; Zhao et al, Bioorg Med Chem Lett . (1999) 9:.. ... 3453-3458; Zhao et al, Bioorg Med Chem Lett (2000) 10:..... 1051-1054; Yu et al, Bioorg Med Chem Lett (2000) 10: 2585-2588; Yu et al, Bioorg Med Chem Lett (2001) 11:..... 2263-2267; and Kandimalla et al, Bioorg Med Chem ( 2001) 9:.... 807-813).

이들 보고는 면역자극성 올리고뉴클레오티드에 의해 야기된 면역 반응을 증강시킬 필요성이 있음을 명백히 보여준다. These reports clearly show that there is a need to enhance the immunostimulatory oligonucleotide of the immune response induced by nucleotides.

발명의 개요 Summary of the Invention

본 발명은 올리고뉴클레오티드 화합물에 의해 유발되는 면역 반응을 증강시키는 방법을 제공한다. The present invention provides a method of raising an immune response enhancer that is induced by the nucleotide compounds. 본 발명에 따른 방법은 면역요법 적용을 위해 면역자극 올리고뉴클레오티드의 면역자극 효과를 증가시킬 수 있다. The process according to the invention can be raised to increase the immunostimulatory effect of the immunostimulatory oligonucleotide for immunotherapy applications. 본 발명자들은 놀랍게도 면역자극 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 최적으로 제공하는 변형이 그 올리고뉴클레오티드의 면역 자극 능력을 극적으로 증강시킨다는 것을 발견하였다. The present inventors have surprisingly discovered that the deformation of the immunostimulatory oligonucleotide at the 5 'terminus of the nucleotide at best dramatically enhancing the immunostimulatory capacity of the oligonucleotide. 그러한 올리고뉴클레오티드를 본원에서는 "이뮤노머(immunomer)" 로 언급한다. Such an oligonucleotide is referred to herein as "Emu nomeo (immunomer)".

그러므로, 제 1 측면으로, 본 발명은 3' 말단, 뉴클레오티드간 연결부, 또는 작용기화된 뉴클레오염기 또는 당에서 비-뉴클레오티드 링커를 통해 연결된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 이러한 올리고뉴클레오티드중 하나 이상이 면역자극성 올리고뉴클레오티드이고 접근가능한 5' 말단을 지닌 이뮤노머를 제공한다. Therefore, the the first aspect, the present invention is the 3 'end, nucleotides between the connection portion, or the functionalisation of nucleobases or ratio in the sugar-comprising at least two oligonucleotides linked by a nucleotide linker, such oligonucleotides one nucleotide or more raise the immunostimulatory oligonucleotide and provides a Emu nomeo having an accessible 5 'end.

한 구체예에서 이뮤노머는 식 5'-Pyr-Pur-3'의 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하는데, 상기 식에서 Pyr은 천연 또는 비-천연 피리미딘 뉴클레오시드이고, Pur은 천연 또는 비-천연 푸린 뉴클레오시드이다. To In one embodiment immunostimulatory oligonucleotide of the immunometric dimmer formula 5'-Pyr-Pur-3 'comprising the nucleotide, wherein Pyr is a natural or non-natural and pyrimidine nucleosides, Pur is a natural or non-natural purine New is a nucleoside.

또 다른 구체예에서 이뮤노머는 CpG, C * pG, CpG * , 및 C * pG * 로 이루어지는 군으로부터 선택된 면역자극성 디뉴클레오티드를 포함하는데, 여기서 C는 시티딘 또는 2'-데옥시시티딘이고, C * 은 2'-데옥시티미딘, 아라비노시티딘, 2'-데옥시-2'-치환된아라비노시티딘, 2'-O-치환된아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-히드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘 또는 그 밖의 비-천연 피리미딘 뉴클레오시드이며, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이고, G * 은 2' 데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2' 치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 또는 그 밖의 비-천연 푸린 뉴클레오시드이며, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 및 포스포로디티오에이트로 이루어지는 군으로부터 In another embodiment the immunometric dimmer and CpG, C * pG, CpG *, and C * pG * comprises an immunostimulatory dinucleotide is selected from the group, wherein C is cytidine or 2 & apos; deoxy consisting of cytidine, C * is a 2'-deoxy-thymidine, cytidine arabinoside, 2'-deoxy-2'-substituted arabinose of cytidine, 2'-O- substituted arabinose cytidine, 2'-deoxy- 5-hydroxy-cytidine, 2'-deoxy -N4- alkyl-cytidine, 2'-deoxy-4-thio uridine or other non-natural pyrimidine nucleoside and, G is guanosine or 2 '- deoxy-and guanosine, G * is 2 & apos; deoxy-7-de-aza guanosine, 2'-deoxy-6-thio guanosine, arabinose guanosine, 2'-deoxy-2' substituted - arabinose guanosine, 2'-O- substituted-arabinoside guanosine, or other non-natural purine nucleoside and, p is composed of phosphodiester, phosphorothioate, phosphorothioate, and dithio benzoate from the group 선택된 뉴클레오시드간 연결이다. A connection between the selected nucleoside. 특정한 바람직한 구체예에서, 면역자극성 디뉴클레오티드는 CpG가 아니다. In certain preferred embodiments, the immunostimulatory dinucleotide is not CpG.

또 다른 구체예에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 하기 식 ( III )의 면역자극성 도메인을 포함한다: In still other embodiments, the immunostimulatory oligonucleotide is an immunostimulatory oligonucleotide comprises a domain of the formula (III):

5'-Nn-N1-YZ-N1-Nn-3' (III) 5'-Nn-N1-YZ- N1-Nn-3 '(III)

상기 식에서, Wherein

Y는 시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시시티딘, 아라비노시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-히드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘 또는 그 밖의 비-천연 피리미딘 뉴클레오시드이고; Y is cytidine, 2'-deoxy-thymidine, 2'-deoxycytidine, cytidine arabinoside, 2'-deoxy-thymidine, 2'-deoxy-2'-substituted arabinose cytidine, 2'-O- substituted arabinose cytidine, 2'-deoxy-5-hydroxy-cytidine, 2'-deoxy -N4- alkyl-cytidine, 2'-deoxy-4-thio uridine or and other non-natural pyrimidine nucleoside, and;

Z는 구아노신, 2'-데옥시구아노신, 2' 데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2' 치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 그 밖의 비-천연 푸린 뉴클레오시드이고; Z is guanosine, 2'-deoxy guanosine, 2 & apos; deoxy-7-de-aza guanosine, 2'-deoxy-6-thio guanosine, arabinose guanosine, 2'-deoxy-2 ' substituted-arabinoside guanosine, 2'-O- substituted-arabinoside guanosine, 2'-deoxy-inosine, or other non-natural purine nucleoside gt;

N1은 각각 바람직하게는 천연 또는 합성 뉴클레오시드, 또는 비염기성(abasic) 뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보뉴클레오시드, β-L-데옥시리보뉴클레오시드, 및 포스포디에스테르 또는 변형된 뉴클레오시드간 연결을 통해 인접한 뉴클레오시드에 3' 쪽으로 연결된 뉴클레오시드로 이루어지는 군으로부터 선택된 면역자극성 부분이며, 여기서 변형된 뉴클레오시드간 연결은, 제한없이, 약 2 Å 내지 약 200 Å의 길이를 가지는 링커, C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜)링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커, 글리세릴 링커, 2'-5' 뉴클레오시드간 연결, 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결로부터 선택되고; N1 are each preferably a natural or synthetic nucleoside or a non-basic (abasic) nucleosides, arabino nucleosides, 2'-deoxy-uridine, α- deoxyribonucleic nucleoside, β-L- deoxyribonucleic nucleoside and phosphodiester or in between the modified nucleoside adjacent through connecting nucleosides and immunostimulatory moiety selected from the group consisting of nucleosides connected towards the 3 ', wherein the modified nucleoside to- connections are, without limitation, about 2 Å to a linker having a length of about 200 Å, C2-C18 alkyl linker, poly (ethylene glycol) linker, 2-aminobutyl-1,3-propanediol linker, glyceryl linker, 2 It is selected from '5' nucleoside cross connection, and phosphorothioate, phosphorothioate dithio benzoate, or methyl phosphonate connection between the nucleoside;

Nn은 각각 천연 뉴클레오시드 또는 면역자극성 부분이며, 바람직하게는 비염기성 뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보뉴클레오시드, 2'-O-치환된 리보뉴클레오시드, 및 변형된 뉴클레오시드간 연결을 통해 인접한 뉴클레오시드에 3' 쪽으로 연결된 뉴클레오시드로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기서 변형된 뉴클레오시드간 연결은 아미노 링커, 2'-5' 뉴클레오시드간 연결, 및 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결로 이루어지는 군으로부터 선택되고; Nn are each a natural nucleoside or immunostimulatory portion, preferably non-basic nucleosides, arabino nucleosides, 2'-deoxy-uridine, α- deoxyribonucleic nucleosides, 2'-O- substituted ribonucleoside oxide, and modified nucleosides for 3 to an adjacent nucleoside over the connection, is selected from the group consisting of nucleosides connected up, wherein the modified nucleoside connection between amino linker, 2 & apos; -5 it is selected from the "nucleoside cross connection, and methyl phosphonate group consisting of a connection between the nucleoside;

단, N1 또는 Nn 중 최소한 하나는 면역자극성 부분이며; However, N1 or Nn is an immunostimulatory least one of the parts;

n은 0 내지 30의 수이고; n is a number from 0 to 30, and;

3' 말단, 뉴클레오티드간 연결부, 또는 작용기화된 뉴클레오염기 또는 당은 면역자극성일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는 또 다른 올리고뉴클레오티드 직접 연결되거나 비-뉴클레오티드 링커를 통해 연결된다. The 3 'end, nucleotides between the connection portion, or the nucleobase or sugar functionalized oligo another that may or may not be an immunostimulatory oligonucleotide and a direct connection or a non-nucleotide are connected through a linker.

제 2의 측면으로, 본 발명은 상기 설명된 이뮤노머 및 접근가능한 5' 말단 외의 위치에서 이뮤노머에 컨쥬게이션된 항원을 포함하는 이뮤노머 컨쥬게이트를 제공한다. The second aspect of the present invention also provides a Emu nomeo conjugate comprising an antigen conjugated to Emu nomeo at a position other than the described Emu nomeo and accessible 5 'ends.

제 3 측면으로 본 발명은 본 발명에 따른 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트 및 생리적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. As a third aspect the present invention provides a pharmaceutical formulation comprising Emu or Emu nomeo nomeo conjugate and a physiologically acceptable carrier according to the invention.

제 4 측면으로, 본 발명은 본 발명에 따른 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트를 척추동물에게 투여하는 것을 포함하여 척추동물에게서 면역 반응을 생성하기 위한 방법을 제공한다. Claim a fourth aspect, the present invention comprises administering the Emu or Emu nomeo nomeo conjugate according to the invention to a vertebrate is provided a method for generating an immune response in vertebrates. 몇몇 구체예에서, 척추동물은 포유류이다. In some embodiments, the vertebrate is a mammal.

제 5 측면으로, 본 발명은 본 발명에 따른 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이 트를 환자에게 투여하는 것을 포함하여 질병 또는 장애에 걸린 환자를 치료적으로 처리하는 방법을 제공한다. Claim a fifth aspect, the invention provides a method of therapeutic treatment to a patient suffering from a disease or disorder comprising administering the Emu or Emu nomeo nomeo conjugated gated according to the invention to a patient. 다양한 구체예에서, 치료될 질병 또는 장애는 암, 자가면역 질병, 기도 염증, 천식, 알레르기, 또는 병원체에 의해 유발되는 질병이다. In various embodiments, the disease or disorder to be treated is a disease caused by cancer, autoimmune diseases, airway inflammation, asthma, allergies, or pathogens.

도 1은 본 발명의 대표적인 이뮤노머의 개략적인 도면이다. 1 is a schematic diagram of an exemplary Emu nomeo of the present invention.

도 2는 본 발명의 여러가지 대표적인 이뮤노머를 도시한다. Figure 2 illustrates a number of exemplary Emu nomeo of the present invention.

도 3은 본 발명의 이뮤노머의 선형 합성을 위해 적합한 대표적인 작은 분자 링커의 군을 도시한다. Figure 3 illustrates an exemplary group of small molecule linkers suitable for linear synthesis of Emu nomeo of the present invention.

도 4는 본 발명의 이뮤노머의 병렬 합성을 위해 적합한 대표적인 작은 분자 링커의 군을 도시한다. Figure 4 illustrates an exemplary group of small molecule linkers suitable for parallel synthesis of Emu nomeo of the present invention.

도 5는 본 발명의 이뮤노머의 선형 합성에 대한 합성 반응식이다. Figure 5 is a synthetic scheme for the linear synthesis of Emu nomeo of the present invention. DMTr = 4,4'-디메톡시트리틸; DMTr = 4,4'- dimethoxy trityl; CE = 시아노에틸. CE = cyanoethyl.

도 6은 본 발명의 이뮤노머의 병렬 합성에 대한 합성 반응식이다. 6 is a synthetic scheme for the parallel synthesis of Emu nomeo of the present invention. DMTr = 4,4'-디메톡시트리틸; DMTr = 4,4'- dimethoxy trityl; CE = 시아노에틸. CE = cyanoethyl.

도 7a는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서의 이뮤노머 1 내지 3에 의한 IL-12의 유도를 그래프로 도시한다. Figure 7a shows the induction of IL-12 by Emu nomeo 1-3 from BALB / c mouse spleen cell culture in a graph. 이들 데이터는 접근가능한 5'-말단을 가지고 있는 이뮤노머 2가 단량체 올리고 1 보다 더 강한 IL-12의 유도인자라는 것과, 접근가능한 5'-말단이 없는 이뮤노머 3이 올리고 1을 사용할 때와 비교하여 면역 자극을 생성하는데 동일하거나 더 약한 능력을 가지고 있음을 시사한다. These data are compared with when using the accessible 5 & apos; that the Emu nomeo 2 with terminal oligonucleotide monomer grows the more strong induction of IL-12 than the first oligonucleotide is Emu nomeo 3 without an accessible 5 'end 1 to suggest that the same to produce an immunostimulatory or with weaker abilities.

도 7b는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서의 이뮤노머 1 내지 3에 의한 IL-6의 유도 (각각 상부에서 바닥까지)를 그래프로 도시한다. Figure 7b shows the induction of IL-6 by Emu nomeo 1-3 from BALB / c mouse spleen cell cultures (to the bottom in each of the upper) in a graph. 이들 데이터는 접근가능한 5'-말단을 가지고 있는 이뮤노머 2가 단량체 올리고 1 보다 더 강한 IL-6의 유도인자라는 것과, 접근가능한 5'-말단이 없는 이뮤노머 3은 올리고 1을 사용할 때와 비교하여 면역 자극을 생성하는데 동일하거나 더 약한 능력을 가지고 있음을 시사한다. These data are compared with when the Emu nomeo 2 with an accessible 5 'end oligonucleotide as more monomer is growing strong induction of IL-6 than 1, Emu nomeo 3 without an accessible 5' end oligonucleotide is used either to suggest that the same to produce an immunostimulatory or with weaker abilities.

도 7c는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서의 이뮤노머 1 내지 3에 의한 IL-10의 유도 (각각 상부에서 바닥까지)를 그래프로 도시한다. Figure 7c shows the induction of IL-10 by Emu nomeo 1-3 from BALB / c mouse spleen cell cultures (to the bottom in each of the upper) in a graph.

도 8a는 각각 이용불가능한 5'-말단과 접근가능한 5'-말단을 가지고 있는 다양한 농도의 이뮤노머 5와 6에 의한, 세포 배양물중에서의 BALB/c 마우스 비장 세포 증식의 유도를 그래프로 도시한다. Figure 8a illustrates the use of each of the 5'-end and a non-accessible 5 & apos; various concentrations with terminal Emu by nomeo 5 and 6, cells BALB / c mouse spleen cells in the induction of proliferation of the culture in a graphically .

도 8b는 CpG 모티프의 5'-플랭킹 (flanking) 서열에서 면역원성 화학적 변형이 일어난 이뮤노머 4 내지 6에 의한 BALB/c 마우스 비장 비대를 그래프로 도시한다. Figure 8b shows a BALB / c mouse spleen enlargement caused by Emu nomeo 4 to 6 immunogenic chemical modification in the 5'-flanking (flanking) the sequence of CpG motifs caused a graph. 다시 말하면, 접근가능한 5'-말단을 가지고 있는 이뮤노머 6은 접근가능한 5'-말단이 없는 이뮤노머 5 및 단량체 올리고 4와 비교할 때 비장 비대를 증가시키는 능력이 보다 크다. In other words, the access Emu nomeo 6 having an available 5'-end is greater than the ability to increase the splenomegaly when oligonucleotide Emu nomeo 5 and the monomer do not have an accessible 5 'end compared to 4.

도 9a는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 다양한 농도의 올리고 4 및 이뮤노머 7과 8에 의한 IL-12의 유도를 그래프로 도시한다. Figure 9a shows the induction of a BALB / c mouse spleen cells with different concentrations of oligonucleotide in the culture, and 4 Emu nomeo 7 and IL-12 by 8 as a graph.

도 9b는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 다양한 농도의 올리고 4 및 이뮤노머 7과 8에 의한 IL-6의 유도를 그래프로 도시한다. Figure 9b shows the induction of a BALB / c mouse spleen cells with different concentrations of oligonucleotide in the culture, and 4 Emu nomeo 7 and IL-6 by 8 graphically.

도 9c는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 다양한 농도의 올리고 4 및 이뮤노머 7과 8에 의한 IL-10의 유도를 그래프로 도시한다. Figure 9c shows the induction of BALB / c mouse spleen cells with different concentrations of oligonucleotide in the culture, and 4 Emu nomeo 7 and IL-10 by 8 as a graph.

도 10a는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 이뮤노머 14, 15 및 16에 의한 세포 증식의 유도를 그래프로 도시한다. Figure 10a shows the induction of cell proliferation by BALB / c mouse spleen cells in the culture Emu nomeo 14, 15 and 16 in the graph.

도 10b는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 다양한 농도의 이뮤노머 14 및 16에 의한 IL-12에 의한 세포 증식의 유도를 그래프로 도시한다. Figure 10b shows the induction of cell proliferation by BALB / c mouse spleen cells in IL-12 according to the Emu nomeo 14 and 16 of different concentrations in the culture in a graph.

도 10c는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 다양한 농도의 이뮤노머 14 및 16에 의한 IL-6에 의한 세포 증식의 유도를 그래프로 도시한다. Figure 10c shows the induction of cell proliferation by BALB / c mouse spleen cells IL-6 by Emu nomeo 14 and 16 of different concentrations in the culture in a graph.

도 11a는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 올리고 4 및 17과 이뮤노머 19 및 20에 의한 세포 증식의 유도를 그래프로 도시한다. Figure 11a shows the induction of cell proliferation by BALB / c mouse spleen cells raised from the culture. 4 and 17 and Emu nomeo 19 and 20 in the graph.

도 11b는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 다양한 농도의 올리고 4 및 17과 이뮤노머 19 및 20에 의한 IL-12에 의한 세포 증식의 유도를 그래프로 도시한다. Figure 11b shows the induction of cell proliferation by the oligonucleotides of various concentrations in spleen cell culture BALB / c mice 4 and 17 and Emu nomeo 19 and 20 IL-12 by a graph.

도 11c는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 다양한 농도의 올리고 4 및 17과 이뮤노머 19 및 20에 의한 IL-6에 의한 세포 증식의 유도를 그래프로 도시한다. Figure 11c shows the induction of cell proliferation by the oligonucleotides of various concentrations in spleen cell culture BALB / c mice 4 and 17 and Emu nomeo 19 and 20 IL-6 by a graph.

도 12는 올리고뉴클레오티드 4 및 이뮤노머 14, 23 및 24를 사용한 BALB/c 마우스 비장 비대를 그래프로 도시한다. Figure 12 shows the oligonucleotides 4 and Emu nomeo BALB / c mouse spleen enlargement with 14, 23 and 24 in the graph.

도 13은 비-뉴클레오티드 연결이 뉴클레오염기에 있는 뉴클레오시드에 3' 위치, 또는 2' 위치에서 부착될 수 있음을 보여주는, 올리고뉴클레오티드의 3'-말단 뉴클레오시드의 개략도이다. Figure 13 is a non-schematic diagram of a nucleotide connection 3 to a nucleoside in the nucleoside base "location, or 2 ', showing that it can be attached at the position, oligonucleotide 3'-end nucleosides of the oligonucleotide.

도 14는 실시예 13에서 사용된 화학적 치환을 도시한다. Figure 14 shows the chemical substitution used in Example 13.

도 15는 실시예 13의 변형된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 얻어진 시토킨 프로필을 도시한다. Figure 15 is an oligonucleotide of Example 13 shows a variant cytokine profile obtained by use of the oligonucleotide.

도 16은 아미노 링커와 비교하여 글리세롤 링커에 대한 상대적인 시토킨 유도를 도시한다. Figure 16 shows the relative induction of cytokines in glycerol linker compared with the amino linker.

도 17은 다양한 링커 및 링커 조합물에 대한 상대적인 시토킨 유도를 도시한다. Figure 17 illustrates the relative cytokine induction for various linker and linker combination.

도 18a 내지 18e는 다양한 PS 및 PO 이뮤노머와 올리고뉴클레오티드에 대한 상대적인 뉴클레아제 내성을 도시한다. Figure 18a to 18e are raised with various PS and PO Emu nomeo showing the relative nuclease resistance to the oligonucleotide.

도 19는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 PS 이뮤노머와 비교하여 PO 이뮤노머에 대한 상대적인 시토킨 유도를 도시한다. Figure 19 illustrates the relative cytokine induction for PO Emu nomeo compared with PS Emu nomeo from spleen cell cultures of BALB / c mouse.

도 20은 C3H/Hej 마우스 비장 세포 배양물중에서 PS 이뮤노머와 비교하여 PO 이뮤노머에 대한 상대적인 시토킨 유도를 도시한다. Figure 20 illustrates the relative cytokine induction for PO Emu nomeo compared to the C3H / Hej mice splenocytes PS Emu nomeo from the culture.

도 21은 고농도의 이뮤노머에서 C3H/Hej 마우스 비장 세포 배양물중에서의 PS 이뮤노머와 비교하여 PO 이뮤노머에 대한 상대적인 시토킨 유도를 도시한다. Figure 21 illustrates the relative cytokine induction for PO Emu nomeo compared with PS Emu nomeo of from C3H / Hej mouse spleen cell culture in high concentration of Emu nomeo.

본 발명은 면역요법 적용을 위한 면역자극제로서의 올리고뉴클레오티드의 치료적 용도에 관한 것이다. The invention as immunostimulant oligonucleotide for immunotherapeutic application relates to therapeutic use of oligonucleotides. 본원에서 인용되는 공개 특허, 특허 출원 및 참고문헌들은 본원에 참고로 삽입된다. Patent Publication, which is incorporated herein, patent applications and references are inserted herein by reference. 본원에서 인용된 참고문헌이 교시하는 것과 본 발명의 상세한 설명이 일치하지 않는 경우, 본 발명의 목적상, 본 발명의 상세한 설명이 우선한다. If the description of the present invention as the references cited in the present teachings do not match, the object of the present invention, a detailed description of the invention shall govern.

본 발명은 면역요법 분야, 예컨대, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 성인 및 소아 및 수의학 분야에서의 암, 자가면역 질병, 천식, 호흡기 알레르기, 음식 알레르기, 및 세균, 기생충, 및 바이러스 감염의 치료에 사용되는 면역자극성 화합물에 의해 유발된 면역 반응을 증강시키는 방법을 제공한다. The present invention immunotherapy field, for example, but are not limited to them, but cancer in adult and pediatric and veterinary medicine, autoimmune diseases, asthma and respiratory allergies, food allergies, and bacteria, which is used in the treatment of parasites, and viruses It provides a method for enhancing the immune response caused by immunostimulatory compounds. 그러므로, 본 발명은 또한 면역요법을 위한 최적 수준의 면역자극성 효과를 가지는 화합물 및 이러한 화합물의 제조하고 사용하는 방법을 제공한다. Thus, the present invention also provides methods to make and use that has an immunostimulatory effect of an optimum level of compound and these compounds for immunotherapy. 또한, 본 발명의 이뮤노머는 DNA 백신, 항체, 알레르겐, 화학요법제, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 사용되는 보조제(adjuvant)로서 유용하다. Further, it is useful as an adjuvant (adjuvant) which is used with a dimmer are immunometric DNA vaccines, antibodies, allergens, chemotherapeutic agents, and antisense oligonucleotides of the present invention.

본 발명자들은 놀랍게도 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 최적으로 제공하는 변형이 그 올리고뉴클레오티드의 면역자극성 능력에 극적으로 영향을 준다는 것을 발견하였다. The inventors have surprisingly found that the strain immunostimulatory oligonucleotide at the 5 'terminus of the nucleotide at the best Giving the oligonucleotide dramatically affect the ability of the immunostimulatory oligonucleotide. 그러한 올리고뉴클레오티드를 본원에서는 "이뮤노머"로 언급한다. Such an oligonucleotide is referred to herein as "Emu nomeo".

제 1 측면으로, 본 발명은 3' 말단, 또는 뉴클레오시드간 연결부 또는 작용기화된 뉴클레오염기 또는 당에서 비-뉴클레오티드 링커에 연결된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 이러한 올리고뉴클레오티드중 하나 이상은 면역자극성 올리고뉴클레오티드이고 접근가능한 5' 말단을 지닌 이뮤노머를 제공한다. First the aspect, the invention provides the 3 'end, or nucleoside cross connection or action a nucleobase or a non-in per vaporization - comprising at least two oligonucleotides linked to a nucleotide linker, one or more of these oligonucleotides is oligonucleotide immunostimulatory oligonucleotide and provides a Emu nomeo having an accessible 5 'end. 본원에서 사용되는 용어 "접근가능한 5' 말단"이란 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이 이뮤노머를 인지하고 이것에 결합하여 면역계를 자극하는 인자들이 이것에 접근하도록 충분히 접근가능함을 의미한다. Means sufficiently close possible As used herein, the term "accessible 5 factors that 'terminal" is raised five nucleotide' end if the Emu nomeo and stimulate the immune system by binding to these are to have access thereto. 접근가능한 5' 말단을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드에서, 말단 당의 5' OH 위치는 2개 이상의 뉴클레오시드 잔기에 공유결합되지 않는다. Accessible 5 'oligonucleotide with a terminal in the nucleotide, the party-terminal 5' OH position is not covalently bonded to at least two nucleoside residues. 임의로, 5' OH는 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트 부분, 방향족 또는 지방족 링커, 콜레스테롤, 또는 접근성을 방해하지 않는 또 다른 물질에 연결될 수 있다. Optionally, 5 'OH it can be coupled to the phosphate, phosphorothioate or phosphorothioate dithio benzoate section, aromatic or aliphatic linker another material that does not interfere with the cholesterol, or accessibility.

본 발명의 목적상, "이뮤노머"는 3' 말단, 또는 뉴클레오시드간 연결부 또는 작용기화된 뉴클레오염기 또는 당에서 직접 또는 비-뉴클레오티드 링커를 통해 연결된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 이러한 올리고뉴클레오티드 (이뮤노머와 관련하여)중 하나 이상이 면역자극성 올리고뉴클레오티드이고 접근가능한 5' 말단을 가지는 임의의 화합물을 의미하는데, 이 화합물은 척추동물에 투여될 때 면역 반응을 유도한다. For the purposes of this invention, "Emu nomeo" is the 3 'end, or nucleoside cross connection or act directly or ratio in the vaporized nucleobase or sugar-comprising a second oligonucleotide or more nucleotides linked by a nucleotide linker, such up to one or more of the nucleotide (in relation to the Emu nomeo) is meant any compound having an immunostimulatory oligonucleotide, and an accessible 5 'end, the compound induces an immune response when administered to a vertebrate. 어떤 구체예에서 척추동물은 사람을 포함한 포유류이다. In some embodiments, the vertebrate is a mammal, including humans.

어떤 구체예에서, 이뮤노머는 동일하거나 상이한 둘 이상의 면역자극성 올리고뉴클레오티드 (이뮤노머와 관련하여)를 포함한다. In some embodiments, the immunometric dimmer same or different than one immunostimulatory oligonucleotide comprises a nucleotide (in relation to the Emu nomeo). 바람직하게는, 각각의 그러한 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 접근가능한 5' 말단을 갖는다. Preferably, the oligonucleotides each such immunostimulatory oligonucleotide has a 5 'end of one or more accessible.

특정 구체예에 있어서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드(들) 이외에, 이뮤노머는 또한 유전자에 상보적인 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. In certain embodiments, in addition to the immunostimulatory oligonucleotide (s), and the immunometric dimmer also includes a complementary oligonucleotide to one or more genes. 본원에서 사용되는 용어 "상보적인"은 생리적 조건하에서 유전자 영역에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. The term "complementary" as used herein means a nucleotide oligonucleotide which hybridizes to the gene region under physiological conditions. 어떤 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 유전자의 발현을 하향조절한다. In some embodiments, the oligonucleotide is down-regulating the expression of the gene. 그러한 하향조절성 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 올리고뉴클레오티드, 작은 억제성 RNA 및 유인(decoy) 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택된다. Such oligonucleotide down-regulatory nucleotide antisense oligonucleotides are preferably oligonucleotides, ribozymes oligonucleotide, oligonucleotide small inhibitory RNA and incentive (decoy) is selected from the group consisting of nucleotide. 본원에서 사용되는 용어 "유전자를 하향조절한다"는 것은 유전자의 전사 또는 유전자 생성물의 번역을 억제하는 것을 의미한다. As used herein, the term "down-regulate the gene" means that the means of suppressing transcription or translation of the gene product of the gene. 그러므로 본 발명의 이들 구체예에 따른 이뮤노머는 면역계를 여전히 자극하면서도 하나 이상의 특이한 질병 표적을 표적화하는 데 사용될 수 있다. Therefore, there can be used, yet these immunometric dimmer immune system according to these embodiments of the present invention still stimulation to the targeted one or more unusual disease target.

특정 구체예에서, 이뮤노머는 리보자임 또는 유인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. In certain embodiments, the oligonucleotide is a ribozyme or immunometric dimmer incentive comprises nucleotides. 본원에서 사용되는 용어 "리보자임"은 촉매적 활성을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드를 말한다. As used herein, the term "ribozyme" refers to oligonucleotides that have a catalytic activity. 바람직하게는 리보자임은 특이한 핵산 표적에 결합하여 그 표적을 절단한다. Preferably the ribozyme is bound to characteristic nucleic acid target cleaves its target. 본원에서 사용되는 용어 "유인 올리고뉴클레오티드"는 서열-특이적인 방식으로 전사 인자에 결합하여 전사 활성을 정지시키는 올리고뉴클레오티드를 말한다. "Oligo nucleotide manned" As used herein, sequence-refers to oligonucleotides to stop the transcription activity by binding to the transcription factor-specific manner. 바람직하게는 리보자임 또는 유인 올리고뉴클레오티드는 제한없이, 스템-루프 또는 헤어핀 구조를 포함하는 2차 구조를 나타낸다. Preferably, oligonucleotide or ribozyme attracted nucleotides, the stem without limitation - shows a secondary structure that includes a loop or hairpin structure. 어떤 구체예에서 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 폴리(I)-폴리(dC)를 포함한다. One or more oligonucleotide In some embodiments the nucleotides of poly (I) - and a poly (dC). 특정 구체예에서는 하나 이상의 Nn 세트가 3 내지 10개의 dG 및/또는 G 또는 2'-치환된 리보 또는 아라비노 G로 된 스트링 (string)을 포함한다. In certain embodiments it includes a string (string), one or more sets of Nn to 3 to 10 dG and / or G, or 2'-substituted ribonucleotides or arabinose G.

본 발명의 목적상, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 다수의 연결된 뉴클레오시드 단위로부터 형성된 폴리뉴클레오시드를 말한다. For the purposes of this invention, the term "oligonucleotide" refers to a poly nucleosides formed from a plurality of nucleoside units linked. 그러한 올리고뉴클레오티드는 게놈 또는 cDNA를 포함하는 기존의 핵산 공급원으로부터 얻어질 수 있지만, 바람직하게는 합성 방법에 의해 제조된다. Such oligonucleotides are prepared by a quality, preferably a synthesis method can be obtained from existing nucleic acid sources, including genomic or cDNA. 바람직한 구체예에서 각 뉴클레오시드 유니트는 헤테로시클릭 염기 및 펜토푸라노실, 트레할로스, 아라비노스, 2'-데옥시-2'-치환된아라비노스, 2'-O-치환된 아라비노스 또는 헥소스 당 기를 포함한다. Each of the nucleoside units in the preferred embodiment is a heterocyclic base and a pento nosil furanyl, trehalose, arabinose, 2'-deoxy-2'-substituted arabinose, 2'-O- substituted arabinose or hexyl source include a sugar. 뉴클레오시드 잔기는 공지된 수많은 뉴클레오시드간 연결중 어느 하나에 의해 상호간에 결합될 수 있다. Nucleoside residues may be coupled to each other by any one of connections between a number of known nucleoside. 그러한 뉴클레오시드간 연결로는 제한없이 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 실록산, 카보네이트, 카르보알콕시, 아세트아미데이트, 카바메이트, 모르폴리노, 보라노, 티오에테르, 가교된 포스포라미데이트, 가교된 메틸렌 포스포네이트, 가교된 포스포로티오에이트, 및 술폰 뉴클레오시드간 연결이 있다. Between such nucleosides yeongyeolro are phosphodiester, phosphorothioate, without limitation, thio benzoate, phosphorothioate dithio benzoate, alkyl phosphonates, alkyl phosphono thio benzoate, phosphotriester, phosphonate lamina date, siloxane, carbonate, carbonate there is alkoxy, acetamido date, carbamate, morpholino, see furnace, a thioether, a cross-linked phosphonate lamina date, cross-linked methylene phosphonate, bridged phosphorothioate, and sulfone nucleoside cross connection. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 또한 하나 이상의 입체 특이적 뉴클레오시드간 연결 (예컨대 (Rp)- 또는 (Sp)-포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트, 또는 포스포트리에스테르 연결)을 가지고 있는 폴리뉴클레오시드를 포함한다. The term "oligonucleotide" is also connected between the one or more stereospecific nucleoside poly nucleoside with (e.g., (Rp) - - or (Sp) phosphorothioate, alkylphosphonate, or phosphotriester connection) and a seed. 본원에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "디뉴클레오티드"는 연결이 포스페이트기를 포함하고 있는 연결이든 또는 그렇지 않든간에 그러한 임의의 뉴클레오시드간 연결을 가지고 있는 폴리뉴클레오시드 및 디뉴클레오시드를 포함하는 것으로 명백하게 의도된다. "Oligonucleotide" As used herein, the term, and "dinucleotide" are any connection which comprises a connection is phosphate or not it or to have a connection between any such nucleosides include poly nucleosides and dinyu nucleoside in the liver that apparently is intended. 어떤 바람직한 구체예에서 이들 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트 연결, 또는 이들의 조합일 수 있다. In some preferred embodiments the connection between these nucleosides may be a phosphodiester, phosphorothioate or phosphorothioate dithio benzoate connection, or a combination thereof.

어떤 구체예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 약 3 내지 약 35 개의 뉴클레오시드 잔기, 바람직하게는 약 4 내지 약 30 개의 뉴클레오시드 잔기, 보다 바람직하게는 약 4 내지 약 20 개의 뉴클레오시드 잔기를 가진다. In some embodiments, each of the oligonucleotides are from about 3 to about 35 nucleoside residues, preferably from about 4 to about 30 nucleoside residues, more preferably from about 4 to about 20 nucleoside residues have. 어떤 구체예에서 올리고뉴클레오티드는 약 5 내지 약 18 개, 또는 약 5 내지 약 14 개의 뉴클레오시드 잔기를 가진다. Oligonucleotide In some embodiments, the oligonucleotide has from about 5 to about 18, preferably about 5 to about 14 nucleoside residues. 본원에서 사용되는 용어 "약"은 정확한 수가 결정적이지 않다는 의미를 함축한다. The term "about" as used herein implies an accurate does not mean inconclusive. 그러므로 올리고뉴클레오티드에서 뉴클레오시드 잔기의 수는 중요하지 않으며, 하나 또는 2개 더 적은 뉴클레오시드 잔기, 또는 하나 내지 여러 개의 추가의 뉴클레오시드 잔기를 가지고 있는 올리고뉴클레오티드도 상술된 구체예의 각각의 균등물로서 포함된다. Therefore up the number of nucleoside residues in the oligonucleotides is not critical, one or two fewer nucleoside residues, or up with one to have several additional nucleoside residues in the oligonucleotides is also example each equal the above described embodiments It is included as the water. 어떤 구체예에서는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드가 11개의 뉴클레오티드를 가진다. In some embodiments, one or more oligonucleotides have 11 nucleotides.

용어 "올리고뉴클레오티드"는 또한 제한없이, 단백질 기, 친유성 기, 인터칼레이팅 제제, 디아민, 폴산, 콜레스테롤 및 아다만탄을 포함하는 추가의 치환체를 가지는 폴리뉴클레오시드를 포함한다. The term "oligonucleotide" also ah, protein groups, lipophilic groups, intercalating agents, diamines, folic acid, cholesterol, and without limitation, but include poly nucleosides having additional substituents, including the carbon. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 또한 중합체를 함유하고 있는 어떠한 다른 뉴클레오염기를 포함하며, 이들로는 제한없이 펩티드 핵산 (PNA), 포스페이트기를 가지고 있는 펩티드 핵산 (PHONA), 록킹 (locking)된 핵산 (LNA), 모르폴리노-골격 올리고뉴클레오티드, 및 알킬 링커 또는 아미노 링커가 있는 골격 부분을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드가 있다. The term "oligonucleotide" also includes any other nucleobase containing polymer, these include a peptide nucleic acid (PNA), peptide nucleic acids (PHONA) with an phosphate, locking (locking) the nucleic acid, without limitation, (LNA ), morpholino-backbone oligonucleotides that have a nucleotide, and alkyl linkers or amino linkers skeletal part with a nucleotide.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 천연 뉴클레오시드, 변형된 뉴클레오시드, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. Oligonucleotides of the invention include natural nucleosides, modified nucleosides, or mixtures thereof. 본원에서 사용되는 용어 "변형된 뉴클레오시드"는 변형된 헤테로시클릭 염기, 변형된 당 부분, 또는 이들의 조합물을 포함하는 뉴클레오시드이다. As used herein, the term "modified nucleoside" is a nucleoside that includes a modified heterocyclic base, when, a modified sugar moiety, or a combination thereof. 어떤 구체예에서 변형된 뉴클레오시드는 본원에서 설명되는 바와 같이 비-천연 피리미딘 또는 푸린 뉴클레오시드이다. As it will be explained in the modified nucleoside present in certain embodiments a non-natural pyrimidine or purine nucleosides. 어떤 구체예에서, 변형된 뉴클레오시드는 2'-치환된 리보뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드 또는 2'-데옥시-2'-플루오로아라비노시드이다. In some embodiments, the substituted 2'-arabinoside to seed the modified nucleoside ribo nucleosides, arabino nucleoside or 2'-deoxy-2'-fluoro.

본 발명의 목적상, 용어 "2'-치환된 리보뉴클레오시드"는 펜토스 부분의 2' 위치에 있는 히드록실기가 치환되어 2'-O-치환된 리보뉴클레오시드를 생성하게 되는 리보노클레오시드를 포함한다. For the purposes of this invention, the term "2'-substituted ribonucleoside seed" may be substituted a hydroxyl group at the 2 'position of the pentose portions Lee that generates a 2'-O- substituted ribonucleoside seed Bono comprises a nucleoside. 바람직하게 그러한 치환은 1 내지 6개의 포화 또는 불포화 탄소 원자를 함유하고 있는 저급 알킬기, 또는 6 내지 10개의 탄소 원자를 가지고 있는 아릴기로 이루어지며, 그러한 알킬, 또는 아릴기는 치환되지 않을 수 있거나 예컨대 할로, 히드록시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 아실, 아실옥시, 알콕시, 카르복실, 카르보알콕시, 또는 아미노기로 치환될 수 있다. Preferably such substitutions can be made with an aryl group having a lower alkyl group, or a 6 to 10 carbon atoms containing from 1 to 6 saturated or unsaturated carbon atoms, such alkyl, or aryl group or can be substituted, for example halo, hydroxy, it can be substituted by trifluoromethyl, cyano, nitro, acyl, acyloxy, alkoxy, carboxyl, carboalkoxy, or amino groups. 그러한 2'-O-치환된 리보뉴클레오시드의 예로는 제한 없이 2'-O-메틸리보뉴클레오시드 및 2'-O-메톡시에틸리보뉴클레오시드가 있다. Examples of such 2'-O- substituted ribonucleoside seed has a 2'-O- methyl ribonucleotides nucleosides and 2'-O- methoxyethyl ribonucleic nucleoside without limitation.

용어 "2'-치환된 리보뉴클레오시드"는 또한 2'-히드록실기가 1 내지 6개의 포화 또는 불포화 탄소 원자를 함유하고 있는 저급 알킬기, 또는 아미노 또는 할로기로 치환된 리보뉴클레오시드를 포함한다. The term "2'-substituted ribonucleoside seeds" also includes the 2'-hydroxyl group is 1 to 6, saturated or unsaturated lower alkyl group, or an amino or a halo-substituted ribonucleoside oxide containing a carbon atom do. 그러한 2'-치환된 리보뉴클레오시드의 예로는 제한 없이 2'-아미노, 2'-플루오로, 2'-알릴, 및 2'-프로파르길 리보뉴클레오시드가 있다. Examples of such 2'-substituted ribonucleoside seed has a 2'-amino, 2'-fluoro, without limitation, 2'-allyl, and 2'-propargyl ribo nucleosides.

용어 "올리고뉴클레오티드"는 하이브리드 및 키메라 올리고뉴클레오티드를 포함한다. The term "oligonucleotide" includes hybrid and chimeric oligonucleotides. "키메라 올리고뉴클레오티드"는 한가지 이상의 유형의 뉴클레오시드간 연결을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드이다. "Chimeric oligonucleotide" is an oligonucleotide that has a connection between more than one type of nucleoside. 그러한 키메라 올리고뉴클레오티드의 바람직한 한가지 예는 포스포로티오에이트, 포스포디에스테르 또는 포스포로디티오에이트 영역 및 비-이온성 연결, 예컨대 알킬포스포네이트 또는 알킬포스포노티오에이트 연결을 포함하는 키메라 올리고뉴클레오티드이다 (참조: Pederson et al., 미국 특허 제 5,635,377호 및 5,366,878호). Preferred one example of the oligonucleotide such a chimeric oligonucleotide is a phosphorothioate, phosphodiester or phosphorothioate dithio benzoate region and a non-chimeric oligonucleotide comprising an ionic connection, for example, alkyl phosphonate or alkyl phosphono thio benzoate connection (see:. Pederson et al, U.S. Patent No. 5,635,377 and No. 5,366,878).

"하이브리드 올리고뉴클레오티드"는 한가지 이상의 유형의 뉴클레오시드를 가지고 있는 올리고뉴클레오티드이다. "Hybrid oligonucleotide" is an oligonucleotide that has a more than one type of nucleoside. 그러한 하이브리드 올리고뉴클레오티드의 바람직한 한 가지 예는 리보뉴클레오티드 또는 2'-치환된 리보뉴클레오티드 영역, 및 데옥시리보뉴클레오티드 영역을 포함한다 (참조: Metelev 및 Agrawal, 미국 특허 제 5,652,355호, 6,346,614호 및 6,143,881호). The hybrid oligonucleotide such an example of the preferred oligonucleotide comprises a ribonucleotide or 2'-substituted ribonucleotide region, and a deoxy-ribonucleotide region (see: Metelev and Agrawal, U.S. Patent No. 5,652,355, No. 6,346,614 and No. 6,143,881) .

본 발명의 목적상, 용어 "면역자극성 올리고뉴클레오티드"는 상술된 바와 같이 척추동물, 예컨대 어류, 가금류, 또는 포유류에 투여되었을 때 면역 반응을 유도하는 올리고뉴클레오티드를 말한다. For purposes of the present invention the term "oligonucleotide immunostimulatory oligonucleotide" refers to a vertebrate, such as fish, oligonucleotides to induce an immune response when administered to poultry, or mammals, as described above. 본원에서 사용되는 용어 "포유류"는 제한 없이 래트, 마우스, 개, 고양이, 말, 소, 젖소, 돼지, 토끼, 사람 이외의 영장류, 및 사람을 포함한다. As used herein, the term "mammal" includes primates, and humans than rats, mice, dogs, cats, horses, cattle, cows, pigs, rabbits, who without any restrictions. 유용한 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 문헌에 설명되어 있다 (Agrawal et al., WO 98/49288, 1998. 11. 5. 공개; WO 01/12804, 2001. 2. 22. 공개; WO 01/55370, 2001. 8. 2. 공개; PCT/USO1/13682, 2001. 4. 30. 출원; 및 PCT/USOI/30137, 2001. 9. 26. 출원). Useful oligonucleotide immunostimulatory oligonucleotide are described in the literature (Agrawal et al, WO 98/49288, 1998. 11. 5. disclosure;. WO 01/12804, 2001. 2. 22. disclosure; WO 01/55370, 2001. 8. 2. The disclosure; PCT / USO1 / 13682, 2001. 4. 30. Application; and PCT / USOI / 30137, 2001. 9. 26. pending). 바람직하게는, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. Preferably, the immunostimulatory oligonucleotide comprises a nucleotide between at least one phosphodiester, phosphorothioate, or phosphorothioate dithio Eight nucleoside connection.

어떤 구체예에서 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 식 5'-Pyr-Pur-3'의 면역자극성 디뉴클레오티드를 포함하는데, 식에서 Pyr은 천연 또는 합성 피리미딘 뉴클레오시드이고 Pur은 천연 또는 합성 푸린 뉴클레오시드이다. To immunostimulatory oligonucleotide In some embodiments, the nucleotides comprising the immunostimulatory dinucleotide of formula 5'-Pyr-Pur-3 ', expression Pyr is a natural or synthetic pyrimidine nucleoside and Pur is a natural or synthetic purine nucleoside . 본원에서 사용되는 용어 "피리미딘 뉴클레오시드"는 뉴클레오시드의 염기 성분이 피리미딘 염기인 뉴클레오시드를 말한다. As used herein, the term "pyrimidine nucleoside" is a base component of the nucleoside refers to a pyrimidine base of the nucleoside. 마찬가지로 용어 "푸린 뉴클레오시드"는 뉴클레오시드의 염기 성분이 푸린 염기인 뉴클레오시드를 말한다. Similarly, the term "purine nucleoside" refers to a base component of the nucleoside base is purine nucleoside. 본 발명의 목적상, "합성" 피리미딘 또는 푸린 뉴클레오시드는 비-천연 피리미딘 또는 푸린 염기, 비-천연 당 부분, 또는 이들의 조합물을 포함한다. For purposes of "synthetic" pyrimidine or purine nucleosides of the present invention a non-sugar moiety include natural, or combinations thereof-natural pyrimidine or purine base, a non.

본 발명에 따른 바람직한 피리미딘 뉴클레오시드는 다음의 구조식 (I)을 갖는다: Have desirable pyrimidine nucleoside of the following formula (I) according to the invention:

Figure 112004017052430-pct00001
(I) (I)

상기 식에서, Wherein

D는 수소 결합 공여체이고; D is a hydrogen bond donor;

D'은 수소, 수소 결합 공여체, 수소 결합 수용체, 친수성 기, 소수성 기, 전자 끌개기 및 전자 주개기로 이루어지는 군으로부터 선택되며; D 'is selected from hydrogen, hydrogen bond donor, hydrogen bond acceptor, hydrophilic group, a hydrophobic group, an electron attractor group, and the group consisting of electron Total Solar;

A는 수소 결합 수용체 또는 친수성 기이고; A is a hydrogen bond acceptor or a hydrophilic group;

A'는 수소결합 수용체, 친수성 기, 소수성 기, 전자 끌개기 및 전자 주개기로 이루어지는 군으로부터 선택되고; A 'is selected from a hydrogen bond acceptor, hydrophilic group, a hydrophobic group, an electron attractor group, and the group consisting of electron Total Solar;

X는 탄소 또는 질소이고; X is carbon or nitrogen;

S'은 펜토스 또는 헥소스 당 고리, 또는 비-천연 당이다. S 'is a pentose or cyclohexyl ring, or a non-sugar source - a natural sugar.

바람직하게는, 당 고리는 포스페이트 부분, 변형된 포스페이트 부분, 또는 피리미딘 뉴클레오시드를 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체에 연결시키기에 적절한 다른 링커 부분으로 유도체화된다. Preferably, the sugar ring is derivatized with a different linker moiety suitable for connection to the phosphate portion, the deformed portion of the phosphate, or pyrimidine nucleoside to another nucleoside or nucleoside analog.

바람직한 수소 결합 공여체로는 제한 없이 -NH-, -NH 2 , -SH 및 -OH가 있다. Preferred hydrogen bond donors include a -NH-, -NH 2, -SH and -OH, without limitation. 바람직한 수소 결합 수용체로는 제한 없이 C=O, C=S, 및 방향족 헤테로사이클의 고리 질소 원자, 예컨대 시토신의 N3가 있다. Preferred hydrogen bond acceptors include, without limitation, a C = O, C = S, and the ring nitrogen atoms of an aromatic heterocycle, e.g., N3 of cytosine.

어떤 구체예에서 (I)의 염기 부분은 비-천연 피리미딘 염기이다. In some embodiments, the base portion of (I) is a non-natural pyrimidine bases. 바람직한 비-천연 피리미딘 염기의 예로는, 제한 없이 5-히드록시시토신, 5-히드록시메틸시토신, N4-알킬시토신, 바람직하게는 N4-에틸시토신, 및 4-티오우라실이 있다. Preferred Examples of non-natural pyrimidine bases, a 5-hydroxy-cytosine, 5-hydroxymethyl cytosine, cytosine N4- alkyl, preferably N4- ethyl-cytosine, and 4-thiouracil, without limitation. 그러나 어떤 구체예에서는 5-브로모시토신이 특별히 배제된다. However, in some embodiments, 5-bromo-cytosine is specifically excluded.

어떤 구체예에서 (I)의 당 부분 S'은 비-천연 당 부분이다. In some embodiments, the sugar moiety of (I) S 'is a non-natural sugar moiety. 본 발명의 목적상, "천연 당 부분"은 핵산의 일부로서 천연 당 부분, 예컨대 리보스 및 2'-데옥시리보스이고, "비-천연 당 부분"은 핵산의 일부로서 천연적으로 발생하지 않지만 올리고뉴클레오티드의 골격으로서 사용될 수 있는 임의의 당, 예컨대 헥소스이다. The object of the invention, "natural sugar moiety" is a part, for example, ribose and 2'-deoxyribose sugar of natural nucleic acid as part of a "non-natural sugar moiety" is raised does not naturally occur as part of a nucleic acid any sugar that can be used as the backbone of the nucleotide, for example, hexyl source. 아라비노스와 아라비노스 유도체가 바람직한 당 부분의 예이다. Arabian an example of the North and arabinose sugar moiety derivatives are preferred.

본 발명에 따른 바람직한 푸린 뉴클레오시드 유사체는 다음 구조식 (II)를 갖는다: Preferred purine nucleoside analogs according to the present invention has the following structural formula (II):

Figure 112004017052430-pct00002
( II ) (II)

상기 식에서, Wherein

D는 수소 결합 공여체이고; D is a hydrogen bond donor;

D'은 수소, 수소 결합 공여체, 및 친수성 기로 이루어지는 군으로부터 선택되고; D 'is selected from the group comprising hydrogen, hydrogen bond donor, and hydrophilic;

A는 수소 결합 수용체 또는 친수성 기이고; A is a hydrogen bond acceptor or a hydrophilic group;

X는 탄소 또는 질소이며; X is a carbon or nitrogen;

각각의 L은 독립적으로 C, O, N, 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되고; Each L is independently selected from the group consisting of C, O, N, and S;

S'은 펜토스 또는 헥소스 당 고리, 또는 비-천연 당이다. S 'is a pentose or cyclohexyl ring, or a non-sugar source - a natural sugar.

바람직하게는, 당 고리는 포스페이트 부분, 변형된 포스페이트 부분, 또는 피리미딘 뉴클레오시드를 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체에 연결시키기에 적절한 다른 링커 부분으로 유도체화된다. Preferably, the sugar ring is derivatized with a different linker moiety suitable for connection to the phosphate portion, the deformed portion of the phosphate, or pyrimidine nucleoside to another nucleoside or nucleoside analog.

바람직한 수소 결합 공여체로는 제한 없이 -NH-, -NH 2 , -SH 및 -OH가 있다. Preferred hydrogen bond donors include a -NH-, -NH 2, -SH and -OH, without limitation. 바람직한 수소 결합 수용체로는 제한 없이 C=O, C=S, -NO 2 및 방향족 헤테로사이클의 고리 질소 원자, 예컨대 구아닌의 N1이 있다. Preferred hydrogen bond acceptors include, without limitation, there is a C = O, C = S, -NO 2 , and N1 of the ring nitrogen atoms, such as guanine of the aromatic heterocycle.

어떤 구체예에서 (II)의 염기 부분은 비-천연 푸린 염기이다. A base portion in certain embodiments (II) is a non-natural purine bases. 바람직한 비-천연 푸린 염기의 예로는 제한 없이 6-티오구아닌 및 7-데아자구아닌이 있다. Preferred Examples of non-natural purine bases are the 6-thioguanine and 7-aza-guanine having unrestricted. 어떤 구체예에서, (II)의 당 부분 S'은 상기 구조식 (I)에 대하여 설명된 것과 같이 천연 당 부분이다. In some embodiments, the portion S 'of a per (II) is a natural sugar moiety, as described with respect to the structural formula (I).

바람직한 구체예에서, 면역자극성 디뉴클레오티드는 CpG, C * pG, CpG * , 및 C * pG * 로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기서 C는 시티딘 또는 2'-데옥시시티딘이고, C * 은 2'-데옥시티미딘, 아라비노시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-히드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘 또는 그 밖의 비-천연 피리미딘 뉴클레오시드이며, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이고, G * 은 2' 데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2' 치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 그 밖의 비-천연 푸린 뉴클레오시드이며, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 및 포스포로디티오에이트로 이루어 In preferred embodiments, the immunostimulatory dinucleotide is selected from the CpG, C * pG, CpG *, and C * pG * the group consisting of, wherein C is cytidine or 2'-deoxycytidine and, C * is 2 '- deoxy thymidine, cytidine arabinoside, 2'-deoxy-thymidine, 2'-deoxy-2'-substituted arabinose cytidine, 2'-O- substituted arabinose cytidine, 2' - deoxy-5-hydroxy-cytidine, 2'-deoxy -N4- alkyl-cytidine, 2'-deoxy-4-thio uridine or other non-natural pyrimidine nucleoside and, G is and guanosine or 2'-deoxy guanosine, G * is 2 & apos; deoxy-7-de-aza guanosine, 2'-deoxy-6-thio guanosine, arabinose guanosine, 2'-deoxy- 2 'substituted-arabinoside guanosine, 2'-O- substituted-arabinoside guanosine, 2'-deoxy-inosine, or other non-natural purine nucleoside and, p is a phosphodiester, phosphorothioate made of a thio benzoate, and phosphorothioate dithio benzoate 지는 군으로부터 선택된 뉴클레오시드간 연결이다. Where a connection between the selected nucleoside from the group. 어떤 바람직한 구체예에서, 면역자극성 디뉴클레오티드는 CpG가 아니다. In some preferred embodiments, the immunostimulatory dinucleotide is not CpG.

면역자극성 올리고뉴클레오티드는 면역자극성 디뉴클레오티드의 한 쪽 또는 양쪽에 면역자극성 부분을 포함할 수 있다. Oligonucleotide immunostimulatory oligonucleotide may comprise one or immunostimulatory portion on either side of the immunostimulatory dinucleotide. 그러므로, 어떤 구체예에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 다음 구조식 ( III )의 면역자극성 도메인을 포함한다: Thus, in some embodiments, the oligonucleotide immunostimulatory oligonucleotides include immunostimulatory domain of the following structural formula (III):

5'-Nn-N1-YZ-N1-Nn-3' ( III ) 5'-Nn-N1-YZ- N1-Nn-3 '(III)

상기 식에서, Wherein

Y는 시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시시티딘 아라비노시티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-히드록시시티딘, 2'-데옥시- N4 -알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘 또는 그 밖의 비-천연 피리미딘 뉴클레오시드이고; Y is cytidine, 2'-deoxy-thymidine, 2'-deoxycytidine cytidine arabinoside, 2'-deoxy-2'-substituted arabinose cytidine, 2'-deoxy-thymidine, 2 '-O- substituted cytidine arabinoside, 2'-deoxy-5-hydroxy-cytidine, 2'-deoxy-N4-alkyl-cytidine, 2'-deoxy-4-thio uridine or other non-natural pyrimidine nucleoside, and;

Z는 구아노신, 2'-데옥시구아노신, 2' 데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2' 치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 그 밖의 비-천연 푸린 뉴클레오시드이고; Z is guanosine, 2'-deoxy guanosine, 2 & apos; deoxy-7-de-aza guanosine, 2'-deoxy-6-thio guanosine, arabinose guanosine, 2'-deoxy-2 ' substituted-arabinoside guanosine, 2'-O- substituted-arabinoside guanosine, 2'-deoxy-inosine, or other non-natural purine nucleoside gt;

N1은 각각 바람직하게는 천연 또는 합성 뉴클레오시드, 또는 비염기성 뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보뉴클레오시드, β-L-데옥시리보뉴클레오시드, 및 포스포디에스테르 또는 변형된 뉴클레오시드간 연결에 의해 인접한 뉴클레오시드에 3' 쪽으로 연결된 뉴클레오시드로 이루어지는 군으로부터 선택된 면역자극성 부분이며, 여기서 변형된 뉴클레오시드간 연결은, 제한없이, 약 2 Å 내지 약 200 Å의 길이를 가지는 링커, C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜)링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커, 글리세릴 링커, 2'-5' 뉴클레오시드간 연결, 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결로 이루어지는 군으로부터 선택되고; N1 are each preferably a natural or synthetic nucleoside or a non-basic nucleosides, arabino nucleosides, 2'-deoxy-uridine, α- deoxyribonucleic nucleoside, β-L- deoxyribonucleic nucleoside and phosphodiester or in the nucleoside adjacent by a modified nucleoside connection between an immunostimulatory moiety selected from the group consisting of nucleosides connected towards the 3 ', wherein the modified nucleoside between connections, without limitation, about 2 Å to a linker having a length of about 200 Å, C2-C18 alkyl linker, poly (ethylene glycol) linker, 2-aminobutyl-1,3-propanediol linker, glyceryl linker, 2'-5 "nucleoside cross connection, and phosphorothioate, phosphorothioate dithio benzoate, or methyl phosphonate is selected from the group consisting of the connection between the nucleoside;

Nn은 각각 천연 뉴클레오시드 또는 면역자극성 부분이고, 바람직하게는 비염기성 뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보뉴클레오시드, 2'-O-치환된 리보뉴클레오시드, 및 변형된 뉴클레오시드간 연결에 의해 인접한 뉴클레오시드에 3' 쪽으로 연결된 뉴클레오시드로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기서 변형된 뉴클레오시드간 연결은 아미노 링커, 2'-5' 뉴클레오시드간 연결, 및 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결로 이루어지는 군으로부터 선택되고; Nn are each a natural nucleoside or immunostimulatory portion, preferably non-basic nucleosides, arabino nucleosides, 2'-deoxy-uridine, α- deoxyribonucleic nucleosides, 2'-O- substituted ribonucleoside oxide, and modified nucleosides in three adjacent nucleosides by the connection between 'is selected from the group consisting of nucleosides connected up, wherein the modified nucleoside connection between amino linker, 2 & apos; -5 it is selected from the "nucleoside cross connection, and methyl phosphonate group consisting of a connection between the nucleoside;

단, N1 또는 Nn 중 하나 이상은 면역자극성 부분이고; However, at least one of N1 or Nn is an immunostimulatory portion;

n은 0 내지 30의 수이고; n is a number from 0 to 30, and;

3' 말단, 뉴클레오시드간 연결부, 또는 유도체화된 뉴클레오염기 또는 당은 면역자극성일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는 또 다른 올리고뉴클레오티드에 직접 연결되거나 비-뉴클레오티드 링커를 통해 연결된다. The 3 'end, the connection between the nucleoside, or derivatized nucleotide bases or sugar is raised further, which may or may not be immunostimulatory and connected directly to a nucleotide or non-nucleotide are connected through a linker.

어떤 바람직한 구체예에서 YZ는 아라비노시티딘 또는 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘 및 아라비노구아노신 또는 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노구아노신이다. In some preferred embodiments YZ is arabinose or 2'-deoxy-2'-city a Dean-substituted arabinoside and cytidine arabinoside guanosine or 2'-deoxy-2'-substituted arabinose guanosine. 바람직한 면역자극성 부분은 제한 없이 메틸포스포네이트, 메틸포스포노티오에이트, 포스포트리에스테르, 포스포티오트리에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 트리에스테르 전구약물, 술폰, 술폰아미드, 술파메이트, 포름아세탈, N-메틸히드록실아민, 카보네이트, 카바메이트, 모르폴리노, 보라노포스포네이트, 포스포라미데이트, 특히 일차 아미노-포스포라미데이트, N3 포스포라미데이트 및 N5 포스포라미데이트, 및 입체 특이적 연결 (예컨대 ( Rp )- 또는 ( Sp )-포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트, 또는 포스포트리에스테르 연결)을 포함하는 포스페이트 골격의 변형을 포함한다. Preferred immunostimulatory part without limitation methyl phosphonate, methyl phosphono thio benzoate, phosphotriester, phosphonic Forty five triesters, phosphorothioate, phosphorothioate dithio benzoate, triester prodrugs, sulfones, sulfonamides, sulfamic formate, formaldehyde acetal, N- methyl hydroxyl amine, carbonate, carbamate, morpholino, see Well-established sports sulfonate, phosphonate lamina date, especially primary amino-phosphonium lamina date, N3 and N5 phosphorylation lamina date phosphorylation ramie It includes modifications of the phosphate backbone, including (phosphorothioate, alkylphosphonate, or phosphotriester connection example (Rp) - - or (Sp)) date, and stereospecific connection.

본 발명에 따른 바람직한 면역자극성 부분은 또한 당 변형, 예컨대 제한 없이, 2'-치환된 펜토스 당, 예를 들면 그것들에 한정되는 것은 아니나 2'-O-메틸리보스, 2'-O-메톡히에틸리보스, 2'-O-프로파르길리보스, 및 2'-데옥시-2'-플루오로리보스; Preferred immunostimulatory no part of the present invention are also modified sugar, e.g., limited, 2'-substituted pentose sugars, for example, but are not limited to those 2'-O- methyl-ribose, 2'-O- methoxy tokhi ethyl-ribose, 2'-O- Pro Parr Gillies boss, and 2'-deoxy-2'-fluoro-Lowry boss; 3'-치환된 펜토스 당, 예를 들면, 그것에 한정되는 것은 아니나 3'-O-메틸리보스; 3'-substituted pentose sugars, e.g., but are not limited thereto 3'-O- methyl ribose; 1',2'-디데옥시리보스; 1 ', 2'-dideoxy ribose; 아라비노스; Arabinose; 치환된 아라비노스 당, 예를 들면 그것들에 한정되는 것은 아니나 1'-메틸아라비노스, 3'-히드록시메틸아라비노스, 4'-히드록시메틸-아라비노스, 및 2'-치환된 아라비노스 당; Substituted arabinose sugars, for example, but are not limited to those 1'-methyl-arabinose, 3'-hydroxymethyl-arabinose, 4'-hydroxymethyl-arabinose, and 2'-substituted arabinose sugar .; 헥소스 당, 예를 들면 그것에 한정되는 것은 아니나 1,5-안히드로헥시톨; It is, for hexyl source party, for it to be limited but are not 1,5-dihydro-hexyl when tolyl; 및 알파-아노머를 가지고 있는 뉴클레오시드를 포함한다. And alpha- and a nucleoside having an anomeric. 변형된 당이 3'-데옥시리보뉴클레오시드 또는 3'-O-치환된 리보뉴클레오시드인 구체예에서 면역자극성 부분은 2'-5' 뉴클레오시드간 연결에 의하여 인접한 뉴클레오시드에 부착된다. Having a sugar modification in the 3'-oxy-ribo nucleosides or 3'-O- in the substituted ribonucleoside seed embodiment immunostimulatory portion is adjacent by the connection between the 2'-5 'nucleoside nucleoside It is attached.

본 발명에 따른 바람직한 면역자극성 부분은 추가로 그 밖의 탄수화물 골격 변형 및 치환, 예를 들면 펩티드 핵산 (PNA), 포스페이트 기를 가지고 있는 펩티드 핵산 (PHONA), 록킹된 핵산 (LNA)을 가지는 올리고뉴클레오티드, 모르폴리노 골격 올리고뉴클레오티드, 및 약 2 Å 내지 약 200 Å의 길이를 가지는 골격 링커 단편, 예컨대 그것에 한정되는 것은 아니지만 알킬 링커 또는 아미노 링커를 가지고 있는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. Preferred immunostimulatory part according to the invention are oligonucleotides with additional other carbohydrate backbone modifications and substitutions, for example, peptide nucleic acids (PNA), peptide nucleic acids (PHONA), locked nucleic acids with an phosphate (LNA) to the nucleotide, morpholino poly no backbone oligonucleotide which is skeleton linker fragment has a length of nucleotides, and from about 2 Å to about 200 Å, for example, but not limited to this oligonucleotide with alkyl linkers or amino linkers include nucleotide. 알킬 링커는 분지된 또는 분지되지 않은, 치환된 또는 치환되지 않은, 그리고 키랄적으로 순수한 또는 라세미 화합물의 혼합물일 수 있다. Alkyl linker may be a mixture of a pure non-A non-branched or branched, substituted or substituted, and key raljeok or racemates. 가장 바람직한 것은 그러한 알킬 링커가 약 2 내지 약 18개의 탄소 원자를 가지는 것이다. Most preferred is such alkyl linkers have from about 2 to about 18 carbon atoms. 어떤 바람직한 구체예에서 그러한 알킬 링커는 약 3 내지 약 9 개의 탄소 원자를 갖는다. Such alkyl linker in certain preferred embodiments is from about 3 to about 9 carbon atoms. 어떤 알킬 링커들은 히드록시, 아미노, 티올, 티오에테르, 에테르, 아미드, 티오아미드, 에스테르, 우레아, 및 티오에테르로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용기를 포함한다. Some alkyl linkers include one or more functional groups selected from hydroxy, amino, thiol, thioether, ether, amide, thioamide, a group consisting of ester, urea, and thioether. 그러한 작용기화된 어떤 알킬 링커는 식 -O-(CH 2 -CH 2 -O-)n (n=1 내지 9)의 폴리(에틸렌 글리콜) 링커이다. Some alkyl linkers such a functionalized is a poly (ethylene glycol) linker of the formula -O- (CH 2 -CH 2 -O-) n (n = 1 to 9). 다른 작용기화된 알킬 링커는 펩티드 또는 아미노산이다. The alkyl linker vaporized other action is a peptide or amino acid.

본 발명에 따른 바람직한 면역자극성 부분은 추가로 DNA 이소폼 (isoform), 예컨대 제한없이 β-L-데옥시리보뉴클레오시드 및 α-데옥시리보뉴클레오시드를 포함한다. Preferred immunostimulatory portion of the present invention includes adding to a DNA isoforms (isoform), for example, without limitation, β-L- deoxyribonucleic nucleosides and α- deoxyribonucleic nucleosides. 본 발명에 따른 바람직한 면역자극성 부분은 3' 변형을 포함하며, 추가로 비천연 뉴클레오시드간 연결 위치, 예컨대 제한 없이 2'-5', 2'-2', 3'-3' 및 5'-5' 연결 위치를 가지는 뉴클레오시드를 포함한다. Preferred immunostimulatory part according to the invention are 3 & apos; comprises a modified, non-natural nucleosides added between connection positions, for example, without limitation 2'-5 ', 2'-2', 3'-3 'and 5' -5 to "include nucleosides having a connected position.

본 발명에 따른 바람직한 면역자극성 부분은 변형된 헤테로시클릭 염기, 예컨대 제한 없이 5-히드록시시토신, 5-히드록시메틸시토신, N4-알킬시토신, 바람직하게는 N4-에틸시토신, 4-티오우라실, 6-티오구아닌, 7-데아자구아닌, 이노신, 니트로피롤, C5-프로피닐피리미딘, 및 디아미노푸린, 예컨대 제한 없이 2,6-디아미노푸린을 가지는 뉴클레오시드를 추가로 포함한다. Preferred immunostimulatory portion of the present invention when a modified heterocyclic base, for example, without limitation, 5-hydroxy-cytosine, 5-hydroxymethyl cytosine, cytosine N4- alkyl, preferably N4- ethyl-cytosine, 4-thiouracil, 6-thioguanine, and includes from 7 to aza-guanine, inosine, you roll trophy, C5- propynyl pyrimidine, and diamino-purine, for example, adding a nucleoside having a 2,6-diamino purine, without limitation.

제한하는 것이 아닌 구체적인 예시로서, 예를 들면 구조식 (III)의 면역자극성 도메인에서 위치 N1 또는 Nn에 있는 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결이 약 2 Å 내지 약 200 Å의 길이를 가지는 링커인 면역자극성 부분이고, 위치 X1에 있는 C2-C18 알킬 링커가 면역자극성 부분이며, 위치 X1에 있는 β-L-데옥시리보뉴클레오시드가 면역자극성 부분이다. As a specific example, and not to limit, for example, immune linker, the connection between the methyl phosphonate nucleosides in a position N1 or Nn in the immunostimulatory domain of structural formula (III) has a length of from about 2 Å to about 200 Å and irritation portion, and a C2-C18 alkyl linker at position X1 immunostimulatory part, is a β-L- deoxyribonucleic nucleoside immunostimulatory part in the position X1. 하기 표 1에는 면역자극성 부분의 대표적인 위치와 구조가 제시되어 있다. Table 1 shows a typical location is shown the structure of the immunostimulatory portion. 특정 위치에서의 면역자극성 부분으로서의 링커에 대한 언급은 그 위치에 있는 뉴클레오시드 잔기가 그것의 3'-히드록실에서 표시된 링커로 치환되고, 그로써 그 뉴클레오시드 잔기와 3' 쪽에 인접한 뉴클레오시드 사이에 변형된 뉴클레오시드간 연결이 생성되었음을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. References to the linker as part of immunostimulatory in a given location is a nucleoside residue at that position is substituted with a linker shown in its 3'-hydroxyl group, thereby the nucleoside residue and the 3 'side of an adjacent nucleoside It shall be understood to mean that a connection is created between the modified nucleosides in between. 마찬가지로, 특정 위치에서의 면역자극성 부분으로서의 변형된 뉴클레오시드간 연결에 대한 언급은 그 위치에 있는 뉴클레오시드 잔기가 열거된 연결에 의하여 3' 쪽에서 인접한 뉴클레오시드에 연결되는 것을 의미한다. Similarly, a reference to a connection between the immunostimulatory portion as the modified nucleosides in a given location means coupled to the 3 'side of the adjacent nucleosides by the nucleoside moiety is an open connection at that position.

표 1 Table 1

위치 location 전형적인 면역자극성 부분 Typical immunostimulatory portion
N1 N1 천연 뉴클레오시드, 비염기성 뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드, 2'-데옥시우리딘, β-L-데옥시리보뉴클레오시드 C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜)연결, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커 (아미노 링커), 2'-5'뉴클레오시드간 연결, 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결. Natural nucleosides, non-basic nucleosides, arabino nucleosides, 2'-deoxy-uridine, β-L- deoxyribonucleic nucleoside C2-C18 alkyl linker, poly (ethylene glycol) connection, 2 aminobutyl-1,3-propanediol linker (amino-linker), 2'-5 'nucleoside cross connection, connection between the methyl phosphonate nucleoside.
Nn Nn 천연 뉴클레오시드, 비염기성 뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드, 2'-데옥시우리딘, 2'-O-치환된 리보뉴클레오시드, 2'-5' 뉴클레오시드간 연결, 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결, 단, N1과 N2는 둘 모두 비염기성 연결이 될 수 없다. Natural nucleosides, non-basic nucleosides, arabino nucleosides, 2'-deoxy-uridine, 2'-O- substituted ribonucleoside seed, connection between the 2'-5 'nucleoside, methylphosphonate phosphonate nucleoside cross-connection, however, N1 and N2 are both not everyone can be a non-basic connections.

하기 표 2는 업스트림 (upstream) 강화 도메인을 가지고 있는 면역자극성 올리고뉴클레오티드내의 면역자극성 부분의 대표적인 위치 및 구조를 제시한다. Table 2 immunostimulatory oligonucleotides with enhanced domain upstream (upstream) presents a representative location and structure of the portion in the immunostimulatory oligonucleotide. 본원에서 사용되는 용어 "스페이서(spacer) 9"는 식 -O-(CH 2 -CH 2 -O) n - (여기서, n=3)의 폴리(에틸렌 글리콜) 링커를 나타낸다. As used herein, the term "spacer (spacer) 9" has formula -O- (CH 2 -CH 2 -O) n - ( where, n = 3) represents a poly (ethylene glycol) linker. 용어 "스페이서 18"은 식 -O-(CH 2 -CH 2 -O) n - (여기서, n=6)의 폴리(에틸렌 글리콜) 링커를 나타낸다. The term "spacer 18" is a formula -O- (CH 2 -CH 2 -O) n - ( where, n = 6) represents a poly (ethylene glycol) linker. 본원에서 사용되는 용어 "C2-C18 알킬 링커"는 식 -O-(CH 2 ) q -O- (식에서 q는 2 내지 18의 정수)의 링커를 나타낸다. As used herein, the term "C2-C18 alkyl linker" is a formula -O- (CH 2) q -O- represents a linker of (wherein q is an integer from 2 to 18). 따라서 용어 "C3-링커" 및 "C3-알킬 링커"는 식 -O-(CH 2 ) 3 -O- 의 링커를 의미한다. Thus the term "C3- linker" and "C3- alkyl linker" refers to a linker of the formula -O- (CH 2) 3 -O-. 스페이서 9, 스페이서 18, 및 C2-C18 알킬 링커의 각각에 대하여, 링커는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트 연결에 의하여 인접한 뉴클레오시드에 연결된다. Spacers 9, for each of the spacers 18, and C2-C18 alkyl linker, the linker is coupled to a phosphodiester, phosphorothioate or phosphorothioate dithio benzoate adjacent nucleosides by the connection.

표 2 Table 2

위치 location 전형적인 면역자극성 부분 Typical immunostimulatory portion
5'N2 5'N2 천연 뉴클레오시드, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커 Natural nucleosides, 2-amino-2-butyl-1,3-propanediol linker
5'N1 5'N1 천연 뉴클레오시드, β-L-데옥시리보뉴클레오시드, C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜), 비염기성 링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커 Natural nucleosides, β-L- deoxyribonucleic nucleosides, C2-C18 alkyl linker, poly (ethylene glycol), a non-basic linkers, 2-aminobutyl-1,3-propanediol linker
3'N1 3'N1 천연 뉴클레오시드, 1',2'-디데옥시리보스, 2'-O-메틸리보뉴클레오시드, C2-C18 알킬 링커, 스페이서 9, 스페이서 18 Natural nucleosides, 1 ', 2'-dideoxy ribose, 2'-O- methyl ribonucleotides nucleosides, C2-C18 alkyl linker, a spacer 9, the spacer 18
3'N2 3'N2 천연 뉴클레오시드, 1',2'-디데옥시리보스, 3'-데옥시리보뉴클레오시드, β-L-데옥시리보뉴클레오시드, 2'-O-프로파르길리보뉴클레오시드, C2-C18 알킬 링커, 스페이서 9, 스페이서 18, 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결 Natural nucleosides, 1 ', 2'-dideoxy ribose, 3'deoxyribonucleic nucleoside, β-L- deoxyribonucleic nucleosides, 2'-O- propargyl ribo nucleosides, C2 -C18 alkyl linker, a spacer 9, the spacer 18, the connection between the methyl phosphonate nucleoside
3'N3 3'N3 천연 뉴클레오시드, 1',2'-디데옥시리보스, C2-C18 알킬 링커, 스페이서 9, 스페이서 18, 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결, 2',5'뉴클레오시드간 연결, d(G)n, 폴리I-폴리dC Natural nucleosides, 1 ', 2'-dideoxy ribose, C2-C18 alkyl linker, a spacer 9, a spacer 18, a methyl phosphonate nucleoside cross connection, 2', 5 'nucleoside cross-connect, d ( G) n, poly-poly-dC I-
3'N2 + 3'N3 3'N2 + 3'N3 1',2'-디데옥시리보스, β-L-데옥시리보뉴클레오시드, C2-C18 알킬 링커, d(G)n, 폴리I-폴리dC 1 ', 2'-dideoxy ribose, β-L- deoxyribonucleic nucleosides, C2-C18 alkyl linker, d (G) n, poly-poly-dC I-
3'N3 + 3'N4 3'N3 + 3'N4 2'-O-메톡시에틸-리보뉴클레오시드, 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결, d(G)n, 폴리I-폴리dC 2'-O- methoxyethyl-ribo nucleosides, connection between the methyl phosphonate nucleoside, d (G) n, poly-poly-dC I-
3'N5 + 3'N6 3'N5 + 3'N6 1',2'-디데옥시리보스, C2-C18 알킬 링커, d(G)n, 폴리I-폴리dC 1 ', 2'-dideoxy ribose, C2-C18 alkyl linker, d (G) n, poly-poly-dC I-
5'N1 + 3'N3 5'N1 + 3'N3 1',2'-디데옥시리보스, d(G)n, 폴리I-폴리dC 1 ', 2'-dideoxy ribose, d (G) n, poly-poly-dC I-

하기 표 3은 다운스트림 강화 도메인을 가지고 있는 면역자극성 올리고뉴클레오티드내의 면역자극성 부분의 대표적인 위치 및 구조를 제시한다. Table 3 immunostimulatory oligonucleotide having a downstream enhanced domain presents a representative location and structure of the portion in the immunostimulatory oligonucleotide.

표 3 TABLE 3

위치 location 전형적인 면역자극성 부분 Typical immunostimulatory portion
5'N2 5'N2 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결 Connection between the methyl phosphonate nucleoside
5'N1 5'N1 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결 Connection between the methyl phosphonate nucleoside
3'N1 3'N1 1',2'-디데옥시리보스, 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결, 2'-O-메틸 1 ', 2'-dideoxy ribose, methyl phosphonate nucleoside cross connection, 2'-O- methyl
3'N2 3'N2 1',2'-디데옥시리보스, β-L-데옥시리보뉴클레오시드, C2-C18 알킬 링커, 스페이서 9, 스페이서 18, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커, 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결, 2'-O-메틸 1 ', 2'-dideoxy ribose, β-L- deoxyribonucleic nucleosides, C2-C18 alkyl linker, a spacer 9, spacers 18, 2-aminobutyl-1,3-propanediol linker, methyl phosphonate nucleoside cross connection, 2'-O- methyl
3'N3 3'N3 3'-데옥시리보뉴클레오시드, 3'-O-치환된 리보뉴클레오시드, 2'-O-프로파르길-리보뉴클레오시드 3'deoxyribonucleic nucleoside, 3'-O- substituted ribo nucleosides, 2'-O- propargyl-ribo nucleosides
3'N2 + 3'N3 3'N2 + 3'N3 1',2'-디데옥시리보스, β-L-데옥시리보뉴클레오시드 1 ', 2'-dideoxy ribose, β-L- deoxyribonucleic nucleoside

본 발명에 따른 이뮤노머는 3' 말단 또는 뉴클레오시드간 연결부 또는 작용기화된 뉴클레오염기 또는 당에서 비-뉴클레오티드 링커를 통해 연결된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. The present invention is immunometric dimmer 3 'terminal nucleoside or the cross-connection or functionalized nucleobase or sugar ratio in accordance with the - at least two oligonucleotides linked by a nucleotide linker comprises a nucleotide. 본 발명의 목적상, "비-뉴클레오티드 링커 (non-nucleotidic linker)"는 공유 또는 비-공유 연결에 의해 올리고뉴클레오티드에 연결될 수 있는 임의의 부분이다. For the purposes of this invention, "non-nucleotide linker (non-nucleotidic linker)" is a shared or a non-random portion of which can be connected to the oligonucleotide by a covalent connection. 바람직하게는, 그러한 링커는 약 2 Å 내지 약 200 Å의 길이를 갖는다. Preferably, such a linker has a length of from about 2 Å to about 200 Å. 바람직한 링커의 여러 예를 하기에 나타낸다. Shown in the various examples of the preferred linker. 비-공유 연결로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, π-스택킹 (stacking) 상호작용, 및 수소 결합이 있다. Non-shared yeongyeolro include, but are not limited to them, but there are electrostatic interactions, hydrophobic interactions, π- stacked (stacking) interactions, and hydrogen bonding. 용어 "비-뉴클레오티드 링커"는 2개의 뉴클레오시드의 3'-히드록실기를 직접적으로 연결시키는 상술된 바와 같은 뉴클레오시드간 연결, 예컨대 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트를 의미하고자 하는 것이 아니다. The term "non-nucleotide linker" is a connection between the two nucleoside as described above to directly connect the 3'-hydroxyl groups of two nucleosides, for example, phosphodiester, phosphorothioate, or phosphorothioate dithio It not intended to mean the benzoate. 본 발명의 목적상, 이러한 직접적인 3'-3' 연결은 "뉴클레오티드 연결"로서 간주된다. For purposes of this direct 3'-3 'connection of the present invention it is regarded as "nucleotide connection".

어떤 구체예에서, 비-뉴클레오티드 링커는 금 입자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 금속이다. In some embodiments, the non-nucleotide linker is a metal including, but not limited to gold particles. 그 밖의 구체예에서, 비-뉴클레오티드 링커는 가용성 또는 불용성 생분해성 중합체 비드이다. In other embodiments, the non-nucleotide linker is a soluble or insoluble biodegradable polymer bead.

그 밖의 구체예에서, 비-뉴클레오티드 링커는 올리고뉴클레오티드에 대한 부착을 가능하게 하는 작용기를 가지고 있는 유기 부분이다. In other embodiments, the non-nucleotide linker is an organic moiety having functional groups that enable the oligonucleotide attached to the nucleotide. 그러한 부착은 바람직하게는 임의의 안정한 공유 연결에 의한 것이다. Such attachment preferably is by any stable covalent connection. 비-제한적인 예로서, 링커는 도 13에서 도시된 바와 같이 뉴클레오시드의 임의의 적합한 위치에 부착될 수 있다. By way of non-limiting example, the linker may be attached to any suitable position of a nucleoside, as illustrated in Fig. 어떤 바람직힌 구체예에서 링커는 3'-히드록실에 부착된다. In some preferred hinge embodiment, the linker is attached to the 3'-hydroxyl. 그러한 구체예에서 링커는 바람직하게는 히드록실 작용기를 포함하는데, 그것은 바람직하게는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 비-포스페이트-기초 연결에 의하여 3'-히드록실에 부착된다. To In such embodiments, the linker preferably comprises a hydroxyl functionality, it is preferably a phosphodiester, phosphorothioate, phosphorothioate dithio benzoate or non-attached to the 3'-hydroxyl groups by the basic connection-phosphate do.

어떤 구체예에서, 비-뉴클레오티드 링커는 생체분자, 예를 들면, 제한없이, 폴리펩티드, 항체, 지질, 항원, 알레르겐, 및 올리고사카라이드이다. In some embodiments, the non-nucleotide linker is a biomolecule, for example, without limitation, polypeptides, antibodies, lipids, antigens, allergens, and oligosaccharides. 다른 구체예에서, 비-뉴클레오티드 링커는 작은 분자이다. In other embodiments, the non-nucleotide linker is a small molecule. 본 발명의 목적상, 작은 분자는 1,000 Da 미만의 분자량을 가지고 있는 유기 부분이다. For purposes of the small molecules of the present invention is an organic moiety having a molecular weight of less than 1,000 Da. 어떤 구체예에서, 작은 분자의 분자량은 750 Da 미만이다. In some embodiments, the molecular weight of the small molecule is less than 750 Da.

어떤 구체예에서 작은 분자는 지방족 또는 방향족 탄화수소이며, 둘 중 어느 하나는 임의로 올리고뉴클레오티드를 연결하거나 올리고뉴클레오티드에 첨부되는 선형사슬에서 히드록시, 아미노, 티올, 티오에테르, 에테르, 아미드, 티오아미드, 에스테르, 우레아, 및 티오우레아로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용기를 포함할 수 있다. Small molecules In some embodiments is an aliphatic or aromatic hydrocarbons, both of which one is optionally up connection or oligonucleotide hydroxy, amino, thiol, thioether, ether, amide, thioamide, ester In a linear chain that is attached to a nucleotide of the nucleotide and it may include at least one functional group selected from urea, and the group consisting of thiourea. 작은 분자는 고리형이거나 비고리형이다. Small molecule is a cyclic or acyclic. 작은 분자 링커의 예로는, 그것들에 한정되는 것은 아니나 아미노산, 탄수화물, 시클로덱스트린, 아단만탄, 콜레스테롤, 합텐 및 항생물질이 있다. Examples of small molecule linkers include, but are not limited to those amino acids, carbohydrates, cyclodextrins, may only Adan peat, cholesterol, haptens and antibiotics. 그러나, 비-뉴클레오티드 링커를 설명하기 위한 목적상, "작은 분자"는 뉴클레오시드를 포함하는 것을 의도되지 않는다. However, non-object image, a "small molecule" for explaining an oligonucleotide linker is not intended to include a nucleoside.

어떤 구체예에서, 작은 분자 링커는 글리세롤 또는 식 HO-(CH 2 ) o -CH(OH)-(CH 2 ) p -OH의 글리세롤 동족체이며, 여기서 o와 p는 독립적으로 1 내지 약 6의 정수, 1 내지 약 4의 정수, 또는 1 내지 약 3의 정수이다. In some embodiments, the small molecule linker is glycerol or a group represented by the formula HO- (CH 2) o -CH (OH) -, and (CH 2) glycerol analogs of p -OH, where o and p is an integer from 1 to about 6 independently , an integer from 1 to about 4 integer or 1 to about 3 in. 다른 어떤 구체예에서, 작은 분자 링커는 1,3-디아미노-2-히드록시프로판의 유도체이다. In some other embodiments, the small molecule linker is a derivative of 1,3-diamino-2-hydroxy-propane. 그런 유도체는 식 HO-(CH 2 ) m -C(O)NH-CH 2 -CH(OH)-CH 2 -NHC(O)-(CH 2 ) m -OH을 가지며, 여기서 m은 0 내지 약 10, 0 내지 약 6, 2 내지 약 6, 또는 2 내지 약 4의 정수이다. Such derivative is formula HO- (CH 2) m -C ( O) NH-CH 2 -CH (OH) -CH 2 -NHC (O) - has the (CH 2) m -OH, where m is 0 to about 10, an integer from 0 to about 6, 2 to about 6, or 2 to about 4.

본 발명에 따른 어떤 비-뉴클레오티드 링커는 도 1에 개략적으로 도시된 바와 같이 2개 이상의 올리고뉴클레오티드의 부착을 가능하게 한다. Any ratio according to the present invention the nucleotide linker allows for the attachment of two or more oligo nucleotides as schematically shown in Fig. 예를 들어 작은 분자 링커인 글리세롤은 3개의 히드록실기를 가지고 있는데, 여기에 올리고뉴클레오티드가 공유적으로 부착될 수 있다. For example, there is a small molecule linker is glycerol has three hydroxyl groups, up to here is the nucleotide may be covalently attached. 그러므로 본 발명에 따른 몇몇 이뮤노머는 3' 말단에서 비-뉴클레오티드 링커에 연결된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. Therefore, some of the ratio in the immunoplate dimmer 3 'end according to the invention two or more oligonucleotide attached to the linker oligonucleotide and a nucleotide. 그러한 이뮤노머는 2개 이상의 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 이러한 각각의 올리고뉴클레오티드는 접근가능한 5' 말단을 가지고 있다. Such a comprises a dimmer immunometric least two immunostimulatory oligonucleotides, oligonucleotides of each of such nucleotide has an accessible 5 'end.

본 발명의 이뮤노머는 도 5 및 6에 개략적으로 도시되고, 또한 실시예에서도 설명되는 바와 같이 자동 합성기 및 포스포라미다이트 방법을 사용하여 편리하게 합성될 수 있다. The immunometric dimmer is shown schematically in Figures 5 and 6 of the present invention, it can also be conveniently synthesized using the automated synthesizer and force Fora midayi bit method, as described in the Examples. 어떤 구체예에서 이뮤노머는 선형 합성 방법에 의하여 합성된다 (도 5 참조). It is synthesized by a linear synthesis immunometric dimmer In some embodiments (see Fig. 5). 본원에서 사용되는 용어 "선형 합성"이란 이뮤노머의 한쪽 끝에서 출발하여 다른 쪽 끝으로 선형으로 진행되는 합성을 말한다. From one end of the Emu is nomeo term "linear synthesis" as used herein refers to a synthesis that proceeds linearly to the other end. 선형 합성은 동일하거나 동일하지 않은 (길이, 염기 조성 및/또는 포함된 화학적 변형의 관점에서) 단량체 단위의 이뮤노머내로 통합되는 것을 가능하게 한다. Linear synthesis makes it possible to be incorporated into the Emu nomeo of the monomer units are not the same or the same (the length, in terms of base composition and / or containing a chemical modification).

또 다른 합성 방식은 "병렬 합성"으로, 이 방식에서는 중심 링커 부분으로부터 바깥쪽으로 합성이 진행된다 (도 6 참조). Another synthetic method is to "parallel synthesis", In this method, the synthesis proceeds outward from a central linker moiety (see Figure 6). 링커에 부착된 고체 지지체는 미국 특허 제 5,912,332호에서 설명되는 바와 같이 병렬 합성에 대해 사용될 수 있다. A solid support attached linker can be used for parallel synthesis, as described in U. S. Patent No. 5,912,332. 또한, 보편적인 고체 지지체, 예컨대 포스페이트가 부착되고 기공 조절된 유리 지지체가 사용될 수 있다. Further, it may be used a universal solid support, such as phosphate attached and Pore controlled glass support.

이뮤노머의 병렬 합성은 선형 합성에 비해 여러가지 장점을 가지고 있다: (1) 병렬 합성은 동일한 단량체 단위의 통합을 가능하게 하고; Parallel synthesis of Emu nomeo has several advantages over linear synthesis: (1) parallel synthesis and enables integration of the same monomer units; (2) 선형 합성과는 달리 2개의 (또는 모든) 단량체 단위가 동시에 합성되고, 이로써 합성 단계의 수 및 합성에 필요한 시간이 단량체 단위에 대한 것과 동일하며; 2 is unlike the two (or all) of the monomer units and a linear synthesis and fused at the same time, whereby the time required for the number and the synthesis of the synthetic steps are the same as for the monomer unit; (3) 합성 단계의 감소로 최종 이뮤노머 생성물의 순도 및 수율을 개선시킨다. (3) improve the purity and yield of the final product Emu nomeo to a reduction in the synthesis step.

선형 합성 또는 병렬 합성 프로토콜에 의한 합성의 종료시에, 변형된 뉴클레오시드가 통합되어 있는 경우, 이뮤노머는 농축 암모니아 용액으로 또는 포스포라미다이트 공급자에 의해 추천받은 바와 같이 편리하게 탈보호될 수 있다. At the end of the linear synthesis or synthesis by parallel synthesis protocols, if a modified nucleoside is incorporated, the immunometric dimmer can conveniently be deprotected as received concentrated ammonia solution or as phosphonic Fora midayi recommended by the agent provider . 생성된 이뮤노머는 바람직하게는 역상 HPLC에 의해 정제되고, 탈트리틸화되고, 탈염되고 투석된다. To the generated immunometric dimmer preferably purified by reverse phase HPLC, and the de-tree tilhwa, is desalted and dialyzed.

하기 표 4는 본 발명에 따른 대표적인 이뮤노머를 제시한다. Table 4 below presents a representative Emu nomeo according to the invention. 추가의 이뮤노머는 하기 실시예에서 설명된다. It is described in the examples of the dimmer added immunoplate.

표 4. 이뮤노머 서열의 예 Table 4. Examples of Emu nomeo sequence

Figure 112004017052430-pct00003

Figure 112004017052430-pct00004

제 2 측면으로 본 발명은 상술된 바와 같은 이뮤노머와, 접근가능한 5' 말단 외의 위치에서 이뮤노머에 컨쥬게이션된 항원을 포함하고 있는 이뮤노머 컨쥬게이트를 제공한다. In a second aspect the invention provides a Emu nomeo and accessible Emu containing the conjugated antigen in Emu nomeo at a position other than the 5 'end nomeo conjugate as described above. 어떤 구체예에서 비-뉴클레오티드 링커는 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이션된 항원을 포함한다. In some embodiments the non-nucleotide linker comprises an oligonucleotide conjugated to a nucleotide antigen. 어떤 다른 구체예에서는 항원은 3' 말단 이외의 위치에서 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이션된다. In some other embodiments the antigen is raised at a position other than the 3 'end is ligated to the nucleotide conjugate. 어떤 구체예에서, 항원은 백신 효과를 생성한다. In some embodiments, the antigen produces a vaccine effect.

항원은 바람직하게는 병원체와 관련된 항원, 암과 관련된 항원, 자가면역 질병과 관련된 항원, 및 다른 질병, 예컨대 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 수의학적 또는 가금류 질병과 관련된 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. Antigen is preferably selected from the antigens associated with a pathogen, antigens associated with a cancer, antigens associated with autoimmune diseases, and other diseases, for example, is, for veterinary or the group consisting of an antigen associated with a disease of poultry, but not limited to them. 본 발명의 목적상, "∼과 관련된"은 항원이 병원체, 암, 자가 면역 질병, 음식 알레르기, 호흡기 알레르기, 천식 또는 다른 질병이 존재하는 경우에 존재하지만, 병원체, 암, 자가면역 질병, 음식 알레르기, 호흡기 알레르기, 또는 질병이 없는 경우, 존재하지 않거나 감소된 양으로 존재함을 의미한다. For the purpose, "related to the ~" of the present invention the antigen is a pathogen, cancer, autoimmune disease, food allergies, present in the case of respiratory allergy, asthma or other diseases exist, pathogens, cancer, autoimmune disease, food allergies , which means if you do not have respiratory allergies or illness, there does not exist a reduced amount should.

이뮤노머는 항원에 공유적으로 연결되거나, 항원과 작동가능하게 결합된다. The immunometric dimmer antigen covalently linked to, or in, it is coupled to an antigen and activated. 본원에서 사용되는 용어 "작동가능하게 결합된다"는 것은 이뮤노머와 항원 두가지의 활성이 모두 유지되는 모든 결합을 의미한다. As used herein, the term "is operably linked" means that means that all bonds are maintained all of the Emu nomeo the antigen two kinds of activity. 그러한 작동가능한 결합의 가능한 예는 동일한 리포솜 또는 다른 그러한 전달 비히클 또는 시약의 일부가 되는 것을 포함한다. Possible examples of such operative combination include those that are part of the same liposome or other such delivery vehicle or reagent. 이뮤노머가 항원에 공유적으로 연결되는 구체예에서 그러한 공유 연결은 바람직하게는 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 접근가능한 5' 말단이외의 이뮤노머의 어떠한 위치에서든 일어난다. The immunometric meoga covalently such shared connection embodiments are coupled to the antigen is preferably take place in any position other than the Emu nomeo immunostimulatory oligonucleotide of the nucleotide access the 5 'end. 예를 들어 항원은 뉴클레오시드간 연결에 부착될 수 있거나 비-뉴클레오티드 링커에 부착될 수 있다. For example, the antigen may be attached to the connection between the non-nucleosides may be attached to the oligonucleotide linker. 또한, 항원은 그 자체가 비-뉴클레오티드 링커일 수 있다. In addition, the antigen itself is a non-nucleotide linker can be a.

제 3 측면으로, 본 발명은 본 발명에 따른 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트와 생리적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. Claim a third aspect, the invention provides a pharmaceutical formulation comprising a carrier which can be physiologically acceptable and conjugated nomeo Emu or Emu nomeo according to the invention. 본원에서 사용되는 용어 "생리적으로 허용될 수 있는"은 이뮤노머의 효력을 방해하지 않고 세포, 세포 배양물, 조직, 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템과 양립할 수 있는 물질을 말한다. "Which can be physiologically acceptable" used herein, the term refers to a material that is compatible with a biological system such as, without interfering with the effects of Emu nomeo cells, cell cultures, tissues, or organisms. 바람직하게는 생물학적 시스템은 살아있는 유기체, 예컨대 척추동물이다. Preferably, the biological system is a living organism such as vertebrates.

본원에서 사용되는 용어 "담체"는 어떠한 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 지질, 또는 약제학적 제형에 사용되는 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 다른 물질을 포함한다. The term "carrier" as used herein include other materials well known in the art for use in any vehicle, diluent, filler, salt, buffer, stabilizer, solubilizer, lipid, or pharmaceutical formulations. 담체, 부형제, 또는 희석제의 특징은 특정 적용에 대한 투여 경로에 따라 좌우되는 것으로 이해되어야 한다. Carriers, excipients, or characteristics of the diluent is to be understood as being dependent upon the route of administration for a particular application. 이들 물질을 함 유하고 있는 약제학적으로 허용될 수 있는 제형의 제법은 문헌에 기술되어 있다 (예컨대 Remington's Pharmaceutical Sciences , 18th Edition, ed., A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990). The preparation of the formulation that can be accepted pharmaceutically, which oil should these materials are described in the literature (e. G. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed., A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990) .

제 4 측면으로, 본 발명은 본 발명에 따른 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트를 척추동물에 투여하는 것을 포함하여 척추동물에게서 면역 반응을 유발시키기 위한 방법을 제공한다. Claim a fourth aspect, the present invention comprises administering the Emu or Emu nomeo nomeo conjugate according to the present invention in vertebrates, there is provided a method for inducing an immune response in vertebrates. 어떤 구체예에서, 척추동물은 포유류이다. In certain embodiments, the vertebrate is a mammal. 본 발명의 목적상, 용어 "포유류"는 사람을 포함하는 것으로 명백하게 의도된다. For the purpose, the term "mammal" of the present invention are obviously intended to include a person. 바람직한 구체예에서 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트는 면역자극이 필요한 척추동물에 투여된다. In a preferred embodiment nomeo Emu or Emu nomeo conjugate is administered to vertebrates require immune stimulation.

본 발명의 이러한 측면에 따른 방법에서 이뮤노머는 어떠한 적당한 경로, 예컨대 제한 없이, 비경구, 경구, 혀 밑, 경피, 비내, 에어로솔, 안내 (intraocular), 기관지내, 직장내, 질내, 유전자 총 (gene gun)에 의해, 피부 패치 또는 점안액으로, 또는 구강세척액 형태로 투여될 수 있다. Without immunometric dimmer any suitable route, for example, restrictions on the method according to this aspect of the invention, parenterally, orally, tongue underneath, transdermal, intranasal, aerosol, intraocular (intraocular), endobronchotracheal, intrarectal, vaginal, gene gun ( by gene gun), it can be administered by a skin patch, or eye drops, mouthwashes or form. 이뮤노머의 치료적 조성물의 투여는 질병의 징후 또는 대용 마커를 감소시키는 데에 효과적인 용량으로 및 기간동안 공지된 절차를 사용하여 수행될 수 있다. Administration of the therapeutic compositions of the Emu nomeo may be carried out using known procedures for the effective dose and the period for reducing the symptoms or surrogate markers of the disease. 전신적으로 투여될 때 치료적 조성물은 바람직하게는 약 0.0001 μM 내지 약 10 μM 의 이뮤노머 혈중 수준을 수득하기에 충분한 용량으로 투여된다. Therapeutic compositions when administered systemically is preferably administered at a sufficient capacity to give the Emu nomeo serum level of from about 0.0001 μM to about 10 μM. 국소 투여를 위해서는 이것보다 훨씬 더 낮은 농도가 효과적일 것이며, 훨씬 더 높은 농도도 허용될 수 있다. For topical administration will be much lower concentrations than this effective, it can also be allowed a much higher concentration. 바람직하게는 이뮤노머의 전체 용량 범위는 환자당 약 0.001 mg 내지 약 200 mg/kg 체중/일일 것이다. Preferably the total dose range of Emu nomeo from about 0.001 mg to about 200 mg / kg body weight / per patient will be one days. 치료적 유효량의 하나 이상의 본 발명의 치료 조성물을 개체에게 단일 치로 에피소드로서 동시에, 또는 차례로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. At the same time one or more therapeutic compositions of the present invention a therapeutically effective amount to a subject as a single value episode, or to administer in turn may be advantageous.

어떤 바람직한 구체예에서 본 발명에 따른 이뮤노머는 백신, 항체, 세포독성 제제, 알레르겐, 항생물질, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 단백질, 유전자 요법 벡터, DNA 백신 및/또는 면역 반응의 특이성 또는 크기를 증강시키기 위한 보조제와 함께 투여된다. This enhances the specificity or magnitude of the immunometric dimmer vaccines, antibodies, cytotoxic agents, allergens, antibiotics, antisense oligonucleotides, peptides, proteins, gene therapy vectors, DNA vaccines and / or immune response according to the invention in certain preferred embodiments It is administered in combination with auxiliaries for. 이들 구체예에서, 본 발명의 이뮤노머는 보조제로서 다양하게 작용할 수 있고/있거나 직접적인 면역자극 효과를 생성시킬 수 있다. In these embodiments, it is possible to variously act as adjuvants of the present invention is immunometric dimmer / or can create a direct immunostimulatory effect.

이뮤노머든 백신이든, 또는 둘 다이든, 임의로 면역원성 단백질, 예컨대 키호울 림펫 헤모시아닌 (KLH), 콜레라 독소 B 서브유닛, 또는 다른 어떠한 면역원성 담체 단백질에 결합될 수 있다. The immunometric, whether meodeun vaccine, or both, may optionally be coupled to the immunogenic proteins, such as key Whole rimpet hemocyanin (KLH), cholera toxin B subunit, or any other immunogenic carrier protein. 임의의 보조제, 예를 들면 제한 없이, 프로인트 완전 보조제, KLH, 모노포스포릴 지질 A (MPL), 명반, 및 사포닌, 예컨대 QS-21, 이미퀴모드 (imiquimod), R848, 또는 이들의 조합물이 과잉으로 사용될 수 있다. Without any supplements, for example, restriction, Freund's complete adjuvant, KLH, monophosphoryl lipid A (MPL), alum, and saponins, such as QS-21, already rake mode (imiquimod), R848, or combinations thereof It can be used in excess.

본 발명의 이러한 측면의 목적상, 용어 "∼과 함께"는 동일한 환자의 동일한 질병을 치료하는 과정중에 있는 것을 의미하고, 이뮤노머 및/또는 백신 및/또는 보조제를 어떠한 순서로든, 예를 들어 동시에 투여하는 것 뿐 아니라 일시적으로 여러날 간격을 두고 순차적으로 투여하는 것을 포함한다. Means that the purposes of this aspect of the invention, "with ~" term is the process of treating the same disease in the same patient, and Emu nomeo and / or vaccine and / or in any order an adjuvant, for example, at the same time in addition to administration with the temporarily multi-day interval it involves administering sequentially. 그러한 병용 처리는 또한 이뮤노머, 및/또는 독립적으로 백신, 및/또는 독립적으로 보조제의 1회 이상의 투여를 포함할 수 있다. Such combination treatment may also include more than a single dose of Emu nomeo, and / or independently the vaccine, and / or independently adjuvant. 이뮤노머 및/또는 백신 및/또는 보조제의 투여는 동일하거나 상이한 경로에 의해 이루어질 수 있다. Emu nomeo and / or vaccine and / or administration of the adjuvant may be by the same or a different route.

본 발명의 이러한 측면에 따른 방법은 면역계의 모델 연구에 유용하다. The method according to this aspect of the invention is useful for model studies of the immune system. 이 방법은 또한 사람 또는 동물 질병의 예방 또는 치료적 처리에도 유용하다. This method is also useful in the prevention or therapeutic treatment of the human or animal disease. 예를 들 면 방법은 가금류 및 수의학적 백신 분야에 유용하다. If the method is useful for poultry and veterinary vaccine applications.

제 5 측면으로, 본 발명은 환자에게 본 발명의 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트를 투여하는 것을 포함하여 질병 또는 장애를 가지고 있는 환자를 치료적으로 처리하는 방법을 제공한다. Claim a fifth aspect, the invention provides a method of treatment in a therapeutically effective for patients with a disease or disorder comprising administering the Emu or Emu nomeo nomeo conjugates of this invention to a patient. 다양한 구체예에서 처리될 질병 또는 장애는 암, 자가면역 질병, 기도 염증, 염증성 질병, 알레르기, 천식 또는 병원체에 의해 유발되는 질병이다. Disease or disorder to be treated in various embodiments is a disease caused by cancer, autoimmune diseases, airway inflammation, inflammatory diseases, allergy, asthma or pathogens. 병원체에는 세균, 기생충, 진균, 바이러스, 비로이드, 및 프리온이 있다. The pathogen has the bacteria, parasites, fungi, viruses, viroids, and prions. 투여는 발명의 제 4 측면에서 설명된 것과 같이 수행된다. Administration is carried out as described in the fourth aspect of the invention.

본 발명의 목적상, 용어 "알레르기"는 제한 없이 음식 알레르기 및 호흡기 알레르기를 포함한다. For the purposes of this invention, the term "allergy" includes food allergies and respiratory allergies, without limitation. 용어 "기도 염증"은 제한 없이 천식을 포함한다. The term "airway inflammation" includes, without limitation, asthma. 본원에서 사용되는 용어 "자가면역 질병"은 "자기 (self)" 단백질이 면역계에 의해 공격을 받는 질병을 나타낸다. As used herein, the term "autoimmune disease" refers to diseases "self (self)" proteins attacked by the immune system. 그러한 용어는 자가면역 천식을 포함한다. And such terms are self-contained immune asthma.

본 발명의 이러한 측면에 따른 방법중 어떠한 것에서도 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트는 질병 또는 질환을 치료하는데 유용하면서 이뮤노머의 면역자극성 효과를 감소시키지 않는 다른 어떠한 제제와 함께 투여될 수 있다. From any of the methods according to this aspect of the present invention nomeo Emu or Emu nomeo conjugate it may be administered in combination with any other formulations that do not reduce the immunostimulatory effect of Emu nomeo as useful in the treatment of a disease or disorder. 예를 들면 암의 치료에서, 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트는 화학요법용 화합물과 함께 투여될 수 있는 것으로 고려된다. For example, in the treatment of cancer, Emu or Emu nomeo nomeo conjugate is considered to be administered in combination with chemotherapy for the compound.

하기의 실시예는 발명의 특정한 바람직한 구체예를 추가로 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범주를 제한하려는 의도는 없다. The following examples are intended to further illustrate certain preferred embodiments of the invention, it is not intended to limit the scope of the invention.

실시예 1: 면역자극성 부분을 함유하고 있는 올리고뉴클레오티드의 합성 Example 1: oligonucleotide containing the immunostimulatory portion of the synthetic nucleotide

올리고뉴클레오티드를 1 ㎛ 규모로 자동 DNA 합성기 (Expedite 8909; PerSeptive Biosystems, Framingham, MA)를 사용하여, 도 5 및 6에 개략적으로 도시된 선형 합성 또는 병렬 합성 절차에 따라 합성하였다. Oligonucleotide automatic DNA synthesizer, an oligonucleotide in 1 ㎛ scale; using (Expedite 8909 PerSeptive Biosystems, Framingham, MA), was synthesized according to the schematic linear synthesis or parallel synthesis procedures illustrated in FIGS.

어플라이드 바이오시스템스사 (Applied Biosystems, Foster City, CA)로부터 데옥시리보뉴클레오시드 포스포라미다이트를 얻었다. Applied Biosystems, Inc. (Applied Biosystems, Foster City, CA) to give an oxy ribo nucleosides force Fora midayi bit from. 1',2'-디데옥시리보스 포스포라미다이트, 프로필-1-포스포라미다이트, 2-데옥시우리딘 포스포라미다이트, 1,3-비스-[5-(4,4'-디메톡시트리틸)펜틸아미딜]-2-프로판올 포스포라미다이트 및 메틸 포스포라미다이트를 글렌 리서치(Glen Research, Sterling, VA)로부터 얻었다. 1 ', 2'-dideoxy ribose force Fora midayi agent, propyl-1-phosphonic Fora midayi bit, 2-deoxy-uridine force Fora midayi agent, 1,3-bis [5- (4,4-dimethoxy ethoxy trityl) amino-pentyl pyridyl] -2-propanol force Fora midayi agent and methylphosphonate Fora obtain a midayi agent from Glen Research (Glen Research, Sterling, VA). β-L-2'-데옥시리보뉴클레오시드 포스포라미다이트, α-2'-데옥시리보뉴클레오시드 포스포라미다이트, 모노-DMT-글리세롤 포스포라미다이트 및 디-DMT-글리세롤 포스포라미다이트를 켐젠스 (ChemGens, Ashland, MA)로부터 얻었다. β-L-2'- deoxyribonucleic nucleoside force Fora midayi agent, α-2'- deoxyribonucleic nucleoside force Fora midayi agent, glycerol mono -DMT- force Fora midayi agent and glycerol di -DMT- Force Fora midayi the bit obtained from Chem presence (ChemGens, Ashland, MA). (4-아미노부틸)-1,3-프로판디올 포스포라미다이트를 클론테크 (Clontech, Palo Alto, CA)로부터 얻었다. (4-amino-butyl) -1,3-propanediol was obtained from the force Fora midayi bit Clontech (Clontech, Palo Alto, CA). 아라비노시티딘 포스포라미다이트, 아라비노구아노신, 아라비노티미딘 및 아라비노우리딘을 릴라이어블 파마슈티칼 (Reliable Pharmaceutical, St.Louis, MO)로부터 얻었다. Arabino cytidine force Fora midayi agent, arabinose guanosine, thymidine, and arabinose arabinose we followed the Dean GW Pharma obtained from block shoe Tikal (Reliable Pharmaceutical, St.Louis, MO). 아라비노구아노신 포스포라미다이트, 아라비노티미딘 포스포라미다이트 및 아라비노우리딘 포스포라미다이트를 하이브리돈, 인크. Arabinose guanosine Force Fora midayi agent, arabinose thymidine Force Fora midayi bit and arabinose uridine Force Fora midayi a bit of money hybridomas, Inc. (Hybridon, Inc., Cambridge, MA)에서 합성하였다 (Noronha et al., (2000) Biochem. 39:7050-7062). It was synthesized from (Hybridon, Inc., Cambridge, MA ) (Noronha et al, (2000) Biochem 39:.. 7050-7062).

모든 뉴클레오시드 포스포라미다이트를 31 P와 1 H NMR 스펙트럼을 사용하여 특성을 확인하였다. All nucleoside seed force Fora midayi agent was confirmed that characteristics using 31 P and 1 H NMR spectrum. 변형된 뉴클레오시드를 특정 부위에서 정상적인 커플링 사이클을 사용하여 통합시켰다. A modified nucleosides were incorporated using a normal coupling cycle in the specific area. 합성 후에 올리고뉴클레오티드를 농축된 수산화 암모늄으로 탈보호시키고 역상 HPLC에 의하여 정제한 다음 투석하였다. After oligonucleotide synthesis the deprotection with ammonium hydroxide, concentrated to a nucleotide and purified by reverse phase HPLC, and then dialysis. 나트륨염 형태로서의 정제된 올리고뉴클레오티드를 사용전에 동결건조시켰다. The purified oligonucleotide was lyophilized as the sodium salt form of the oligonucleotide prior to use. 순도는 CGE 및 MALDI-TOF MS에 의해 시험하였다. Purity was tested by CGE and MALDI-TOF MS.

실시예 2: 비장 세포 증식의 분석 Example 2: Analysis of spleen cell proliferation

비장세포 증식의 시험관내 분석은 전술한 바와 같은 표준 절차를 사용하여 수행하였다 (참조: Zhao et al., Biochem Pharma 51:173-182 (1996)). In vitro analysis of spleen cell proliferation was carried out using the standard procedures described above (see: Zhao et al, Biochem Pharma 51:. 173-182 (1996)). 그 결과는 도 8a에 도시된다. The result is shown in Figure 8a. 이들 결과는 고농도에서 2 개의 접근가능한 5' 말단을 가지고 있는 이뮤노머 6이 접근가능한 5' 말단이 없는 이뮤노머 5 또는 접근가능한 5' 말단이 하나 있는 올리고뉴클레오티드 4보다 더 큰 폭으로 비장세포 증식을 유발하였음을 입증한다. These results indicate that the 2 growth splenocytes with two accessible 5 up with the "Emu nomeo 6 is accessible 5 with the terminal & apos; end the Emu nomeo 5 or accessible 5 'end is not one greater than the nucleotide 4 width in a high concentration demonstrate that they have caused. 이뮤노머 6은 또한 LPS 포지티브 대조표준보다 더 큰 폭의 비장세포 증식을 유발한다. Emu nomeo 6 also induce spleen cell proliferation of greater width than the LPS standard positive control.

실시예 3: 생체내 비장비대 분석 Example 3: In vivo analysis splenomegaly

시험관내 결과의 생체내 모델로의 적응성을 시험하기 위하여 선택된 올리고뉴클레오티드를 마우스에 투여하고 비장비대의 정도를 면역자극 활성의 수준의 지표로서 측정하였다. Oligonucleotide selected to test the applicability of the in vitro results in vivo model of administration of the oligonucleotide in mice and measured the degree of splenomegaly as an indicator of the level of immunostimulatory activity. 5 mg/kg의 단일 용량을 BALB/c 마우스 (암컷, 생후 4-6주, Harlan Sprague Dawley Inc., Baltic, CT)에 복강내로 투여하였다. A single dose of 5 mg / kg was administered intraperitoneally in BALB / c mice (female, 4-6 weeks of age, Harlan Sprague Dawley Inc., Baltic, CT). 마우스를 올리고뉴클레오티드 투여후 72시간 후에 희생시키고, 비장을 꺼내어 무게를 측정하였다. Raise the mice were weighed and then sacrificed 72 hours after oligonucleotide administration, the spleen was taken out. 그 결과는 도 8b에 도시된다. The result is shown in Figure 8b. 이들 결과는 2 개의 접근가능한 5' 말단을 가지고 있는 이뮤노머 6이 올리고뉴클레오티드 4 또는 이뮤노머 5보다 더 훨씬 큰 면역자극 효과를 가지고 있음을 입증한다. These results raise the Emu 2 nomeo 6 with the 5 'terminus capable of approaching to demonstrate that has a much more greater immunostimulatory effect than 4 nucleotides, or Emu nomeo 5.

실시예 4: 시토킨 분석 Example 4: Cytokine analysis

척추동물 세포, 바람직하게는 BALB/c 마우스 비장 세포 또는 사람 PBMC에서의 IL-12 및 IL-6의 분비를 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. Vertebrate cells, preferably measured by secretion of IL-12 and IL-6 in the BALB / c mouse spleen cells or human PBMC in the sandwich ELISA. 시토킨 항체와 시토킨 표준을 포함하는 필요한 시약들은 파밍겐 (PharMingen, San Diego, CA)으로부터 구입하였다. Cytokine antibodies and necessary reagents, including cytokine standards were purchased from Pharmingen Gen (PharMingen, San Diego, CA). ELISA 플레이트 (Costar)를 PBSN 완충액 (PBS/0.05 % 나트륨 아지드, pH 9.6)중의 5 ㎍/ml 농도의 적절한 항체와 함께 밤새 4 ℃에서 인큐베이션한 후, PBS/1 % BSA로 37 ℃에서 30분동안 차단하였다. ELISA plates (Costar) PBSN buffer (Oh PBS / 0.05% sodium azide, pH 9.6) and then incubated overnight at 4 ℃ with an appropriate antibody of 5 ㎍ / ml concentration, in 37 ℃ 30 minute PBS / 1% BSA It was blocked for. 세포 배양 상층액 및 시토킨 표준을 PBS/10 % FBS로 적당하게 희석하고 플레이트에 삼중으로 첨가한 다음 25 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. A cell culture supernatants and cytokine standards diluted appropriately in PBS / 10% FBS was added in triplicate to the plate and then incubated for 2 hours at 25 ℃. 플레이트 위를 1 ㎍/ml의 적당한 비오티닐화된 항체로 덮고 25℃에서 1.5 시간 동안 인큐베이션하였다. Covering the top plate with a suitable non-ot the biotinylated antibody of 1 ㎍ / ml was incubated at 25 ℃ for 1.5 hours. 그런 다음 플레이트를 PBS-T 완충액 (PBS/0.05 % 트윈 20)으로 집중적으로 세척하고 다시 25 ℃에서 1.5 시간 동안 인큐베이션한 후, 스트렙트아비딘 컨쥬게이션된 퍼옥시다제 (Sigma, St. Louis, MO)를 첨가하였다. After washing the plate and then to focus the PBS-T buffer (PBS / 0.05% Tween 20) and incubated for 1.5 hours at 25 ℃ again, streptavidin conjugated peroxidase (Sigma, St. Louis, MO) It was added. 플레이트를 Sure Blue TM (Kirkegaard and Perry) 발색 시약으로 전개시키고 스탑 용액 (Stop Solution) (Kirkegaard and Perry)을 첨가함으로써 반응을 종결지었다. A plate Sure Blue TM (Kirkegaard and Perry) chromogenic reagent and the built deployment stop solution to terminate the reaction by the addition of (Stop Solution) (Kirkegaard and Perry ). 색 변화를 Ceres 900 HDI 분광계 (Bio-Tek Instruments)상에서 측정하였다. A color change was measured on a Ceres 900 HDI Spectrometer (Bio-Tek Instruments). 그 결과를 하기 표 5A에 나타내었다. The results are shown in Table 5A.

사람 말초혈 단핵세포 (PBMC)를 건강한 자원자의 말초혈로부터 Ficoll-Paque 밀도 구배 원심분리 (Histopaque-1077, Sigma, St. Louis, MO)에 의해 분리하였다. The human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from peripheral blood of healthy volunteers were separated by a Ficoll-Paque density gradient centrifugation (Histopaque-1077, Sigma, St. Louis, MO). 간단하게 설명하면, 헤파린 처리된 혈액을 원추형 원심분리기에서 Histopaque-1077 (동일한 부피)위에 놓고 400×g에서 30분 동안 실온에서 원심분리하였다. Briefly, heparin-treated blood was placed on a conical centrifuge Histopaque-1077 (equal volume) in a separator and centrifuged at room temperature for from 400 g × 30 min. 단핵세포를 함유하고 있는 담황갈색의 막 (buffy coat)을 조심스럽게 제거하여 등장성 인산염 완충된 식염수 (PBS)로 250×g에서 10분 동안 원심분리함으로써 2회 세척하였다. Contain monocytes and out for the film (buffy coat) camel that carefully removed by centrifugation with the isotonic phosphate buffered saline (PBS) at 250 × g for 10 min and washed twice. 그런 다음 그 결과의 세포 펠릿을 L-글루타민 (Media Tech, Inc., Herndon, VA)을 함유하고 10 % 열처리 비활성화된 FCS 및 페니실린-스트렙토마이신 (100 U/ml)이 첨가되어 있는 RPMI 1640 배지에 재현탁시켰다. In RPMI 1640 medium, which is streptomycin (100 U / ml) is added - Then, the resultant cell pellet L- glutamine (Media Tech, Inc., Herndon, VA) containing the deactivated FCS and penicillin heat treatment 10% reproduction was suspended. 세포를 올리고뉴클레오티드의 존재 또는 부재하에 1×10 6 세포/ml/웰에서 상이한 기간동안 24웰 플레이트에서 배양하였다. Up to 1 × 10 6 cells were cultured in 24-well plates for different periods of time in cells / ml / well in the presence or absence of oligonucleotide. 배양 기간의 종료시에, 상층액을 수득하여 -70 ℃에서 동결건조시켜서 저장한 후에 다양한 시토킨, 예를 들면 IL-6 (BD Pharmingen, San Diego, CA), IL-10 (BD Pharmingen), IL-12 (BioSource International, Camarillo, CA), IFN-α (BioSource International) 및 -γ (BD Pharmingen) 및 TNF-α (BD Pharmingen)를 샌드위치 ELISA에 의하여 분석하였다. After storage at the end of the incubation period, thereby to obtain the supernatant freeze-dried at -70 ℃ various cytokines, such as IL-6 (BD Pharmingen, San Diego, CA), IL-10 (BD Pharmingen), IL to -12 (BioSource International, Camarillo, CA), IFN-α (BioSource International) and -γ (BD Pharmingen) and TNF-α (BD Pharmingen) and analyzed by sandwich ELISA. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다. The results are shown in Table 5.

모든 경우에 세포 배양 상층액중의 IL-12 및 IL-6의 수준을, IL-12 및 IL-6 각각에 대하여 동일한 실험 조건하에서 작성된 표준 곡선으로부터 계산하였다. The level of IL-12 and IL-6 in the cell culture supernatant in all cases, was calculated from a standard curve created under identical experimental conditions, with respect to IL-12 and IL-6, respectively. 세포 배양 상층액중의 IL-10, IFN-감마 및 TNF-α의 수준을 IL-10, IFN-감마 및 TNF-α 각각에 대하여 동일한 실험 조건하에서 작성된 표준 곡선으로부터 계산하였다. The IL-10, IFN- gamma and the level of TNF-α in the cell culture supernatants was calculated from the standard curve created under identical experimental conditions, with respect to IL-10, IFN- gamma and TNF-α, respectively.

표 5. 이뮤노머 구조 및 사람 PBMC 배양물중의 면역자극 활성 Table 5. Emu nomeo structure and activity of human immune stimulation of PBMC cultures

올리고 번호 Raise Number 서열 및 변형 (5'-3') Sequences and modifications (5'-3 ') 올리고 길이/ 또는 각 사슬 Oligonucleotide length / or each chain IL-12 (pg/ml) D1 D2 IL-12 (pg / ml) D1 D2 IL-6 (pg/ml) D1 D2 IL-6 (pg / ml) D1 D2
25 25 5'-CTATCTGTCGTTCTCTGT-3' 5'-CTATCTGTCGTTCTCTGT-3 ' 18량체 (PS) 18-mer (PS) 184 332 184 332 3077 5369 3077 5369
26 26 5'-TCTGTCR 1 TTCT-3'\ X 1 5'-TCTGTCR 1 TTCT-3'/ 5'-TCTGTCR 1 TTCT-3'\ X 1 5'-TCTGTCR 1 TTCT-3 '/ 11량체 (PS) 11-mer (PS) 237 352 237 352 3724 4892 3724 4892

올리고 번호 Raise Number 서열 및 변형 (5'-3') Sequences and modifications (5'-3 ') 올리고 길이/ 또는 각 사슬 Oligonucleotide length / or each chain IL-10 (pg/ml) D1 D2 IL-10 (pg / ml) D1 D2 IFN-γ(pg/ml) D1 D2 IFN-γ (pg / ml) D1 D2
25 25 5'-CTATCTGTCGTTCTCTGT-3' 5'-CTATCTGTCGTTCTCTGT-3 ' 18량체 (PS) 18-mer (PS) 37 88 37 88 125 84 125 84
26 26 5'-TCTGTCR 1 TTCT-3'\ X 1 5'-TCTGTCR 1 TTCT-3'/ 5'-TCTGTCR 1 TTCT-3'\ X 1 5'-TCTGTCR 1 TTCT-3 '/ 11량체 (PS) 11-mer (PS) 48 139 48 139 251 40 251 40

올리고 번호 Raise Number 서열 및 변형 (5'-3') Sequences and modifications (5'-3 ') 올리고 길이/ 또는 각 사슬 Oligonucleotide length / or each chain TNF-α(pg/ml) D1 D2 TNF-α (pg / ml) D1 D2
25 25 5'-CTATCTGTCGTTCTCTGT-3' 5'-CTATCTGTCGTTCTCTGT-3 ' 18량체 (PS) 18-mer (PS) 537 nt 537 nt
26 26 5'-TCTGTCR 1 TTCT-3'\ X 1 5'-TCTGTCR 1 TTCT-3'/ 5'-TCTGTCR 1 TTCT-3'\ X 1 5'-TCTGTCR 1 TTCT-3 '/ 11량체 (PS) 11-mer (PS) 681 nt 681 nt

D1 및 D2는 공여체 1 및 2이다. D1 and D2 are donor 1 and 2.

표 5A. Table 5A. 이뮤노머 구조 및 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물 중의 면역자극 활 성 Emu nomeo structure and BALB / c mouse spleen cells in the culture immunostimulatory active

Figure 112004017052430-pct00005

정상적인 글씨체는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고; Normal font indicates a phosphorothioate connection; 이탤릭체는 포스포디에스테르 연결을 나타낸다. Italics indicate the phosphodiester connection.

Figure 112004017052430-pct00006

또한, 도 7a 내지 7c에 도시된 결과는 2 개의 접근가능한 5' 말단을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드 2가 낮은 농도에서 각각 하나의 접근가능한 5' 말단을 가지고 있거나 없는 올리고뉴클레오티드 1 또는 3보다 IL-12와 IL-6을 상승시키지만, IL-10은 그렇지 않았음을 입증한다. Further, in Fig. 7a to the results shown in 7c has two accessible 5 has a 'oligonucleotide having a terminal nucleotide divalent each one accessible 5 at low concentrations' end or oligonucleotides without a nucleotide 1 or IL-12 than the third but elevated IL-6, IL-10 is proven otherwise did.

실시예 5: 사슬 길이가 이뮤노머의 면역자극 활성에 미치는 효과 Example 5: Effects of chain length on the immunostimulatory activity of the Emu nomeo

올리고뉴클레오티드 사슬의 길이의 효과를 연구하기 위하여 각 사슬에 18, 14, 11 및 8개의 뉴클레오티드를 함유하고 있는 이뮤노머를 합성하고, BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 시토킨 IL-12 및 IL-6의 분비를 유도하는 그것들의 능력에 의해 측정하여, 면역자극 활성에 대하여 시험하였다 (표 6-8). Among the synthetic oligo Emu nomeo containing 18, 14, 11, and 8 nucleotides in each of the chain in order to study the effect of the length of the nucleotide chain, and BALB / c mouse spleen cell culture cytokine IL-12 and IL- measured by their ability to induce the secretion of 6, it was tested for immunostimulatory activity (Table 6-8). 이 실시예와 후속하는 모든 실시예에서 시토킨 검정은 실시예 4에서 설명된 것처럼 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물에서 수행하였다. In this embodiment and subsequent embodiments, which all cytokine assay BALB / c mice was performed in spleen cell cultures as described in Example 4.

표 6. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성 Table 6. Emu nomeo structure and immunostimulatory activity

Figure 112004017052430-pct00007

표 7. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성 Table 7. Emu nomeo structure and immunostimulatory activity

Figure 112004017052430-pct00008

표 8. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성 Table 8. Emu nomeo structure and immune stimulating activity

Figure 112004017052430-pct00009

상기의 결과들은 이뮤노머의 면역자극 활성이 올리고뉴클레오티드 사슬의 길이가 18-량체로부터 7-량체로 감소됨에 따라 증가되었음을 보여준다. The above results show that the increase with the reduced 7-mer from the immunostimulatory activity of oligonucleotides of the nucleotide chain length of the Emu nomeo 18-mer. 6-량체 또는 5-량체 정도의 짧은 올리고뉴클레오티드 사슬을 가지고 있는 이뮤노머는 단일 5' 말단을 가지고 있는 18-량체의 올리고뉴클레오티드의 면역자극 활성에 필적하는 면역자극 활성을 보였다. 6 dimer or short oligonucleotides of about five-mer oligonucleotides of 18-mer with a single dimmer immunometric 5 'end with a nucleotide chain showed an immune stimulatory activity comparable to the immunostimulatory activity of the oligonucleotide. 그러나, 6-량체 또는 5-량체 정도의 짧은 올리고뉴클레오티드 사슬 길이를 가지는 이뮤노머는 링커가 약 2 Å 내지 약 200 Å의 길이인 경우에 면역자극 활성을 증가시켰다. However, short oligonucleotides of about 6 mer or 5-mer has a dimmer immunometric linker having a nucleotide chain length increased the immune stimulatory activity in the case of a length of about 2 Å to about 200 Å.

실시예 6: 비-천연 피리미딘 또는 비-천연 푸린 뉴클레오시드를 함유하고 있는 이뮤노머의 면역자극 활성 Example 6: Non-natural pyrimidine or a non-immunostimulatory activity of Emu nomeo that contain natural purine nucleoside

하기 표 9 내지 11에서 나타내는 바와 같이 면역자극 활성은 면역자극성 디뉴클레오티드 모티프에 비-천연 피리미딘 뉴클레오시드 또는 비-천연 푸린 뉴클레오시드를 가지고 있는 다양한 길이의 이뮤노머에 대해 유지되었다. To the immunostimulatory activity as indicated in Table 9 to 11 in a non-immunostimulatory dinucleotide motif-was maintained for Emu nomeo of varying lengths that has a natural purine nucleoside-natural pyrimidine nucleoside or non.

표 9. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성 Table 9. Emu nomeo structure and immune stimulating activity

Figure 112004017052430-pct00010

Figure 112004017052430-pct00011

표 10. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성 Table 10. Emu nomeo structure and immunostimulatory activity

Figure 112004017052430-pct00012

Figure 112004017052430-pct00013

표 11. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성 Table 11. Emu nomeo structure and immune stimulating activity

Figure 112004017052430-pct00014

Figure 112004017052430-pct00015

실시예 7: 링커가 면역자극 활성에 미치는 효과 Example 7: Effect linker on the immune stimulating activity

2개의 올리고뉴클레오티드를 연결시키는 링커의 길이의 효과를 조사하기 위하여, 동일한 올리고뉴클레오티드를 함유하지만 링커는 상이한 이뮤노머들을 합성하여 면역자극 활성에 대하여 시험하였다. Two oligonucleotide in order to examine the effect of the length of the linker connecting the oligonucleotide, but the same oligonucleotide containing nucleotide linker was tested for immunostimulatory activity by combining different Emu nomeo. 하기 표 12에 나타낸 그 결과는 링커의 길이가 이뮤노머의 면역자극 활성에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. To shown in Table 12. The results indicate that the length of the linker that play an important role in the immune stimulatory activity of Emu nomeo. 가장 좋은 면역자극 효과는 산재된 포스페이트 전하를 가지고 있는 비염기성 링커 또는 C3- 내지 C6-알킬 링커를 사용하는 경우에 달성되었다. The best immunostimulatory effect was achieved when using a non-basic linker or C3- to C6- alkyl linker which has a charge-phosphate scattered.

표 12. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성 Table 12. Emu nomeo structure and immunostimulatory activity

Figure 112004017052430-pct00016

Figure 112004017052430-pct00017

실시예 8: 올리고뉴클레오티드 골격이 면역자극 활성에 미치는 효과 Example 8: Preparation of an oligonucleotide backbone are effects on the immune stimulating activity

일반적으로 천연 포스포디에스테르 골격을 함유하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 골격을 가지고 있는 동일한 길이의 올리고뉴클레오티드보다 면역자극성이 덜하다. In general, the natural force immunostimulatory oligonucleotide containing Fordyce ester backbone oligonucleotide are less immunostimulatory than the oligonucleotides of the same length of nucleotides with phosphorothioate backbone. 이런 더 낮은 정도의 면역자극 활성은 부분적으로는 실험 조건하에서의 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드의 빠른 분해에 기인하는 것일 수 있다. Immunostimulatory activity of this lower level can be to partly oligonucleotide phosphodiester under the test conditions due to the rapid degradation of the oligonucleotide. 올리고뉴클레오티드의 분해는 일차적으로 3' 말단으로부터 올리고뉴클레오티드를 분해시키는 3'-엑소뉴클레아제의 결과이다. Oligonucleotide of the nucleotide degradation is a result of the 3'-exonuclease degradation of primarily the 3 'terminal nucleotide from the oligonucleotide. 이 실시예의 이뮤노머는 유리 3' 말단을 함유하지 않는다. This embodiment does not contain an immunometric dimmer glass 3 'end. 그러므로 포스포디에스테르 골격을 가지고 있는 이뮤노머는 실험 조건하에서 상응하는 단량체 올리고뉴클레오티드보다 더 긴 반감기를 가져야 하고, 따라서 개선된 면역자극 활성을 나타내야 한다. Thus oligonucleotide corresponding monomers that under the experimental conditions immunometric dimmer with phosphodiester backbone have a longer half-life than the oligonucleotide, and thus should exhibit the improved immunostimulatory activity. 하기 표 13에 나타낸 결과는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 시토킨 유도에 의해 측정된 면역자극 활성을 나타내는 이뮤노머 84 및 85를 사용하여 이런 효과를 증명한다. To the results shown in Table 13 using the Emu nomeo 84 and 85 showing a BALB / c mouse spleen cell culture cytokine-induced immune stimulating activity as determined by in demonstrate this effect.

표 13. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성 Table 13. Emu nomeo structure and immunostimulatory activity

Figure 112004017052430-pct00018

실시예 9: 이뮤노머 73 내지 92의 합성 Example 9: Synthesis of Emu nomeo 73 to 92

올리고뉴클레오티드를 1 μM 규모로 자동 DNA 합성기 (Expedite 8909 PerSeptive Biosystems)를 사용하여 합성하였다. Oligonucleotides were synthesized using an automated DNA synthesizer (Expedite 8909 PerSeptive Biosystems) with the nucleotide 1 μM scale. 데옥시뉴클레오시드 포스포라미다이트는 어플라이드 바이오시스템스 (Applied Biosystems, Foster City, CA)로부터 얻었다. Deoxy nucleoside force Fora midayi teuneun was obtained from Applied Bio Systems (Applied Biosystems, Foster City, CA). 7-데아자-2'-데옥시구아노신 포스포라미다이트를 글렌 리서치 (Glen Research, Sterling Virginia)로부터 얻었다. 7-aza-2'-de oxy-guanosine to obtain a force Fora midayi agent from Glen Research (Glen Research, Sterling Virginia). 1,3-비스-DMT-글리세롤-CPG 를 켐젠스 (ChemGens, Ashland, MA)로부터 얻었다. 1,3-bis -DMT- -CPG glycerol were obtained from Chem presence (ChemGens, Ashland, MA). 변형된 뉴클레오시드를 정상적인 커플링 사이클을 사용하여 특정 부위에서 올리고뉴클레오티드에 통합하였다. A modified nucleoside using normal coupling cycles up at a particular region was incorporated into the oligonucleotide. 합성후에 올리고뉴클레오티드를 농축된 수산화 암모늄을 사용하여 탈보호하고, 역상 HPLC에 의하여 정제하고, 투석하였다. After oligonucleotide synthesis the deprotection using a concentrated ammonium hydroxide for nucleotides, and purified by reverse phase HPLC, followed by dialysis. 나트륨 염으로서 정제된 올리고뉴클레오티드를 사용전에 동결건조시켰다. The purified oligonucleotide was lyophilized as the sodium salt of the oligonucleotide prior to use. 올리고뉴클레오티드의 순도를 CGE 및 MALDI-TOF MS (Bruker Proflex III MALDI-TOF 질량 분광계)에 의해 체크하였다. Raising the purity of nucleotides was checked by CGE and MALDI-TOF MS (Bruker Proflex III MALDI-TOF mass spectrometer).

실시예 11: 이뮤노머 안정성 Example 11: Stability Emu nomeo

올리고뉴클레오티드를 10 % 우혈청이 함유되어 있는 PBS 중에서 37 ℃에서 4, 24 또는 48 시간 동안 인큐베이션하였다. Oligonucleotide in 37 ℃ in PBS, which is an oligonucleotide containing 10% bovine serum and incubated for 4, 24 or 48 hours. 온전한 올리고뉴클레오티드를 모세관 겔 전기영동에 의하여 측정하였다. Intact oligonucleotide was determined by the nucleotide in capillary gel electrophoresis. 그 결과를 하기 표 14에 나타낸다. The results are shown in Table 14.

표 14. 10 % 우혈청 PBS 용액중에서의 올리고뉴클레오티드의 분해 Table 14. Degradation of oligo nucleotides of the 10% bovine serum PBS solution

Figure 112004017052430-pct00019

실시예 12: 접근가능한 5' 말단이 면역자극 활성에 미치는 효과 Example 12: an accessible 5 'end effects on the immune stimulating activity

BALB/c 마우스 (4 내지 8 주) 비장 세포를 RPMI 완전 배지중에서 배양하였다. The BALB / c mice (4-8 weeks) spleen cells were cultured in RPMI complete medium. 뮤린 대식세포-유사 세포인 J774 (ATCC, Rockville, MD)를 10 % (v/v)의 FCS 및 항생물질 (100 IU/ml의 페니실린 G/스트렙토마이신)가 첨가되어 있는 둘베코 변형 이글스 배지중에서 배양하였다. In Dulbecco's modified Eagles medium in which the addition of similar cells, J774 (ATCC, Rockville, MD) to 10% (v / v) (penicillin G / streptomycin in 100 IU / ml) in FCS and antibiotic-murine macrophages and cultured. 모든 다른 배양 시약은 메디아테크 (Mediatech, Gaithersburg, MD)로부터 구입하였다. All other culture reagents were purchased from Media Tech (Mediatech, Gaithersburg, MD).

IL-12 및 IL-6에 대한 ELISA. ELISA for IL-12 and IL-6. BALB/c 마우스 비장 또는 J774 세포를 24-웰 디쉬에 각각 5×10 6 또는 1×10 6 세포/ml의 밀도로 플레이팅하였다. Each of the BALB / c mouse spleen or J774 cells were plated in 24-well dish, 5 × 10 6 or 1 × 10 6 play a density of cells / ml. TE 완충액 (10 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA)에 용해된 CpG DNA를, 마우스 비장 세포 배양물에는 최종 농도가 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 또는 10.0 ㎍/ml이 되도록, 그리고 J774 세포 배양물에 대해서는 최종 농도가 1.0, 3.0 또는 10.0 ㎍/ml이 되도록 첨가하였다. A CpG DNA dissolved in TE buffer (10 mM Tris -HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA), mouse spleen cells cultured in water at a final concentration of 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, or 10.0 ㎍ / ml, and for the J774 cell culture it was added to a final concentration of 1.0, 3.0 or 10.0 ㎍ / ml. 그런 다음 세포를 37 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하고, 그 상층액을 수집하여 ELISA 검정을 수행하였다. Then, cells are incubated at 37 ℃ for 24 hours, was performed ELISA assay by collecting the supernatant. 실험을 각 농도에 대하여 삼중으로 각 CpG DNA에 대하여 2 또는 3회 수행하였다. Experiments for each concentration were carried out 2 or 3 times for each CpG DNA in triplicate.

IL-12 및 IL-6의 분비는 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. Secretion of IL-12 and IL-6 was measured by sandwich ELISA. 시토킨 항체 및 표준을 포함하여 필요한 시약들은 파밍겐 (PharMingen)으로부터 구입하였다. Cytokine antibody and the reagent containing the standard were purchased from Pharmingen Gen (PharMingen). ELISA 플레이트 (Costar)를 PBSN 완충액 (PBS/0.05 % 나트륨 아지드, pH 9.6)중의 5 ㎍/ml 농도의 적절한 항체와 함께 밤새 4 ℃에서 인큐베이션한 후, PBS/1 % BSA로 37 ℃에서 30분동안 차단하였다. ELISA plates (Costar) PBSN buffer (Oh PBS / 0.05% sodium azide, pH 9.6) and then incubated overnight at 4 ℃ with an appropriate antibody of 5 ㎍ / ml concentration, in 37 ℃ 30 minute PBS / 1% BSA It was blocked for. 세포 배양 상층액 및 시토킨 표준을 PBS/1 % BSA로 적당하게 희석하고 플레이트에 삼중으로 첨가한 다음 25 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. A cell culture supernatants and cytokine standards diluted appropriately in PBS / 1% BSA was added in triplicate to the plate and then incubated for 2 hours at 25 ℃. 플레이트를 세척하고 1 ㎍/ml의 적당한 비오티닐화된 항체와 함께 25℃에서 1.5 시간 동안 인큐베이션하였다. Wash the plate, and incubated for 1.5 hours at 25 ℃ with a suitable non-ot the biotinylated antibody of 1 ㎍ / ml. 그런 다음 플레이트를 PBS/0.05 % 트윈 20으로 집중적으로 세척한 후 다시 25 ℃에서 1.5 시간 동안 인큐베이션한 후, 스트렙트아비딘 컨쥬게이션된 퍼옥시다제 (Sigma)를 첨가하였다. Then, after the plates are incubated for 1.5 hours at 25 ℃ again after intensive washing with a PBS / 0.05% Tween 20, streptavidin-conjugated peroxidase for the peroxidase (Sigma) were added. 플레이트를 Sure Blue TM (Kirkegaard and Perry) 발색 시약으로 전개시키고 스탑 용액 (Kirkegaard and Perry)을 첨가함으로써 반응을 종결지었다. The plates Sure TM Blue (Kirkegaard and Perry) chromogenic reagent and the deployment stop solution (Kirkegaard and Perry) built to stop the reaction by the addition of. 색 변화를 Ceres 900 HDI 분광계 (Bio-Tek Instruments)상에서 측정하였다. A color change was measured on a Ceres 900 HDI Spectrometer (Bio-Tek Instruments). 세포 배양 상층액중의 IL-12 및 IL-6의 수준은 각각 IL-12 와 IL-6에 대한 동일한 실험 조건하에서 작성된 표준 곡선으로부터 계산하였다. IL-12 and the level of IL-6 in the cell culture supernatants was calculated from the standard curve created under identical experimental conditions for IL-12 and IL-6, respectively. 그 결과를 하기 표 15에 나타내었다. The results are shown in Table 15.

표 15. 연구에 사용된 포스포로티오에이트 CpG DNA 서열 및 변형 a Table 15. The phosphorothioate used in the study thio benzoate CpG DNA sequence and a strain

Figure 112004017052430-pct00020

a : 화학적 구조 b ~ l에 대해서는 차트 1 참조; a: 1 for the chemical structure, see Chart b ~ l; 5'-CG-3' 디뉴클레오티드는 밑줄로 표시한다. 5'-CG-3 'dinucleotides are underlined.

차트 1 Chart 1

Figure 112004017052430-pct00021

표 16. BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중의 CpG DNA-컨쥬게이트에 의한 IL-12 및 IL-6 분비의 유도 Table 16. BALB / c mouse spleen cells in the induction of IL-12 and IL-6 secretion by CpG DNA- conjugated in the culture

Figure 112004017052430-pct00022

이들 결과를 함께 고려하면, CpG DNA의 접근가능한 5'-말단은 그것의 최적 면역자극 활성에 필요하며, 더 작은 기, 예컨대 포스포로티오에이트, 모노뉴클레오티드, 또는 디뉴클레오티드는 면역자극 경로에 포함된 수용체 또는 인자들에 대한 CpG DNA의 5'-말단의 이용성을 효과적으로 차단하지 못하는 것으로 나타난다. Considering these results together, accessible to the 5'-end of the CpG DNA is a necessary and at its optimal immune stimulating activity, a smaller group, such as phosphorothioate, mono-nucleotide, or di-nucleotide comprises a immunostimulatory path It appears to be not effective to block the availability of the 5'-end of CpG DNA for the factor or receptor. 그러나 CpG DNA의 5'-말단에서 플루오레신 또는 더 큰 분자같이 큰 분자의 컨쥬게이션은 면역자극 활성을 제거할 수 있다. However, conjugation of fluorescein or a larger molecule, such as a large molecule on the 5'-end of CpG DNA can be removed immunostimulatory activity. 이들 결과는 CpG DNA-항원/백신/모노클로날 항체 (mAb) 컨쥬게이트의 면역자극 활성을 연구하는 데 직접적인 영향을 준다. These results suggest that a direct impact to study the monoclonal antibody (mAb) conjugated to the immunostimulatory activity of the CpG DNA- antigen / vaccine / monoclonal. CpG DNA의 5'-말단에서의 백신 또는 mAb와 같은 큰 분자의 컨쥬게이션은 CpG DNA의 차선의 면역자극 활성을 유도할 수 있다. Conjugation of a larger molecule, such as a vaccine or mAb at the 5'-end of CpG DNA can induce immunostimulatory activity of the CpG DNA lane. CpG DNA의 3'-말단에서의 기능성 리간드의 컨쥬게이션은 증가된 뉴클레아제 안정성에 기여할 뿐 아니라 생체내에서 CpG DNA의 증가된 면역자극 능력에도 기여한다. Conjugation of a functional ligand on the 3'-end of the CpG DNA is also contributes to the stability, as well as contribute to the increased nuclease increase in CpG DNA in vivo immunostimulatory capacity.

실시예 13: 링커가 시토킨 분비에 미치는 효과 Example 13: Effect on cytokine secretion linker

본 연구를 위하여 다음의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. For this study, the following oligonucleotides were synthesized nucleotides. 이들 변형된 올리고뉴클레오티드의 각각은 이뮤노머내로 통합될 수 있다. Each of these modified oligonucleotides may be incorporated into an Emu nomeo.

표 17 . Table 17. 치환 위치를 나타내는 CpG DNA의 서열 Sequence of the CpG DNA representing the substitution position

Figure 112004017052430-pct00023

Figure 112004017052430-pct00024

a : 치환 1 내지 9의 화학적 구조에 대해서는 도 14를 참조하라. a: Refer to Figure 14 for the chemical structure of a substituted 1 to 9. 모든 CpG DNA는 포스포로티오에이트 골격이 변형되었다. All CpG DNA was transformed a phosphorothioate backbone.

면역자극 활성의 강화를 위한 최적 링커 크기를 평가하기 위해서 본 발명자들은, BALB/c 마우스 비장 세포 배양물에서 변형된 CpG DNA에 의해 유도된 IL-12 및 IL-6의 분비를 측정하였다. In order to evaluate the optimal size of the linker to enhance the immunostimulatory activity present inventors, BALB / c mouse spleen cells were measured for the secretion of IL-12 and IL-6 induced by CpG DNA variant from the culture. 모든 CpG DNA는 농도-의존성 IL-12 및 IL-6 분비를 유도하였다. All CpG DNA in a concentration-dependent induced IL-12 and IL-6 secretion. 도 15는 모 CpG DNA와 비교하여, CpG 디뉴클레오티드에 대해 5'-플랭킹 서열에서 다섯번째 뉴클레오티드에 링커를 가지고 있는 선택된 CpG DNA, 116, 119, 126, 130 및 134의 1 ㎍/ml의 농도에서 얻어진 결과를 나타낸다. 15 is a 1 ㎍ / ml concentration of the base as compared with CpG DNA, the selected CpG DNA with a linker in the fifth nucleotide from the 5'-flanking sequence to the CpG dinucleotide, 116, 119, 126, 130 and 134 the results obtained in the. C2-(1), C3-(2), 및 C4-링커 (3)을 함유한 CpG DNA는 모 CpG DNA 4의 것과 유사한 IL-12 생성물의 분비를 유도하였다. C2- (1), C3- (2), and C4- CpG DNA containing linker (3) induced the secretion of IL-12 similar to that of the parent product CpG DNA 4. 5'-플랭킹 서열에서 CpG 디뉴클레오티드로부터 다섯번째 뉴클레오티드에 있는 C6 및 C9-링커 (4 및 5)를 함유한 CpG DNA는 모 CpG DNA가 유도한 것보다 더 낮은 수준의 IL-12 분비를 유도하였는데 (도 15), 이것은 C4-링커보다 더 긴 링커의 치환이 더 낮은 수준의 IL-12를 유도하는 결과를 초래하였음을 시사한다. 5'-C9- and C6 plug in the fifth nucleotide from the CpG dinucleotide in the ranking sequence Linker (4 and 5) containing a CpG DNA induces a lower level of IL-12 secretion than is the parent CpG DNA induces a It was (Fig. 15), suggesting that it has resulted to induce more lower levels of IL-12 substitution of a long linker more C4- linker. 링커가 있는 다섯개의 모든 CpG DNA는 모 CpG DNA보다 2배 내지 3배 더 높은 IL-6 분비를 유도하였다. Of five with a linker all CpG DNA induced a 2-fold to 3-fold higher than the parent IL-6 secretion CpG DNA. 이들 CpG DNA에서 링커의 존재는 링커를 가지고 있지 않은 CpG DNA와 비교하여 IL-6의 유도에 상당한 영향을 주었다. Linker in the presence of these CpG DNA as compared to CpG DNA did not have a linker had a significant effect on the induction of IL-6. 그러나 본 발명자들은 IL-6 분비에 대한 길이-의존성 링커 효과는 관찰하지 못하였다. However, the present inventors have found that the length of the IL-6 secretion were not observed are not dependent linker effect.

에틸렌글리콜-링커를 함유하고 있는 CpG DNA의 면역자극 활성에 미치는 효과를 조사하기 위해, 본 발명자들은 트리에틸렌글리콜-링커 (6)가 각각 CpG 디뉴클레오티드에 대해 5'-말단의 다섯번째 뉴클레오티드 위치 및 3'-플랭킹 서열의 네번째 뉴클레오티드 위치에 통합되어 있는 CpG DNA 137 및 138을 합성하였다. Glycol - to investigate the effect of the immunostimulatory activity of the CpG DNA, which contains the linker, the inventors triethylene glycol Five nucleotide positions in the 5'-end to the CpG dinucleotide, the linker (6), respectively, and the 3'-flanking sequence CpG DNA 137 and 138 incorporated in the fourth nucleotide position were synthesized. 마찬가지로 CpG DNA 139 및 140은 헥사에틸렌글리콜-링커 (7)를 각각 CpG 디뉴클레오티드에 대해 5'- 또는 3'-플랭킹 서열에 함유하고 있다. Similarly, CpG DNA 139 and 140 is hexaethylene glycol and containing in the 5'-or 3'-flanking sequence to the CpG dinucleotide linker (7), respectively. 네 개의 변형된 CpG DNA (137 ~ 140)를 모두 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물에서 시토킨 유도 (IL-12, IL-6 및 IL-10)에 대하여 시험하고, 모 CpG DNA 4와 비교하였다. The four modified CpG DNA (137 ~ 140) were all compared with BALB / c mouse spleen cell culture cytokine induction (IL-12, IL-6 and IL-10) all CpG DNA tested for, and 4 in the . 모든 CpG DNA는 시험된 농도 범위 (0.03 내지 10.0 ㎍/ml)에 걸쳐 농도-의존성 시토킨 생성을 유도하였다 (데이터는 제시하지 않음). Induce dependence cytokine generation (data not shown) All CpG DNA concentration over the test concentration range (0.03 to 10.0 ㎍ / ml). 0.3 ㎍/ml 농도의 CpG DNA 137 ~ 140에 의해 유도된 시토킨의 수준은 하기 표 18에 나타낸다. 0.3 ㎍ / ml levels of the cytokine induced by CpG DNA concentration of 137 ~ 140 are set forth in Table 18. 5'-플랭킹 서열에 에틸렌글리콜-링커를 가지고 있는 CpG DNA 137 및 139는 모 CpG DNA 4가 유도한 것보다 더 높은 수준으로 IL-12 (2106±143 및 2066±153 pg/ml) 및 IL-6 (2362±166 및 2507±66 pg/ml) 분비를 유도하였다 (표 18). 5'-flanking sequence to the ethylene glycol-at a higher level than a CpG DNA 137 and 139 have a linker is derived parent CpG DNA 4 IL-12 (2106 ± 143 and 2066 ± 153 pg / ml) and IL -6 (2362 ± 166 and 2507 ± 66 pg / ml) were (Table 18) lead to secretion. 동일한 농도에서 137과 139는 모 CpG DNA보다는 약간 더 낮은 수준의 IL-10 분비를 유도하였다 (표 18). The same concentration of 137 and 139 is to induce a slightly lower level of IL-10 secretion than all CpG DNA (Table 18). 3'-플랭킹 서열에 더 짧은 에틸렌글리콜-링커 (6)를 가지고 있는 CpG DNA 138은 모 CpG DNA와 유사한 IL-12 분비를 유도하였지만, IL-6 및 IL-10 의 수준은 상당히 더 낮았다 (표 18). 3'-flanking sequence to the shorter glycol - 138 CpG DNA with a linker 6 but induce IL-12 secretion is similar to the parent CpG DNA, the level of IL-6 and IL-10 are significantly lower ( Table 18). 더 긴 에틸렌글리콜-링커 (7)를 가지고 있는 CpG NDA 140은 모 CpG DNA와 비교하여, 세 가지의 시험된 모든 시토킨을 상당히 더 낮은 수준으로 유도하였다 (표 18). Longer glycol - CpG NDA 140 to have a linker (7) is compared to the parent CpG DNA, was induced to all three cytokines tested in a significantly lower level (Table 18).

트리에틸렌글리콜-링커 (6)가 C9-링커 (5)와 유사한 사슬 길이를 가지고 있긴 하지만, 트리에틸렌글리콜-링커를 함유하고 있는 CpG DNA는 비장 세포 배양물에서 시토킨 분비의 유도에 의해 측정하여 C9-링커를 함유하고 있는 CpG DNA 보다 더 좋은 면역자극 활성을 가지고 있다. Triethylene glycol by CpG DNA, which contains the linker spleen cells as measured by the induction of cytokine secretion in the culture-linker (6) Although having a similar chain length of C9- and linker (5), however, triethylene glycol It has a better immune stimulating activity than the CpG DNA containing the C9- linker. 이들 결과는 더 긴 알킬-링커 (4 및 5)를 함유하고 있는 CpG DNA로 관찰된 더 낮은 면역자극 활성이 그것들의 증가된 길이가 아니라 소수성 특성과 관련이 있을 것이라는 점을 시사한다. These results indicate that the longer the alkyl-implies that the lower immunostimulatory activity observed with CpG DNA, which contains the linker (4 and 5) would not increase the length thereof be related to the hydrophobic characteristics. 이러한 관찰은 본 발명자들로 하여금 면역자극 활성에 대해 친수성 작용기를 함유하고 있는 분지된 알킬-링커의 치환을 조사하게 하였다. These observations allow the inventors branched alkyl containing a hydrophilic functional group on the immunostimulatory activity were to investigate the substitution of a linker.

표 18 . Table 18. BALB/c 마우스 비장 세포 배양물에서 에틸렌글리콜-링커를 함유하는 CpG DNA에 의해 유도된 시토킨 분비. BALB / c mouse spleen cells in culture glycol - the cytokine secretion induced by CpG DNA containing linker.

CpG DNA 번호 CpG DNA code 시토킨, pg/ml Cytokines, pg / ml
IL-12 IL-12 IL-6 IL-6 IL-10 IL-10
4 4 1887±233 1887 ± 233 2130±221 2130 ± 221 86±14 86 ± 14
137 137 2106±143 2106 ± 143 2362±166 2362 ± 166 78±21 78 ± 21
138 138 1888±259 1888 ± 259 1082±25 1082 ± 25 47±14 47 ± 14
139 139 2066±153 2066 ± 153 2507±66 2507 ± 66 73±17 73 ± 17
140 140 1318±162 1318 ± 162 476±13 476 ± 13 25±5 25 ± 5
매질 medium 84±13 84 ± 13 33±6 33 ± 6 2±1 2 ± 1

분지된 알킬-링커를 함유하고 있는 CpG DNA의 면역자극 활성에 미치는 효과를 시험하기 위하여 히드록실 (8) 또는 아민 (9) 작용기를 함유하는 2개의 분지된 알킬-링커를 모 CpG DNA 4에 통합시키고 그 결과 변형된 CpG DNA (150 ~ 154-표 19)의 면역자극 활성에 미치는 효과를 조사하였다. A branched alkyl-In order to test the effect of the immunostimulatory activity of the CpG DNA, which contains the linker hydroxyl (8) or an amine (9) two branched alkyl which contains a functional group - integrating the linker to the parent CpG DNA 4 and it examined the effect on the immune stimulating activity of the resulting modified CpG DNA (150 ~ 154- Table 19). 상이한 뉴클레오티드 위치에 아미노-링커 (9)를 함유하고 있는 CpG DNA 150 내지 154를 사용하여 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물에서 (증식) 및 생체내에서 (비장비대) 얻어진 데이터를 하기 표 19에 나타내었다. In different nucleotide positions amino- using CpG DNA 150 to 154, which contains the linker 9 shown in BALB / c mouse spleen cells to the data obtained (splenomegaly) within the (proliferation) and in vivo in cultures Table 19 It was.

표 19 . Table 19. BALB/c 마우스 비장 세포 배양물 및 BALB/c 마우스의 비장 비대에서 아미노부티릴 프로판디올-링커를 함유하고 있는 CpG DNA에 의해 유도된 비장 세포 증식 BALB / c mouse spleen cell culture, and amino-butyryl-propanediol in splenomegaly in BALB / c mice spleen cells induced by CpG DNA, which contains the linker proliferation

CpG DNA 번호 a CpG DNA number a 비장 세포 증식 (PI) b Spleen cell proliferation (PI) b 비장 무게 (mg) c Spleen weight (mg) c
4 4 3.7 ± 0.8 3.7 ± 0.8 121 ± 16 121 ± 16
150 150 2.5 ± 0.6 2.5 ± 0.6 107 ± 11 107 ± 11
151 151 9.2 ± 0.7 9.2 ± 0.7 169 ± 16 169 ± 16
152 152 8.8 ± 0.4 8.8 ± 0.4 220 ± 8 220 ± 8
153 153 7.6 ± 0.7 7.6 ± 0.7 127 ± 24 127 ± 24
154 154 7.8 ± 0.04 7.8 ± 0.04 177 ± 12 177 ± 12
M/V M / V 1.2 ± 0.3 1.2 ± 0.3 102 ± 8 102 ± 8
LPS LPS 2.8 ± 0.5 2.8 ± 0.5 ND 10 ND 10

모 (parent) CpG DNA 4는 0.1 ㎍/ml의 농도에서 3.7 ±0.8의 증식 지수를 보였다. Parent (parent) DNA 4 CpG showed a proliferation index of 3.7 ± 0.8 eseo 0.1 ㎍ / ml concentration. 동일한 농도에서 상이한 위치에 아미노-링커 9를 가지고 있는 변형된 CpG DNA 151 내지 154는 모 CpG DNA보다 더 높은 수준으로 비장 세포 증식을 유발하였다 (표 19). Amino at a different position on the same level - the CpG DNA 151 to 154 modified with a linker 9 was induced spleen cell proliferation at a higher level than the parent CpG DNA (Table 19). 다른 링커들로도 관찰된 바와 같이 치환이 CpG 디뉴클레오티드와 인접하여 일어난 경우 (150), 모 CpG DNA와 비교하여 더 낮은 증식 지수가 관찰되었고, 이것은 추가로 CpG 디뉴클레오티드에 인접하여 링커 치환이 일어나는 것이 면역자극 활성에는 불리한 영향을 미친다는 것을 확인해준다. When caused by substitution adjacent to the CpG dinucleotide, as observed different linker deulrodo 150, all lower proliferative index was observed as compared to CpG DNA, it is immune occurring linker substituted adjacent to the CpG dinucleotides in addition stimulating activity confirms that there is adversely affected. 일반적으로 5'-플랭킹 서열에서 2'-데옥시리보뉴클레오티드에 대한 아미노-링커의 치환 (151 및 152)은 3'-플랭킹 서열에서의 치환 (153 및 154)으로 발견된 것보다 더 높은 비장 세포 증식을 초래하였다. In general, for the 5'-flanking amino 2'-deoxy ribonucleotides in sequence - substitution of the linker (151 and 152) is higher than that found with substitutions (153 and 154) in the 3'-flanking sequence It resulted in spleen cell proliferation. 유사한 결과를 비장비대 분석에서도 관찰하였고 (표 19), 그것은 비장 세포 배양물에서 관찰된 결과를 확인해준다. Similar results were observed in splenomegaly analysis (Table 19), it confirms the results observed in the spleen cell cultures. 글리세롤-링커 (8)를 함유하고 있는 변형된 CpG DNA는 아미노-링커 (9)를 함유하고 있는 변형 CpG DNA로 관찰된 것과 유사하거나 약간 더 높은 면역자극 활성을 보였다 (데이터는 제시되지 않음). Glycerol - the CpG DNA transformation, which contains the linker 8-amino-showed a similar or slightly higher immunostimulatory activity as observed in the modified CpG DNA, which contains the linker 9 (data not shown).

링커 8 및 9를 함유하고 있는 CpG DNA의 면역자극 효과를 비교하기 위해, 본 발명자들은 5'-플랭킹 서열에 치환이 일어난 CpG DNA 145 및 152를 선택하여 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물에서 시토킨 IL-12 및 IL-6 분비를 유도하는 그것들의 능력을 분석하였다. In order to compare the immune stimulatory effects of CpG DNA, which contains the linker 8 and 9, the present inventors have selected the CpG DNA 145 and 152 takes place is substituted on the 5'-flanking sequence to cytokines in BALB / c mouse spleen cell cultures Kin a IL-12 and their ability to induce IL-6 secretion was analyzed. CpG DNA 145 및 152는 둘 다 농도-의존성 시토킨 분비를 유도하였다. CpG DNA 145 and 152 are both concentration-dependent induced cytokine secretion. 도 4는 모 CpG DNA 4와 비교된, 0.3 ㎍/ml 농도에서의 145 및 152에 의해 유도된 마우스 비장 세포 배양물중의 IL-12 및 IL-6 수준을 도시한다. Figure 4 illustrates the mouse IL-12 and IL-6 levels in the spleen cell cultures induced by 145 and 152 in comparison with the parent CpG DNA 4, 0.3 ㎍ / ml concentration. 두 가지 CpG DNA는 모두 모 CpG DNA 4보다 더 높은 수준의 IL-12 및 IL-6 을 유도하였다. Two kinds of CpG DNA were all induced higher levels of IL-12 and IL-6 than the parent CpG DNA 4. 글리세롤-링커 (8)를 함유하고 있는 CpG DNA는 아미노-링커 (9)를 함유하고 있는 CpG DNA보다 약간 더 높은 수준의 시토킨 (특히 IL-12)을 유도하였다 (도 16). Glycerol-induced slightly higher levels of cytokines (in particular IL-12) than CpG DNA containing the linker (9) (Fig. 16) linker (8) and CpG DNA is amino which contain. 이들 결과는 추가로 친수성 기를 함유하고 있는 링커가 CpG DNA의 면역자극 활성에는 더 유리하다는 것을 확인해준다. These results confirms that the linker, which contains an additional hydrophilic glass that has more immunostimulatory activity of CpG DNA.

본 발명자들은 CpG DNA의 다중 링커 치환의 2 가지의 상이한 측면을 조사하였다. The inventors have investigated the two different sides of the multi-linker substitutions of CpG DNA. 한 세트의 실험에서, 본 발명자들은 13-량체에 대한 뉴클레오티드 서열의 길이를 유지시켰고, 1 내지 5 개의 C3-링커 (2)를 5'-말단 위치에 통합시켰다 (120 ~ 124). In one set of experiments, the inventors sikyeotgo keep the length of the nucleotide sequence of the 13-mer, incorporated 1 to 5 C3- linker 2 at the 5'-end position (120 to 124). 이들 변형된 CpG DNA는 용해도에 문제를 일으키지 않으면서 링커의 길이의 증가가 미치는 영향을 연구하는 것을 가능하게 해주었다. The modified DNA is CpG gave it possible to, without causing problems in the solubility study the effect of the increase in length of the linker on. 두번째 세트의 실험에서는, 본 발명자들은 CpG 디뉴클레오티드에 대한 5'-플랭킹 서열에 인접한 위치에 2개의 동일한 링커 치환 (3, 4 또는 5)을 통합하였고, 그것이 면역자극 활성에 어떠한 추가의 부가 효과를 나타내는지를 연구하였다. In the experiment of the second set, the inventors have found that 5'-flanking sequences were integrated at a position adjacent to the two same-substituted linker (3, 4, or 5), that no further additional effects of the immunostimulatory activity of the CpG dinucleotide It investigated whether representing the.

변형된 CpG DNA를, BALB/c 마우스 비장 세포 배양물에서 모 CpG DNA 4와 비교하여 시토킨 생성을 유도하는 능력에 대하여 연구하였다. A CpG DNA transformation, as compared with the parent 4 CpG DNA in BALB / c mouse spleen cell cultures were studied for their ability to induce cytokine generation. 모든 CpG DNA는 농도-의존성 시토킨 생성을 유도하였다. All CpG DNA in a concentration-dependent induced cytokine generation. 1.0 ㎍/ml 농도의 CpG DNA에서 얻어진 데이터를 하기 표 20에 나타낸다. To the data obtained in CpG DNA in 1.0 ㎍ / ml concentrations shown in Table 20. 이 분석에서 모 CpG DNA 4는 1 ㎍/ml 농도에서 967±28 pg/ml의 IL-12, 1593±94 pg/ml의 IL-6, 및 14±6 pg/ml의 IL-10 분비를 유도하였다. In this assay all CpG DNA 4 is 1 ㎍ / in ml, 967 ± 28 in pg / ml IL-12, 1593 ± 94 pg / ml of IL-6, and 14 ± 6 pg / ml induce IL-10 secretion It was. 표 20에 나타낸 데이터는 링커 치환의 수가 감소함에 따라 IL-12 유도 또한 감소되었음을 나타낸다. Data in Table 20 shows that IL-12 also induced decreased with a decrease in the number of linker substituted. 그러나 CpG DNA 123 및 124에 의한 IL-12 분비의 더 낮은 수준의 유도는 CpG DNA의 더 짧은 길이의 결과일 수 있다. However, the lower level of the induction of IL-12 secretion by CpG DNA 123 and 124 may be a result of the shorter length of the CpG DNA. 15-뉴클레오티드보다 더 짧은 변형되지 않은 CpG DNA를 사용한 본 발명자들의 연구 결과는 별 의미없는 면역자극 활성을 보였다 (데이터는 제시되지 않음). 15 findings by the present inventors with the CpG DNA is not shorter than the modified oligonucleotides showed no immunostimulatory activity by means (data not shown). 링커 치환의 길이나 수가 IL-6 분비에 대한 효과를 반감시키는 것은 아니다. Not to halve the effect of the linker length and the number of substitution IL-6 secretion. IL-10 분비가 링커 치환에 따라 증가되긴 하였지만, 이들 CpG DNA에 의한 전체적인 IL-10 분비는 최소였다. IL-10 secretion is doegin but increases with the substituted linker, overall IL-10 secretion by these CpG DNA was minimal.

CpG 디뉴클레오티드에 대한 5'-플랭킹 서열의 4번째 및 5번째 위치에 2개의 링커 치환을 함유하고 있는 CpG DNA (링커 3-127; 링커 4-131; 링커 5-135) 및 상응하는 5'-절단된 변형체 128, 132, 및 136 각각을, BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 시토킨 분비를 유도하는 능력에 대하여 시험하였다. CpG DNA, which in the fourth and fifth position in the 5'-flanking sequence to the CpG dinucleotide containing two linker substituted (linker 3-127; 4-131 linker; the linker 5-135) and the corresponding 5 & apos; - cutting the elastic element 128, 132, and 136, respectively, BALB / c mouse spleen cells were tested for their ability to induce cytokine secretion in the culture. 1.0 ㎍/ml 농도에서 분비된 IL-12 및 IL-6의 수준은 도 17에 도시된다. Level of 1.0 secreted from ㎍ / ml concentration of IL-12 and IL-6 it is shown in Fig. 도 17에 제시된 결과는 면역자극 활성이 통합된 링커의 성질에 좌우됨을 시사한다. Suggests that the results shown in Figure 17 is dependent on the nature of the linker is integrated immunostimulatory activity. C4-링커 3으로 4번째와 5번째 뉴클레오시드를 치환한 것 (CpG DNA 127)은 모 CpG DNA 4와 비교하여 시토킨 분비에 대해 미미한 영향을 나타냈고, 이것은 이들 위치에 있는 뉴클레오염기 및 당이 수용체 인지 및/또는 결합에 불필요함을 시사한다. Be substituted with C4- linker 3 the fourth and fifth nucleosides (CpG DNA 127) are showed a slight effect on cytokine secretion by CpG DNA compared to the base 4, this nucleobases in these positions and suggest that the party is not required that the receptor and / or binding. 링커 치환 (CpG DNA 128)을 지나친 뉴클레오티드의 결실은 CpG DNA 4 및 127로 발견된 것보다 더 높은 수준의 IL-12 및 IL-6 분비를 유도하였다. The linker-substituted (CpG DNA 128) deletion of nucleotide excessive induced higher levels of IL-12 and IL-6 secretion by CpG DNA than is found 4 and 127. 예상했던 바와 같이 2개의 C6-링커 (4)의 치환은 모 CpG DNA 4에 의해 유도된 것보다 더 낮은 수준의 IL-12 분비 및 유사한 IL-6 분비를 초래하였다. Substitution of two C6- linker (4), as expected, has resulted in a lower level of IL-12 secretion and the like IL-6 secretion than that induced by the parent CpG DNA 4. 5'-절단된 CpG DNA 132는 CpG DNA 131보다 더 높은 수준의 시토킨 분비를 유도하였다. 5'-CpG DNA cut 132 is to induce higher levels of cytokine secretion than CpG DNA 131. 2개의 C9-링커 (5)를 가지고 있는 CpG DNA 135 및 136은 미미한 시토킨 분비를 유도하였으며, 이것은 상술한 바와 같이 동일한 링커를 함유하고 있는 단일-치환된 CpG DNA로 얻어진 결과를 확인해준다. Two C9- CpG DNA 135 and 136 with a linker (5) is induced a slight cytokine secretion, and this single, which contains the same linker as mentioned above - confirms the results obtained with the substituted CpG DNA.

실시예 14: 포스포디에스테르 연결이 시토킨 유도에 미치는 효과 Example 14: Effect of phosphodiester connection on cytokine induction

이뮤노머-유도된 시토킨 유도에 미치는 포스포디에스테르 연결의 효과를 시험하기 위하여 다음의 분자들을 합성하였다. Emu nomeo - In order to test the effect of the phosphodiester connection on the induced cytokine induction was synthesized in the following molecules.

표 21. PO-이뮤노머 서열 및 분석 데이터 Table 21. PO- Emu nomeo sequences and data analysis

Figure 112004017052430-pct00025

a 화살표는 각각의 DNA 분자에서 CpG 디뉴클레오티드의 5'-3'방향성을 나타내고 X 및 Y의 구조는 박스안에 도시되어 있다. a arrow indicates the 5'-3 'orientation of the CpG dinucleotides from the respective DNA molecular structure of X and Y is shown in the box.

b PS 및 PO는 각각 포스포로티오에이트 및 포스포디에스테르 골격을 나타낸다. b PS and PO represents a respective phosphorothioate and phosphodiester backbone.

c MALDI-TOF 질량 분광계에 의해 측정됨. measured by MALDI-TOF mass spectrometry c.

PS-CpG DNA 4 (표 21)는 마우스에서 면역 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌고 (데이터는 제시하지 않음) PO-CpG DNA 155는 대조표준으로 작용하였다. PS-4 CpG DNA (Table 21) has been shown to induce an immune response in mice (data not presented) PO-CpG DNA 155 is served as the control standard. PO-이뮤노머 156 및 157은 각각 글리세릴 링커 X (표 21)를 통해 3'-말단에 의해 결합된 모 CpG DNA 155의 2개의 동일한 절단된 복사물을 함유한다. PO- Emu nomeo 156 and 157 contains two identical truncated copies of CpG DNA base 155 joined by a 3'-terminal glyceryl through each linker X (Table 21). 156과 157 각각이 14 염기의 동일한 올리고뉴클레오티드 절편을 함유하고 있는 반면, 157의 5'-말단은 2 개의 C3-링커, Y (표 21)의 첨가에 의해 변형되었다. 156 and 157, respectively, the same oligonucleotide of 14 bases, while containing the nucleotide fragments, the 5'-end of the 157 was modified by the addition of two linker C3-, Y (Table 21). 모든 올리고뉴클레오티드 4, 155 내지 157은 마우스 면역계를 활성화시키는 것으로 알려진 'GACGTT' 6량체 모티프를 함유한다. All oligonucleotide 4, 155 to 157 contains a 'GACGTT' 6-mer motifs are known to activate the mouse immune system.

뉴클레아제에 대한 PO-이뮤노머의 안정성을, 10 % 우태아 혈청 (FBS)(열로 인해 비활성화되지 않았음)을 함유하고 있는 세포 배양 배지중에서 CpG DNA 4, 155 내지 157을 37 ℃에서 4, 24, 및 48 시간 동안 인큐베이션함으로써 분석하였다. Stability PO- Emu nomeo for nuclease, 10% fetal bovine serum (FBS) to CpG DNA 4, 155 to 157 from cell culture medium, which contains the (heat is not disabled because of the well) in 37 ℃ 4, by incubation for 24, and 48 hours and analyzed. 그런 다음 반응 혼합물중에 남아있는 온전한 CpG DNA를 CGE에 의해 측정하였다. The whole CpG DNA which then remains in the reaction mixture were determined by CGE. 도 18A 내지 D는 10 % FBS에서 24시간 동안 인큐베이션된 CpG DNA 4, 155 ~ 157의 뉴클레아제 분해 프로필을 도시한다. Figure 18A-D illustrates a CpG DNA 4, nuclease degradation profile of 155-157 in a 10% FBS and incubated for 24 hours. 각 시점에서 남아있는 전장 CpG DNA의 양을 도 18E에 도시한다. The amount of full-length CpG DNA remaining at each time point is shown in FIG. 18E. 예상했던 바와 같이 모 CpG DNA 4가 혈청 뉴클레아제에 대해 가장 큰 내성을 나타냈다. CpG DNA base 4, as expected, showed the greatest resistance to serum nucleases. 18-량체 4는 약 55 %가 48시간 인큐베이션 후에 분해되지 않은 채로 남아있었다. 18-mer 4 remained about 55% is not decomposed after 48 hours of incubation. 대조적으로 전장 PO-이뮤노머 155는 단지 약 5 %만이 동일한 실험 조건하에서 약 4 시간 후에 남아있었고, 이것은 포스포디에스테르 연결을 함유하고 있는 DNA가 빠르게 분해된다는 것을 확인해준다. In contrast, full-length PO- Emu nomeo 155 only was left only about 5% under the same experimental conditions, after about 4 hours, and this confirms that the DNA containing the phosphodiester connection that degrades faster. 예상했던 바와 같이 PO-이뮤노머 156과 157은 둘 다 혈청 뉴클레아제에 대해 155 보다는 더 내성이었다. As expected PO- Emu nomeo 156 and 157 was more tolerant than 155 for both serum nucleases. 4 시간 후에 155의 약 5 %와 비교했을 때 156과 157 각각의 약 62 % 및 73 %가 온전하게 남아있었다 (도 18 E). After 4 hours was approximately 5% compared with approximately 62% of 156 and 157, respectively, and 73% of the 155 it remained intact (Fig. 18 E). 48시간 후에는, 156과 157의 약 23 % 및 37 %가 분해되지 않은 채로 남아있었다. 48 hours later, it is about 23% and 37% of 156 and 157 remained undissolved. 이들 연구 결과는 3'-3'-연결된 PO-이뮤노머가 혈청 뉴클레아제에 대해 더 안정함을 보여줄 뿐 아니라, 5'-말단에서의 화학적 변형이 추가로 뉴클레아제 안정성을 증가시킬 수 있음을 나타낸다. These results can increase the chemical modification are added to the nuclease stability of the 5'-end as well as to show that the more stable to 3'-3'- PO- the immunometric meoga serum nuclease is connected, It denotes a.

CpG DNA의 면역자극 활성을 BALB/c 및 C3H/HeJ 마우스 비장 세포 배양물중에서 분비된 시토킨 IL-12 및 IL-6의 수준을 측정함으로써 연구하였다. By measuring the level of cytokines IL-12 and IL-6 secretion by the immunostimulatory activity of the CpG DNA in BALB / c and C3H / HeJ mouse spleen cells in culture was studied. 모든 CpG DNA는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 농도-의존성 시토킨 분비를 유도하였다 (도 19). All CpG DNA in a concentration from BALB / c mouse spleen cell culture-dependent induced cytokine secretion (Fig. 19). PS-CpG DNA 4는 3 ㎍/ml에서 각각 2656±256 및 12234±1180 pg/ml의 IL-12 및 IL-6을 유도하였다. PS-4 CpG DNA is induced in each of 2656 ± 256 and 12234 ± 1180 pg / ml at 3 ㎍ / ml IL-12 and IL-6. 모 PO-CpG DNA 155는 10 ㎍/ml 농도에서를 제외하면 바탕값 이상으로 시토킨 수준을 상승시키지 못하였다. Mo PO-CpG DNA 155, except in the 10 ㎍ / ml concentration did not raise the cytokine levels above background level. 이 관찰은 뉴클레아제 안정성 분석 결과와 일치한다. This observation is consistent with the stability analysis nucleases. 대조적으로 PO-이뮤노머 156 및 157은 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 IL-12 및 IL-6 두 가지 모두의 분비를 유도하였다. In contrast PO- Emu nomeo 156 and 157 BALB / c mouse spleen cells was induced release of both IL-12 and IL-6 among the two kinds of the culture.

도 19에 도시된 결과는 PS- 및 PO-CpG DNA의 시토킨 유도 프로필의 분명한 차이를 보여준다. The results shown in Figure 19 shows the clear difference in cytokine induction profiles of PS- and PO-CpG DNA. PO-이뮤노머 156 및 157은 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에 서 PS-CpG DNA 4보다 더 높은 수준의 IL-12를 유도하였다 (도 19A). PO- Emu nomeo 156 and 157 BALB / c mouse spleen cells in the standing PS-CpG DNA 4 higher levels of IL-12 than in the cultures was induced (Fig. 19A). 대조적으로 3 ㎍/ml의 농도에서는 무시해도 좋을 정도의 양으로 IL-6을 생성하였다 (도 19B). In contrast, 3 ㎍ / ml in concentration was in an amount of negligible generate IL-6 (Figure 19B). 가장 높은 농도 (10 ㎍/ml)에서조차도 PO-이뮤노머 156은 PS-CpG DNA 4보다 상당히 덜 IL-6을 유도하였다. Even at the highest concentration (10 ㎍ / ml) PO- Emu nomeo 156 induce significantly less IL-6 than PS-CpG DNA 4. PO-이뮤노머 157의 5'-말단에 있는 C3 링커의 존재는 156과 비교하여 약간 더 높은 수준의 IL-6 분비를 초래하였다. The presence of a C3 linker to the 5'-end of the PO- Emu nomeo 157 was caused by a slightly higher level of IL-6 secretion of compare 156. 그러나 중요한 것은 PO-이뮤노머 157에 의해 유도된 IL-6의 수준은 PS CpG DNA 4에 의해 유도된 IL-6보다 훨신 더 낮다는 사실이다. However, significant levels of IL-6 induced by PO- Emu nomeo 157 is the fact that hwolsin lower than the IL-6 induced by CpG DNA PS 4. 도 19A의 삽입도는 3 ㎍/ml 농도에서 분비된 IL-6에 대한 IL-12의 비율을 나타낸다. Insert of FIG. FIG. 19A shows the ratio of IL-12 to the IL-6 secretion in 3 ㎍ / ml concentration. IL-12 분비를 증가시키는 것 외에 PO-이뮤노머 156 및 157은 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 PS-CpG DNA 4보다 더 높은 수준의 IFN-γ를 유도하였다 (데이터는 제시되지 않음). In addition to increase the IL-12 secretion PO- Emu nomeo 156 and 157 is to induce higher levels of IFN-γ than PS-CpG DNA from spleen cell cultures of BALB / c mouse 4 (data not shown).

BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 PO- 및 PS-CpG DNA에 의해 유도된 상이한 시토킨 프로필로 인해, 본 발명자들은 C3H/HeJ 마우스 비장 세포 배양물 (LPS 저-반응성 스트레인)중에서 CpG DNA에 의한 시토킨 유도 패턴을 연구하게 되었다. Due to the BALB / c mouse spleen cell cultures from different PO- and cytokine profile induced by PS-CpG DNA, the present inventors have found that C3H / HeJ mouse spleen cell culture-by CpG DNA in (LPS low reactivity strain) It was studying the cytokine induction pattern. 이 분석에서 시험된 3개의 모든 CpG DNA는 농도-의존성 시토킨 분비를 유도하였다 (도 20A 및 B). All three CpG DNA tested in this assay is the concentration-dependence was induced cytokine secretion (Fig. 20A and B). BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 PO-CpG DNA 155가 시토킨 분비를 못하였기 때문에 그것은 C3H/HEJ 비장 세포 배양물 중에서는 더 이상 시험하지 않았다. Because of BALB / c mouse spleen cells hayeotgi not get the PO-CpG DNA 155 from the culture cytokine secretion that did not test C3H / HEJ spleen cells in culture is no more. PO-이뮤노머 156 및 157은 둘 다 PS-CpG DNA 4 보다 더 높은 IL-12 생성을 유도하였다 (도 20A). PO- Emu nomeo 156 and 157 is to induce both IL-12 produced higher than PS-CpG DNA 4 (Fig. 20A). 그러나 3 ㎍/ml의 농도에서는 아무 것도 IL-6을 유도하지 못하였다. However, nothing did not induce IL-6 in 3 ㎍ / ml concentration. 가장 높은 시험 농도 (10 ㎍/ml)에서는 두 가지 모두 PS-CpG DNA 4보다 상당히 더 적은 양으로 IL-6을 유도하였다 (도 20B). In the high test concentration (10 ㎍ / ml) were both IL-6 induces a significantly smaller amount than PS-CpG DNA 4 (FIG. 20B).

분비된 IL-6에 대한 IL-12의 비율을 계산하여 PS 및 PO CpG DNA의 시토킨 분비 프로필을 구별하는 데 사용하였다 (도 20A 삽입도). Was calculated by the ratio of IL-12 on the secretion of IL-6 are used to distinguish the cytokine secretion profile of PS and PO CpG DNA (insert Fig. 20A also). 또한 C3H/HeJ 비장 세포 배양물의 결과는 CpG DNA로 관찰된 반응이 LPS 오염에 의한 것이 아님을 보여준다. In addition, C3H / HeJ splenocytes cultured water results show that the observed response to CpG DNA not due to LPS contamination.

PS-CpG DNA는 생체내에서 강력한 항종양 활성을 유도하는 것으로 밝혀졌다. PS-CpG DNA has been shown to induce a potent anti-tumor activity in vivo. PO-CpG DNA가 더 큰 뉴클레아제 안정성을 나타내고 시험관내 분석에서 더 높은 수준의 IL-12 및 IFN-γ 분비를 유도하였기 때문에 본 발명자들은 PO-이뮤노머의 이런 바람직한 성질이 생체내에서 항종양 활성을 개선시키는지를 밝혀내는 데 관심을 모았다. PO-CpG DNA represents the more stable the greater nuclease vitro assay tests because higher levels of IL-12 and induces IFN-γ secreted by the present inventors are the desirable properties of this PO- Emu nomeo antineoplastic in vivo It attracted attention to figuring out how to improve the activity. 본 발명자들은 PO-이뮤노머 157을, 야생형 p53을 발현하는 MCF-7 유방암 세포 또는 돌연변이된 p53을 발현하는 DU-145 전립선암 세포의 종양 이종이식편을 내포하고 있는 누드 마우스에 0.5 mg/kg의 용량으로 격일로 피하 투여하였다. The present inventors have found that MCF-7 breast cancer cells or the capacity to express a mutant p53 prostate cancer DU-145 0.5 mg / kg on tumor cells in nude mice, enclosing the xenografts which express wild-type p53 to PO- Emu nomeo 157, as it was administered subcutaneously every other day. PO-이뮤노머 157은 식염수 대조표준과 비교하여 제 15일에 MCF-7 종양 성장을 57 % 억제하였다 (도 21A). PO- Emu nomeo 157 is a MCF-7 tumor growth in the 15 days as compared to saline control standard was inhibited 57% (Fig. 21A). 그것은 또한 제 34일에 DU-145 종양 성장을 52 % 억제하였다 (도 21B). It was also inhibit the DU-145 tumor growth 52% to 34 days (Fig. 21B). 이들 항종양 연구는 제안된 디자인의 PO-이뮤노머가 생체내에서 강력한 항종양 활성을 나타낸다는 것을 시사한다. These anti-tumor studies suggest that the PO- of the proposed design shows a potent antitumor activity in vivo immunometric meoga.

실시예 22: 짧은 이뮤노머 Example 22: Short Emu nomeo

시토킨 유도에 미치는 짧은 이뮤노머의 영향을 시험하기 위하여 다음의 이뮤노머들을 사용하였다. To test the effect of short-Emu nomeo on cytokine induction was used in the next Emu nomeo. 이들 결과는 절편 당 5 뉴클레오티드 정도로 짧은 이뮤노머가 시토킨 생성을 유도하는 데 효과적임을 나타낸다. These results indicate that an effective way to induce the short-immunometric meoga cytokine produced about 5 nucleotides per fragment.

표 22. 이뮤노머 구조 및 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중의 면역자극 활 성 Table 22. Emu immunostimulatory bow of nomeo structure and BALB / c mouse spleen cell culture castle

Figure 112004017052430-pct00026

정상적인 글씨체는 포스포로티오에이트 연결을 나타낸다. Normal font indicates a phosphorothioate connection.

Figure 112004017052430-pct00027

균등물 Equivalents

전술한 발명이 명료함과 이해를 목적으로 어느 정도 상세하게 설명되긴 하였 지만, 당업자에게는 본 명세서를 숙지함에 따라 본 발명의 범주 및 첨부되는 특허청구범위를 벗어남이 없이 외형 및 상세한 부분에 다양한 변화가 이루어질 수 있음이 분명할 것이다. Was the above-described invention doegin described somewhat in detail for purposes of clarity and understanding, but one skilled in the art that various changes in the appearance and details of without departing from the claims that category and accompanying of the invention as read the present specification this can be achieved will be evident.

Claims (36)

  1. 3' 말단, 뉴클레오시드간 연결부, 작용기화된 뉴클레오염기 또는 당에서 비-뉴클레오티드 링커에 연결된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이뮤노머로서, 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상이 접근가능한 5' 말단을 지니며, CpG, C * pG, CpG * , 및 C * pG * (여기서 C는 시티딘 또는 2'-데옥시시티딘이고, C * 은 2'-데옥시티미딘, 아라비노시티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-히드록시시티딘, 2'-데옥시- N 4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘 또는 그 밖의 비-천연 피리미딘 뉴클레오시드이고, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이고, G * 은 2'-데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2' 치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 또는 그 밖의 3-a & apos; end, the nucleoside cross connection, the nucleoside base or the ratio in per functionalized as comprising two or more oligonucleotides linked to a nucleotide linker Emu nomeo, wherein the oligonucleotide capable of either nucleotides or more accessible 5 'ends said, CpG, Gini C * pG, CpG *, and C * pG * (wherein C is cytidine or 2'-deoxycytidine and, C * is 2 & apos; deoxy-thymidine, cytidine arabinoside, 2 '- deoxy-2'-substituted arabinose cytidine, 2'-O- substituted arabinose cytidine, 2'-deoxy-5-hydroxy-cytidine, 2'-deoxy-N-alkyl 4- - cytidine, 2'-deoxy-4-thio uridine or other non-natural pyrimidine nucleoside and, G is guanosine or 2'-deoxy guanosine, G * is 2 & apos; deoxy 7-to-aza guanosine, 2'-deoxy-6-thio guanosine, arabinose guanosine, 2'-deoxy-2 'substituted-arabinoside guanosine, 2'-O- substituted-ara Vino guanosine, or other -천연 푸린 뉴클레오시드이고, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 및 포스포로디티오에이트로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오시드간 연결임을 특징으로 함)로 이루어진 군에서 선택된 면역자극성 디뉴클레오티드를 포함하는, 면역자극성 올리고뉴클레오티드인 이뮤노머. - a natural purine nucleoside, p is a phosphodiester, phosphorothioate, and phosphorothioate dithio benzoate immunostimulatory dinucleotide is selected from the group consisting of a box, characterized in that the selected nucleoside connection between) from the group consisting of containing oligonucleotide immunostimulatory oligonucleotide of Emu nomeo.
  2. 삭제 delete
  3. 제 1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드중 하나 이상이 하기 구조식 ( III )을 지님을 특징으로 하는 이뮤노머: The method of claim 1, wherein the oligonucleotide Emu nomeo characterized by the jinim to the one or more nucleotides structural formula (III):
    5'-Nn-N1-YZ-N1-Nn-3' ( III ) 5'-Nn-N1-YZ- N1-Nn-3 '(III)
    상기 식에서, Wherein
    Y는 시티딘, 2' 데옥시시티딘 아라비노시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-히드록시시티딘, 2'-데옥시- N4 -알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘 또는 그 밖의 비-천연 피리미딘 뉴클레오시드이고; Y is cytidine, 2 'deoxycytidine cytidine arabinoside, 2'-deoxy-thymidine, 2'-deoxy-2'-substituted arabinose cytidine, 2'-O- substituted arabinose City Dean, 2'-deoxy-5-hydroxy-cytidine, 2'-deoxy-N4-alkyl-cytidine, 2'-deoxy-4-thio uridine or other non-natural pyrimidine nucleoside ego;
    Z는 구아노신, 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2' 치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2' 데옥시이노신, 또는 그 밖의 비-천연 푸린 뉴클레오시드이고; Z is guanosine, 2'-deoxy guanosine, 2'-deoxy-7-de-aza guanosine, 2'-deoxy-6-thio guanosine, arabinose guanosine, 2'-deoxy -2 "substituted-arabinoside guanosine, 2'-O- substituted-arabinoside guanosine, 2 & apos; deoxy-inosine, or other non-natural purine nucleoside gt;
    N1은 각각 천연 또는 합성 뉴클레오시드, 또는 비염기성(abasic) 뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보뉴클레오시드, β-L-데옥시리보뉴클레오시드, 및 포스포디에스테르 또는 변형된 뉴클레오시드간 연결에 의해 인접한 뉴클레오시드에 3' 쪽에서 연결된 뉴클레오시드로 이루어지는 군으로부터 선택된 면역자극성 부분이며, 여기서 변형된 뉴클레오시드간 연결은 2 Å 내지 200 Å의 길이를 가지는 링커, C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜) 링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커, 글리세릴 링커, 2'-5' 뉴클레오시드간 연결, 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결로부터 선택되지만 이들에 제한되지 않고; N1 are each a natural or synthetic nucleoside or a non-basic (abasic) nucleosides, arabino nucleosides, 2'-deoxy-uridine, α- deoxyribonucleic nucleoside, β-L- deoxyribonucleic nucleoside and phosphodiester or in the nucleoside adjacent by a modified nucleoside connection between an immunostimulatory moiety selected from the group consisting of the 3 'side of the nucleoside attached, wherein the modified nucleoside connection between two the linker has a length of Å to 200 Å, C2-C18 alkyl linker, poly (ethylene glycol), the connection between the linker, 2-aminobutyl-1,3-propanediol linker, glyceryl linker, 2'-5 'nucleoside , and phosphorothioate, phosphorothioate dithio benzoate, or methyl phosphonate nucleoside selected from the connections between the seed but not limited to these;
    Nn은 각각 천연 뉴클레오시드, 또는 비염기성 뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보뉴클레오시드, 2'-O-치환된 또는 2'-치환된 리보뉴클레오시드, 및 변형된 뉴클레오시드간 연결에 의해 인접한 뉴클레오시드에 3' 쪽에서 연결된 뉴클레오시드로 이루어지는 군으로부터 선택된 면역자극성 부분이며, 변형된 뉴클레오시드간 연결은 아미노 링커, 2'-5' 뉴클레오시드간 연결, 및 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결로 이루어지는 군으로부터 선택되고; Nn are each a natural nucleoside, or a non-basic nucleosides, arabino nucleosides, 2'-deoxy-uridine, α- deoxyribonucleic nucleosides, 2'-O- substituted or 2'-substituted the ribonucleoside oxide, and the modified nucleoside is a immunostimulatory moiety selected side New in nucleoside 3 'adjacent by a seed connected between from the group consisting of nucleosides connected, the connection between the modified nucleoside is an amino linker, 2 It is selected from the "5 'nucleoside cross connection, and methyl phosphonate group consisting of a connection between the nucleoside;
    n은 0 내지 30의 수임을 특징으로 하는 이뮤노머. n is nomeo Emu characterized by ordination of 0-30.
  4. 제 1항에 있어서, 인접한 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드간 연결이 포스포로티오에이트 연결을 포함함을 특징으로 하는 이뮤노머. The method of claim 1, wherein the Emu nomeo, characterized in that it comprises the connection between the oligonucleotide phosphorothioate link between the adjacent nucleotide.
  5. 제 1항에 있어서, G * 가 2'-데옥시-7-데아자구아노신임을 특징으로 하는 이뮤노머. According to claim 1, G * is nomeo Emu characterized by the 2'-deoxy-7-aza guanosine to credentials.
  6. 제 1항에 있어서, 하기 구조식을 지님을 특징으로 하는 이뮤노머: The method of claim 1, wherein the Emu, characterized by the following structural formula jinim nomeo:
    Figure 112009045752567-pct00028
  7. 제 1항에 있어서, 이뮤노머가 유전자에 상보적인 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 이뮤노머. The method of claim 1, wherein the Emu nomeo, characterized in that it comprises one or more complementary oligonucleotide in the immunoplate meoga gene.
  8. 제 1항에 있어서, 이뮤노머가 하나 이상의 리보자임 또는 유인(decoy) 올리고뉴클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 이뮤노머. According to claim 1, wherein the immunometric meoga one or more ribozymes or incentive (decoy) oligonucleotide nomeo Emu, characterized in that it comprises a nucleotide.
  9. 제 1항에 있어서, 이뮤노머가 G4 테트라뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 Nn 부분을 포함함을 특징으로 하는 이뮤노머. The method of claim 1, wherein the Emu nomeo, characterized in that it comprises one or more Nn portion including the immunometric meoga G4 tetra nucleotide.
  10. 제 1항에 있어서, 비-천연 피리미딘이 하기 구조식 ( I )을 지님을 특징으로 하는 이뮤노머: The method of claim 1 wherein the non-Emu nomeo characterized by jinim natural pyrimidin the following structural formula (I):
    Figure 112007054061142-pct00029
    ( I ) (I)
    상기 식에서, Wherein
    D는 수소 결합 공여체이고; D is a hydrogen bond donor;
    D'은 수소, 수소 결합 공여체, 수소 결합 수용체, 친수성 기, 소수성 기, 전자 끌개기 및 전자 주개기로 이루어지고, 브롬이 제외되는 군으로부터 선택되고; D 'is selected from hydrogen, hydrogen bond donor, hydrogen bond acceptor, hydrophilic group, hydrophobic group, electron attractor group and an electron group is formed of a total solar, bromine are excluded;
    A는 수소 결합 수용체 또는 친수성 기이고; A is a hydrogen bond acceptor or a hydrophilic group;
    A'은 수소 결합 수용체, 친수성 기, 소수성 기, 전자 끌개기 및 전자 주개기로 이루어지는 군으로부터 선택되고; A 'is selected from a hydrogen bond acceptor, hydrophilic group, a hydrophobic group, an electron attractor group, and the group consisting of electron Total Solar;
    X는 탄소 또는 질소이고; X is carbon or nitrogen;
    S'은 펜토스 또는 헥소스 당 고리, 또는 비-천연 당이다. S 'is a pentose or cyclohexyl ring, or a non-sugar source - a natural sugar.
  11. 제 10항에 있어서, 당 고리가 포스페이트 부분, 변형된 포스페이트 부분, 또는 피리미딘 뉴클레오시드를 또 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체에 연결시키기 위한 그 밖의 비-뉴클레오티드 링커 부분으로 유도체화됨을 특징으로 하는 이뮤노머. The method of claim 10, wherein the sugar ring is Other non for connecting a phosphate portion, a modified phosphate portions, or pyrimidine nucleoside to another nucleoside or nucleoside analog - characterized in that the derivatization of the oligonucleotide linker moiety Emu nomeo of.
  12. 제 10항에 있어서, 수소 결합 공여체가 -NH-, -NH 2 , -SH 및 -OH로 이루어지는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 이뮤노머. 11. The method of claim 10, characterized in that the Emu nomeo that hydrogen bond donor -NH-, -NH 2, selected from the group consisting of -SH and -OH.
  13. 제 10항에 있어서, 수소 결합 수용체가 C=O, C=S, 및 방향족 헤테로사이클의 고리 질소 원자로 이루어지는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 이뮤노머. 11. The method of claim 10, wherein the hydrogen bond acceptor C = O, C = S, and Emu nomeo as claimed selected from the group consisting of ring nitrogen atoms of an aromatic heterocycle.
  14. 제 10항에 있어서, 비-천연 피리미딘 염기가 5-히드록시시토신, 5-히드록시메틸시토신, N4-알킬시토신, N4-에틸시토신, 및 4-티오우라실로 이루어지는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 이뮤노머. 11. The method of claim 10 wherein the non-natural that a pyrimidine base is 5-hydroxy-cytosine, 5-hydroxymethyl cytosine, N4- alkyl cytosine, N4- ethyl-cytosine, and 4-thiouracil selected from the group consisting of which is characterized Emu nomeo.
  15. 제 10항에 있어서, 비-천연 당이 아라비노스 및 아라비노스 유사체로부터 선택됨을 특징으로 하는 이뮤노머. 11. The method of claim 10 wherein the non-arabinose and the arabinose nomeo Emu, characterized in that the selection from the North analogues of natural sugar.
  16. 제 1항에 있어서, 푸린 뉴클레오시드가 하기 구조식 ( II )을 지님을 특징으로 하는 이뮤노머: According to claim 1, characterized in that Emu the purine nucleoside is jinim the following structural formula (II) nomeo:
    Figure 112009003240787-pct00030
    ( II ) (II)
    상기 식에서, Wherein
    D는 수소 결합 공여체이고; D is a hydrogen bond donor;
    D'은 수소, 수소 결합 공여체, 및 친수성 기로 이루어지는 군으로부터 선택되고; D 'is selected from the group comprising hydrogen, hydrogen bond donor, and hydrophilic;
    A는 수소 결합 수용체 또는 친수성 기이고; A is a hydrogen bond acceptor or a hydrophilic group;
    X는 탄소 또는 질소이고; X is carbon or nitrogen;
    각각의 L은 독립적으로 C, O, N, 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되고; Each L is independently selected from the group consisting of C, O, N, and S;
    S'은 펜토스 또는 헥소스 당 고리, 또는 비-천연 당이다. S 'is a pentose or cyclohexyl ring, or a non-sugar source - a natural sugar.
  17. 제 16항에 있어서, 당 고리가 포스페이트 부분, 변형된 포스페이트 부분, 또는 피리미딘 뉴클레오시드를 또 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체에 연결시키기 위한 그 밖의 링커 부분으로 유도체화됨을 특징으로 하는 이뮤노머. 17. The method of claim 16, Emu to the other characterized in that the derivatization with a linker moiety for sugar to the ring is connected to a phosphate portion, a modified phosphate portions, or pyrimidine nucleoside to another nucleoside or nucleoside analog nomeo.
  18. 제 16항에 있어서, 수소 결합 공여체가 -NH-, -NH 2 , -SH 및 -OH로 이루어지는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 이뮤노머. 17. The method of claim 16, wherein the hydrogen bond donor, -NH-, -NH 2, -SH and nomeo Emu, characterized in that the member selected from the group consisting of -OH.
  19. 제 16항에 있어서, 수소 결합 수용체가 C=O, C=S, -N= 및 방향족 헤테로사이클의 고리 질소 원자로 이루어지는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 이뮤노머. 17. The method of claim 16, wherein the hydrogen bond acceptor C = O, C = S, -N =, and Emu nomeo, characterized in that the ring selected from the group consisting of a nitrogen atom of an aromatic heterocycle.
  20. 제 16항에 있어서, 비-천연 푸린이 6-티오구아닌 또는 7-데아자구아닌임을 특징으로 하는 이뮤노머. 17. The method of claim 16 wherein the non-nomeo Emu characterized in that the natural purine is 6-thioguanine or 7-to-aza guanine.
  21. 제 1항에 있어서, 비-뉴클레오티드 링커가 2 Å 내지 200 Å의 길이를 가지는 링커, 금속, 가용성 또는 불용성 생분해성 중합체 비드, 올리고뉴클레오티드의 3'-말단 뉴클레오시드에 부착되는 것을 가능하게 하는 작용기를 지닌 유기 부분, 생체 분자, 고리형 또는 비고리형 작은 분자, 지방족 또는 방향족 탄화수소, 아미노산, 탄수화물, 시클로덱스트린, 아다만탄, 콜레스테롤, 합텐, 항생물질, 글리세롤, 또는 화학식 HO-(CH 2 ) o -CH(OH)-(CH 2 ) p -OH의 글리세롤 유사체 (o 및 p는 독립적으로 1 내지 6의 정수임), 및 1,3-디아미노-2-히드록시프로판의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 상기 지방족 또는 방향족 탄화수소중 어느 하나는 올리고뉴클레오티드를 연결시키거나 올리고뉴클레오티드에 부착되는 선형 사슬에 히드록시, 아미노, 티올, 티오에테르, The method of claim 1 wherein the non-functional groups which enable a nucleotide linker attached to a linker, a metal, soluble or insoluble biodegradable polymer bead, oligonucleotide 3'-end nucleosides of the oligonucleotide has a length of 2 Å to about 200 Å the organic portion with, biomolecule, cyclic or acyclic small molecule, an aliphatic or aromatic hydrocarbons, amino acids, carbohydrates, cyclodextrins, adamantane, cholesterol, haptens, antibiotics, glycerol, or the general formula HO- (CH 2) o -CH (OH) - (CH 2 ) glycerol analogs of p -OH (o and p are independently an integer of 1 to 6), and 1, 3 selected from the group consisting of diamino-2-hydroxy-propane derivative and, any of the aliphatic or aromatic hydrocarbon is raised to connect a nucleotide or oligonucleotide in a linear chain that is attached to a nucleotide hydroxy, amino, thiol, thioether, 테르, 아미드, 티오아미드, 에스테르, 우레아, 및 티오우레아로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용기를 포함할 수 있음을 특징으로 하는 이뮤노머. Termini, amide, thioamide, nomeo Emu, characterized in that it is possible to include one or more functional groups selected from ester, urea, and the group consisting of thiourea.
  22. 제 1항에 있어서, 뉴클레오시드간 연결이 필수적으로 포스포디에스테르 연결로 구성됨을 특징으로 하는 이뮤노머. According to claim 1, characterized in that the Emu nomeo between nucleosides connect the essentially consisting of a phosphodiester connection.
  23. 제 1항에 따른 이뮤노머 및 접근가능한 5' 말단 이외의 위치에서 이뮤노머에 컨쥬게이션되는 항원을 포함하는 이뮤노머 컨쥬게이트. The Emu nomeo conjugate comprising an antigen that is conjugated to the Emu nomeo at a position other than the Emu nomeo and an accessible 5 'end according to one of the preceding claims.
  24. 제 1항에 있어서, C * 가 아라비노시토신 또는 2'-데옥시-2-치환된 아라비노시토신이고, G * 가 아라비노구아노신 또는 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노구아노신, 2'-데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 또는 2'-데옥시이노신임을 특징으로 하는 이뮤노머. According to claim 1, * C is cytosine arabinose or 2'-deoxy-2-substituted the cytosine arabinoside, G * is arabinose guanosine or 2'-deoxy-2'-substituted arabinose guano Shin, 2'-deoxy-7-de-aza guanosine, 2'-deoxy-6-thio guanosine or 2'nomeo Emu characterized oxy Ino credentials.
  25. 제 1항에 따른 이뮤노머 및 생리적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제형. The pharmaceutical formulations comprising the Emu acceptable carrier and physiological nomeo according to one of the preceding claims.
  26. 제 1항에 있어서, 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 연결을 포함함을 특징으로 하는 이뮤노머. According to claim 1, wherein the cross-nucleosides connected nomeo Emu, characterized in that it comprises a phosphorothioate connection.
  27. 제 1항에 있어서, 뉴클레오시드간 연결이 필수적으로 포스포로티오에이트 연결로 구성됨을 특징으로 하는 이뮤노머. According to claim 1, wherein the cross-nucleosides connected essentially phosphorothioate nomeo Emu, characterized by consisting of a benzoate connection.
  28. 제 25항에 있어서, 백신을 추가로 포함함을 특징으로 하는 약제학적 조성물. The method of claim 25, wherein the pharmaceutical composition characterized in that it further comprises a vaccine.
  29. 제 6항에 따른 이뮤노머 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제형. A pharmaceutical formulation comprising a acceptable carrier and Emu nomeo physiologically according to claim 6.
  30. 제 23항에 따른 이뮤노머 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제형. A pharmaceutical formulation comprising a acceptable carrier and Emu nomeo physiologically according to claim 23.
  31. 제 1항에 있어서, 상기 뉴클레오시드 연결부가 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것을 특징으로 하는 이뮤노머. The method of claim 1, wherein the Emu nomeo, characterized in that the connecting portion comprises a nucleoside phosphorothioate connection.
  32. 제 1항에 있어서, 상기 뉴클레오시드 연결부가 포스포로티오에이트 연결로 이루어짐을 특징으로 하는 이뮤노머. According to claim 1, characterized in that the Emu nomeo to the connecting portion made of an a nucleoside phosphorothioate connection.
  33. 제 1항에 따른 이뮤노머를 필수 성분으로 포함하는 면역자극제. The immune stimulant comprising as the Emu nomeo essential component according to one of the preceding claims.
  34. 제 1항에 따른 이뮤노머를 필수 성분으로 포함하는 애주번트(adjuvant). The adjuvant comprising a nomeo Emu essential component according to claim 1 (adjuvant).
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