KR100754051B1

KR100754051B1 - 분획된 대두 단백질 및 그 제조법

Info

Publication number: KR100754051B1
Application number: KR1020037004643A
Authority: KR
Inventors: 이시카와마사히로; 고노미츠타카; 나가오야스에; 히로츠카모토히코
Original assignee: 후지 세이유 가부시키가이샤
Priority date: 2000-10-02
Filing date: 2001-09-28
Publication date: 2007-08-31
Also published as: DE60138201D1; JP4453253B2; US20040028799A1; KR20030038783A; EP1323353B1; WO2002028198A1; EP1323353A1; EP1323353A4; CN1237890C; AU2001292291B2; AU9229101A; CN1466420A; JPWO2002028198A1; US7226633B2

Abstract

대두 단백질을 함유한 용액을 약산성 조건하에서 가온한 후, pH 5.6∼6.6에서 가용성 획분과 불용성 획분으로 효율적이고도 공업적으로 분획할 수 있는, 대두 단백질의 고순도 7S 글로불린 및 11S 글로불린으로의 분획방법을 제공한다.

필요에 따라서는, 제조방법에 있어서 피타아제에 의한 처리를 채용하여 7S 글로불린과 11S 글로불린으로 분획할 수도 있다.

Description

분획된 대두 단백질 및 그 제조법 {FRACTIONATED SOYBEAN PROTEIN AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME}

본 발명은 대두 단백질을 함유하는 용액으로부터 7S 글로불린이 풍부한 획분(劃分)과 11S 글로불린이 풍부한 획분을 제조하는 방법에 관한 것이다.

대두의 저장 단백질은, pH 4.5 부근에서 침전하는데, 비교적 간단히 단백질 이외의 성분과 단백질 성분으로 분리할 수 있다. 이 저장 단백질은 대두 분리 단백질로 불리우며, 식품공업에 있어서의 이용은 많이 이러한 형태로 된다. 단백질은 또한 초원심 분석에 의한 침강 상수(常數)로부터, 2S, 7S, 11S, 15S의 각 글로불린으로 분류된다. 이 중에서, 7S 글로불린과 11S 글로불린은 글로불린 획분의 주요한 구성 단백질 성분 [주: 7S 글로불린, 11S 글로불린은 침강법에 의한 분류명이며, 면역학적 명명법에서 말하는 β-콩글리시닌(conglycinin), 글리시닌에 실질적으로 상당함.]이며, 이 양자는 점성, 응고성, 계면활성 등에 있어서 다른 성질을 가진다. 따라서, 대두 단백질을 7S 글로불린이 풍부한 구분과 11S 글로불린이 풍부한 구분으로 분획(分劃)함으로써 이들 두가지 단백질의 성질을 이용하는 것이 가능해 져서, 산업에 있어서의 단백질 이용 분야의 확대를 기대할 수 있다.

7S 글로불린과 11S 글로불린은 몇개의 서브 유닛(subunit)으로 되어있고, 7S 글로불린은 α, α' 및 β의 세종류의 서브 유닛, llS 글로불린은 산성 폴리펩티드 (A)와 염기성 폴리펩티드 (B)를 한 쌍으로 한 몇 종류의 서브 유닛으로 되어 있다. 그 존재 비율은, 전형적으로는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 얻어진 패턴의 덴시토메트리(densitometry)에 의한 면적비로서 7S 글로불린:11S 글로불린이 약 1:2이다. 7S 글로불린과 11S 글로불린의 성질은, 분자량과 하전(荷電)의 상태도 서로간에 극히 유사하다. 특히, 이들 두가지 글로불린은 여러가지 서브 유닛의 조합에 의해 다양성을 가진 단백질이고, 이들의 성질은 어느 정도 폭이 있어 서로 오버 랩되어 있다. 따라서, 양자의 상호의 혼입이 없는 유효한 분리를 하는 것은 용이하지 않다.

종래부터 알려져 있는 분획법을 아래에서 설명한다. 즉,

(1) 등전점의 차이를 이용하는 것: 추출을 11S 글로불린의 등전점 근방의 pH에서 하여 7S 글로불린만을 추출시키는 방법 (일본국 특개소55-124557호 공보);

(2) 칼슘과의 반응성의 차이를 이용하는 것: 추출시에 소량의 칼슘염을 첨가하여 7S 글로불린이 풍부한 획분을 추출시키는 방법 (일본국 특개소48-56843호 공보);

(3) 어떤 pH 및 이온 강도에서의 용해성의 차이를 이용하는 방법: pH l.2∼4.0의 염화 나트륨 또는 염화 칼륨 존재하에서 불용성 부분을 제거하여 7S 글로불린을 제조하는 방법 (일본국 특개소49-31843호 공보);

(4) 등전점 침전한 슬러리를 pH 5.0∼5.6으로 조정하고, 또한 염화 나트륨 농도를 0.01∼0.2M의 몰 농도로 조정하여 7S 및 11S 획분을 분리하는 방법 (일본국 특개소58-36345호 공보); 및

(5) 냉침(冷沈) 현상(cryoprecipitation)과 환원제 등을 이용하는 방법: 11S 글로불린이 저온하에서는 용해성이 저하하는 현상 (냉침 현상이라고 부른다)을 이용한 방법으로서, 대두 단백질 원료를 아황산 화합물, 글루타티온 화합물 또는 시스테인 화합물의 존재하에, 또한 pH 6.5 이상의 물계(水系) 존재하에 처리하고, pH 5.5 ∼ 7.0 및 20℃ 이하의 범위로 조정해서 7S 글로불린이 풍부한 가용성 획분과 11S 글로불린이 풍부한 불용성 획분으로 분획하는 방법 (일본국 특개소61-187755호 공보).

이들 종래에 알려져 있는 분획방법은, 어떠한 pH, 이온 강도, 어떤 종류의 염의 존재, 어떠한 온도 등에 있어서 7S 글로불린과 11S 글로불린의 용해성의 차이를 유리하게 이용한 기술이지만, 어느 정도 명확한 분획을 나타낼 수 있더라도 실험실적 방법의 영역을 면할 수 없어 공업적인 분획법으로서는 부적당하다는 문제점이 있어 실용면에서 문제를 남기고 있었다. 예를 들면, 일본국 특개소61-187755호 공보의 방법에서는, 냉침 현상은 온도에 강하게 의존하므로 5℃ 정도까지 냉각할 필요가 있고, 공업적으로 채용되는 낮은 원심력으로 분리하기 위해서는 대량의 아황산 화합물 등의 첨가를 필요로 한다고 하는 실용면에서의 문제와, 가용성 획분속으로의 11S 글로불린의 혼입이 적지 않게 있다는 분획 정밀도면에서의 문제를 남기고 있었다.

7S 글로불린이 풍부한 단백질을 얻기 위해서는, 육종(育種)에 의한 11S 글로불린 결손 대두, 즉 7S 글로불린이 풍부한 종자(Breeding Science, 46, 11, 1996)로부터 단백질을 분리하는 것이 검토되어, 그것을 응용한 보고(Breeding Science, 50, 101, 2,000)나 특허(US 6,171,640 Bl)도 발표되어 있다.

이상과 같이, 가용성 및 불용성 각 획분에 대한 서로의 혼입율이 적고, 또한 간편하게 효율적으로 공업규모에서의 제조를 할 수 있는 7S 글로불린이 풍부한 획분과 11S 글로불린이 풍부한 획분의 분획법의 개발 연구가 수행되고 있다.

한편, 대두 유래의 단백질에는, 세포막을 비롯하여 프로틴 보디(protein body) 혹은 오일 보디(oil body) 등의 막(membrane)을 구성하는 극성 지질과의 친화력이 높은 단백질[지질 회합(會合) 단백질; oil-body-associated proteins]이 존재하며, 공업적으로 생산하는 분리 대두 단백질의 약 35％나 되는 많은 양으로 생산되고 있는 것이 佐本(Samoto) 등에 의해 보고되어 있다 [Biosci. Biotechnol. Biochem., 62 (5), 935-940 (1998)]. 이 지질 회합 단백질은 막(膜) 단백질을 주체로 하는 단백질군의 총칭이며, 특히 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 추정 분자량에 있어서 주로 34 kDa, 24 kDa, 18 kDa를 나타내는 단백질을 함유하고, 클로로포름:에탄올 = 2:1의 극성 혼합용매에 의해 추출되는 극성 지질을 10∼12 중량％ 정도 함유한다.

종래의 분획법은 7S와 11S에만 주목하고 있고, 각 획분에 혼재하는 지질 회합 단백질에 대해서는 고려되어 있지 않은 경우가 많았다. 그 이유로서, 지질 회합 단백질은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 분석에서는 7S나 11S 만큼 정확히 특정할 수 없고, 그 존재를 과소하게 평가하는 경우가 많았다. 바꿔 말하면, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 측정되는 순도만으로는 참된 순도를 과대하게 평가하고 있는 경우가 많아, 참으로 순도가 높은 7S나 11S를 얻기 위해서는 이 지질 회합 단백질의 거동을 고려 할 필요가 있다. 즉, 이제까지의 7S/11S의 두획분으로의 분획은 7S와 11S의 비율에 의해서만 분획품의 순도를 논의하고 있는 경우가 많았다. 그러나 각 획분에는 지질 회합 단백질을 수반하고, 실제의 단백질 조성으로서는 지질 회합 단백질을 많이 함유하는 정제 순도가 약간 낮은 조(粗)분획 품으로 되어 있는 경우가 많았다.

본 발명의 목적의 하나는, 7S 글로불린과 11S 글로불린의 신규 분획법을 제안하는 것이며, 특히 공업적 규모로 할 수 있고, 높은 정밀도로 효율이 좋은 분획법을 목적으로 한다. 그리고 다른 목적은 지질 회합 단백질의 혼입율이 적고, 순도가 높은 7S 글로불린과 11S 글로불린의 특성을 가진 단백질 획분을 얻는 것에 있다.

본 발명은 대두 단백질을 함유하는 용액을 약산성 조건하에서 가온(加溫)한 후, pH 5.6∼6.6에서 가용성 획분과 불용성 획분으로 분획하는 것을 특징으로 하는 분획 대두 단백질의 제조법이다. 상기 약산성 조건은 pH 3.8∼6.8이 바람직하고, 가온하는 온도는 30∼75℃가 바람직하다. 결과적으로, 7S 글로불린이 풍부하고 지질 회합 단백질이 적은 가용성 획분을 얻을 수 있다. 그리고 이렇게 함으로써 11S 글로불린 및 지질 회합 단백질이 풍부한 불용성 획분이 생성하는데, 이 불용성의 획분의 11S 글로불린을 거의 중성의 수용액중에서 추출함으로써, 지질 회합 단백질을 불용화시킨채로 11S 글로불린만을 용해시켜 분리하는 것이 가능하여, 11S 글로불린이 풍부하고 지질 회합 단백질이 적은 획분을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은 제조공정 중에서 피타아제에 의한 피틴산 분해를 실시함으로써 분리 공정에서의 분리 정밀도를 향상시킴과 아울러 저(低)피틴산 함량의 고순도 7S 글로불린 대두 단백질이나 고순도 11S 글로불린 대두 단백질을 얻을 수 있다.

상기 제조법에 의해 얻어진 가용성 획분은 7S 글로불린/(11S 글로불린 + 7S 글로불린)의 비가 0.4 이상인데, 조건을 적당히 선택함으로써 이 비를 0.8 이상, 0.85 이상, 혹은 0.9 이상으로 증가시킨 고순도 단백질을 용이하게 얻을 수 있다. 또한 이 가용성 획분은 11S 글로불린의 함량이 적거나 7S 글로불린 이외의 단백질의 함량이 적은, 특히 지질 회합 단백질이 전체 단백질 고형분당 10％ 이하인 대두 단백질인데, 보다 정확한 의미에서의 고순도 7S 글로불린을 얻을 수 있다. 또 하나의 획분인 불용성 획분은, 11S 글로불린/(11S 글로불린 + 7S 글로불린)의 비가 0.7 이상인 획분이며, 조건을 적당히 선택함으로써 이 비가 0.8 이상, 0.85 이상, 혹은 0.9 이상인 고순도 단백질을 용이하게 얻을 수 있다.

여기서, 7S 글로불린이나 11S 글로불린의 상대적인 량은, (아래에서 설명하는 보정 순도의 경우를 제외하고) SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 얻어진 영동 패턴을 덴시토메타(densitometer)로 측정하고, 이 획분의 면적비로 나타낸다.

또한, 상기 지질 회합 단백질은, 대부분 변성해 있지 않은 산(酸)침전 글로불린으로부터 황산 나트륨을 사용해서 정밀하게 얻으면 산침전 글로불린 중에 30∼35％ 정도 존재하고 [상기 Biosci. Biotechnol. Biochem., 62 (5), 935-940 (1998)], 또한 클로로포름/메탄올 = 2:1 (용량비)로 추출되는 극성 지질이 상기 산침전 글로불린 고형물 중에는 3∼4 중량％가 존재하며, 다른 한편으로는 지질 회합 단백질 중에는 10∼12％ 존재하는 사실로부터, 상기 극성 지질 [이하, 간단히 "클로로포름-메탄올 추출 유분(油分)으로 할 경우가 있음]은 산침전 글로불린 중에서도 지질 회합 단백질 중에 우세하게 존재하며, 클로로포름-메탄올 추출 유분의 10 중량배가 지질 회합 단백질인 것으로 환산할 수 있다. 그러나 이 환산은 지질 회합 단백질이 헥산 등에 의한 탈지의 공정을 거친 대상에 적용할 수 있고, 헥산 추출의 공정을 거치지 않고 있는 대상일 경우에는 헥산으로 미리 탈지한 후에 적용할 수 있다. 7S 글로불린이 풍부한 상기 가용성 획분은, 본 발명에 의하면 클로로포름-메탄올 추출 유분이 1％ 이하이며, 환산하면 지질 회합 단백질은 10％ 이하이다.

또 한편의 불용성 획분은 11S 글로불린/(11S 글로불린 + 7S 글로불린)의 비가 0.7 이상인데, 이 불용성의 획분에 함유된 11S 글로불린을 거의 중성 (pH 6.5∼8.5)의 수용액 중에서 추출함으로써, 지질 회합 단백질을 불용화시킨 채로 11S 글로불린만을 용해시켜 분리하는 것이 가능하고, 11S 글로불린이 풍부하고 [11S 글로불린/(11S 글로불린 + 7S 글로불린)의 비가 0.7 이상], 지질 회합 단백질이 적은 획분은 지질 회합 단백질이 전체 단백질에 대해 20％ 이하, 즉 클로로포름:메탄올 = 2:1에서 추출되는 극성 지질이 2% 이하인 대두 단백질 획분이 된다.

또한, 이들 두가지 획분은 피타아제에 의한 피틴산 분해에 의해 얻게 되는, 단백질당 1.2％ 이하의 저(低)휘틴의 단백질 획분을 얻을 수 있다. 분획효율을 올리기 위한 피타아제의 처리 시기는 분획 전의 어느 공정에서 해도 좋다.

도 1은 pH 4.8 및 60℃에서의 가온 처리에 의해 얻게 되는 가용성 획분 및 불용성 획분의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 패턴이다.

도 2는 가용성 획분으로부터 얻은 7S 글로불린이 풍부한 단백질의 용해특성을 나타내는 도면이다.

도 3은 불용성 획분으로부터 얻은 11S 글로불린이 풍부한 획분의 용해특성을 나타내는 도면이다.

[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]

본 발명에 사용한 분석 방법을 아래에 기재한다.

＊ 조(粗)단백질(crude protein): 케엘다알법(Kjeldahl method)에 근거하여 질소함량을 구하고, 계수 6.25를 곱해서 조단백질로 환산하였다.

＊ SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동: Laemmli [Nature, 227, 680 (1970)]의 방법에 근거하여 겔 농도 10∼20％의 그래디언트 겔로써 분석하였다. 샘플 사용량은 10 ㎍으로 하였다.

＊ 피틴산: Alii Mohamed의 방법 (Cereal Chemistry 63, 475-478, 1986)에 준거해서 측정하였다.

＊ 클로로포름-메탄올 추출 유분(油分): 건조된 시료에 대하여 클로로포름과 메탄올의 혼합액 (용량비, 2:1)을 약 50배 가하고, 환류 추출되는 고형분의 중량비를 클로로포름-메탄올 추출 유분으로서 측정하였다.

＊ 순도 (SPE 기준): 상기의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 얻어진 영동 패턴을 덴시토메터(densitometer)로써 측정하고, 그 전체에 대한 해당 획분의 면적 비율(%)을 순도 (SPE 기준)로 하였다. 여기서, 7S 글로불린 함량은 α, α' 및 β 서브 유닛의 총량을 가리키고, 11S 글로불린 함량은 산성 폴리펩티드 (A)와 염기성 폴리펩티드 (B)의 총량을 가리킨다.

＊ 보정 순도: 위에서 얻어진 순도 (SPE 기준)로부터, 혼재하는 지질 회합 단백질의 량도 고려한 보정 순도를 아래와 같이 산출하였다. 즉, 시료의 순도(SPE 기준)의 값을 A％로 하고, 이 시료 중에는 7S 글로불린 및 11S 글로불린 이외에 클로로포름-메탄올 추출 유분의 10 중량배에 상당하는 지질 회합 단백질도 존재하므로, 7S 글로불린 및 11S 글로불린에 지질 회합 단백질의 양을 포함한 합계 단백질에 대한 순도로서 산출한다.

보정 순도(％）＝[100(％) - 클로로포름-메탄올 추출 유분(％)×10]×A(％)/100

아래에 본 발명의 바람직한 실시의 형태를 기재한다.

본 발명에서 사용하는 원료 대두는 시판의 대두 또는 육종이나 유전자 조작 등에 의해 특정한 획분이 결손한 대두 중의 어느 것이라도 사용 가능하다.

또한 대두 단백질을 함유하는 용액은, 대두의 가수(加水) 슬러리 혹은 이 슬러리로부터 얻게되는 두유이어도 좋은데, 탈지 대두의 가수 슬러리, 이 슬러리로부터 얻게 되는 탈지 두유, 산침전 대두 단백질 슬러리 또는 분리 대두 단백질 용액이 보다 바람직하다.

본 발명의 실시에 있어서, 7S 글로불린이 풍부한 획분과 11S 글로불린이 풍부한 획분으로 분획하기 위해서는, 미변성 혹은 저변성 대두 단백질 용액이 바람직 하다. 대두 단백질 용액을 pH 3.8∼6.8, 바람직하게는 pH 4.0∼6.6, 보다 바람직하게는 pH 4.2∼6.2의 약산성 조건하에서 30∼75℃, 바람직하게는 35∼65℃, 더욱 바람직하게는 40∼60℃의 가온 처리한 후, pH 5.6∼6.6, 바람직하게는 pH 5.6∼6.4로 조정하면 7S 글로불린이 풍부한 가용성 획분과 11S 글로불린이 풍부한 불용성 획분의 분리가 용이해진다. 그리고 제조 공정중, 특히 가용성 획분과 불용성 획분을 분획할 때까지의 어느 공정에서, 대두 단백질과 공존하는 피틴산을 피타아제로써 분해함으로써 7S 글로불린이 풍부한 획분과 11S 글로불린이 풍부한 획분의 분리가 한층 용이해진다. 피타아제 처리는 가온 처리와 동시에 하면 간편하다. 처리 조건은 기원에 따라 다소 다른지만, 보통 pH 3.5∼9.0, 온도 20∼70℃, 5분간∼3시간, 단백질 중량(g)당 0.1∼100 unit 정도의 농도로 하여 피타아제를 작용시키는 것이 적당하다. 그리고 1 unit의 피타아제 활성은 pH 5.5, 37℃에서 반응 초기의 1분간에 피틴산으로부터 1 μ몰의 인산을 유리하는 효소량을 나타낸다.

상기 가온 처리를 위한 가온 유지 시간의 장단, 환원제 첨가의 유무는 가온 처리의 pH 및 온도와는 달리 분리의 난이에 그다지 크게 영향을 주지 않아 그다지 중요하지 않다. 가온 처리시의 pH가 3.8∼6.8의 범위 밖, 또는 온도가 30℃∼75℃의 범위 밖이면 7S 글로불린과 11S 글로불린의 분리가 어렵게 된다. 또한, 분리시의 pH가 5.6 미만에서는 불용성 획분에의 7S 글로불린의 혼입이 많아지고, 역으로 pH가 6.6을 넘으면 가용성 획분에의 11S 글로불린의 혼입이 많아져서 바람직하지 않다.

가온 처리후, 미생물 관리상 냉각하는 쪽이 바람직하지만, 그대로의 온도에서 분획을 실시해도 좋다. 분획의 수단은 공지의 분리 수단 (여과 분리, 원심분리 등)을 이용할 수 있고, 특히 연속식 원심분리기 [예를 들면 디캔터(decanter)] 등을 이용해도 용이하게 분리할 수 있다. 물론 뱃치(batch)식 등의 비연속식 원심분리기를 사용해도 좋다.

본 발명에 의한 가용성 획분인 7S 글로불린이 풍부한 획분과 불용성 획분인 11S 글로불린이 풍부한 획분의 분획상태는, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 얻어진 패턴으로 평가할 수 있다 [순도(SPE 기준)].

그러나 SPE 기준의 순도에서는, 지질 회합 단백질이 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서의 염색성이 낮기 때문에 과소하게 평가되므로, 상기 보정 순도(％）＝[100(％）－ 클로로포름-메탄올 추출 유분(％)×10]×A(％)/100의 식을 이용한 순도 보정의 값쪽이 보다 진정한 순도에 가까운 값이라 생각된다.

분리후의 가용성 획분은, 이대로, 혹은 농축하거나, 중화하거나, 살균하거나, 혹은 건조하여 7S 글로불린이 풍부한 획분으로 해서 사용할 수 있다. 농축하는 수단으로서는, 가용성 획분을 등전점 부근의 pH (pH 4.5∼5.3, 바람직하게는 pH 4.7∼5.1)로 이행시켜서 생기는 침전 커어드(curd)를 분리 회수하는 방법을 예시할 수 있고, 그 후 중화, 가열살균 처리하고, 건조하는 형태가 가장 통상적이다. 가열살균 처리는 공지의 HTST(High Temperature Short Time), UHT(Ultra High Temperature) 처리 등으로 할 수 있다. 목적에 따라, 용액상태에서 프로테아제 등을 이용한 효소처리를 하는 것도 물론 가능하다.

또한 분리후의 불용성 획분으로부터는 거의 중성 (대체로 pH 6.5∼8.5)의 수용액을 사용해서 11S 글로불린 성분을 추출하여 불용성의 지질 회합 단백질과 (불용성 획분이 비지 성분을 함유할 경우는 비지 성분도) 분리할 수 있다. 이 때, 약 4,000G 이상의, 바람직하게는 약 5,000G 이상의 높은 G 원심분리에 의해 처리하는 것이 11S 글로불린과 지질 회합 단백질의 분리에 적합하고, 11S 글로불린/(11S 글로불린 + 7S 글로불린)의 비가 10.7 이상을 유지한 채, 클로로포름-메탄올 추출 유분(油分)이 고형물 중 2％ 이하로 저하한 단백질을 얻을 수 있다.

얻어진 11S 글로불린을 함유한 액은, 이대로, 혹은 농축하거나, 중화하거나, 건조하여 11S 글로불린이 풍부한 대두 단백질로서 사용할 수 있다. 농축수단으로서 가용성 획분을 등전점 침전 (pH 4.5∼5.8, 바람직하게는 pH 4.7∼5.5)시켜서 침전커어드를 분리 회수하는 방법은 물성을 향상하는 점에서 바람직하고, 또한 등전점 침전 후에 중화, 가열살균 처리하고, 혹은 다시 프로테아제 등을 이용한 효소처리할 수도 있다. 살균, 건조한 형태가 가장 통상적이다. 가열살균 처리는 공지의 HTST(High Temperature Short Time), UHT(Ultra High Temperature) 처리 등으로 할 수 있다.

이하 실시예에 의해 본 발명의 실시 형태를 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예에 의해 그 기술범위가 한정되는 것이 아니다.

실시예 1

대두를 파쇄하고, n -헥산을 추출 용매로 하여 기름을 추출 분리 제거하여 얻어진 저(低)변성 탈지 대두 [질소 가용(可溶) 지수(NSI): 91] 1 중량부에 10 중량부의 추출용 물을 가하고, 실온 및 pH 7.0에서 1시간 추출후 원심분리하여 탈지 두유를 얻었다. 이 탈지 두유를 염산을 사용해서 pH 3.6∼7.0의 범위로 조정하고, 비가열 또는 80℃ 이하의 범위에서 가열을 하였다. pH 조정한 탈지 두유가 소정의 온도에 달한 후, 즉시 30℃ 부근까지 냉각하고, pH 5.8로 조정하여 뱃치식 원심분리기 (3,000G)에서 7S 글로불린을 함유하는 가용성 획분과 11S 글로불린을 함유하는 불용성 획분을 원심분리하였다. 또한, 이 원심분리시의 각 용액의 온도는 25℃ 부근이었다. 상기 pH 및 가열의 범위에 있어서의 두유의 가용성 획분과 불용성 획분의 분리 상태를 관찰한 결과, pH 3.8∼6.8, 바람직하게는 pH 4.0∼6.6, 더욱 바람직하게는 pH 4.2∼6.2의 산성하에서, 30℃ 이상, 바람직하게는 35℃ 이상, 더욱 바람직하게 40℃ 이상의 가온 처리를 하면 가용성 획분과 불용성 획분은 명확한 분리를 하였다. 그러나 원심분리후의 가용성 획분과 불용성 획분의 단백질 조성을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 평가한 결과, 70℃에서 가온 처리를 하면 불용성 획분에 7S 글로불린이 혼입하기 시작하고, 80℃ 이상의 가온 처리에서는 거의 모든 7S 글로불린이 불용성 획분에 함유되어 있는 것이 관찰되어, 7S 글로불린과 11S 글로불린을 분획할 수 없었다.

이들 결과로부터, pH 3.8∼6.8, 바람직하게는 pH 4.0∼6.6, 더욱 바람직하게는 pH 4.2∼6.2의 산성하에서, 30∼75℃, 바람직하게는 35∼65℃, 더욱 바람직하게 40∼60℃의 가온 처리를 한 후에 pH 5.8에서 원심분리함으로써, 7S 글로불린을 함유하는 가용성 획분과 11S 글로불린을 함유하는 불용성 획분을 간편하게 분리할 수 있는 것을 알았다.

도 1은, 상기 가온 처리 조건 중에서 pH 4.8에 있어서의 60℃ 가온 처리에 의해 얻어진 가용성 획분과 불용성 획분의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 패턴이다.

상기 분리후의 가용성 획분과 불용성 획분의 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비 (SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의한 영동 패턴을 덴시토메터로써 측정한 해당 획분의 면적비율; 이하 같다) 를 표 1에 나타내었다.

표 1 (pH 4.8에 있어서 60℃ 가온 처리를 했을 경우)

가용성 획분 불용성 획분

7S:11S 95:5 7:93

또한, 얻어진 가용성 획분 및 불용성 획분의 각 고형분 중에서의 클로로포름-메탄올 추출 유분은 각각 0.9％ 및 3.2％이어서, 불용성 획분에의 지질 회합 단백질의 농축이 확인되었다.

실시예 2

실시예 1과 마찬가지로 탈지한 저변성 탈지 대두 1 중량부에 10 중량부의 추출용 물을 가하고, 실온∼80℃, pH 3.6∼7.2의 범위에서 30분간 추출하여 슬러리를 얻었다. 이 추출 슬러리를 실온 부근까지 냉각한 후, 염산 혹은 가성 소오다를 사용해서 pH 5.8로 조정하고, 뱃치식 원심분리기 (3,000G)에서 7S 글로불린을 함유하는 가용성 획분과 11S 글로불린을 함유하는 불용성 획분을 원심분리하였다. 그리고 원심분리시의 각 용액의 온도는 25℃ 부근이었다. 상기 추출 온도, pH의 범위에 있어서의 슬러리의 가용성 획분과 불용성 획분의 분리 상태를 관찰한 결과, pH 3.8∼6.8, 바람직하게는 pH 4.0∼6.6, 더욱 바람직하게는 pH 4.2∼6.2의 산성하에서 30℃ 이상, 바람직하게는 35℃ 이상, 더욱 바람직하게는 40℃ 이상의 가온 처리를 하면 가용성 획분과 불용성 획분은 명확한 분리를 하였다. 그러나 원심분리후의 가용성 획분과 불용성 획분의 단백질 조성을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 확인한 결과, 70℃에서 가온 처리를 하면 불용성 획분에 7S 글로불린이 혼입하기 시작하고, 80℃ 이상의 가온 처리에서는 거의 모든 7S 글로불린이 불용성 획분에 함유되어 있는 것이 확인되어, 7S 글로불린과 11S 글로불린을 분획할 수 없었다.

이들 결과로부터, pH 3.8∼6.8, 바람직하게는 pH 4.0∼6.6, 더욱 바람직하게는 pH 4.2∼6.2의 산성하에서 30∼75℃, 바람직하게는 35∼65℃, 더욱 바람직하게는 40∼60℃의 추출 처리를 한 후에, pH 5.8에서 원심분리함으로써 7S 글로불린을 함유하는 가용성 획분과 11S 글로불린을 함유하는 불용성 획분을 간편하게 분리할 수 있음이 확인되었다.

pH 5.3에서 40℃의 추출 처리 후에 얻어진 가용성 획분과 불용성 획분의 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비를 실시예 1의 방법으로 산출하여 표 2에 나타내었다.

표 2 (pH 5.3에 있어서 40℃ 추출 처리를 했을 경우)

가용성 획분 불용성 획분

7S:11S 96:4 8:92

더욱이, 얻어진 가용성 획분 및 불용성 획분의 각 고형분 중에서의 클로로포름-메탄올 추출 유분은 각각 0.8% 및 3.0%이어서, 불용성 획분에의 지질 회합 단백질의 농축이 확인되었다.

이상 실시예 1 및 실시예 2의 결과로부터, 산성하의 가열 처리를 거침으로 써, 대두 단백질을 함유하는 용액으로부터 7S 글로불린을 함유한 가용성 획분과 11S 글로불린 및 지질 회합 단백질을 함유한 불용성 획분을 공업적인 낮은 원심력으로 분리하는 것이 가능함이 확인되었다.

실시예 3

실시예 1과 마찬가지로 추출한 탈지 두유를 염산으로 pH 4.8로 조정한 후, 50℃가 되도록 가온을 하였다. pH 조정한 탈지 두유가 50℃에 달한 직후, 및 50℃에서 60분간 유지한 후, 30℃ 부근까지 냉각하고, 가성 소오다로 pH 5.8로 조정하여 뱃치식 원심분리기(3,000G)에서 원심분리하였다. 이 때 유지시간의 차이에 관계없이 가용성 획분과 불용성 획분은 명확한 분리를 하였다. 또한, 이 원심분리시의 용액온도는 25℃ 부근이었다.

얻어진 가용성 획분과 불용성 획분의 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비를 실시예 1의 방법으로 산출하여 표 3 및 표 4에 나타내었다.

표 3 (50℃에서 유지시간 없음의 경우)

가용성 획분 불용성 획분

7S:11S 95:5 7:93

표 4 (50℃에서 60분간 유지했을 경우)

가용성 획분 불용성 획분

7S:11S 93:7 8:92

이들 결과로부터, 유지시간의 차이에 따른 7S 글로불린과 11S 글로불린의 상호간의 혼입은 나타나지 않아, 산성하에서의 가온 유지시간은 특히 제한되지 않음 을 알았다.

실시예 4

실시예 1과 마찬가지로 추출한 탈지 두유를 염산으로 pH 4.8 로 조정한 후, 50℃가 되도록 가온을 하였다. pH 조정한 탈지 두유가 50℃에 달한 후, 즉시 30℃ 부근까지 냉각하고, 가성 소오다로 pH 5.7 및 pH 6.0으로 조정해서 뱃치식 원심분리기(3,000G)에서 원심분리하였다. 이 때, 가용성 획분과 불용성 획분은 명확한 분리를 하였다. 또한, 이 원심분리시의 용액온도는 25℃ 부근이었다.

얻어진 가용성 획분과 불용성 획분의 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비를 실시예 1의 방법으로 산출하여 표 5 및 표 6에 나타내었다.

표 5 (pH 5.7에서 분리했을 경우)

가용성 획분 불용성 획분

7S:11S 92:8 8:92

표 6 (pH 6.0에서 분리했을 경우)

가용성 획분 불용성 획분

7S:11S 83:17 5:95

이들 결과로부터, 원심분리시의 pH, 즉, 7S 글로불린을 함유한 가용성 획분과 11S 글로불린을 함유한 불용성 획분의 분리시의 pH 에는 어느 정도의 폭이 있는 것을 알았다.

실시예 5

실시예 1과 마찬가지로 추출한 탈지 두유를 염산으로 pH 4.8로 조정한 후, 50℃가 되도록 가온을 하였다. pH 조정한 탈지 두유가 50℃에 달한 후, 즉시 30℃ 부근까지 냉각하고, 가성 소오다로 pH 5.8로 조정해서 뱃치식 원심분리기(3,000G)에서 원심분리하였다. 이 때, 가용성 획분과 불용성 획분은 명확한 분리를 하였다. 또한 이 원심분리시의 용액 온도는 25℃ 부근이었다. 얻어진 불용성 획분에 물을 가하고 (2배 중량), 가성 소오다로 pH 7.0으로 중화한 후, 높은 G의 원심분리(5,000G, 10분)에 의해 디파인(defining)을 해서 11S 글로불린이 풍부한 상청을 얻었다. 한편, 가용성 획분은 염산으로 pH 4.9로 조정한 후, 원심분리(3,000G, 5분)해서 훼이(whey)를 제거함으로써 침전 커어드(curd)를 얻었다. 침전 커어드에 물을 가하고 (4배 중량), 가성 소오다로 중화하여 7S 글로불린이 풍부한 획분을 얻었다.

각각의 획분을 140℃에서 15초간 살균하고, 이것을 분무건조해서 7S 글로불린 및 11S 글로불린이 풍부한 2종류의 분말상 분획 대두 단백질을 얻었다. 얻어진 7S 글로불린과 11S 글로불린의 성분조성을 표 7에 나타내었다.

표 7

7S 글로불린 11S 글로불린

수분 5.0％ 5.0％ 건조물 기준 97.8％ 96.8% 순도(SPE 기준) 94.8％ 92.2% 클로로포름-메탄올 추출 유분 0.8% 2.0% 피틴산 2.1％ 2.0% 보정 순도 87.2% 73.8%

이상의 결과로부터, 탈지 두유를 원료로 하여 순도가 높고, 클로로포름-메탄올 추출 유분이 적은 7S, 11S를 얻게 되는 것을 알았다.

실시예 6

실시예 1과 마찬가지로 추출한 탈지 두유를 염산으로 pH 4.5로 조정한 후, 뱃치식 원심분리기(2,000G)에서 원심분리하여 불용성 획분 [이하, "산침(酸沈) 커어드"라 함]과 가용성 획분 (훼이)을 분리하였다. 산침 커어드 (소위 분리 대두 단백질)에 물을 가하고 충분히 분산시킨 후, 50℃가 되도록 가온을 하였다. 산침 커어드 분산 용액이 50℃에 달한 후, 즉시 30℃ 부근까지 냉각하고, 가성 소오다로 pH 5.8로 조정해서 뱃치식 원심분리기 (3,000G)에서 원심분리하였다. 이 때, 가용성 획분과 불용성 획분은 명확한 분리를 하였다. 더욱이 이 원심분리시의 용액 온도는 25℃ 부근이었다. 얻어진 불용성 획분에 물을 가하고 (2배 중량), 가성 소오다로 중화하였다. 한편, 가용성 획분은 염산으로 pH 4.9 로 조정한 후, 원심분리해서 훼이를 제거하여 침전 커어드를 얻었다. 침전 커어드에 물을 가하고 (4배 중량), 가성 소오다로 중화하였다. 각각의 중화한 획분을 140℃에서 15초간 살균하고, 이것을 분무건조하여 7S 글로불린 및 11S 글로불린이 풍부한 2종류의 분획 대두 단백질을 얻었다.

상기 분리후의 가용성 획분과 불용성 획분의 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비를 실시예 1의 방법으로 산출하여 표 8에 나타내었다.

표 8

가용성 획분 불용성 획분

7S:11S 96:4 10:90

이 결과로부터, 분획에 사용하는 대두 단백질 용액으로서 산침 커어드 (분리 대두 단백질)를 사용해도 산성하에서의 가열 처리에 의해 7S 글로불린이 풍부한 가용성 획분과 11S 글로불린이 풍부한 불용성 획분을 정밀도 양호하게 분리할 수 있는 것을 알았다.

실시예 7

실시예 1과 마찬가지로 추출한 탈지 두유를 염산으로 pH 6.2로 조정한 후, 40℃가 되도록 가온을 하였다. 이 용액 [피틴산 함량 2.20％／단백질 중량: Alli Mohamed의 방법 (Cereal Chemistry 63, 475-478 (1986)에 준거해서 측정]에 단백질 중량당 8 unit 상당 (1 unit 피타아제 활성은 pH 5.5 및 37℃에서, 반응 초기의 1분간에 기질인 피틴산으로부터 1 μmol의 인산을 유리하는 효소량)의 피타아제 (노보사제 「PHYTASE NOVO L」)을 가하고 30 분간 효소반응을 하였다. 반응후 (피틴산 함량 0.05％／단백질 중량), 염산으로 pH 4.8로 조정하고, 50℃가 되도록 가온을 하였다. pH 조정한 피타아제 반응후의 용액이 50℃에 달한 후, 즉시 30℃ 부근까지 냉각하고, 가성 소오다로써 pH 6.2로 조정해서 뱃치식 원심분리기 (3,000G)에서 원심분리하였다. 이 때 가용성 획분과 불용성 획분은 명확한 분리를 하였다.

그리고 이 원심분리시의 용액온도는 25℃ 부근이었다. 얻어진 불용성 획분에 물을 가하고 (2배 중량), 가성 소오다로 중화하였다. 한편, 가용성 획분은, 염산으로 pH 4.9로 조정한 후, 원심분리해서 훼이 획분을 제거하여 침전 커어드를 얻었다. 침전 커어드에 물을 가하고 (4배 중량), 가성 소오다로 중화하였다. 각각의 중화한 획분을 140℃에서 15초 살균하고, 분무 건조하여 7S 글로불린 및 11S 글로불린이 풍부한 2종류의 분획 대두 단백질을 얻었다.

실시예 1의 방법에 근거하여 산출한 상기 분리후의 가용성 획분과 불용성 획분의 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비, 및 시료 건조 중량당의 피틴산 함량을 표 9에 나타내었다.

표 9

가용성 획분 불용성 획분

7S:11S 95:5 8:92 피틴산 0.05％ 0.05％

이 결과로부터, 피타아제에 의해 피틴산을 분해한 대두 단백질 용액을 사용하더라도 산성하에서의 가열 처리에 의해, 7S 글로불린이 풍부한 가용성 획분과 11S 글로불린이 풍부한 불용성 획분을 정밀도 양호하게 분리할 수 있는 것을 알았다.

실시예 8

실시예 1과 마찬가지로 추출한 탈지 두유를 시료 A 및 시료 B의 2가지로 나누었다. 시료 A는 염산으로 pH 4.8로 조정한 후, 50℃가 되도록 가온을 하였다. pH 조정한 탈지 두유가 50℃에 달한 후, 즉시 45℃ 부근까지 냉각하고, 가성 소오다로 pH 5.8로 조정해서 뱃치식 원심분리기(3,000G)로 원심분리하였다. 이 때, 가용성 획분과 불용성 획분은 명확히 분리하였다. 그리고 원심 분리시의 용액온도는 40℃ 부근이었다. 얻어진 가용성 획분을 40℃가 되도록 가온한 후, 이들을 시료 A-1 및 시료 A-2의 2가지로 나누고, 시료 A-1에는 단백질 중량당 8 unit 상당의 피타아제 (노보사제 「PHYTASE NOVO L」)를 가하고, 30분간 효소반응을 하였다. 반응후, 시료 A-1 및 시료 A-2의 두가지 모두를 염산으로 pH 4.9로 조정하고, 원심분리 (3,000G, 5분간)하여 훼이 획분을 제거하여 침전 커어드를 얻었다. 침전 커어드에 물을 가하고 (4배 중량), 가성 소오다로 pH 7.0으로 중화하였다. 각각의 중화한 획분을 140℃에서 15초간 살균하고, 이것을 분무건조하여, 피타아제 처리한 정제 7S 글로불린 획분과, 피타아제 처리하지 않은 정제 7S 글로불린 획분을 얻었다 (A-1, A-2).

한편, 시료 B는 pH 6.4로 조정하고, 4℃에서 하루밤 방치하여 원심분리 (5,000G, 4℃에서 10분간)해서 얻어진 상청액을 pH 4.5로 조정하여 원심분리(3,000G, 5분간)해서 얻어진 침전물을 회수해서 냉침(cryoprecipitated) 7S 글로불린으로 하였다.

이 냉침 7S 글로불린 침전물에 4배량의 물을 가하고, pH 6.0으로 조정후 시료 B-1 및 시료 B-2의 2가지로 나누었다. 시료 B-1에는 단백질 중량당 8 unit 상당의 피타아제 (노보사제 「PHYTASE NOVO L」)를 가하고 30 분간 효소반응을 하였다. 반응후, 시료 B-1 및 시료 B-2 두가지 모두를 염산으로 pH 4.9로 조정하고 원심분리 (3,000G, 5분간)하여 훼이 획분을 제거하여 침전 커어드를 얻었다. 침전 커어드에 물을 가한 후, 가성 소오다로 pH 7.0으로 중화해서 살균하고, 분무건조해서 피타아제 처리한 냉침 7S 글로불린 획분과, 피타아제 처리하지 않은 냉침 7S 글로불린 획분을 얻었다 (B-1, B-2). 각 시료의 조성을 표 10에 나타내었다.

표 10

정제 7S 글로불린 냉침 7S 글로불린 A-1 A-2 B-1 B-2

수분 4.8% 4.7% 4.7% 4.9% 조(粗)단백질 98.1% 98.0% 97.2% 97.2 순도 (SPE 기준) 97.1% 97.1% 78.2% 78.3% 클로로포름-메탄올 추출 유분 0.7% 0.7% 2.8% 2.8% 피틴산 0.06% 1.9% 0.07% 2.0% 보정 순도 90.3% 90.3% 56.3% 56.3%

단, 조단백질은 건조물 기준이다.

이상의 결과로부터, 지질 회합 단백질의 존재는 피타아제 처리의 유무에는 좌우되지 않는 것이 확인되었다. 또한, 냉침법으로 얻어지는 7S 글로불린은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 근거한 순도 (SPE 기준)에서는 80％ 가까운 값을 나타내지만, 지질 회합 단백질을 고려한 보정 순도에서는 약 60％ 정도 밖에 없는 것이 확인되어, 본 발명에 의한 7S 글로불린의 순도가 고순도인 것으로 나타났다.

실시예 9

실시예 6과 마찬가지로 조제한 산침(酸沈) 커어드에 물을 가해서 충분히 분산시킨 후, 가성 소오다로 pH 5.0으로 조정하고, 40℃가 되도록 가온을 하였다.

이 산침 커어드 분산액에, 단백질 중량당 8 unit 상당의 피타아제 (노보사제 「PHYTASE NOVO L」)을 첨가하고 30분간 효소반응을 하였다. 반응후, 즉시에 30℃ 부근까지 냉각하고, 가성 소오다로 pH 6.0로 조정해서 뱃치식 원심분리기(3,000G)에서 원심분리하였다. 이 때, 가용성 획분과 불용성 획분은 명확한 분리를 하였다. 그리고 이 원심분리시의 용액 온도는 25℃ 부근이었다. 얻어진 불용성 획분에 물을 가하고 (2배 중량), 가성 소오다로 중화하였다. 한편, 가용성 획분은 염산으로 pH 4.9로 조정한 후, 원심분리해서 훼이 획분을 제거하여 침전 커어드를 얻었다. 침전 커어드에 물을 가하고 (4배 중량), 가성 소오다로 중화하였다. 각각의 중화한 획분을 140℃에서 15초간 살균하고, 이것을 분무 건조하여, 피타아제 처리한 7S 글로불린 및 11S 글로불린이 풍부한 2종류의 분획 대두 단백질을 얻었다.

상기 분리후의 실시예 1의 방법에 근거해서 산출한 가용성 획분과 불용성 획분의 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비, 및 건조 중량당의 피틴산 함량을 표 11에 나타내었다.

표 11

가용성 획분 불용성 획분

7S:11S 94:6 7:93 피틴산 0.06％ 0.07％

실시예 10

실시예 1과 마찬가지로 탈지한 저변성 탈지 대두 1 중량부에, 10 중량부의 40℃의 추출용 물을 첨가하고, 염산으로 pH 5.3으로 조정하였다. 이 용액에 단백질 중량당 8 unit상당의 피타아제 (노보사제 「PHYTASE NOVO L」)을 가하고, 40℃에서 단백질의 추출과 효소반응을 같이 한 30분간의 처리를 하여 효소 처리한 추출 슬러리를 얻었다. 이 효소처리 추출 슬러리를 25℃ 부근까지 냉각하고, 염산으로 pH 6.1로 조정하고, 뱃치식 원심분리기(3,000G)에서 원심분리하였다. 이 때, 가용성 획분과 불용성 획분은 명확한 분리를 하였다. 또한, 이 원심분리시의 용액온도는 25℃ 부근이었다. 얻어진 불용성 획분에 물을 가하고 (탈지 대두의 7배량), 가성 소오다로 pH 7.2로 조정해서 30분간 추출을 한 후, 원심분리기에서 불용성 획분을 제거하여 11S 글로불린이 풍부한 상청을 얻었다. 또한, 상청의 일부는 높은 G의 원심분리 (5,000G, 10분)에 의해 디파인(defining)을 하여 보다 맑고 깨끗한 상청을 얻었다. 얻어진 11S 글로불린이 풍부한 상청은, 염산으로 pH 5.0로 조정하고, 원심분리해서 침전 커어드를 얻었다. 침전 커어드에 물을 가하고 (4배 중량), 가성 소오다로 중화후, 140℃에서 15초간 살균하고, 이것을 분무 건조해서, 피타아제 처리한 11S 글로불린이 풍부한 분획 대두 단백질을 얻었다.

한편, 가용성 획분은 염산으로 pH 4.9로 조정후, 원심분리해서 침전 커어드를 얻었다. 침전 커어드를 10배량의 물로 수세후, 물을 가하고 (4배 중량), 가성 소오다로 중화하고, 140℃에서 15초간 살균을 한 후, 즉시 분무건조해서, 피타아제 처리한 7S 글로불린이 풍부한 분획 대두 단백질을 얻었다.

실시예 1의 방법에 근거해서 산출한 상기 분리후의 가용성 획분과 불용성 획분의 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비, 및 피틴산 함량을 표 12에 나타내었다.

표 12

가용성 획분 불용성 획분

7S:11S 94:6 7:93 피틴산 0.06％ 0.09％

또한, 7S 글로불린이 풍부한 단백질 (표 중에서 7S) 및 11S 글로불린이 풍부한 단백질 (표 중에서 11S)와, 비교를 위해 시판 분리 단백질 (「FUJIPRO-F」, 표 중의 SPI)의 분말 조성을 표 13에 나타내었다.

표 13

수분 조단백질 7S/11S 피틴산 클로로포름-메탄올 추출 유분 (%) (%) (비) (%) (%)

7S 4.3 98.2 95/5 0.06 0.7 11S 5.5 94.3 4/96 0.09 2.8 [디파인(defining) 없음] 11S 4.8 98.2 4/96 0.09 1.8 [디파인(defining) 있음] SPI 5.5 90.2 30/70 1.8 3.5

단, 조단백질은 건조물 기준이다.

더욱이 7S 글로불린이 풍부한 단백질의 아미노산 조성을 측정한 결과, 메티오닌 + 시스테인의 함황(含黃; sulfur-containing) 아미노산의 값은 12 mg/g 단백질을 나타내었다. 본래 7S 글로불린의 완전한 정제품의 함황(含黃) 아미노산 함량은 5 mg/g인데 대해, 정제도가 낮은 7S 글로불린 함유 단백질에는 트립신 인히비터와 같이 함황 아미노산을 다량으로 함유하는 단백질 획분이 혼재하므로, 함황 아미노산 함량은 15 mg/g 이상을 나타내는 것이 많음에 비하여 이 제품의 함황 아미노산 함량의 값은 낮으므로, 이 점에서도 이 제품의 7S 글로불린은 고순도인 것이 나타났다.

실시예 11

실시예 1과 마찬가지로 탈지한 저변성 탈지 대두 1 중량부에 10 중량부의 40℃의 추출용 물을 가하고, 염산으로 pH 6.1로 조정하였다. 이 용액에 단백질 중량당 8 unit 상당의 피타아제 (노보사제 「PHYTASE N0VO L」)을 가하고, 40℃에서 단백질의 추출과 효소반응을 함께 한 30분간의 처리를 하여 효소처리한 추출 슬러리 를 얻었다. 이 효소처리 추출 슬러리를 25℃ 부근까지 냉각하고, 기성 소오다로 pH 6.1로 조정하여 뱃치식 원심분리기 (3,000G)에서 원심분리하였다. 이 때, 가용성 획분과 불용성 획분은 명확한 분리를 하였다. 또한, 이 원심분리시의 용액온도는 25℃ 부근이었다. 얻어진 불용성 획분에 물을 가하고（탈지 대두의 7배량), 가성 소오다로 pH 7.2로 조정하여 30분간 추출을 한 후, 원심분리해서 불용성 획분을 제거하여 11S 글로불린이 풍부한 상청을 얻었다. 얻어진 11S 글로불린이 풍부한 상청은 염산으로 pH 5.0로 조정하고, 원심분리해서 침전 커어드를 얻었다. 침전 커어드에 물을 가하고 (4배 중량), 가성 소오다로 중화후, 140℃에서 15초간 살균하고, 이것을 분무건조하여 피타아제 처리한 11S 글로불린이 풍부한 분획 대두 단백질을 얻었다. 한편, 가용성 획분은, 염산으로 pH 4.9로 조정한 후, 원심분리해서 침전 커어드를 얻었다. 이 침전 커어드에 물을 가하고 (4배 중량), 가성 소오다로 중화후, 140℃에서 15초간 살균하고, 이것을 분무건조해서 피타아제 처리한 7S 글로불린이 풍부한 분획 대두 단백질을 얻었다.

실시예 1의 방법에 근거해서 산출한 상기 분리후의 가용성 획분과 불용성 획분의 7S 글로불린과 11S 글로불린의 존재비, 및 시료 고형분 중의 피틴산 함량을 표 14에 나타내었다.

표 14

가용성 획분 불용성 획분

7S:11S 89:11 7:93 피틴산 0.09% 0.12%

실시예 12

실시예 1과 마찬가지로 조제한 탈지 두유를 염산으로 pH 5.0로 조정한 후, 40℃가 되도록 가온을 하였다. 이 탈지 두유를 그대로, 그리고 단백질 중량당 8 unit 상당의 피타아제 (노보사제「PHYTASE N0VO L」)를 가하고, 40℃에서 30분간 유지하였다. 그 후, 30℃ 부근까지 냉각하고, 가성 소오다를 사용하여, 피타아제를 가하지 않은 용액은 pH 5.8, 피타아제를 가한 용액은 pH 6.0으로 각각 조정하였다. 각 용액 100g을 뱃치식 원심분리기(3,000G)에서 원심분리하였다. 이 때, 가용성 획분과 불용성 획분은 명확한 분리를 하였다. 그리고 이 원심분리시의 용액온도는 25℃ 부근이었다. 표 15에 상기의 방법으로 원심분리된 불용성 획분의 침전량을 나타낸다.

표 15

피타아제 처리 없음 피타아제 처리 있음

침전중량 (g) 12.2 10.6 고형분（％） 27.0 31.1 회수 고형분 (g) 3.3 3.3

실시예 13

실시예 6과 마찬가지로 조제한 산침 커어드에 물을 첨가해서 충분히 분산시킨 후, 가성 소오다로 pH 5.0으로 조정하고, 40℃가 되도록 가온을 하였다. 이 산침 커어드 분산액을 그대로, 그리고 단백질 중량당 8 unit 상당의 피타아제 (노보사제「PHYTASE N0VO L」)를 가하고, 40℃에서 30분간 유지하였다. 그 후, 30℃ 부근까지 냉각하고, 가성 소오다를 사용하여, 피타아제를 가하지 않은 용액은 pH 5.8, 피타아제를 가한 용액은 pH 6.0으로 각각 조정하였다. 각 커어드 슬러리를 5％ 농도로 조정하고, 뱃치식 원심분리기 (3,000G)에서 원심분리하였다. 이 때, 가용성 획분과 불용성 획분은 명확한 분리를 하였다. 또한, 이 원심분리시의 용액 온도는 25℃ 부근이었다.

표 16은 상기한 방법으로 원심분리된 불용성 획분의 침전량을 나타낸다.

표 16

피타아제 처리 없음 피타아제 처리 있음

침전중량 (g) 15.5 13.5 고형분 (％） 26.5 30.4 회수 고형분 (g) 4.1 4.1

실시예 12 및 실시예 13의 결과로부터, 피타아제에 의한 피틴산의 분해를 함으로써 7S 글로불린을 함유한 가용성 획분과 11S 글로불린을 함유한 불용성 획분을 분리할 때, 불용성 획분의 탈수율이 높고, 분리가 보다 한 층 용이해지는 것이 나타났다.

비교예 1

실시예 1과 마찬가지로 추출한 탈지 두유를 비등욕 중에서 10분간 끓였다. 물로 냉각한 후 염산으로 pH 4.8로 조정하고, 50℃가 되도록 가온하였다. pH 조정한 탈지 두유가 50℃에 달한 후, 즉시 30℃ 부근까지 냉각하고, pH 5.8로 조정해서 뱃치식 원심분리기(3,000G)에서 원심분리하였으나, 불용성 획분 및 가용성 획분을 명확히 분리할 수 없었다. 따라서, 뱃치식 고속 원심분리기를 사용하여 8,000G에서 원심분리를 하여 불용성 획분과 가용성 획분을 얻었다. 그러나, 얻어진 가용성 획 분의 단백질 회수율은 30.3％로서 저하해 있고, 그 조성을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 확인한 결과, 7S 글로불린이 거의 함유되어 있지 않았다.

이들 결과로부터, 분명히 약산성 조건하에서의 가열 처리전의 가열이 분획에 악영향을 미치는 것이 확인되었다.

(분획 대두 단백질의 용해특성)

실시예 6에서 얻어진 피틴산을 분해하지 않고 있는 7S 글로불린과 11S 글로불린, 실시예 9에서 얻어진 피틴산을 분해한 7S 글로불린과 11S 글로불린의 4종의 분획 대두 단백질의 용해특성을 상대적으로 비교하였다.

용해특성은, 염산을 사용하여 pH 조정한 1％의 분획 대두 단백질 용액중의 전체 단백질량에 대한 9,000G에서 원심분리한 가용성 획분에 함유되는 단백질량의 비율로서 구하였다. 또한, 1% 용액의 조제, pH의 조정 및 원심분리는 25℃에서 하였다.

도 2에 7S 글로불린, 도 3에 11S 글로불린의 용해특성을 나타낸다.

이들 결과로부터 피틴산을 분해함으로써, 7S 글로불린은 pH 4 이하의 용해성이 크게 향상하고, 11S 글로불린은 pH 6.5 이상의 용해성이 저하하고 있는 것이 나타났다.

이상 설명한 바와 같이, 본원 발명은 대두 단백질을 함유한 용액을 약산성 조건하에서 가온한 후, pH 5.6∼6.6에서 가용성 획분과 불용성 획분으로 효율적이고도 공업적으로 분획할 수 있다.

Claims

대두 단백질을 함유하는 용액을 약산성 조건하에서 30∼75℃에서 가온한 후, pH 5.6∼6.6에서 가용성 획분과 불용성 획분으로 분획하는 것을 특징으로 하는 분획 대두 단백질의 제조법.
제1항에 있어서, 약산성 조건이 pH 3.8∼6.8인 제조법.
삭제
제1항에 있어서, 제조 공정 도중에 피타아제에 의하여 피틴산을 분해하는 제조법.
제1항에 있어서, 가용성 획분의 7S 글로불린/(11S 글로불린 + 7S 글로불린)의 비가 0.4 이상인 제조법.
제1항에 있어서, 가용성 획분의 고형분 중에서, 클로로포름:메탄올 = 2:1의 혼합물로써 추출되는 극성 지질이 1％ 이하인 제조법.
제4항에 있어서, 가용성 획분의 고형분 중의 피틴산 함량이 1.2％ 이하인 제조법.
제1항에 있어서, 불용성 획분의 11S 글로불린/ (11S 글로불린 + 7S 글로불린)의 비가 0.7 이상인 제조법.
제4항에 있어서, 불용성 획분의 고형분 중의 피틴산 함량이 1.2％ 이하인 제조법.
제1항에 있어서, 불용성 획분의 11S 글로불린을 pH 6.5∼8.5의 수용액 중에서 추출하고, 이것을 원심분리하여 추출 획분을 채취하는 제조법.
제10항에 있어서, 추출 획분의 고형분 중에서, 클로로포름/메탄올 = 2:1의 혼합물로써 추출되는 극성 지질이 2％ 이하인 제조법.
제10항에 있어서, 추출 획분의 고형분 중의 피틴산 함량이 1.2% 이하인 제조법.
7S 글로불린/(11S 글로불린 + 7S 글로불린)의 비가 0.4 이상이고, 고형분 중에서, 클로로포름/메탄올 = 2:1의 혼합물로써 추출되는 극성 지질이 1％ 이하인 고순도 7S 글로불린 단백질.
제13항에 있어서, 고형분 중의 피틴산 함량이 1.2％ 이하인 고순도 7S 글로불린 단백질.
11S 글로불린/(11S 글로불린 + 7S 글로불린)의 비가 0.7 이상이고, 고형분 중에서, 클로로포름/메탄올 = 2:1의 혼합물로써 추출되는 극성 지질이 2％ 이하인 고순도 11S 글로불린 단백질.
제15항에 있어서, 고형분 중의 피틴산 함량이 1.2％ 이하인 고순도 11S 글로불린 단백질.