KR100605150B1 - 아데노바이러스 사멸 방법 - Google Patents

Abstract

이산화티타늄 광촉매의 산화작용을 이용하여 아데노바이러스를 사멸시키는 방법에 관하여 개시한다. 상기 아데노바이러스 사멸방법은 아데노바이러스 함유 샘플 중의 아데노바이러스가 이산화티타늄의 광촉매 작용에 의하여 발생한 활성산소와 반응하여 산화되는 단계를 포함한다. 상기 방법에 따르면, 이산화티타늄의 아데노바이러스 제거 특성을 이용하여 인체에 치명적인 아데노바이러스를 비교적 간단한 방법으로 효과적으로 제거할 수 있는 이점이 제공된다. 특히 이산화티타늄과 같은 광촉매물질이 이용될 수 있는 새로운 분야가 제시됨으로써 광촉매의 적용영역을 현저하게 확대할 수 있게 되었다

아데노바이러스, 이산화티타늄, 광촉매, 분산액,

Description

아데노바이러스 사멸 방법{Method for destroying adenovirus}

도1은 본 발명에 따른 아데노바이러스 사멸 방법에 사용되는 이산화티타늄 분산액의 제조공정의 일 실시예에 대한 순서도이다.

도2 및 도3은 본 발명에 따른 아데노바이러스 사멸 방법의 사멸효과를 촬영한 사진으로서, 도2는 광촉매를 코팅하지 않은 시편을 촬영한 것이고, 도3은 광촉매를 코팅한 시편을 촬영한 것이다.

본 발명은 이산화티타늄 광촉매의 산화작용을 이용하여 아데노바이러스를 사멸시키는 방법에 관한 것이다.

아데노바이러스는 1953년 W.P.로 및 휴브너 등이 인체에서 적출한 구개편도와 아데노이드의 조직배양에 의하여 발견한 바이러스로서, 사람에게 호흡기나 눈의 점막 또는 그 부근의 림프절에 침입하여 인두결막열, 유행성각결막염 등의 질환을 일으키는 바이러스이다. 아데노바이러스는 인두나 분비물 또는 대변에 섞여 배출되어 여름철 수영장에서 감염되는 전염성이 강한 바이러스이다. 현재까지 아데노바이러스에 대한 특효약은 아직 없는 것으로 알려져 있으며, γ-글로블린이 예방효과 가 있는 정도만이 알려져 있다.

이와 같이 인체에 치명적인 질환을 야기할 수 있는 아데노바이러스를 효과적으로 제거하는 기술에 대해서는 현재까지 별다른 연구성과가 없는 실정이므로, 이에 대한 연구개발이 절실하다고 할 수 있다.

본 발명은 이산화티타늄 등의 광촉매물질이 아데노바이러스를 제거하는 기전을 발휘할 수 있음에 착안하여, 이를 기초로 하여 이산화티타늄의 분산액을 이용하여 광촉매코팅층을 형성하고 이에 광을 조사함으로써 아데노바이러스를 효과적으로 사멸시킬 수 있는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 아데노바이러스 사멸방법은 아데노바이러스 함유 샘플 중의 아데노바이러스가 이산화티타늄의 광촉매 작용에 의하여 발생한 활성산소와 반응하여 산화되는 단계를 포함한다.

상기 아데노바이러스 사멸 방법은 시료챔버 상에 이산화티타늄 분산액을 분사한 후 경화시킴으로써 이산화티타늄 코팅층을 형성하는 단계, 상기 시료챔버에 소정시간 광을 조사하여 프리-엑티베이션시키는 단계, 상기 시료챔버에 아데노바이러스를 함유한 RPMI 배지를 넣고 소정시간 광을 조사하여 이산화타타늄 코팅층의 광측매 반응을 일으키는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

또한 상기 시료챔버에 광을 조사하는 광원으로서 20 watt의 발광램프를 사용하며, 상기 발광램프와 시료챔버의 이산화티타늄 코팅층 사이의 거리는 15cm 로 설 정하며, 상기 발광램프의 광 조사기간은 적어도 8 시간 이상인 것이 바람직하다.

상기 아데노바이러스 사멸 방법에서 사용되는 이산화티타늄 광촉매 재료를 구성하는 이산화티타늄 분산액은, 티타늄알콕사이드 용액과 에탄올을 혼합하여 혼합용액을 형성하는 단계; 상기 혼합용액에 물과 촉매를 투입하고 교반함으로써 이산화티타늄 슬러리용액을 형성하는 단계; 상기 이산화티타늄 슬러리용액을 필터링 장비에 넣고 질소가스를 사용하여 가압하는 단계; 상기 이산화티타늄 슬러리용액을 건조시켜 비결정구조의 이산화티타늄 분말을 형성하는 단계; 상기 비결정구조의 이산화티타늄 분말을 가열하여 결정화하는 단계; 상기 결정화된 이산화티타늄 분말을 입자 크기가 5 내지 10nm 가 되도록 분쇄하는 분쇄단계; 및 상기 결정화된 이산화티타늄 분말을 분산매 상에 투입하고 산 촉매를 부가한 다음에 60℃ 내지 80℃의 온도에서 교반함으로서 이산화티타늄 분산액을 형성하는 단계:를 포함하는 공정으로 제조되는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용된 사용된 용어 "이산화티타늄"은 빛에너지를 화학에너지로 전환하는 광촉매반응을 일으키는 광촉매물질을 이르는 것이다. 상기 광촉매 반응은 자외선이나 가시광선이 광촉매 물질에 조사되었을 때 광촉매 물질의 전자가 가전자대(Valence Band)에서 전도대(Conduction Band)로 여기 된다. 이때 전도대(Conduction Band)에는 전자(e-)들이 형성되고 가전자대(Valence Band)에는 정공(h+)이 형성된다. 이와 같이 형성된 전자와 정공은 수산화라디칼 등의 강한 산화력을 가지는 활성산소를 발생시키고, 이러한 활성산소에 의하여 아데노바이러스가 산화되어 사멸되는 것으로 추정된다.

상기와 같은 이산화티타늄의 광촉매 효과를 가지기 위해서, 시료 샘플 상에 이산화티타늄 코팅층을 형성하는 것이 바람직하다. 이산화티타늄 코팅층은 후술하는 제조공정에 의하여 제조된 이산화티타늄 분산액을 시료 샘플 상에 스프레이 등의 도포장치를 이용하여 분무한 후 가열 또는 상온으로 유함으로써 형성될 수 있다. 시료 상에 분무된 이산화티타늄 분산액은 일정시간이 경과하면 분산매인 물이 증발되고, 시료 상에는 미세한 분말 크기의 이산화티타늄 코팅층이 형성되는 것이다.

이하에서 본 발명에 따른 아데노바이러스 사멸 방법에서 사용되는 이산화티타늄 분산액을 제조하는 공정의 일 예를 설명한다.

(1) TTIP와 ETOH의 혼합

티타늄 금속의 알콕사이드 용액(Titanium tetra-isopropoxide: TTIP)과 수분을 포함하지 않은 무수에탄올(Water-free Ethanol: EtOH) 용액을 혼합한다. 알콕사이드 용액과 무수에탄올의 혼합비율은 몰비 1:5가 바람직하다. TTIP는 수분과 쉽게 반응하므로, TTIP가 공기 중의 수분과 반응하는 것을 억제하기 위하여 무수에탄올을 첨가하는 것이다. 이에 의하여 최종입자의 특성을 결정하는 물과의 반응공정(후술함)의 속도를 조절할 수 있다.

(2) 물과 촉매의 첨가

TTIP와 EtOH의 혼합물에 물과 미량의 촉매를 첨가한다. 상기 첨가비율은 TTIP와 물의 몰비가 1:20이고, TTIP와 촉매의 몰비가 1:0.05 인 것이 바람직하다. 상기 촉매제로는 통상적으로 사용되는 염기 촉매 또는 산촉매를 사용할 수 있다. 본 공정에서 TTIP의 유기분자와 물의 수산화기 사이의 교환반응(수화반응) 및 축합반응이 발생하여 흰색의 이산화티타늄 입자가 생성되기 시작한다. 상기 염기 또는 산 촉매는 상기 교환반응과 축합반응의 속도를 조절함으로써 최종 이산화티타늄 분말의 입자크기, 응집도, 입자크기 분포도 및 결정구조를 제어하게 된다.

(3) 교반

위 공정에서 생성되기 시작하는 흰색의 이산화티타늄 입자들을 미세하게 분쇄함과 동시에 물과 TTIP 사이의 균일한 반응을 유도하기 위하여, 상기 혼합용액을 300rpm으로 1시간 이상 강하게 교반한다. 교반이 완료되면 슬러리 형태의 이산화티타늄 용액이 형성된다.

(4) 필터링

상기 슬러리 형태의 이산화티타늄 용액을 필터링 장비에 넣고 질소 가스로 가압하여 잔여 용액을 채취한다. 상기 슬러리 형태의 이산화티타늄 용액에는 알콜, 물, 염 등과 같은 불순물이 존재하고 있으며, 본 공정에 의하여 이들 중에서 이산화티타늄 입자만을 필터링할 수 있다. 필터링 장비는 0.33μm 정도의 구멍을 갖는 멤브레인을 사용하는 것이 바람직하다.

(5) 건조

상기 필터링된 이산화티타늄 슬러리 용액을 건조하여 비결정구조의 이산화티타늄 분말을 형성한다. 본 건조 공정의 온도는 100 내지 150℃가 바람직하다. 본 공정에 의하여 필터링된 입자들에 남아있는 수분 및 유기물이 제거된다.

(6) 결정화(calcination)

위 건조 공정에서 생성된 이산화티타늄 분말은 결정성이 거의 없는 비결정구조의 물질이다. 상기 비결절구조의 분말을 결정화하기 위해서 400℃ 이상의 온도에서 열처리하여야 한다. 본 실시예의 이산화티타늄 분말의 대부분은 아나타제 결정구조를 가지는 것이 바람직하다.

(7) 분쇄

상기 결정화 과정에서 생성된 분말 입자들은 상호 응집하여 수백 나노미터 내지 수 마이크로미터 정도의 크기를 갖는다. 입자 크기가 크면 그 특성이 떨어질 뿐 아니라 입자가 분산매(물)에 분산되지 않고 침전하는 문제가 발생한다. 따라서 상기 결정화 과정을 거친 이산화티타늄 분말을 지르코니아 볼과 초순수 물에 혼합한 후 밀링(milling)한다.

본 분쇄 공정에 의하여 최종 이산화티타늄 분말의 입자 크기가 5 내지 10nm 의 범위에 있도록 하는 것이 바람직하다.

(8) 분산액 제조

상기 미세한 이산화티타늄 분말은 분산매(물) 상에 분산시킨다. 또한 입자들의 분산도를 향상시키기 위하여 산촉매를 첨가한 후 60 내지 80℃의 온도에서 교반한다.

(9) 희석

상기 이산화티타늄 분산액은 원액이므로, 시료 상에 코팅이 용이하게 이루어지도록 하기 위하여 상기 분산액에 물을 적절히 첨가한다.

이하에서, 상기 실시예의 제조공정에 따라 제조된 이산화티타늄 분산액을 이 용하여 아데노바이러스 사멸효과를 시험한 결과를 설명한다.

(1)시료 챔버의 내면에 광촉매 코팅층의 형성(제1 단계)

2개의 시료 챔버(제1 시료챔버 및 제2 시료챔버)의 내면에 도1의 공정에 의하여 제조된 광촉매 분산액을 분무하고 가열하여 광촉매코팅층을 각각 형성한다. 다른 2개의 콘트롤 챔버에는 광촉매코팅층을 형성하지 않는다.

(2) 대장암세포주의 배양(제2 단계)

광촉매코팅층이 형성된 제1 시료챔버 및 광촉매 코팅층이 형성되지 않은 콘트롤 챔버에 각각 10⁴ 수의 DLD1 대장암세포주를 각각 분주하여 배양한다. 본 단계는 아래의 단계들을 개시하기 2일 전 정도에 행하는 것이 바람직하다.

(3)프리-엑티베이션(제3 단계)

광촉매코팅층이 형성된 제1 시료챔버 및 제2 시료 챔버를 세포 배양 후드(Cell culture hood)에 놓은 다음 20 Watt의 통상적인 백열전구를 사용하여 1 시간 동안 광을 조사함으로써 프리-엑티베이션(pre-activation) 시킨다. 전구와 챔버의 광촉매코팅층 사이의 거리는 15cm로 설정한다.

(4) 1차 광촉매반응 단계(제4 단계)

광촉매코팅층이 형성된 제2 시료 챔버에 녹색형광단백질을 발현하는 아데노바이러스 1ml를 10% FBS가 첨가된 RPMI media에 넣고 1시간, 3시간 및 7시간 동안 배양하는 3개의 실험을 행한다. 본 단계는 제3 단계와 동일한 광의 조사 조건에서 행한다.

한편 광촉매코팅층이 형성되지 않는 콘트롤 챔버에서도 위와 동일한 조건으로 실험을 행한다.

(5) 2차 광촉매반응 단계(제5단계)

상기 제2 시료챔버와 RPMI media 를 꺼내어 상기 DLD1 대장암세포주가 각각 배양된 제1 시료챔버 및 제2 콘트롤 챔버 상에 각각 넣은 다음 1시간 동안 배양한다. 본 단계는 제3 단계와 동일한 광의 조사 조건에서 행한다.

결국, 아데노바이러스는 상기 제4단계와 제5 단계를 합하여 총 2시간, 4시간 및 8시간 동안 광을 조사한 상태에서 배양되었다.

한편 광촉매코팅층이 형성되지 않은 콘트롤 챔버에서도 위와 동일한 조건으로 실험을 행한다.

이하에서, 상기 실험에 따른 결과를 설명한다.

(1) 관찰 방법

상기 제5단계까지 수행된 후 이를 세포배양기에 집어넣어 overnight 배양하고, 제1 시료챔버에 들어 있는 RPMI media를 제거하고 1X PBS로 2회 washing 한 후, 4% paraformaldehyde로 20분간 세포들을 fix하고, actin staing을 위해 Rhodamine-Phalodine으로 staining 한 후, DABCO anti-bleaching media를 20 ul 떨어뜨린 후 coverslip을 덮어 관찰시까지 4℃로 유지된 냉장고에 알루미늄포일로 싸서 보관한다. 상기 과정은 광촉매가 코팅되지 않은 콘트롤 챔버에서도 동일하게 행한다.

관찰시에는 슬라이드를 형광현미경 아래에 놓고 FITC channel을 통해 녹색형 광을 띠는 세포주의 수와 형광도를, 광촉매가 코팅된 시료챔버와 광촉매가 코팅되지 않은 콘트롤 챔버에서 배양된 것에 대하여 각각 관찰 및 비교하였다.

(2) 관찰결과

본 실험은 동일 조건 하에서 광 조사시간 만을 달리하면서(2시간, 4시간 및 8시간) 이산화티타늄의 광촉매의 아데노바이러스 사멸 효과를 시험한 것이다.

상기 시험결과에 따르면, 광 조사시간이 증가에 따라 아데노바이러스의 생존세포수와 형광도는 저하됨을 알 수 있다. 특히 총 8시간 동안 광을 조사한 시료 챔버에서는 각각 2시간과 4시간의 광조사 시간을 거친 시료챔버에 비하여 현저히 낮은 아데노바이러스의 형광도를 보인다.

한편 동일 조건 하에서 광촉매를 코팅한 시료 챔버와 광촉매를 코팅하지 않은 콘트롤 챔버의 광 조사시간에 따른 관찰결과를 상호 대비하면, 본 발명에 따른 아데노바이러스 사멸 효과를 더욱 명백하게 확인할 수 있다. 즉, 총 2시간 및 총 4시간의 광조사 시간에서는 형광을 띠는 잔존 세포주의 수나 형광도에 있어서 양자는 큰 차이를 보이지 아니하였으나, 총 8시간의 광을 조사한 경우에는 광촉매를 코팅한 시료 챔버가 콘트롤 챔버에 비하여 현저히 낮은 생존바이러스의 형광도를 나타내었다.

결국, 20Watt의 백열전구를 광원으로 사용하고 광촉매와 광원과의 사이를 15cm를 설정하였을 때, 최소한 8시간의 광조시사간 동안 광촉매반응을 일으키는 경우에 아데노바이러스를 매우 효율적으로 제거할 수 있음이 밝혀졌다. 따라서 광촉매코팅층의 광촉매반응의 효율성을 향상시키는 다양한 기술구성을 적절히 채택하면 아데노바이러스를 매우 효과적으로 사멸시킬 수 있게 된다.

광촉매코팅층에 조사되는 광원의 종류 또는 광원과 광촉매코팅층 사이의 거리와 같은 광조사조건을 달리하는 경우에는, 아데노바이러스가 효과적으로 제거될 수 있는 광조사 시간이 변경될 수 있고, 이러한 사항은 본 발명의 기술적 사상 하에서 당업자의 반복적인 실험에 의해서 밝혀질 수 있다. 따라서 본 발명의 보호범위는 본 명세서에 개시된 실시예에 한정되지 않음은 물론이다.

본 발명은 이산화티타늄의 아데노바이러스 제거 특성을 이용하여 인체에 치명적인 아데노바이러스를 비교적 간단한 방법으로 효과적으로 제거할 수 있는 이점을 제공한다. 특히 본 발명의 기술사상에 따르면, 이산화티타늄과 같은 광촉매물질이 이용될 수 있는 새로운 분야가 제시됨으로써 광촉매의 적용 영역을 현저하게 확대할 수 있게 되었다.

Claims (4)

1. 삭제
2. 삭제
3. 아데노바이러스 함유 샘플 중의 아데노바이러스가 이산화티타늄의 광촉매 작용에 의하여 발생한 활성산소와 반응하여 산화되는 단계를 포함한 아데노바이러스 사멸 방법으로서,

   시료챔버 상에 이산화티타늄 분산액을 분사한 후 경화시킴으로써 이산화티타늄 코팅층을 형성하는 단계, 상기 시료챔버에 광을 조사하여 프리-엑티베이션시키는 단계, 상기 시료챔버에 아데노바이러스를 함유한 RPMI 배지를 넣고 광을 조사하여 이산화타타늄 코팅층의 광측매 반응을 일으키는 단계를 포함하고,

   상기 시료챔버에 광을 조사하는 광원으로서 20watt의 발광램프를 사용하며, 상기 발광램프와 시료챔버의 이산화티타늄 코팅층 사이의 거리는 15cm 로 설정하며, 상기 발광램프의 광 조사기간은 8 시간인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 사멸 방법.
4. 아데노바이러스 함유 샘플 중의 아데노바이러스가 이산화티타늄의 광촉매 작용에 의하여 발생한 활성산소와 반응하여 산화되는 단계를 포함한 아데노바이러스 사멸 방법으로서,

   상기 이산화티타늄 광촉매 재료를 구성하는 이산화티타늄 분산액은,

   티타늄알콕사이드 용액과 에탄올을 혼합하여 혼합용액을 형성하는 단계;

   상기 혼합용액에 물과 촉매를 투입하고 교반함으로써 이산화티타늄 슬러리용액을 형성하는 단계;

   상기 이산화티타늄 슬러리용액을 필터링 장비에 넣고 질소가스를 사용하여 가압하는 단계;

   상기 이산화티타늄 슬러리용액을 건조시켜 비결정구조의 이산화티타늄 분말을 형성하는 단계;

   상기 비결정구조의 이산화티타늄 분말을 가열하여 결정화하는 단계;

   상기 결정화된 이산화티타늄 분말을 입자 크기가 5 내지 10nm 가 되도록 분쇄하는 분쇄단계; 및

   상기 결정화된 이산화티타늄 분말을 분산매 상에 투입하고 산 촉매를 부가한 다음에 60℃ 내지 80℃의 온도에서 교반함으로서 이산화티타늄 분산액을 형성하는 단계를 포함하는 공정으로 제조되는 것을 특징으로 아데노바이러스 사멸 방법.

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