KR100535951B1 - 3-메칠-(ｏ-치환된 옥시이미노)-피라졸린-5-온 유도체를함유하는 항암제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 3-메칠-(O-치환된 옥시이미노)-피라졸린-5-온 유도체를 함유하는 항암제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 세포분열에 결정적으로 작용하는 CDC25B의 탈인산화효소에 대한 탁월한 저해활성을 가지고 있는 다음 화학식 1로 표시되는 (O-치환된 옥시이미노)-피라졸린-5-온 유도체가 유효활성 성분으로 함유되어 있는 항암제에 관한 것이다.
상기 화학식 1에서, R1 및 R2는 각각 발명의 상세한 설명에서 정의한 바와 같다.

Description

3-메칠-(Ｏ-치환된 옥시이미노)-피라졸린-5-온 유도체를 함유하는 항암제{3-Methyl-(O-Substituted Oximino)-pyrazolin-5-one Derivatives as Antitumor}
본 발명은 3-메칠-(O-치환된 옥시이미노)-피라졸린-5-온 유도체를 함유하는 항암제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 세포분열에 결정적으로 작용하는 CDC25B의 탈인산화효소에 대한 탁월한 저해활성을 가지고 있는 다음 화학식 1로 표시되는 (O-치환된 옥시이미노)-피라졸린-5-온 유도체가 유효활성 성분으로 함유되어 있는 항암제에 관한 것이다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1은 C1∼C4 알킬기 또는 치환된 페닐기이며, 여기서 치환된 페닐기는 수소원자, 할로겐원자, C1∼C4 알킬기, C1∼C4 알콕시기, C2 ∼C4 아실기 및 니트로기 중에서 선택된 하나 또는 둘 이상 치환된 페닐기이고;
R2는 C1∼C4 알킬기, C2∼C4 알케닐기, C2 ∼C4 알키닐기, C2∼C4 아실기, 메탄설포닐기, 톨루엔설포닐기, C1∼C4 알콕시카보닐메틸기, 카복시메틸기, 또는 상기한 카복시메틸기의 무기금속 또는 유기아민의 염이다.
상기 화학식 1로 표시되는 (O-치환된 옥시이미노)-피라졸린-5-온 유도체는 공지 화합물로서, 주로 살균제로 유용하다고 알려져 있다. 그 예로서, 미국특허 제 4,666,933호에는 R2가 주로 치환된 벤질기인 경우 살균제로서 유용하다고 공지되어 있다. 그 외에 독일특허공개 DE 3831430 A1, DE 3539995 A1, DE 3528753 A1, 및 DE 3446876 A1에도 유사한 화합물들이 살균제로서 유용하다고 공지되어 있다. 또한, 일본특허공개 JP 03-232860 A2, JP 03-232859 A2, 및 JP 62-283962 A2에서는 R2가 각각 치환된 아미노카보닐, 치환된 설포닐, 치환된 카보닐기인 화합물이 살균제로 유용한 것으로 공지되어 있다.
상기한 바와 같이, 상기 화학식 1로 표시되는 (O-치환된 옥시이미노)-피라졸린-5-온 유도체는 주로 농약의 살균제로서의 용도가 있는 것으로 공지되어 있다.
그러나, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 (O-치환된 옥시이미노)-피라졸린-5-온 유도체들이 CDC25B에 대한 저해활성을 가지고 있으므로, 이들 유도체들을 항암제로서의 새로운 용도를 특허 청구하고자 하는 것이다.
CDC25B는 세포분열을 하는데 있어서 G2/M 주기로의 진행을 결정하는 매우 중요한 탈인산화효소(phosphatase)로서, CDC25B의 활성을 저해하게 되면 세포분열이 저해되고 결국 세포사멸로 이어져 항암작용을 하게된다. CDC25B는 위암(Jpn. J. Cancer Res. 1997, 88, 9947), 대장암(Exp.Cell Res. 1998, 240, 236; Lab. Invest. 2001, 81, 465), 폐암(Cancer Res. 1998, 58, 4082), 뇌암 및 후두암(Cancer Res. 1997, 57, 2366), 그리고 유방암(Cancer statistics in Japan 1997 Foundation for Promotion of Cancer Research, Tokyo, Jpn.) 등의 종양에서 과발현되는 것이 관찰되었으며, CDC25B가 과발현된 유전형질변형 생쥐(Oncogene 1999, 18, 4561)에서 유선의 이상증식이 관찰되었으며, 카시노젠(9,10-디메틸-1,2-벤즈안트라센)을 처리 시 유방암이 매우 쉽게 발생되었다. 따라서 CDC25B는 항암제 개발에 있어서 중요한 타겟이 되며, CDC25B를 저해함과 동시에 정상세포에 대한 세포독성이 적은 새로운 항암제의 개발이 절실히 요구된다.
이에, 본 발명자들은 CDC25B에 대한 선택적 저해활성을 가지는 화합물을 개발하고자 연구하였고, 그 결과 (O-치환된 옥시이미노)-피라졸린-5-온 유도체들이 CDC25B에 우수한 저해활성을 가지고 있고, 다른 유사한 탈인산화효소에 대한 선택성을 가진다는 것을 알게됨으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 (O-치환된 옥시이미노)-피라졸린-5-온 유도체를 항암제로 사용하는 용도를 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 (O-치환된 옥시이미노)-피라졸린-5-온 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이 유효성분으로 함유된 항암제를 그 특징으로 한다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1은 C1∼C4 알킬기 또는 치환된 페닐기이며, 여기서 치환된 페닐기는 수소원자, 할로겐원자, C1∼C4 알킬기, C1∼C4 알콕시기, C2 ∼C4 아실기 및 니트로기 중에서 선택된 하나 또는 둘 이상 치환된 페닐기이고;
R2는 C1∼C4 알킬기, C2∼C4 알케닐기, C2 ∼C4 알키닐기, C2∼C4 아실기, 메탄설포닐기, 톨루엔설포닐기, C1∼C4 알콕시카보닐메틸기, 카복시메틸기, 또는 상기한 카복시메틸기의 무기금속 또는 유기아민의 염이다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 (O-치환된 옥시이미노)-피라졸린-5-온 유도체가 세포분열 주기의 G2/M으로의 진행을 결정하는데 결정적인 역할을 수행하게 되는 CDC25B 탈인산화효소에 대해 저해활성을 가지고 있어 세포분열을 저해하는 특성을 가지고 있으며, 또한 인체 내의 다른 탈인산화효소들에 대해 선택성을 나타내므로, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 항암제의 유효활성 성분으로 사용하는 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 (O-치환된 옥시이미노)-피라졸린-5-온 유도체는 키랄 중심을 가질 수 있고, 이러한 화합물의 경우 라세믹(racemic) 화합물 또는 이들의 모든 가능한 이성질체가 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명은 라세믹체, 각 이성체 또는 이들 이성체 혼합물을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 (O-치환된 옥시이미노)-피라졸린-5-온 유도체의 방사성 유도체를 포함하며, 이들 방사성 화합물은 생체연구 분야에 유용하다.
또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 (O-치환된 옥시이미노)-피라졸린-5-온 유도체는 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 의해 약제학적으로 허용 가능한 염을 형성할 수 있다. 예를 들면, 염산, 브롬산, 황산, 인산, 아세트산, 시트르산, 푸마르산, 락트산, 말레산, 숙신산 및 타르타르산 등의 유기 또는 무기산과 함께 약제학적으로 허용 가능한 이들의 산의 염을 형성하거나, 또는 나트륨, 칼륨 등의 알칼리금속이온과 반응하여 이들의 금속염을 형성하거나, 또는 암모늄 이온과 반응하여 또 다른 형태의 약제학적으로 허용 가능한 염을 형성할 수도 있다.
또한, 본 발명에 따른 항암제 또는 약제 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물에 통상의 무독성 약제학적으로 허용 가능한 담체, 보강제 및 부형제 등을 첨가하여 약제학적 분야에서 통상적인 제제 예를 들면 정제, 캅셀제, 트로키제, 액제, 현탁제 등의 경구투여용 제제로 제제화할 수 있다. 또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 인체에 대한 투여용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인환자를 기준으로 할 때 일반적으로 10 ∼ 400 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
한편, 본 발명이 항암제로서 함유하게 되는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 공지 화합물로서, 이의 제조방법 역시 이미 공지되어 있다. 그 대표적인 제조방법이 미국특허 제 4,666,933호 등에 기술되어 있으며, 이를 간략히 나타내면 다음 반응식 1과 같다.
상기 반응식 1에서, R1 및 R2는 각각 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같고, X는 할로겐원자를 나타낸다.
상기 반응식 1에 따른 공지 제조방법을 설명하면, 상기 화학식 2로 표시되는 에틸 아세토아세테이트와 상기 화학식 3으로 표시되는 치환된 히드라진과 초산을 용매로 가열하여 반응시켜 상기 화학식 4로 표시되는 1-치환된 3-메틸-피라졸린-5-온 유도체를 합성한다. 여기서 초산용매로 가열하는 대신 초산, 벤조산 등의 약산을 촉매로 하여 알콜을 용매로 상온에서 반응시켜도 같은 결과를 얻을 수 있다. 이렇게 얻어진 상기 화학식 4로 표시되는 화합물은 물을 용매로 사용하고 염산과 아질산나트륨을 사용하여 히드록시이미노기를 도입하여 상기 화학식 5로 표시되는 1-치환된 4-히드록시이미노-3-메틸-피라졸-5-온 유도체를 얻는다. 이때 히드록시이미노기를 도입하는 일반적인 방법인 이소아밀나이트레이트를 사용하여도 같은 결과를 얻는다. 상기 화학식 5로 표시되는 화합물은 다시 수소화나트륨을 염기로 디메틸포름이미드 용매하에서 알킬 할라이드, 알케닐 할라이드, 또는 알키닐 할라이드 및 아실 클로라이드, 메탄설포닐 클로라이드, 톨루엔설포닐 클로라이드, 알콕시카보닐메틸 할라이드 등을 반응시켜 상기 화학식 1로 표시되는 목적 화합물을 얻는다.
이상에서 설명한 바와 같은 본 발명은 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 4-메톡시이미노-3-메틸-1-페닐-피라졸린-5-온(화합물번호 1)의 합성
1) 5-메틸-2-페닐-피라졸린-3-온의 제조
에틸 아세토아세테이트(3.0 g, 23.1 mmol)을 빙초산 100 mL에 녹이고 페닐히드라진(2.5 g, 23.1 mmol)을 천천히 적가한 후 4 시간 동안 환류시켰다. 초산을 증류시켜 대부분 제거한 후, 물과 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 포화 탄산나트륨 수용액으로 충분히 씻어주었다. 유기층을 소금물로 씻어준 후, 무수 황산 마그네슘으로 수분을 제거하고, 감압하에서 용매를 제거하였다. 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(핵산/에틸 아세테이트, 2/1)로 분리하여 흰색의 고체로서 5-메틸-2-페닐-피라졸린-3-온(3.63 g, 90.0%)을 얻었다.
1H NMR(200 MHz, CDCl3) δ2.20(s, 3H), 3.43(s, 2H), 7.20(d, 1H, J=3.7 Hz), 7.38(t, 2H, J=7.7 Hz), 7.9(d, 2H, J=8.1 Hz); MS(m/z) 174.
2) 4-히드록시이미노-5-메틸-2-페닐-피라졸린-3-온의 제조
5-메틸-2-페닐-피라졸린-3-온(3.0 g, 17.2 mmol)을 물 20 mL에 녹이고 0 ℃에서 진한 염산 30 mL를 넣었다. 소량의 물에 녹인 아질산 나트륨(1.78 g, 25.8 mmol)을 반응용액에 천천히 가한다. 이때 고체가 생기면 여과하고 물로 씻어주었다. 생성물을 건조시키면 주황색의 고체 4-히드록시이미노-5-메틸-2-페닐-피라졸린-3-온(3.33 g, 수율 95.8%)이 얻어졌다.
3) 4-메톡시이미노-3-메틸-1-페닐-피라졸린-5-온의 제조
4-히드록시이미노-5-메틸-2-페닐-피라졸린-3-온(1.0 g, 4.92 mmol)을 무수 디메틸포름아미드에 녹이고 수소화 나트륨(0.24 g, 5.90 mmol)을 넣고 질소 가스 하에서 30 분 동안 교반시켰다. 요오드화메탄(1.05 g, 7.38 mmol)을 넣고 상온에서 1 시간 동안 교반시켰다. 반응이 종결되면 에틸 아세테이트와 물로 추출하였고 유기층을 소금물로 씻어준 후, 무수 황산 마그네슘으로 수분을 제거하고, 감압하에서 용매를 제거하였다. 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(핵산/에틸 아세테이트, 4/1)로 분리하여 주황색의 고체로서 4-메톡시이미노-3-메틸-1-페닐-피라졸린-5-온(0.72 g, 수율 67.3 %)을 얻었다.
1H NMR(200 MHz, CDCl3) δ2.26(s, 3H), 4.33(s, 3H), 7.20(d, 1H, J=3.7 Hz), 7.38(t, 2H, J=7.7 Hz), 7.9(d, 2H, J=8.1 Hz) ; MS(m/z)(relative intensity) 217(77.28), 186(11.47), 158(14.29), 146(4.98), 118(21.07), 105(19.81), 103(16.73), 91(35.58), 77(100), 64(15.46), 51(22.47).
실시예 2: 1,3-디메틸-4-프로파질옥시이미노-피라졸린-5-온(화합물번호 16)의 합성
1) 2,5-디메틸-피라졸린-3-온
에틸 아세토아세테이트(3.0 g, 23.1 mmol)을 빙초산 100 mL에 녹이고 메틸히드라진(1.06 g, 23.1 mmol)을 천천히 적가한 후 4 시간 동안 환류시켰다. 초산을 증류시켜 대부분 제거한 후, 물과 디클로로메탄으로 추출하였고 유기층을 포화 탄산나트륨 수용액으로 충분히 씻어주었다. 유기층을 소금물로 씻어주고 무수 황산 마그네슘로 수분을 제거하여 감압하에서 용매를 제거하였다. 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그라피(헥산/에틸 아세테이트, 2/1)로 분리하여 노란색의 고체 2,5-디메틸-피라졸린-3-온(2.0 g, 77.4%)을 얻었다.
2) 2,5-디메틸-4-히드록시이미노-피라졸린-3-온
2,5-디메틸-피라졸린-3-온(2.0 g, 17.8 mmol)을 물 20 mL에 녹이고 0 ℃에서 진한 염산 30 mL를 넣었다. 소량의 물에 녹인 아질산 나트륨(1.84 g, 26.7 mmol)을 반응용액에 천천히 가한다. 이때 고체가 생기면 여과하고 물로 씻어준다. 여과액을 디클로로메탄으로 추출하였고 유기층을 소금물로 씻어준 후, 무수 황산 마그네슘으로 수분을 제거하고, 감압하에서 용매를 제거하였다. 생성물을 건조시켜 노란색의 고체 2,5-디메틸-4-히드록시이미노-피라졸린-3-온(1.6 g, 68.2%)을 얻어졌다.
1H NMR(200 MHz, CDCl3) δ2.25(s, 3H), 3.37(s, 3H) ; MS(m/z) 141.
3) 1,3-디메틸-4-프로파질옥시이미노-피라졸린-5-온
2,5-디메틸-4-히드록시이미노-피라졸린-3-온(1.0 g, 7.08 mmol)을 무수 디메틸포름아미드에 녹이고 수소화 나트륨(0.34 g, 8.5 mmol)을 넣고 질소가스 하에서 30 분 동안 교반시켰다. 프로파질 브로마이드(1.32 g, 10.6 mmol) 1.0 mL를 넣고 상온에서 1 시간 동안 교반시켰다. 반응이 종결되면 에틸 아세테이트와 물로 추출하였다. 유기층을 소금물로 씻어준 후, 무수 황산 마그네슘으로 수분을 제거하고, 감압하에서 용매를 제거하였다. 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그라피(헥산/에틸 아세테이트, 7/1)로 분리하여 주황색의 고체로서 1,3-디메틸-4-프로파질옥시이미노-피라졸린-5-온(0.64 g, 44%)을 얻었다.
1H NMR(200 MHz, CDCl3) δ2.17(s, 3H), 2.57(t, 1H, J=2.1 Hz), 3.31(s, 3H), 5.03(d, 2H, J=2.4 Hz); MS(m/z)(relative intensity) 179(25.64), 162(18.97), 140(5.25), 112(9.55), 96(3.65), 84(4.64), 67(38.36), 43(100).
상기 실시예 1 및 2와 유사한 방법으로 다음의 표 1에 열거한 화합물들을 합성하였다.
.
실시예 3: 4-메톡시이미노-3-메틸-1-페닐-피라졸린-5-온 (화합물번호 1) 및 1,3-디메틸-4-프로파질옥시이미노-피라졸린-5-온 (화합물번호 16)에 대한 X-선 분광분석
1,3-디메틸-4-프로파질옥시이미노-피라졸린-5-온 (화합물번호 16)의 1H NMR에서 소량의 불순물(impurity)이 관측되며, 피크의 위치와 모양이 주 생성물과 매우 유사하여 다음과 같이 옥심(oxime)의 산소가 (E)-형과 (Z)-형으로 존재하는 이성질체가 섞여 있는 것으로 판단되었다.
그러나 일반적인 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피법으로는 분리가 용이하지 않아 역상 컬럼 크로마토그래피(Finepak C8 reverse column, 아세토니트릴/물(30/70)]로 분석한 결과, (E)-형과 (Z)-형의 두 이성질체가 95 : 5의 비율로 분리되었다. 그 외에 2-위치가 방향족 벤젠구조인 경우는 하나의 화합물만이 얻어졌다.
방향족 벤젠구조가 치환된 화합물 중 대표적인 4-메톡시이미노-3-메틸-1-페닐-피라졸린-5-온 (화합물번호 1)와 메틸-4-프로파질옥시이미노-피라졸린-5-온 (화합물번호 16) 중 95%에 해당하는 주 생성물을 결정화하여 각각 X-선 분광분석을 하였다. 그 결과 아래의 그림에서와 같이 두 가지 화합물이 모두 (Z)-형에 해당하는 B 형의 구조를 가진 것이 확인되었다.
실시예 4 : 제제화 예
한편, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 다음은 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
제제 1 : 정제(직접 가압)
활성성분 5.0 ㎎을 체로 친 후, 락토스 14.1 ㎎, Crospovidone USNF 0.8 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 0.1 ㎎을 혼합하고 가압하여 정제로 만들었다.
제제 2 : 정제(습식 조립)
활성성분 5.0 ㎎을 체로 친 후, 락토스 16.0 ㎎과 녹말 4.0 ㎎을 섞었다. 폴리솔베이트 80 0.3 ㎎을 순수한 물에 녹인 후 이 용액의 적당량을 ㅊ첨가한 다음, 미립화하였다. 건조 후에 미립을 체질한 후 콜로이달 실리콘 디옥사이드 2.7 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 2.0 ㎎과 섞었다. 미립을 가압하여 정제로 만들었다.
제제 3 : 분말과 캡슐제
활성성분 5.0 ㎎을 체로 친 후에, 락토스 14.8 ㎎, 폴리비닐 피롤리돈 10.0 ㎎, 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎와 함께 섞었다. 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 단단한 No. 5 젤라틴 캡슐에 채웠다.
실시예 5: CDC25B 효소 효력검정(Enzyme assay)
CDC25B의 catalytic domain(aa 378-566)에 해당하는 부분을 GST fusion protein으로 E.coli에서 발현 생산하여 효소원으로 사용하였다. 효소 효력검정(Enzyme assay)은 96 well plate상에서 웰(well)당 최종 반응 부피를 200 ㎕로 맞추어서 수행하였다. 반응물에는 완충액(30 mM Tris buffer, pH 8.5, 75 mM NaCl, 0.67 mM EDTA, 1 mM DTT) 170 ㎕, CDC25B 효소 20 ㎕(0.2 ㎍), DMSO에 녹인 시험화합물 10 ㎕를 각각 첨가하며 최종 반응 농도를 1 ㎍/mL CDC25B 효소, 20 μM FDP가 되도록 맞추어 실온에서 1 시간 배양하여 측정하였다. 이 때 FDP와 DTT는 검정하기 바로 전에 완충액에 첨가하여 항상 신선한 상태에서 검정을 실시하도록 하였다. 1 시간 배양 후 효소반응에 의해 생성되는 fluorescence를 485 nm(excitation), 538 nm(emission)에서 측정하였다.
시험화합물은 먼저 최종 농도가 10 μM이 되게 처리하여 1 차 스크리닝을 한 후 우수한 억제능을 보이는 화합물을 선별하여 IC50 값을 구하였다. 1 차 스크리닝으로 선별된 화합물은 일반적으로 최종 농도가 1, 2, 5, 10 μM이 되게 처리하여 %억제율 값을 구하였으며, 억제효과가 조금 떨어지는 경우(20 μM에서 50% 이하의 억제효과를 보이는 경우)에는 화합물의 농도를 20 μM까지 높여 처리한 후 %억제율을 구하여 IC50 값을 얻었다.
상기 실시예 1 내지 18에서 합성한 (E)-이성체 화합물 각각에 대하여 cdc25B에 대한 %억제율과 IC50 값을 다음 표 2에 열거하였다.
실시예 6: 세포독성시험(Cell cytotoxicity assay)
암세포배양
항암활성 측정에 사용한 세포들은 A-549(비소형 세포 폐암), SK-OV-3(선암, 난소 악성 복수증), SK-MEL-2(악성흑색종, 대퇴부 피부로의 전이), XF498(중추신경계 종양) 및 HCT15(결장선암)이다. 이들 암세포는 모두 인간 유래의 종양 세포주들로서 미국의 국립암연구소(NCI)로부터 분양 받아 한국화학연구원에서 계대 배양중인 것을 사용하였다. 이 세포들은 모두 배양액으로서 5% 소의 태아 혈청으로 보강된 RPMI 1640 배양액을 사용하여, 37 ℃ 항온 항습 5% CO2, 인큐베이터에서 배양하였다. 세포의 계대는 3 ∼ 4일에 1 회씩 하였으며, 세포를 부착 면으로부터 분리하기 위하여 PBS(phosphate buffered saline) 용액에 0.25% 트립신과 3 mM 트란스-1,2-디아미노사이클로헥산-N,N,N,N-테트라아세트산(CDTA)을 용해시킨 용액을 사용하였다.
활성측정
1989년 미국의 국립암연구소에서 약물의 생체외(in vitro) 항암활성을 측정하기 위하여 개발된 SRB분석법(sulforhodamine B assay method)을 사용하였다. 즉, 계대 중인 세포들을 실험에 사용하기 위하여 트립신-CDTA 용액을 이용하여 세포들을 착면으로부터 분리시키고, 플레이트(96 well microplate, Falcon사 제품)에 웰(well)당 세포수가 5×103(A549, HCT15), 1×104(SK-MEL-2, XF498), 2×104(SK-OV-3)이 되도록 분주하였다. 분주된 세포들은 CO2 인큐베이터내에서 24 시간 배양하여 바닥에 부착시킨 후, 아스피레이터(aspirator)로 배양액을 제거하고, 화합물번호 1 및 화합물번호 16의 화합물들을 6 농도의 로그 투여량(log dose)으로 배양액에 희석된 화합물 용액들을 세포가 들어 있는 웰에 각각 100 mL씩 3 배수로 넣어주고, 48 시간 동안 더 배양하였다. 화합물을 용해시키기 위하여 필요에 따라 디메틸설폭사이드(DMSO)를 사용하였다. 또한 이렇게 희석한 화합물 용액은 세포에 가하기 전에 0.22 mL 필터로 여과하여 실험의 무균 상태를 유지하였다. 세포를 약물과 48시간 배양한 후 각 웰의 배양액을 제거하고 10% 트리클로로아세트산(TCA)를 100 mL씩 가하여 4 ℃에서 1 시간 동안 방치하여 세포들을 플레이트의 바닥면에 고정시켰다. 세포의 고정이 끝난 후 플레이트를 물로 5∼6회 세척하여 남아있는 TCA용액을 완전히 제거하고, 남은 물기가 없도록 실온에서 건조시켰다. 완전히 건조된 플레이트는 웰당 100 mL의 1% 아세트산 용액에 0.4% SRB를 용해시킨 염색용액을 가하여 30 분간 세포를 염색하고, 다시 1% 아세트산 용액으로 5 ∼ 6회 세척하여 세포에 결합하지 않은 SRB를 제거하였다. 이렇게 염색된 셀 플레이트(cell plate)들은 다시 실온에서 건조시킨 후 웰당 100 mL의 10 mM 완충되지 않은 트리스마 염기 용액(unbuffered trisma base solution)을 가하여 진탕기(titer plate shaker)로 10 분간 흔들어 염색약을 용출시킨 후 마이크로 플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 암세포들에 대한 약물의 효과를 계산하기 위하여 약물을 가할 때의 세포수(Tz)와, 약물이 들어있지 않은 배양액을 가하여 48 시간 배양하였을 때의 세포수(C) 및 각 농도의 약물과 함께 48 시간 배양했을 때의 세포수(T) 등을 측정하여 다음의 수학식에 의하여 계산하였다.
이렇게 계산된 값들로부터 로터스 프로그램(LOTUS program)의 데이터 회귀(data regression)를 이용하여 약물이 암세포의 성장을 50% 억제하는 농도 즉, ED50를 계산하여 각 약물의 항암 활성도를 다음 표 3에서 비교하였다.
상기 화학식 1로 표시되는 3-메칠-(O-치환된 옥시이미노)-피라졸린-5-온 유도체는 CDC25B 효소에 대한 우수한 저해활성을 나타내고 있으며, 여러 가지 암세포들 즉, A-549(비소형 세포 폐암), SK-OV-3(선암, 난소 악성 복수증), SK-MEL-2(악성흑색종, 대퇴부 피부로의 전이), XF498(중추신경계 종양) 및 HCT15(결장선암)에 대해 세포독성을 나타내고 있으므로 CDC25B 효소저해에 근거한 항암 작용이 있음이 분명하다. CDC25B는 세포분열을 하는데 있어서 G2/M 주기로의 진행을 결정하는 매우 중요한 탈인산화효소로서 이를 저해하게 되면 세포분열이 저해되고 결국 세포사멸로 이어져 항암 작용을 하게된다. CDC25B는 위암, 폐암, 뇌암 및 후두암, 그리고 유방암 등의 종양에서 과발현되고 있으며, CDC25B의 과발현 정도가 큰 환자들이 생존률이 낮은 것으로 보아 CDC25B 효소저해에 근거한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 암세포 억제에 매우 유용할 것으로 판단된다.
따라서, 상기 화학식 1로 표시되는 3-메칠-(O-치환된 옥시이미노)-피라졸린-5-온 유도체는 부작용이 적은 저독성 항암제로서 사용이 가능하다.

Claims (3)

  1. 다음 화학식 1로 표시되는 3-메칠-(O-치환된 옥시이미노)-피라졸린-5-온 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이 함유된 것임을 특징으로 하는 항암제 :
    [화학식 1]
    상기 화학식 1에서,
    R1은 C1∼C4 알킬기 또는 치환된 페닐기이며, 여기서 치환된 페닐기는 수소원자, 할로겐원자, C1∼C4 알킬기, C1∼C4 알콕시기, C2 ∼C4 아실기 및 니트로기 중에서 선택된 하나 또는 둘 이상 치환된 페닐기이고;
    R2는 C1∼C4 알킬기, C2∼C4 알케닐기, C2 ∼C4 알키닐기, C2∼C4 아실기, 메탄설포닐기, 톨루엔설포닐기, C1∼C4 알콕시카보닐메틸기, 카복시메틸기, 또는 상기한 카복시메틸기의 무기금속 또는 유기아민의 염이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은
    4-메톡시이미노-3-메틸-1-페닐-피라졸린-5-온 (화합물번호 1)
    3-메틸-1-페닐-4-n-프로폭시이미노-피라졸린-5-온 (화합물번호 2)
    3-메틸-1-페닐-4-i-프로폭시이미노-피라졸린-5-온 (화합물번호 3)
    3-메틸-1-페닐-4-프로파질옥시이미노-피라졸린-5-온 (화합물번호 4)
    4-에톡시카보닐메틸이미노-3-메틸-1-페닐-피라졸린-5-온 (화합물번호 5)
    4-암모늄옥시카보닐메틸이미노-3-메틸-1-페닐-피라졸린-5-온 (화합물번호 6)
    3-메틸-1-페닐-4-트리에틸암모늄옥시카보닐메틸이미노-피라졸린-5-온 (화합물번호 7)
    3-메틸-4-모포리늄옥시카보닐메틸이미노-1-페닐-피라졸린-5-온 (화합물번호 8)
    3-메틸-1-페닐-4-포타슘옥시카보닐메틸이미노-피라졸린-5-온 (화합물번호 9)
    3-메틸-4-메틸카보닐메틸이미노-1-페닐-피라졸린-5-온 (화합물번호 10)
    3-메틸-4-n-프로폭시이미노-1-(3-톨릴)-피라졸린-5-온 (화합물번호 11)
    4-메톡시이미노-1-(4-메톡시페닐)-3-메틸-피라졸린-5-온 (화합물번호 12)
    4-알릴옥시이미노-1-(2-클로로페닐)-3-메틸-피라졸린-5-온 (화합물번호 13)
    1-(2,4-디클로로페닐)-4-메톡시이미노-3-메틸-피라졸린-5-온 (화합물번호 14)
    1-(2,4-디클로로페닐)-3-메틸-4-n-프로폭시이미노-피라졸린-5-온 (화합물번호 15)
    1,3-디메틸-4-프로파질옥시이미노-피라졸린-5-온 (화합물번호 16)
    1,3-디메틸-4-메틸카보닐메틸이미노-피라졸린-5-온 (화합물번호 17) 및
    1,3-디메틸-4-메탄설포닐옥시이미노-피라졸린-5-온 (화합물번호 18) 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 항암제.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 (E)-이성체인 것임을 특징으로 하는 항암제.
KR10-2003-0067964A 2003-09-30 2003-09-30 3-메칠-(ｏ-치환된 옥시이미노)-피라졸린-5-온 유도체를함유하는 항암제 KR100535951B1 (ko)

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