KR100519695B1 - 포도와 오이 혼합액을 이용한 동충하초 균사체 액상배양액을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포도와 오이 혼합액을 동충하초 균사체로 배양한 배양액을 포함하는, 티로시나제 저해 효과가 있는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 티로시나제 저해 효과, 즉 피부 미백 효과가 크게 향상된 피부 미백용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

Description

포도와 오이 혼합액을 이용한 동충하초 균사체 액상 배양액을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물 {Cosmetic Composition For Skin Whitening Comprising Submerged-Liquid Culture Of Paecilomyces japonica Mycelia with a Mixed Juice of Grape and Cucumber}

본 발명은 포도 및 오이를 이용한 누에 동충하초(Paecilomyces japonica) 균사체 액상 배양액을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

상세하게는, 본 발명은 포도와 오이 혼합액을 동충하초 균사체로 액상 배양한 배양액을 포함하는, 항암 및 신생혈관 억제 및 항혈액응고 효과를 나타내는 피세탄놀(piceatannol)과 퀘르세틴(quercetin)의 함량이 높고 티로시나제 저해 활성을 갖는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 사람의 피부가 검게 변화되는 것은 여러 원인이 있지만, 주요인은 자외선에 피부가 노출되어 피부세포의 일종인 멜라노사이트 내에서 멜라닌이 합성된 후 방출되어 피부 표피가 검게 된다. 티로시나제가 멜라노사이트 내의 티로신을 기질로 하여 작용하여 도파퀴논을 생성시키며, 계속적인 산화반응에 의해 도파크롬을 거쳐 멜라닌의 단량체인 5,6-디히드록시인돌과 5,6-디히드록시인돌-2-카르복실산이 생성되며, 이들의 공중합에 의해 흑색 색소인 멜라닌이 생성된다.

이와 같은 멜라닌 생성 메카니즘의 이해는 멜라닌 조절 기구를 통하여 색소 침착의 발생을 방지하기 위한 미백제 개발에 매우 중요하다. 피부 흑변화를 방지하기 위하여 멜라닌 생성과정 중의 일부 반응을 억제함으로써 멜라닌의 생성을 감소시키는 방법이 널리 사용되고 있다. 이것은 티로시나제의 활성을 억제함으로써 가능하다. 따라서, 티로시나제 활성 억제 물질은 메라닌 생성을 억제하여 피부 미백 효과를 갖는다고 할 수 있고, 이러한 사실은 문헌에 공지되어 있다 (J. Soc. Cosmet. Chem. 42, 361, 1991 참조).

현재 티로시나제의 활성을 억제하는 물질을 탐색하는 연구가 집중되고 있으며, 지금까지 개발된 티로시나제 활성 억제 물질의 대표적인 예는 코직산, 알부틴, 비타민 C, 히드로퀴논, 식물 추출물 등이다. 그러나, 코직산은 티로시나제의 활성 부위에 존재하는 구리 이온을 킬레이팅시켜 효소활동을 억제하는 작용을 하고, 그 억제 효과는 우수하지만 화장품에 배합시 안정성이 낮아 화장료로서 적당하지 않다. 비타민 C 및 그 유도체는 티로시나제 활성 억제 효과가 낮고, 히드로퀴논은 미백작용이 비가역적이고 피부 자극이 크기 때문에 안전성 문제로 그 사용이 제한되고 있으며, 최근에는 발암성이 인정되어 화장품 원료로는 사용이 금지되고 있다. 대부분의 식물 추출물의 경우에는 고농도에서만 비교적 높은 티로시나제 활성 억제 효과를 나타내고, 저농도에서는 억제 효과가 거의 나타나지 않는다.

포도는 생혈, 조혈작용을 하는 과실이며 알카리성 식품으로, 전화당, 주석산, 포도산, 탄닌, 칼슘 등의 성분을 함유하고, 비타민류도 A, B₁, B₂, C, D 등이 풍부하다. 또한, 포도는 여성 미용에 영향을 주는 화합물이 존재한다. 자흑색 포도에 많이 존재하는 비타민 B₁은 신경조직의 중요한 영양분으로서 이것이 부족하면 각기병의 원인이 되고, 심장이나 혈관 계통의 장애, 부종, 마비현상이 일어나는 다발성 신경염 등 여러 가지 증상이 일어난다.

또한, 포도에는 다양한 생리활성을 갖는 폴리페놀계 화합물이 포함되어 있다. 이들 중 레스베라트롤(resveratrol)은 체내에 흡수된 후 대사과정을 통해 피세탄놀(piceatannol)로의 변환 과정을 거침으로써 암세포만을 특이적으로 공격해 사멸시키는 항암작용을 유도시킨다 [Science 275, 218, 1997 및 British Journal of Cancer 86, 774, 2002]. 붉은 포도에 함유되어 있는 퀘르세틴(quercetin)은 전립선암을 예방하고 항혈액응고 효과가 있는 것으로 밝혀졌다 [Am. J. Surg. 158, 351, 1989; Food Chem. Toxicol. 33, 1061, 1995].

또한, 포도가 피부 미백 효과를 갖는다는 보고가 있지만 포도 자체만으로는 그 효과에 한계가 있기 때문에, 피부 미백 효과를 향상시키는 기술개발이 요구되고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 포도와 오이를 동충하초 균사체로 액상 배양하여 피부 미백 효과를 가질 뿐만 아니라 항암, 신생혈관 억제 및 항혈액응고 효과도 갖는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 포도와 오이를 적절히 배합한 혼합액을 동충하초 균사체로 액상 배양함으로써 티로시나제 저해 활성이 증가된다는 사실을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 포도와 오이 혼합액을 동충하초 균사체로 배양한 배양액을 포함하는, 피세탄놀 및 퀘르세틴의 함량이 증가하고 티로시나제 저해 효과, 즉 피부 미백 효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물은 포도와 오이의 혼합액에 동충하초 균사체를 배양한 후 이를 여과하여 생리활성 물질 함량이 높고, 티로시나제 저해 활성 등이 우수한 배양액을 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물에 포함되는 포도와 오이 배양액의 제조는 균사체를 종배양한 후, 이를 사용하여 본 배양을 실시할 수도 있다. 구체적으로, 종배양을 위해 멸균/냉각 처리한 포도와 오이의 혼합액을 멸균후 상온으로 냉각하고, 동충하초 균사체를 접종하고 배양한다. 본배양을 위해 상기 단일 혼합액을 배양기에 넣고 멸균/냉각한 후, 종배양액을 접종하여 진탕배양하고, 이어서 배양액을 여과하여 본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물에 사용되는 배양액을 얻을 수 있다.

상기 포도/오이 배양액 제조에 사용되는 포도와 오이 혼합액 중 오이의 함량은 혼합액의 총부피를 기준으로 30 내지 70 부피%, 바람직하게는 40 내지 70 부피%,, 보다 바람직하게는 50 내지 70 부피%이다. 오이가 30 부피% 미만이면 충분한 미백 효과를 얻을 수 없고, 오이가 70 부피%를 초과하면 피세탄놀 등의 유효 성분의 함량이 저하될 수 있다.

상기 배양시에 혼합액에는 추가로 동충하초 영양분으로서 필요한 최소량, 예를 들어 혼합액의 1 부피% 이하의 감자즙을 포함시킬 수도 있다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면 포도(49.5 부피%)와 오이(49.5 부피%) 혼합액에 감자즙 1 부피%를 포함시킬 수 있고, 이러한 비율은 목적하는 최종 배양액 성분에 따라 변경 가능하다

특히, 본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물은 피세탄놀, 퀘르세틴과 같은 생리활성 물질의 함량이 높을 뿐만 아니라, 멜라닌 생합성 저해 활성, 구체적으로 티로시나제 활성 저해 효과가 우수하여 피부 미백 효과도 얻을 수 있다. 티로시나제 활성 저해 활성이 피부 미백에 우수한 효과를 갖는다는 것은 상기한 바와 같이 이미 문헌에 의해 공지된 바 있다.

본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물은 상기 제조한 포도/오이 배양액을 여과한 후 여과된 배양액 자체를 피부에 도포함으로써 소기의 피부 미백 효과를 얻을 수도 있으며, 다양한 형태의 화장품 제조를 위해 사용되는, 화장품 업계에 공지된 임의의 적합한 소정량의 기타 첨가제와 함께 그 용도에 따라 적절한 형태로 제조되어 사용될 수 있다.

상기 본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 유연 화장수, 영양 화장수, 엣센스, 영양 크림, 젤형 크림, 맛사지 크림 또는 팩 형태로 용이하게 제조될 수 있으며, 이로 제한되지 않는다.

포도 및 오이는 널리 식용되고 있는 모든 품종을 본 발명에 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서 사용된 포도는 당도가 13-15 브릭스(Brix)인 켐벨 품종을, 오이는 가시오이를 시중에서 구입하여 사용하였다.

본 발명에서 사용된 포도즙은 고온, 예를 들어 100℃에서 일정 시간, 예를 들어 30분간 끓인 후 압착여과하여 얻은 것을, 오이는 예를 들어 실온에서 압착여과하여 얻은 것을 사용할 수 있다.

발효에 사용한 균주로서 누에 동충하초(Paceilomyces japonica) 균사체를 경상남도 농업기원에서 분양받아 사용하였으며, 멜라닌 생합성 저해 활성, 구체적으로 티로시나제 저해 활성은 버섯 티로시나제 (EC 1. 14. 18. 1)을 Sigma사에서 구입하여 사용하였다.

본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물에 함유된 생리활성 폴리페놀계 화합물을 구명하기 위하여 사용한 피세탄놀을 비롯한 17종의 표준물질은 Sigma사에서 구입하여 사용하였다. 티로시나제 저해 활성 측정에 이용된 96웰 플레이트는 NUNC^TM을 사용하였고, 마이크로플레이트 판독기는 Bio-Rad 3550을 사용하였다. 성분 분석에 이용된 컬럼관은 Hewlett Packard C18 (200 ×4.5 mm, 5.0 ㎛ 입경)을 사용하였다. HPLC는 Waters Liquid Chromatography(Model 2690)을 사용하였고, 검출기는 UV 검출기를 사용하였다.

이하의 실험예에서 본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물에 대한 시험예를 상세하게 설명한다.

<실험예 1> 티로시나제 활성 저해 효과 조사

티로시나제 활성에 대한 저해역가는 시료 15 ㎕를 96웰 마이크로플레이트에 넣고, 0.1 M 인산염 완충액(pH 6.5) 150 ㎕와 1.5 mM L-티로신 용액 25 ㎕를 넣은 후, 2100 unit/ml 버섯 티로시나제(Sigma, 0.05 M 인산염 완충액, pH 6.5) 7 ㎕를 첨가하여 30℃에서 10분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 판독기(Bio-Rad 3550)를 사용하여 490 nm에서 측정하였다. 티로시나제에 대한 저해율(%)은 다음 식에 의하여 계산하였으며, IC₅₀ 값은 효소활성 저해율 50%에 달하는 저해물질의 농도로 결정하였다.

A : 저해제를 첨가한 시료의 반응전 흡광도

B : 저해제를 첨가한 시료의 반응후 흡광도

C : 저해제를 첨가하지 않은 시료의 반응전 흡광도

D : 저해제를 첨가하지 않은 시료의 반응후 흡광도

<실험예 2> HPLC를 이용한 생리활성 폴리페놀계 화합물 조사

분석기기

2개의 펌프를 갖는 자동 구배 (gradient) 조절기가 장착된 Waters사의 HPLC(model 2690)를 사용하였으며, 검출기는 Waters사의 검출기(model 996)를 사용하였다. 컬럼은 Hewlett Packard사에서 시판하는 C18(200 × 4.5 mm, 5.0 ㎛ 입경) 컬럼을 이용하였다. 데이터 저장과 평가는 워크스테이션(Workstation) 810 소프트웨어(Water사)와 개인용 컴퓨터를 이용하여 실시하였다.

표준물질

생리활성 폴리페놀계 화합물 분석을 위하여 사용한 표준물질(갈산, 프로토카테큐산, (+)-카테킨, (-)-에피카테킨, 2,5-디히드록시벤즈알데히드, 카페인산, 바닐린산, 시린진산, 시링알데히드, p-쿠마르산, 피세탄놀, 레스베라트롤, 미리세틴, 퀘르시트린, 퀘르세틴, 칼페롤)은 Sigma사 제품을 사용하였으며, 용매로는 메탄올을 사용하였으며 농도는 200 ppm이 되도록 하였다. 모든 용액을 0.45 ㎛ 막(Millipore사 제품)으로 여과하고, 사용 전에 용액내 기체를 제거하였다.

시료 조제

분석용액 25 ml을 0.1M HCl 용액으로 pH가 2가 되도록 맞추고, 디에틸에테르 (50 ml ×3)로 추출하였다. 유기층을 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 농축하였다. 메탄올을 사용하여 농축 잔류물이 800 ppm이 되도록 하였다. 모든 용액은 0.45 ㎛ 막으로 여과하고 사용 전에 용액내 기체를 제거하였다.

분석 조건

모든 시료는 20 ㎕씩 주입하였다. A 용매계(물:초산:메탄올 = 88:2:10)와 B 용매계(물:초산:메탄올 = 8:2:90)를 농도 구배로 사용하여 용리하였다. 즉, 0∼15분까지는 A 용매계가 85%, B 용매계가 15%가 되도록 하였다. 15 내지 25분까지는 A 용매계가 50%, B 용매계가 50%가 되도록 용리하였다. 25 내지 34분까지는 A 용매계가 20%, B 용매계가 80%가 되도록 용리하였다. 유속은 0.7 ml/min이 되도록 하였으며 UV 검출기 파장은 280 nm 영역을 사용하였다. 본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물의 유효성분의 확인은 도 6에 나타낸 표준물질의 체류 시간을 비교하여 확인하였으며, 최종 확인은 확인하고자 하는 표준물질을 내부기준물질로 사용하여 확인하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들에게만 한정하는 것은 아니다.

<실시예> 동충하초 균사체를 이용한 포도/오이즙 혼합액의 액상 배양액의 제조

시중에서 구입한 15 브릭스의 켐벨 품종 포도를 100℃에서 30분간 가열한 후 압착여과하여 포도즙을 얻고, 시중에서 구입한 오이를 잘 세척한 후 압착 여과하여 오이즙을 제조하였다. 종배양은 감자즙액 1%, 포도 49.5%와 오이 49.5%의 혼합액 400 ㎖를 1ℓ 삼각 플라스크에 넣고 121℃에서 15분간 멸균하고, 실온까지 냉각시켰다. 이때 혼합액의 pH는 3.58이었고, 당도는 8 브릭스이었다.

멸균된 혼합액 400 ml에 100 mm 배양접시 분량의 균사체 (누에 동충하초) 1/2의 분량을 무균상태에서 접종시켰다. 균사체가 접종된 혼합액을 25℃에서 진탕배양시켰다. 배양 후 3일부터 동충하초 균사체 비드가 보이기 시작하여 7일 이후부터는 배양용기의 2/3 수준까지 생성되었다. 배양 전후에 산도의 변화는 거의 없었으며, 당도는 8 브릭스에서 7 브릭스로 낮아졌다. 배양시간은 12∼16일이 소요되었다.

본배양 방법으로서, 시중에 유통되는 18ℓ 음용수통에 1%의 감자즙액, 49.5%의 포도즙액과 49.5%의 오이즙액 혼합액 15ℓ를 넣고 솜 마개로 봉한 후, 121℃에서 30분간 멸균한 다음 상온으로 냉각하고 종배양액 400 ml을 접종하여 25℃에서 120 rpm으로 진탕배양하였다. 배양이 완료된 배양액은 거름종이(No. 2)로 2회 여과한 후, 거름종이 (NO. 5)로 2회 여과하여 맑은 암자색의 발효액을 얻었다.

본 실시예에서 얻어진 배양액의 배양 시간별 티로시나제 저해 활성 정도를 상기한 바와 같이 측정하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 도시한 바와 같이, 본 발명의 발효액은 멜라닌 생합성 저해 활성, 구체적으로 티로시나제의 활성을 강력하게 저해하여 피부 미백 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다.

또한, 본 실시예의 배양액에는 동충하초 균사체 액상 배양 전에는 항암 효과와 항혈액응고, 신생혈관 억제 효과가 있다고 이미 밝혀진 피세탄놀과 퀘르세틴이 3 ppm 이하로 존재하였으나, 발효 후에는 피세탄놀과 퀘르세틴의 함량이 각각 64 ppm과 38 ppm으로 10∼15배 증가하였다. 따라서, 본 발명의 포도/오이 배양액을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물은 피부 미백 효과 뿐만 아니라 상기 활성 성분에 의한 항암 효과 등도 보일 수 있을 것으로 기대된다 (도 2).

<제조예>

이하에서 본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물의 제조예를 설명한다. 이들 제조예는 당업계에 공지된 방법으로 제조할 수 있으며, 각각의 조성 및 함량은 본 발명을 설명하기 위해 선택된 예로서 본 발명의 범위가 이로 제한되는 것은 아니다.

<제조예 1>

본 발명의 포도/오이 발효액을 함유한 유연 화장수(스킨)의 제조예는 다음과 같다.

성분	함량 (단위: 중량%)
발효액	45
글리세린	5.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
피이지 1500	1.0
알란토인	0.1
DL-판테놀	0.3
EDTA-2NA	0.02
벤조페놀-9	0.04
소듐 히아루로네이트	5.0
에탄올	10.0
옥틸도데세스-16	0.2
폴리솔베이트 20	0.2
방부제, 향, 색소	미량
증류수	잔량
합계	100

<제조예 2>

본 발명의 포도/오이 발효액을 함유한 영양크림의 제조예는 다음과 같다.

성분	함량 (단위: 중량%)
발효액	35
친유형 모노스테아린글리세린	2.0
세테아릴알콜	2.2
스테아린산	1.5
밀납	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6
경화식물유	1.0
스쿠알란	3.0
광물유	5.0
트리옥타노인	5.0
디메치콘	1.0
소듐마그네슘실리케이트	0.1
글리세린	5.0
베타인	3.0
트리에탄올아민	1.0
소듐 히아루로네이트	4.0
방부제, 향, 색소	미량
증류수	잔량
합계	100

<제조예 3>

본 발명의 포도/오이 발효액을 함유한 맛사지 크림의 제조예는 다음과 같다.

성분	함량 (단위: 중량%)
발효액	30.0
친유형 모노스테아린산글리세린	1.5
스테아린알콜	1.5
스테아린산	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6
이소스테아릴이소스테레이트	5.0
스쿠알란	5.0
광물유	35.0
디메치콘	0.5
히드록시에틸 셀룰로오스	0.12
글리세린	6.0
트리에탄올아민	0.7
방부제, 향, 색소	미량
증류수	잔량
합계	100

<제조예 4>

본 발명의 포도/오이 발효액을 함유한 엣센스의 제조예는 다음과 같다.

성분	함량 (단위: 중량%)
발효액	28.0
글리세린	5.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.25
신탄검	0.10
카르복시비닐폴리머	0.30
방부제, 향, 색소	미량
증류수	잔량
합계	100

<제조예 5>

본 발명의 포도/오이 발효액을 함유한 팩의 제조예는 다음과 같다.

성분	함량 (단위: 중량%)
발효액	32.0
폴리비닐알콜	15.0
셀룰로오스 검	0.15
글리세린	3.0
피이지 1500	2.0
사이크로데스트린	0.15
DL-판테놀	0.4
알란토인	0.1
글리시리진산모노암모늄	0.3
니코틴아미드	0.5
에탄올	6.0
피이지 40 경화피마자유	0.3
방부제, 향, 색소	미량
증류수	잔량
합계	100

<비교예 1>

알부틴을 함유한 엣센스의 제조예는 다음과 같다.

성분	함량 (단위: 중량%)
알부틴	1.0
글리세린	5.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.25
신탄검	0.10
카르복시비닐폴리머	0.30
방부제, 향, 색소	미량
증류수	잔량
합계	100

상기 제조한 본 발명의 발효액을 포함하는 피부 미백 화장료 조성물의 미백 효과를 실제 사용 시험을 통하여 평가하였다. 실시예 1에서 제조한 맑은 암자색의 여과된 배양액, 제조예 4의 엣센스와 비교예 1의 엣센스를 20 내지 30세의 12명의 피시험대상에게 매일 2회씩 세안 후 적당량을 안면에 40일 동안 도포한 후, 육안으로 피부를 평가하였다. 판정 기준과 시험 결과는 다음과 같다.

판단기준

등급	미백 효과 수준
x	없음
-	낮음
+	높음
++	매우 높은

시험 결과

시험 대상	실시예 1의 배양액	제조예 1	비교예 1
1	++	++	+
2	++	+	+
3	++	+	-
4	++	+	x
5	++	+	-
6	++	++	+
7	++	+	+
8	+	-	-
9	++	+	+
10	++	++	-
11	++	+	-
12	++	+	+

상기 시험 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 티로시나제 저해 활성을 갖는 본 발명의 피부 미백 화장용 조성물은 비교예에 비해 개선된 피부 미백 효과를 갖는다는 것이 입증되었다.

상기 설명한 바와 같이, 본 발명에 따라 포도와 오이의 혼합액을 동충하초 균사체로 액상 배양한 발효액을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물은 항암, 항혈액응고 효과가 있는 피세탄놀과 퀘르세틴을 다량 함유할 뿐만 아니라 티로시나제 저해 효과, 즉 피부 미백 효과가 크게 향상된 것으로 밝혀졌기 때문에, 우수한 피부 미백용 화장료 조성물로서 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 바람직한 제조 방법의 일실시예를 공정별로 도시한 개략도.

도 2는 포도 및 오이의 혼합액을 동충하초 균사체로 액상배양한 배양액의 성분 분석 결과 나타낸 HPLC 그래프.

도 3은 포도 및 오이의 혼합액에 동충하초 균사체를 배양한 시간에 따른 티로시나제(tyrosinase) 저해 활성 그래프.

Claims (2)

1. 포도와 오이 혼합액을 누에 동충하초 (Paecilomyces japonica) 균사체로 배양한 피세탄놀 및 퀘르세틴 함유 배양액을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 유연 화장수, 영양 화장수, 엣센스, 영양 크림, 젤형 크림, 맛사지 크림 또는 팩 형태의 피부 미백용 화장료 조성물.