KR100495374B1 - 형광, 인광 측정장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 형광 측정장치, 인광 측정장치의 노이즈를 저감시켜, 장치 또는 시료용기에 유래하는 백그라운드를 내려 결과적으로 계측시의 S/N 비가 증대하여 장치최소 검출감도를 높일 수 있고, 또한 고신뢰성, 저비용의 형광, 인광 측정장치를 제공한다.

형광 측정장치 또는 인광 측정장치에 있어서 시료의 분석측정을 행할 때, 광원으로부터 발생하는 여기광의 시료까지의 광로와 시료로부터 발생하는 형광 또는 인광의 검출부까지의 광로의 양자를 차단한다. 1개의 초퍼에 의하여 이를 행한다.

Description

형광, 인광 측정장치{FLUORESCENCE, PHOSPHORESCENCE MEASURING APPARATUS}

발명은 여기광을 조사한 측정대상 시료로부터 발생하는 형광 또는 인광을 측정하는 장치에 관한 것으로, 특히 간단한 구성으로, 높은 검출감도, S/N 비를 얻을 수 있는 형광, 인광 측정장치에 관한 것이다.

형광, 인광 측정장치는, 여기램프 또는 레이저광 등의 여기광을 측정대상 시료에 조사하면, 시료의 성분, 구조에 따른 조사한 여기광의 파장과는 다른 파장의 발광이 관찰되는 현상을 이용하여 측정대상물 중의 목적성분을 검출하는 장치이다.

실제의 측정장치에 있어서는, 시료에 유래하는 목적의 발광 측정시에 여기광이 시료용기, 개재하는 렌즈, 필터 등에 조사됨으로써, 목적 이외의 발광, 형광 또는 인광이 측정되어, 측정값의 S/N 비가 저하하는 일이 있다. 또 조사광의 대치(對峙)측에서 측광을 행한 경우, 여기광의 잔광이 측광기에 입사되고, 마찬가지로 S/N 비가 저하하는 일이 있다. 즉 시료에 유래하지 않는 형광 또는 인광(이하 측정간섭광이라 함)은, 원래 시료 중에 측정 대상물이 포함되어 있지 않음에도 불구하고, 마치 시료 중에 측정 대상물이 있는 것처럼 분석측정이 이루어져, 잘못된 판단이 이루어질 가능성이 있다. 또 산란광 또는 측정 간섭광의 강도에 불균일이 있기 때문에 결과적으로, 적용한 분석 측정법 또는 측정장치의 최소검출 한계를 현저하게 저하시키게 된다.

종래, 이 램프, 레이저, 개재하는 렌즈, 필터 또는 시료용기 유래의 산란광 또는 측정을 방해하는 간섭광을 저감시킬 목적으로, 미리 형광분석 등을 행하여 더욱 측정 간섭광이 작은 원료를 선택하여 그 재료로 하는, 재료를 얇게 하는 등에 의하여 재료의 사용량을 줄이는, 또는 재료 표면의 코팅을 행하여 왔다. 또 램프, 레이저는 조사종료후, 되도록이면 잔광이 남지 않도록, 전압, 형상, 가스압 등을 검토하여 개량이 가해졌다. 측광방법에 관하여 여기광 조사의 방향이 측광의 방향과 일치하는 투과면 형광 측정방식 외에, 방향이 일치하지 않고, 램프, 레이저 유래의 광을 직접 검출부에 받아 들이지 않는 측면 형광 측정방식, 조사면 형광 측정방식 등이 적절하게 선택되어 사용된다. 또는 형광체, 발광체의 개발에 의하여 여기광 파장과 형광 또는 인광파장의 차, 이른바 스톡스 시프트를 크게 하여 파장선택 필터를 개재시켜 여기광 파장과 인접하는 파장의 빛의 검출을 회피하는 시도도 이루어졌다. 또 형광발광, 인광발광 지속시간이 긴 발광체를 사용하여 여기광 조사시간과는 다른 시간에 형광 또는 인광측정을 행하는 시간분해 측정방법도 개발되었다. 최근 특히 스톡스 시프트가 크고, 발광지속 시간이 긴 유로퓸 등 희토류의 원소를 사용한 발광체의 개발이 진전되어, 그것을 측정 대상물에 표식하여 분석측정을 행하는 방법도 개발 개량이 이루어졌다.

그러나 어느 방법에 있어서도 산란광 또는 측정을 방해하는 간섭광 등을 충분히 저감, 또는 없애는 것에 이르고는 있지 않고, 시료 이외의 물건에 유래하는 간섭광의 발생은 회피되지 않는 것이었다.

시간분해 형광 측정법에 있어서는, 여기광을 측광기에 도입되지 않기 때문에 여기광의 소등되고 있는 시간에 형광 측광시간을 설정하는 것이 통상법(常法)이었다. 예를 들면 1000Hz에서 플래시 램프를 0.01m(밀리미터)초간 점등시켜 램프의 점등후의 0.4m초로부터 0.8m초까지의 사이를 계측하여, 1m초 사이클로 측광을 행하여, 1초간 분의 광량을 적산하여 데이터 표시하는 것이 일반적 방법이다.

형광 측정장치 또는 인광 측정장치에 있어서는, 광원으로서 텅스텐 램프, 수은 램프, 아르곤가스 램프, 크세논 플래시 램프, 질소가스 레이저 또는 아르곤가스 레이저 등이 사용되고 있다. 목적 이외의 빛이 시료에 조사되는 것을 차단하는 방법으로서, 차광판 또는 광로 차단판(이하, 초퍼)을 사용하는 일이 있다. 원반형상의 흑판이 있는 원주상에 일정한 크기의 간극을 만들고 흑판을 회전시켜 이 간극을 통해서만 광원으로부터 발생하는 여기광을 통과시킴으로써, 일정한 시간간격의 여기광을 시료에 조사시키는 것이다.

램프광원은 소등시 빛이 순간에 없어지는 일은 없고, 광원의 중심은 잠시 밝기를 작게 하고 있어, 그 때문에 전압을 오프한 후에도 광원은 빛을 발하고 있는 것이 일반적이다. 이 전압을 오프한 후의 잔광은 때로는 광원측 또는 검출부측의 렌즈, 필터, 시료, 또는 시료용기를 발광시켜 계측시의 노이즈 또는 백그라운드를 높히는 요인이 되고 있다. 또한 이 잔광은 광원으로부터 발생되는 빛의 원래의 파장과는 다른 것이기 때문에 여기광과 형광 또는 인광을 그 파장을 가지고 분리하고자 하는 경우, 이 잔광은 때로는 형광 또는 인광과 동일하거나 인접한 파장을 가지는 일이 있어, 계측시의 노이즈를 올리는 요인이 되고 있다. 이 광원의 잔광을 제거할 목적으로 초퍼의 간극의 종료가, 광원의 전원의 차단과 동시거나 그것에 앞서 이루어지도록 설정할 수도 있다.

시간분해 형광 측정방법에 있어서는, 시료에의 여기광 조사시간과, 시료로부터 발생하는 형광 또는 인광의 계측시간이 달라져, 이에 의하여 여기광에 유래하는 노이즈의 계측을 감소시켜 계측을 감도 좋게 행하고자 하는 것이다. 이들 노이즈 또는 백그라운드를 저감할 목적으로, 시료 또는 광원측의 렌즈, 필터의 앞에 초퍼를 놓고, 목적 외의 빛이 시료에 조사되는 것을 방해하고 있다. 초퍼의 간극과 전원의 온/오프는 동조시킨다.

또한 광원으로부터 발생한 빛의 조사를 받은 렌즈, 필터 또는 미러는 광산란을 일으키는 일이 있다. 산란광은 이것을 시료에 조사되지 않도록 하는 것이 좋다. 또는 전류를 오프한 후의 램프 잔광이 시료에 조사되는 것을 방지할 목적으로 램프와 시료를 연결하는 광로에 초퍼를 두고 물리적으로 광원으로부터 발생하는 필요 이외의 빛의 차단을 행하고 있다. 이에 의하여 램프 소등시 또는 여분의 빛의 시료에의 진입이 방해되어 시료는 목적의 에너지를 얻어서만 형광 또는 인광을 발한다.

마찬가지로 물리적 초퍼설치 또는 전기 회로적 셔터설정에 의하여 여기광의 광량 검출기에의 조사를 방지하고 있다. 이들에 의하여 여기광에 유래하는 노이즈의 저감 및 여기광 조사에 계속해서 발생하는 광원의 잔광, 렌즈, 필터, 미러 또는 시료 홀더에 유래하는 잔광 또는 산란광을 제거할 수 있다.

이와 같은 초퍼를 사용한 시간분해 형광 검출방법으로서 일본국 특개평10-267844호공보 기재의 기술이 알려져 있다. 이 기술은 여기광의 광원을 연속 광원으하여 시료에 입사시키는 빛을 펄스광으로 하기 위하여 제 1 초퍼를 사용하고, 시료로부터 투과하여 온 빛 중, 원하는 형광, 인광만을 검출하기 위하여 제 2 초퍼를 사용한다는 것이다. 이 방법에 의하여 광원의 잔광, 렌즈, 필터, 미러 또는 시료 홀더에 유래하는 잔광 또는 산란광을 효율 좋게 제거할 수 있다.

상기 일본국 특개평10-267844호 공보기재의 기술에서는 2개의 초퍼를 독립하여 설치하고, 이들을 PLL 회로 등에 의하여 동기하여 제어할 필요가 있어, 장치의 복잡화, 고비용화를 초래하고 있었다.

본 발명의 목적은 초퍼를 광원으로부터 검출부에 이르는 광로의 복수부분에 삽입하여 효과적으로 시료만으로부터 발하는 형광 또는 인광을 계측 가능하고, 또한 이에 관한 초퍼를 1매로 함으로써, 구조가 간단하기 때문에 고장이 적고, 저비용이며, 또한 고감도, 높은 S/N 비에서의 측정이 가능한 형광, 인광 측정장치를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 형광 측정장치 또는 인광 측정장치에 있어서는, 시료의 분석측정을 행할 때, 광원으로부터 발생하는 여기광의 시료까지의 광로와 시료로부터 발생하는 형광 또는 인광의 광량 검출부까지의 광로를 1매의 차광판을 사용하여 각각 차단하는 것을 행한다.

광로가 여기광과 검출측의 양쪽에서 차단되는 경우, 여기광 광원이 반드시 광원의 플래싱(점등 소등의 반복) 또는 펄스발생을 행할 필요가 없고, 연속한 점등이 가능하게 된다. 이에 의하여 시료에 조사되는 광량의 증감은 원반형상의 초퍼이면 빛을 통과시키는 간극의 대소와 원반 회전속도에 의하여 제어 가능하게 된다.

최근, 레이저장치의 진전, CCD 카메라, 포토다이오드 어레이, 광전자 증배관등의 영상처리기술의 진보는 현저한 바가 있다. 또 마이크로칩 또는 마이크로장치를 사용하여 유전자, 단백질 등, 생물 유래의 물질의 초미량 분석기술이 크게 이루어지려고 하고 있다. 시료 분석측정을 마이크로장치로 행하는 경우, 파이프형상 또는 오목형상의 용기에 있는 시료는 레이저에 의하여 여기광의 조사를 받은 후, 발생한 인광 또는 형광은 측광기에 의하여 측광계측을 받고, 또는 CCD 카메라의 화상에 포착되어 데이터처리후, 계측값을 표시하거나 이것을 가지고 시료의 분석을 행한다.

렌즈 또는 필터는 빛의 조사에 의하여 형광 또는 인광을 발하는 것이 있음이 알려져 있다. 검출부측에 있는 렌즈 또는 필터에는 여기광이 닿지 않도록 하는 것이 바람직하다. 빛의 반사(광로변경) 또는 집속, 확산이 필요한 경우, 미러에 의하여 이것을 행한다. 반사경의 알루미늄 금속재는 형광 또는 인광을 발하지 않는 것이 확인되고 있다.

이하, 본 발명의 형광 또는 인광 측정장치의 실시예를 도 1 내지 도 7을 사용하여 상세하게 설명한다.

(실시예 1)

도 1에 본 발명 실시예의 시스템 레이아웃도를 나타낸다. 펄스발생관원 등의 광원(1)으로부터의 빛은 렌즈계(2)에 의하여 집광되어, 여기용 파장성분만을 인출하는 선택필터(3)를 통과한 후, 집광 미러(4)로 집광되어 마이크로플레이트 등의 시료용기(5)에 분주된 시료(6)에 조사한다. 이 시료(6)로부터의 형광 또는 인광은 반대측 집광 미러(7)에 의하여 집광되어, 여기광인 단파장 광을 제거하고, 필요한 파장대의 빛을 인출하는 선택폭 필터(8)를 통과한 후, 렌즈계(9)를 통하여 광검출기 (10)에서 광량 변환된다.

모터(11), 초퍼 블레이드(12)에 대해서는 뒤에서 해설한다.

여기서 시료를 유로퓸과 그 착체, 및 표식된 단백질 등이라 할 때, 여기파장은 약 340nm(나노미터) 전후, 검출하는 형광 또는 인광의 파장은 615nm 전후로 설정된다.

반사경의 알루미늄 금속재는 형광, 인광을 발하지 않음이 확인되어 있다.

도 2에 본 시스템의 타이밍차트의 일례를 나타낸다.

광원으로부터의 펄스발광 여기광은, 약 O.O1m(밀리미터)초 전후와 아주 단기간뿐이다. 이 빛으로 여기된 시료로부터의 형광 또는 인광은 광원의 여기광 발생정지후 0.2m 내지 0.6m초 지연된 시점으로부터 광검출기의 게이트를 열고, 그후 약 0.4m 내지 0.8m초간 계측을 행하여 신호검출기의 게이트를 폐쇄하고, 다음의 여기광 발광의 타이밍으로 옮기도록 설정되어 있다.

여기서 형광 및 인광측정을 고감도로 행하고자 하면, 렌즈계나 필터로부터 발하는 형광, 인광성분이나 광원의 펄스여기 종료후의 잔광을 무시할 수 없게 되어 계측 노이즈가 되어 검출된다.

도 3에 측정 타이밍시의 모식도를 나타낸다.

광원(1)의 여기광으로 렌즈계(29), 필터(38) 등으로부터는 물질 특유의 형광, 인광이 반드시 발생한다. 또 광원의 잔광으로부터의 여기가 있어, 이 빛으로부터의 형광, 인광이 겹친다.

따라서 본 발명의 실시예에 의거하면, 상기 문제의 해결을 위하여 도 1의 시스템 레이아웃에 모터(11)와 이 모터축에 직결의 초퍼(12)를 설치하는 것이다.

이 초퍼는 도 4와 같은 구성으로 되어 있다. 즉, 광원과 피측정 시료 사이의 광로에 빛을 통과시키기 위한 슬릿부(13)와, 피측정 시료와 검출기 사이의 광로의 빛을 차단하기 위한 차광부(14)가 1쌍이 된 것이 복수개, 상기 차광판에 설치되어 있어, 1쌍의 슬릿부(13)와 차광부(14)는 원판형상의 차광판의 거의 반경방향 위에 있어서, 반경방향에서 다른 위치에 설치되어 있다. 슬릿부와 차광부의 반경방향의 위치관계는 광학계의 배치방법으로 자유롭게 설정 가능하다. 또 거의 반경방향위란, 거의 동일한 반경 위에 있다는 것이나, 거의란, 엄밀히 동일한 반경위치에 있을 필요는 없음을 의미하고 있다. 광원과 피측정 시료 사이의 광로에 빛을 통과시키기 위한 슬릿부(13)가 빛을 통하고 있는 타이밍과, 피측정 시료와 검출기 사이의 광로의 빛을 차단하기 위한 차광부(14)가 빛을 차단하고 있는 타이밍이 적어도 조금이라도 겹쳐져 있으면 본 실시예의 효과는 달성할 수 있다.

이 도면에서 안쪽의 슬릿(13)을 광원측의 집광광로에 삽입하고, 바깥쪽의 차광부(14)를 시료로부터 검출기 사이의 광로에 도면과 같이 삽입한다(도 8참조). 도 3에 측정 타이밍시의 모식도를 나타낸다. 광원의 펄스발생과 타이밍을 취함으로써 도 3과 같은 타이밍차트가 그려진다.

이 초퍼는 광원(1)이 시료(6)를 조사하고 있는 동안, 시료(6)로부터의 광검출기(10)에의 광로는 차단하여 광검출기(10)에는 빛을 유도하지 않는다. 또 시료(6)로부터의 빛을 검출기(10)측으로 도입하고 있는 동안은, 광원(1)의 빛은 시료(6)에는 조사하지 않는 구성으로 할 수 있다. 또 초퍼를 고속으로 회전함으로써 반복하여 측정의 시간을 짧게 할 수 있다. 또 슬릿의 여기광에 대한 개구시간을 충분히 짧게 할 수 있어, 광원으로서 연속광을 사용하여도 펄스 여기하는 것이 가능하다. 또한 광원으로서 플래시 램프 등의 펄스광원을 사용하는 경우는, 슬릿이 여기광 광로를 통과하는 타이밍으로 펄스광원에 대하여 트리거를 인가함으로써 마찬가지로 실시 가능하다. 이 경우, 슬릿통과의 모니터가 필요하여 도시 생략하고 있으나, 포토커플러 등을 사용하면 좋다.

(실시예 2)

도 5에 여기광의 광원으로부터 시료까지의 광로의 개방시, 시료로부터 검출부까지의 형광 또는 인광광로 차단시의 광원으로부터 발생한 빛의 광로를 나타낸다. 검출부에 있는 렌즈, 필터에 빛이 닿지 않아, 이들 부위에서 필요없는 산란광 또는 형광 또는 인광을 발생시키고 있지 않음을 알 수 있다.

도 6에 여기광의 광원으로부터 시료까지의 광로의 차단시, 시료로부터 검출부까지의 형광 또는 인광광로 개방시의 시료로부터 발생한 빛의 광로를 나타낸다. 시료로부터의 형광 또는 인광이 광검출기에 포획되어, 광원으로부터의 여기광 또는 산란광이 검출부에 닿고 있지 않음을 알 수 있다.

본 발명에 의한 백그라운드저감의 효과를 도 7에 모식도로 나타낸다. A는 단백질에 유로퓸에 적합한 착체를 거쳐 유로퓸 표식이 이루어진 시료를 사용하였을 때 키세논 플래시 램프에 의하여 여기된 시료는 인광을 방출한다. 인광은 시간과 함께 감쇠하나, 이 인광의 반감기는 비교적 길다. B는 본 발명을 사용하지 않고 초퍼를 사용할 때의 백그라운드 노이즈의 감쇠를 나타낸다. 키세논 플래시 램프의 플래싱 후, 계측되는 광량은 급속하게 감쇠하나, 광원의 소등후의 잔광 또는 여기광의 조사에 의한 시료 이외의 렌즈, 필터의 발광 등의 미광(迷光)에 의하여 백그라운드는 낮으나 검출된다. C는 본 발명을 사용한 경우의 백그라운드 노이즈의 감쇠를 나타낸다. 광검출기측의 렌즈 필터에 필요없는 빛이 조사되지 않고, 또 여기광측의 렌즈, 필터의 잔광, 산란광 또는 미광은 광검출기에 잡히지 않아, 이들에 유래하는 형광 또는 인광의 검출이 없다.

0.4m초 내지 0.8m초의 계측되는 광량을 채용할 때, (A에 의하여 얻어지는 광량)/(C에 의하여 얻어지는 광량)은, (A에 의하여 얻어지는 광량)/(B에 의하여 얻어지는 광량)에 비하여 커져 S/N 비가 크게 개선되는 것을 알 수 있다.

(1) 본 발명에 의하면, 형광 측정장치, 인광 측정장치의 노이즈를 저감시켜 장치 또는 시료용기에 유래하는 백그라운드를 내려, 결과적으로 계측시의 S/N 비가 증대하여 최소 검출감도 또는 계측감도를 높일 수 있다.

(2) 본 발명에 의하면, 형광 측정장치, 인광 측정장치의 1개의 초퍼에 의하여 광원으로부터 시료까지 및 시료로부터 광검출기까지의 광로의 양쪽을 차단하는 것이 가능하다. 그 결과, 저비용, 고신뢰성의 장치를 제공할 수 있다.

(3) 본 발명에 의하면, 시간분해 형광 측정법 또는 형광 내지 인광 측정법에 있어서, 여기광 광원은 램프 또는 레이저를 펄스점멸시키는 일 없이 연속광에 의한 계측을 가능하게 한다.

(4) 본 발명에 의하면, 형광 측정장치, 인광 측정장치의 광차단기구 사이에 끼워진 광로에 있어서 렌즈 또는 필터를 사용하지 않고, 이것에 유래하는 형광 또는 인광을 없앨 수 있다. 그 결과, 장치 또는 시료 용기에 유래하는 백그라운드를 내려 노이즈를 저감시키고, 또한 장치 최소 검출감도 또는 계측감도를 높일 수 있다.

도 1은 본 발명에 의한 형광, 인광 계측장치 광학계 모식도,

도 2는 본 발명에 의하지 않는 장치 타이밍차트예,

도 3은 본 발명에 의한 타이밍차트예,

도 4는 본 발명에 의한 초퍼 모식도,

도 5는 본 발명에 의한 광원으로부터 발생하는 여기광 광로를 나타내는 도,

도 6은 본 발명에 의한 시료로부터 발생하는 형광 또는 인광의 광로를 나타내는 도,

도 7은 본 발명에 의한 시료로부터 발생하는 유로퓸 인광의 경시감쇠, 계측 시의 백그라운드 노이즈 경시감쇠의 예를 나타내는 도,

도 8은 본 발명의 슬릿 차광부와 광로의 관계의 상세도이다.

※도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

1 : 광원, 2, 9 : 렌즈계

3, 8 : 파장선택 필터 4, 7 : 집광 미러

5 : 시료용기 6 : 시료

10 : 광 검출기 11 : 모터

12 : 초퍼 블레이드 13 : 슬릿

14 : 블레이드

Claims (7)

1. 광원과,

   상기 광원으로부터 발하는 빛으로부터 측정에 필요한 파장을 선택하여 인출하여 집광시키는 광학계와,

   집광된 빛을 피측정 시료에 조사하여 그 시료로부터 발생하는 형광 또는 인광을 검출하는 검출기를 구비한 형광, 인광 측정장치에 있어서,

   상기 광원과 상기 피측정 시료 사이의 광로와, 상기 피측정 시료와 상기 검출기 사이의 광로에 각각 적어도 하나의 광로 차단기구를 구비하고, 또한 상기 복수의 광로 차단기구는 공통의 차광판에 의하여 광로를 차단하는 기구를 구비하며, 또한, 상기 피측정 시료 측으로부터 상기 공통의 차광판을 지나는 광로에 있어서는 집광미러에 의하여 광로의 굴절 또는 빛의 집속 또는 확산이 이루어지는 것을 특징으로 하는 형광, 인광 측정장치.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 광원은 연속 점등하는 광원이고,

   상기 광원으로부터의 빛이 상기 피측정 시료에 입사하는 시간대에는 상기 피측정 시료와 상기 검출기 사이의 광로 차단기구가 광로를 차단하도록 동작하고,

   상기 피측정 시료로부터 발생하는 형광, 인광이 상기 검출기에 입사하는 시간대에는 상기 광원과 피측정 시료 사이의 광로 차단기구가 광로를 차단하도록 동작하 도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 형광, 인광 측정장치.
3. 제 1항에 있어서,

   상기 광원이 펄스를 발생하는 광원인 것을 특징으로 하는 형광, 인광 측정장치.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 공통의 차광판은 원판형상이고,

   상기 광원과 상기 피측정 시료 사이의 광로에 빛을 통과시키기 위한 슬릿부와, 상기 피측정 시료와 상기 검출기 사이의 광로의 빛을 차단하기 위한 차광부가 1쌍이 된 것이 상기 차광판에 설치되어 있는 것을 특징으로 하는 형광, 인광 측정장치.
5. 제 4항에 있어서,

   상기 1쌍의 슬릿부와 차광부는 원판형상의 차광판의 거의 반경방향 위에 있어서 반경방향으로 다른 위치에 설치되어 있는 것을 특징으로 하는 형광, 인광 측정장치.
6. 삭제
7. 삭제