KR100403720B1

KR100403720B1 - 헛개나무 어린 가지로부터 분리된 간독성, 숙취 및 피로해소 활성을 갖는 저급알콜 불용성 추출 분획 및 다당체물질 및 이를 함유한 조성물

Info

Publication number: KR100403720B1
Application number: KR20020002770A
Authority: KR
Inventors: 나천수; 정남철
Original assignee: (주)생명의나무; 산림청 임업연구원
Priority date: 2002-01-17
Filing date: 2002-01-17
Publication date: 2003-11-05
Anticipated expiration: 2022-01-17
Also published as: KR20030062529A

Abstract

본 발명은 간보호 활성을 갖는 헛개나무(Hovenia dulcisThunb.)의 어린 가지의 열수 추출물중 저급 알콜 불용성 추출분획 및 이로부터 정제 분리된 다당체 물질에 관한 것으로서, 이 저급 알콜 불용성 추출분획 및 다당체 물질은 사염화탄소에 의한 간독성을 효과적으로 치료함으로써, 간염, 간경화와 같은 간질환, 간독성 해소에 의한 피로 및 숙취의 치료 및 예방에 유용한 약학 조성물 및 건강식품으로서 사용될 수 있다.

Description

헛개나무 어린 가지로부터 분리된 간독성, 숙취 및 피로 해소 활성을 갖는 저급알콜 불용성 추출 분획 및 다당체 물질 및 이를 함유한 조성물{LOWER ALCOHOL INSOLUBLE EXTRACT AND A POLYSACCHARIDE THEREIN ISOLATED FROM THE YOUNG BRANCHES OF HOVENIA DULCIS THUNB. HAVING ANTIHEPATOTOXIC, ANTI-HANGOVER AND ANTI-FATIGUE ACTIVITY AND COMPOSITION CONTAINING SAME}

우리나라에서 가장 이병율이 높은 질병의 하나인 간염은 술자리 등 간염 보균자와의 접촉에 의해 감염되는 것으로 알려져 있고 예방목적으로 바이러스성 B형 간염에 사용되는 백신이 개발된 바 있으나 이미 감염된 간염환자를 치료할 수 있는 특효약은 아직까지 개발되지 못하고 있다. 이러한 간염은 과로, 스트레스, 과음, 흡연에 의해 간손상을 가져와 만성간염, 간경변 및 간경화를 일으키고 결국 간암으로 발전하는 것으로 밝혀져 있다.

최근 한국인의 건강수준에서 간암에 의한 사망률은 세계 1위이고 만성 간질환의 경우도 그 사망률이 3번째로 조사되었다. 또한 최근 통계청에서 우리나라 40대의 경우는 간질환이 가장 높은 사망원인으로 발표하였다. 국내의 간질환중에서 가장 높은 사망률의 원인은 바이러스성 간염이지만, 서구에서는 바이러스성 간염보다는 간경화에 의한 사망이 5-10배 정도로 높게 보고되어있다. 간은 완충능력이 큰 기관으로 질환의 초기단계에서는 잘 나타나지 않고 상당히 악화되어서야 발견된다. 간경변증은 각종 간질환이 만성적으로 진행할 경우 공통적으로 이르는 마지막단계이다. 그 원인으로는 알코올, 약물, 화학약품, 바이러스성 간염, 담도질환과 같은 대사성질환, 자가면역성 질환 등이 있으나 원인을 알 수 없는 경우도 많다. 간경변증의 경우 간혈류량저하, 간내혈류의 단축, 대사효소의 기능저하, 혈중단백의 질적, 양적 변화 및 담즙유량의 변화 등 전반적인 간기능이 저하된다.

또한 간은 인체에서 혈액 저장 및 순환, 혈액양 조절과 방어해독작용을 하며 정신적 활동과 밀접하게 관련되어 있다고 알려져 있다. 산업화에 따른 공해물질, 유독물질에 우리의 몸은 항상 노출되어 있어 우리의 간은 끊임없이 해독작용에 시달리고 있다. 더욱이 심각한 것은 정신적인 스트레스로 인한 간손상이다. 정신적 휴식을 가질 경우 손상된 간세포는 복구되지만 급박한 현대사회에서 정신적 휴식의 여유를 찾을 수 없어 정신적 스트레스, 과음, 흡연으로 간손상을 가중시켜 인체가 방어 해독 작용을 하지 못해 면역 체계에 이상을 가져와 다른 질병의 원인이 되기도 한다.

간독성을 일으키는 유발물질에는 사염화탄소, D-갈락토사민, LPS, 브로모벤젠 등이 있는데, 사염화탄소(CCl₄)는 간세포의 과산화지질 반응을 일으켜 간독성을 나타내는 것으로 알려져 있다. [레크나겔(Recknagel)의 문헌 (Pharmacol. Rev., 19, 145-208. 1967), 알퍼스 등(Alpers, et al.)의 문헌(Mol. Pharmacol., 4, 566-573, 1968) 및 슬레이터(Slater)의 문헌(Slater, T. F.(Eds), Academic Press, London, pp. 243, 1982) 참조]. D-갈락토사민은 체내 탄수화물대사에서 글루코스 공여체로 사용되는 유리딘의 기능을 저해하여 당뉴클레오티드, 글루쿠론산, 글리코겐 합성으로 이어지는 간에서 수행하는 인체혈당조절기능에 악영향을 미쳐 간기능을 손상시킨다. 또한 LPS(Lipopolysaccharide)는 면역적인 반응에 의해 마우스의 간상해를 유도하는 것으로 알려져 있다[웬델(Wendel A.)의 문헌(Methods Enzymol. 186, 675-680 1990) 참조]. 이러한 간독성 물질에 의한 간 상해는 사염화탄소와 같이 직접적인 간조직의 상해에 의한다기보다는 종양괴사인자(TNF-α)나 활성화산소(O₂)와 같은 강력한 매개자의 방출에 의해서 이루어진다. D-갈락토사민과 LPS를 함께 투여하게 될 경우, B형 간염 바이러스에 의해서 유발되는 간손상의 해부학적 특징과 유사한 반응을 나타내기 때문에 간염 치료효과 모델로 이용되고 있다 [티그스 등(Tiegs G. et al)의 문헌(1989. Biochem. pharmacol., 38. 627-631 1989)참조].

브로모벤젠에 의한 간독성효과는 토란조(Toranzo et al) 등의 문헌(Toxicology and Applied pharmacology 40, p415-425 1977)에 개시된 바와 같이, 시험관내 실험에서 랫트의 간 마이크로좀과의 공유결합과 BB-3,4-옥시드와 같은 화학적으로 반응성을 갖는 대사물질에 의한 세포 단백질의 공유결합의 변형에 기인한 것으로 여겨진다.

알콜은 체내에 저장되지 못하기 때문에 대사가 되어야 하는데, 이 과정은 대부분 간에서 이루어지며, 이러한 대사는 간에 존재하는 알콜분해효소들에 의해 이루어진다. 알콜은 이러한 효소들에 의해 아세트알데히드란 물질을 거쳐 분해되는데, 이 아세트알데히드는 독성이 있어 간세포에 손상을 주게 된다. 그리고 알콜의대사 결과, 지방산(脂肪酸)이 많이 만들어져 간에 지방이 축적되는데 이를 '알콜성 지방간'이라고 한다. 이 알콜성 지방간은 특히 만성간질환으로 진행하는 경우가 많은데, 알콜성 간염이 10-35%에서, 간경변증이 8-20%에서 발생한다고 한다.

정상적인 상태에서 소량의 알콜을 섭취할 경우 간장내로 들어온 에탄올은 시토졸 내의 알콜탈수소효소(ADH)와 알데히드탈수소효소(ALDH)의 작용에 의해 아세테이트로 되어, 순환계를 통해 간세포 밖으로 배설된다. 장기적으로 알콜을 섭취할 경우나 다량 음주시에는 알콜성 간장애를 일으키게 되며, 급성 알콜투여는 일시적으로 간에서 중성지방 축적을 일으킨다. 특히 에탄올의 최초 대사산물인 아세트알데히드는 에탄올에 비해 월등히 반응성이 높고 독성이 강하여 알콜성 간장해의 주원인 물질로 주목을 받고 있다 [와이너 등(Weiner et al.)의 문헌[Ethanol and the liver in the liver Biology and Pathology,ed. Arias, M., Jakoby, W., Popper, H., Strachter D., and Shafritz, D. A. Raven Press Ltd., New York, p. 1169 1988) 참조].

간 내에는 아세트알데히드뿐만 아니라 각종 약물 및 지방대사산물과 과산화지질의 대사과정, 그리고 C-C결합의 산화적 절단으로 생체에 극히 유해한 것으로 알려진 여러 가지 알데히드가 생성되는데, 아세트알데히드를 포함한 알데히드의 산화에 관여하는 주효소는 ALDH로서 간, 콩팥, 심장 및 위를 포함한 많은 장기와 조직에 널리 분포하며, 시토졸, 미토콘드리아 및 마이크로솜에도 존재하여 폭넓은 기질 특이성을 보이고 각종 알데히드에 대응할 수 있는 약물대사효소의 성격을 지니고 있다[팁톤 등(Tipton, K. F. et al)의 문헌(Cellular and intracellulardistribution of aldehyde dehydrogenases. inHuman metabolism of alcohol. Vol. 2 p. 105-116 CRC Press Boca Raton. 1989) 참조]. 따라서 어떤 요인에 의해 간내 ALDH 활성에 변화가 오게 되면 활성알데히드의 해독 및 물질대사에 중요한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.

젖산탈수소효소(latate dehydrogenase;LDH)는 어느 조직에나 분포하는 효소로서 피루베이트와 락테이트의 가역적 전환에 촉매작용을 한다. 특히, 근육운동이나 스트레스에 의하여 조직내에 대사활동이 증가하면 산소가 부족하게되어 젖산은 물론 이의 분해효소인 젖산탈수소효소의 활성이 증가하는 것으로 밝혀졌다(Yoshida, T. et al;Eur. J. Appl. Physiol.,56p7, 1987). 또한 마우스에 구속스트레스를 가할 경우 혈액내 혈청의 생화학수치가 젖산탈수소효소(LDH), 아스파레이트 트랜스아미나제(asparate transaminase;GOT), 알라닌 트랜스아미나제(alanine transaminase;GPT)가 올라가고 이들 혈청생화학 수치가 전신피로와 관련이 큰 것으로 보고되고 있다(Cho, T.S.et al:Yakhak Hoeji,39, p548, 1995; Gay, R.J. et al:Clin. Chem.,14, p740, 1968 참조)

천연물로부터 인간의 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 신물질을 찾고자 하는 시도는 과거부터 많은 과학자들의 연구 대상이 되어 왔다. 그간 이들 자원을 이용한 의약품의 개발로 현재 사용되고 있는 의약품의 50% 이상이 천연물로부터 유래된 것이고 미국의 경우 사용하는 의약품 중 30%가 식물로부터 얻어진 것으로서, 미국 FDA로부터 승인된 의약품이 120종으로 시장 규모는 약 10조 달러에 이르고 있다.

요시가와 등(Yoshikawa et al.)의 문헌(Chem. Pharm. Bull.43(3) : 532 - 534. 1995)에는 일본산 헛개나무의 열매와 씨에 함유되어 있는 트리테르펜 배당체 성분들이 히스타민 방출 억제와 체내 알콜흡수를 억제하는 효과를 가진다고 개시되어 있으며, 하제 등(Hase et al)의 문헌(Chem. Pharm. Bull.20(4) 381-385 1997)에는 헛개나무의 열매가 사염화탄소나 D-갈락토사민/리포폴리사카라이드에 의해 발생하는 간손상을 억제한다고 개시되어 있다. 이 외에 요시가와 등(Yoshikawa et al) 등의 문헌들(Chem. Pharm. Bull.41(10) : 1722 - 1725; 1993 및 Phytochemistry. 34(5) : 1431 - 1433.)에는 체내에서 당분을 제거하고 알레르기 반응을 억제하는 물질을 일본특산 토멘텔라 헛개나무의 종자 및 잎에서 추출 분리하였다고 개시되어 있다.

상기 문헌들에는 헛개나무의 과일이나 종자의 전체 용매 추출물을 대상으로 약효를 실험한 것으로서, 본원에서와 같이, 헛개나무 어린가지의 열수 추출물을 대상으로 실험한 선행문헌은 없다.

본 발명자들은 여러 종류의 천연물을 대상으로 하여 간질환 예방 및 치료에 유용한 활성이 기대되는 식물을 탐색하는 과정에서 헛개나무 어린 가지의 저급 알콜 불용성 분획 추출물 및 그로부터 분리된 다당체가 유용한 활성을 나타냄을 발견하였다.

헛개나무(Hovenia dulcisThunb)는 갈매나무과 낙엽활엽교목으로 경기, 강원 이남의 표고 50-800m에 분포하고 있으며, 일본, 중국에도 분포하고 있다. 또한 한국과 일본에는Hovenia dulcisThunb(한국, 일본, 중국; 꽃은 연녹색, 잎에는 털이없다)라는 기본종외에 그 변종들인Hovenia dulcisvar.latifoliaNakai.(일본특산 동북지방;Hovenia dulcis에 비해 잎이 대단히 크다),Hovenia dulcisvar.koreanaNakai(한국특산; 꽃은 백색이다) 그리고,Hovenia dulcisvar.tomentellaMakino(일본특산 본주, 사국; 잎에 털이 있다)가 분포하고 있다. 수고 10-15m, 흉고직경 30-40cm에 달하며 대경목으로는 수고 20m, 직경 80cm까지 자란다. 또한 내한성과 내음성, 맹아력이 강하다. 漢名은 지구라고 하며 일본명은 켄보나시(けんぼなし)라고 한다(Uehara K. I.,JUMOKUDAITSUSETSU, Yumei Press. 2nd Ed. pp1072-1074, 1960).

본 발명의 목적은 간보호, 숙취해소 및 피로예방 효과를 갖는 헛개나무 어린 가지의 추출분획 및 이로부터 분리된 활성성분을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 추출 분획 및 이로부터 분리된 활성성분들의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 추출분획 또는 그로부터 분리·동정된 다당체 물질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 젖산 탈수소효소 저해용 약학조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 추출 분획 또는 이로부터 분리된 활성성분을 포함하는 간질환, 숙취 및 피로의 예방 및 치료 효과를 갖는 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 추출 분획 또는 이로부터 분리된 활성성분을 포함하는 간질환, 숙취 및 피로의 예방을 위한 건강 식품을 제공하는 것이다.

도 1. 헛개나무 어린 가지로부터 메탄올 불용성 분획 및 다당체 물질의 분리도.

도 2. 헛개나무 어린 가지 메탄올 불용성 분획의 이온교환수지 컬럼크로마토그래피법에 의한 고분자 분획물들의 UV 및 RI 흡수도.

도 3. 이온교환수지 크로마토그래피법에 의한 분획 1의 절대분자량 측정을 위한 SEC 피크 및 MALLS 스펙트럼.

도 4. 이온교환수지 크로마토그래피법에 의한 분획 2의 절대분자량 측정을 위한 SEC 피크 및 MALLS 스펙트럼.

도 5. 이온교환수지 크로마토그래피법에 의한 분획 3의 절대분자량 측정을 위한 SEC 피크 및 MALLS 스펙트럼.

도 6. 이온교환수지 크로마토그래피법에 의한 분획 4의 절대분자량 측정을 위한 SEC 피크 및 MALLS 스펙트럼.

도 7. 이온교환수지 크로마토그래피법에 의한 분획 5의 절대분자량 측정을 위한 SEC 피크 및 MALLS 스펙트럼.

도 8. 이온교환수지 크로마토그래피법에 의한 분획 1의 구성당 GC 스펙트럼.

도 9. 이온교환수지 크로마토그래피법에 의한 분획 2의 구성당 GC 스펙트럼.

도 10. 이온교환수지 크로마토그래피법에 의한 분획 3의 구성당 GC 스펙트럼.

도 11. 이온교환수지 크로마토그래피법에 의한 분획 4의 구성당 GC 스펙트럼.

도 12. 이온교환수지 크로마토그래피법에 의한 분획 5의 구성당 GC 스펙트럼.

도 13. 어린 가지 메탄올 불용성 분획의 사염화탄소 유도된 간절편에서의 LDH 방출량 억제 효과 실험결과.

1: 무처리군 2: 사염화탄소 4mM 투여군

3: 사염화탄소 4mM+ 메탄올불용성분획 200㎍/㎖ 투여군

4: 사염화탄소 4mM+ 메탄올가용성분획 200㎍/㎖ 투여군

도 14. 어린 가지 메탄올 불용성 분획의 사염화탄소 유도된 간절편에서의 단백질 합성량 측정실험결과.

1: 무처리군 2: 사염화탄소 4mM 투여군

3: 사염화탄소 4mM+ 메탄올불용성분획 200㎍/㎖ 투여군

4: 사염화탄소 4mM+ 메탄올가용성분획 200㎍/㎖ 투여군

도 15. 어린 가지 메탄올 불용성 분획의 갈락토사민/LPS 유도된 간절편에서의 LDH 방출량 측정실험결과.

1: 무처리군 2: D-갈락토사민 500μM+LPS 1㎍/㎖ 투여군

3: D-갈락토사민 500μM+LPS 1㎍/㎖+메탄올불용성분획 200㎍/㎖ 투여군

4: D-갈락토사민 500μM+LPS 1㎍/㎖+ 메탄올가용성분획 200㎍/㎖ 투여군

도 16. 어린 가지 메탄올 불용성 분획의 갈락토사민/LPS 유도된 간절편에서의 단백질 합성량 측정실험결과.

1: 무처리군 2: D-갈락토사민500μM+LPS 1㎍/㎖ 투여군

도 17. 어린 가지 메탄올 불용성 분획의 브로모벤젠 유도된 간절편에서의 LDH 방출량 측정실험결과.

1: 무처리군 2: 브로모벤젠 1mM 투여군

3: 브로모벤젠 1mM+ 메탄올불용성분획 200㎍/㎖ 투여군

4: 브로모벤젠 1mM+ 메탄올가용성분획 200㎍/㎖ 투여군

도 18. 어린 가지 메탄올 불용성 분획의 브로모벤젠 유도된 간절편에서의 단백질 합성량 측정실험결과.

1: 무처리군 2: 브로모벤젠 1mM 투여군

3: 브로모벤젠 1mM+ 메탄올불용성분획 200㎍/㎖ 투여군

4: 브로모벤젠 1mM+ 메탄올가용성분획 200㎍/㎖ 투여군

도 19. 어린 가지 메탄올 불용성 분획의 혈중알코올농도 저하 측정실험결과.

도 20. 어린 가지 메탄올 불용성 분획의 마우스에서의 혈중 알콜농도 저하효과에 대한 알콜 디히드로게나제 활성실험결과.

1: 40% 알콜(0.3mM)+물(0.3mM) 투여군

2: 40% 알콜(0.3mM)+메탄올불용성분획(0.3㎖,500mg/㎖) 투여군

3: 40% 알콜(0.3mM)+메탄올가용성분획(0.3㎖,500mg/㎖) 투여군

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 건조시킨 헛개나무(Hovenia dulcisThunb.)의 어린 가지, 바람직하게는 1년 내지 4년생의 어린 가지를 열수 가압 또는 저급 알콜로 추출하여 얻어진 열수 또는 저급알콜 추출액에 저급알콜을 가하여 얻어지는 저급알콜 불용성 분획을 제공한다.

본 발명의 헛개나무는 한국산(Hovenia dulcisvar.latifoliaNakai.), 일본산 및 중국산(Hovenia dulcisvar.tomentellaMakino,Hovenia dulcisvar.latifoliaNakai)을 모두 포함한다.

추가적으로, 본 발명은 상기 추출분획을 이온교환수지 컬럼크로마토그래피로 분리하여 얻어지는, 간보호, 숙취 해소 활성 및 항피로 효과가 탁월한 다당체 물질을 제공한다.

본 발명의 저급알콜 불용성 분획은 (1) 건조시킨 헛개나무 어린 가지로부터 열수 가압 추출물을 얻는 제 1단계 및 (2) 1단계에서 얻은 열수 추출물에 저급알콜을 넣어 저급알콜 불용성 분획을 얻는 제 2단계를 포함하는 방법에 의하여 제조할 수 있다.

제 1단계에서는 헛개나무 어린 가지 건조물을 가압 열수 추출방법에 따라 추출하는데, 예를 들어, 음건하여 세절한 헛개나무(Hovenia dulcisThunb.) 어린 가지의 부피에 대하여 약 1 내지 5배, 바람직하게는 약 3배의 물을 가하고, 약 1 내지 3기압, 바람직하게는 약 1.5 기압에 해당하는 압력으로 약 100 내지 150℃, 바람직하게는 약 100 내지 120℃에서 15분 내지 48시간, 바람직하게는 30분 내지 12시간 동안 추출한 후에, 이를 상온에서 방치하여 식힌 다음, 여과한 후, 여과액을 통상의 동결건조방법에 따라 동결 건조하여 가압 열수 추출 분획을 얻을 수 있다.

제2단계에서는 상기로부터 얻어진 가압 열수 추출물을 상온에서 건조 또는 감압농축하고 이 농축물을 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등의 저급알콜로부터 선택된 추출용매의 단독 또는 혼합용매, 바람직하게는 100% 메탄올 추출용매로 30분 내지 3시간, 바람직하게는 1시간 동안, 3 내지 4회 환류 추출한 후, 얻어진 환류 추출액을 원심분리하여 저급알콜 불용성 분획을 모아 저급 알콜 불용성 분획을 얻거나 상기 환류 추출액을 여과하여 여과되지 않은 불용성 분획에 2 내지 8배, 바람직하게는 약 4배 부피의 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등의 저급 알콜로부터 선택된 추출용매, 바람직하게는 100% 에탄올 추출용매를 첨가하여 얻어진 상등액과 침전물을 분리한 후, 그 침전물에 증류수를 가해 재용해한 후, 이를 동결건조하여 저급 알콜 불용성 분획을 얻는다.

본 발명의 간보호 활성을 갖는 다당체 물질은 상기 제법으로부터 얻은 저급 알콜 불용성 분획을 이온교환수지 크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조될 수 있다.

상기의 저급알콜 불용성 분획을 증류수에 녹인 후, 0 내지 5몰의 염화나트륨 수용액을 농도 단계별로 이온 교환 수지 컬럼에 넣어 차례로 용출시킨 후, 투석,농축 및 동결건조를 차례로 수행하여 각 농도별로 고분자의 다당체 물질로 구성된 고분자 분획물들을 얻는다. 이 때, 이온교환 수지는 양이온 교환수지 또는 음이온 교환수지를 사용할 수 있으며, 바람직한 양이온성 교환수지로는 AG 50W-x8, 앰버라이트(Amberlite) IR-120, 도웩스(Dowex) 50W-x8 등과 같은 강산성 양이온 교환수지; 앰버라이트(Amberlite) IRC-50, 바이오-렉스(Bio-Rex) 70, 듀올라이트 (Duolite)-436 등과 같은 약산성 양이온 교환수지; 앰버라이트(Amberlite) IRA-67, 도웩스(Dowex) 3-x4A 등과 같은 약염기성 양이온 교환수지; AG 2x8, 앰버라이트(Amberlite) IRA-400, 도웩스(Dowex) 2-x8계열 등과 같은 강염기성 양이온 교환수지; 또는 CM-셀룰로오스, SE-셀룰로오스와 같은 양이온 교환수지, DEAE 셀룰로오스와 같은 음이온 교환 수지와 같은 개량된 섬유성 셀룰로오스로 이루어진 교환수지; 또는 가교 결합된 덱스트란으로 제조되는, 예를 들어, G-25 및 G-50 비드형 양이온 세파덱스형 수지, 아가로즈로 제조되는, 예를 들어, 세파로즈 CL 및 바이오겔 A 세파로즈형 수지 또는 프락토겔(Fractogels)이나 토요펄(Toyopearl) 수지와 같은 개량된 비드형 이온교환수지가 적합하며, 더욱 더 바람직한 교환 수지는 약염기성 음이온 교환수지인 토요펄 DEAE 형 교환수지가 바람직하며, 더욱 더 바람직한 교환 수지는 토요펄 DEAE-650C 형 교환수지이다.

상기 이온교환수지를 통하여 용출되는 다당체들은 염화나트륨의 농도에 따라, O M 염화나트륨 용액에서는 만노즈, 글루코즈, 갈락토즈. 아라비노즈, 자일로즈로 구성된 분자량 68,040, 36,440의 고분자성 다당체가 분리되며, 0.1 M 염화나트륨 용액에서는 만노즈, 글루코즈, 라마노즈, 아라비노즈로 구성된 분자량22,500, 233,300, 200,700의 고분자성 다당체가 용출되며, 0.2 M 염화나트륨 용액에서는 만노즈, 라마노즈, 아라비노즈, 자일로즈로 구성된 분자량 32,840의 고분자성 다당체가 용출되며, 0.3 M 염화나트륨 용액에서는 만노즈, 글루코즈, 아라비노즈로 구성된 분자량은 88,610, 79,190의 고분자성 다당체가 용출되며, 3 M 염화나트륨 용액에서는 만노즈, 갈락토즈, 아라비노즈, 자일로즈로 구성된 분자량은 216,500의 고분자성 다당체가 용출된다.

본 발명은 상기 염화나트륨 여러 농도에 따라 용출되는 모든 다당체들뿐만 아니라, 분자량 20,000달톤 이상의 모든 다당체들을 포함한다.

본 발명의 저급알콜 불용성 분획 및 이로부터 분리된 다당체 물질들은 간독성 및 숙취 해소 및 간질환 관련 효소 저해 실험에 있어서 유의성 있는 활성을 나타내므로 각종 간질환, 즉 간염, 지방간, 간경화증뿐만 아니라, 간장독성, 숙취 및 피로 등의 예방 및 치료에 유용할 수 있다.

이에 따라, 본 발명은 헛개나무 어린 가지의 저급알콜 불용성 분획 및 그로부터 분리·동정된 다당체 물질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 알콜 탈수소 효소 및 젖산 탈수소 효소 저해용 약학조성물을 제공한다. 또한 상기 추출물을 포함하는 건강보조식품을 제공한다.

또한 본 발명은 헛개나무 어린 가지의 저급알콜 불용성 분획 및/또는 그로부터 분리·동정된 다당체 물질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 간질환 치료 및 예방에 유용한 약학조성물을 제공한다. 또한 상기 추출물을 포함하는 건강보조식품을 제공한다.

본 발명의 상기 저급알콜 불용성 분획 및/또는 다당체 물질을 유효성분으로서 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 알콜 디히드로게나제 또는 락틱산 디히드로게나제 효소 저해제, 및 각종 간질환, 특히 간염, 간독성에 대한 예방 및 치료용 조성물을 제조할 수 있다. 이 약학조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의하여 정제, 캡슐제, 산제, 과립제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 액제 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여용 약제학적 제제로 제형화될 수 있다.

본 발명의 상기 저급알콜 불용성 분획 또는 그로부터 분리된 다당체 물질을 함유한 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 유효성분으로서 체중 1kg당 0.01 내지 10g, 바람직하게는 1 내지 5g의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 증증도에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 상기 저급알콜 불용성 분획 및 그로부터 분리된 다당체 물질은 각종 간질환 예방 및 숙취 해소 등의 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 저급알콜 불용성 분획 또는 그로부터 분리된 다당체 및/또는 다당체 혼합물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강 식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.1 내지 15 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100m1를 기준으로 1 ∼ 30g, 바람직하게는 3 ∼10g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 저급알콜 불용성 분획 및/또는 이로부터 분리되는 다당체 물질을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등), 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100m1당 일반적으로 약 1 ∼ 20g, 바람직하게는 약 5 ∼ 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

건강식품용 개발을 위하여 본 발명의 상기 저급알콜 불용성 분획 및 다당체물질을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어 각종 식품류, 음료류, 껌류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

이하 본 발명을 다음과 같은 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이것들만으로 한정되는 것은 아니다.

참고예 1: GPC에 의한 절대 분자량의 측정

펌프(Spectra system p2000), 가드 컬럼(TSK PWH, Tosoh사), RI-감지기(Shodex SE71), SEC(Size Exclusion Chromatography) 컬럼으로서 TSK 겔 3000pw, 4000pw, 5000pw(7.8×300mm, Tosoh) 및, MALLS(다각 레이저광 산란, Dawn DSP-F, Wyatt Technology)) 검출기로 이루어진 기기 및 전개용매로서 0.02% 소듐 아지드에 0.15 M의 NaNO₃되게 만든 용액을 0.5ml/분의 유속으로 흘려 보내 GPC를 실시함으로써 절대분자량을 측정하였다.

참고예 2 : 활성실험 시약 및 재료

락틱산 디히드로게나제(LDH)의 양은 시그마사(미국) 키트 340-UV를 사용하였고, 간독성물질에 의해 손상된 간장에서 회복능력을 나타내는 단백질의 합성량 측정에 사용된 동위원소인³H-류신(5μCi/plate) 및 RNA의 합성량 측정에 사용된 동위원소인³H-우리딘 (15μCi/plate)은 시그마사(미국)의 것을 사용하였다. 알콜 디히드로게나제 활성도 측정은 FID (Flame Ionization Detector)를 장착한 HP 5890 가스 크로마토그래피(미국 휴렛-패카드사 제품)을 이용한 가스 크로마토그래피 헤드스페이스(Gas chromatography head space) 분석법을 사용하였다.

실시예 1 : 헛개나무 어린 가지로부터 열수 추출물의 분리

경기도 포천군 소홀면 직동리 국립수목원내에서 채취하여 음건한 헛개나무 2년생 어린 가지 1kg에 증류수 5ℓ를 넣고 120℃에서 3시간동안 고압(1.5 기압)하에서 가압열수추출을 열수추출기(합동정밀기공 HD5-A 190모델, 한국)로 실시하였다. 추출액을 와트만 페이퍼(Whatman No. 2, 미국)로 여과시켜 얻은 추출물을 동결 건조기(삼원냉열 SFDSM24L 모델, 한국)로 건조하여 헛개나무 어린 가지의 열수 추출물(12.2g)을 제조하였다.

실시예 2 : 헛개나무 어린 가지로부터 저급알콜 불용성 분획 및 다당체의 분리

(1) 저급알콜 불용성 분획의 분리방법 1

실시예 1에서 수득한 열수 추출물 12.2g을 HPLC용 순수 메탄올 3ℓ로 1시간씩 3회 환류 추출하였다. 이 추출액을 모아 원심분리기(UNION 5KR모델, 한국)으로 10∼20분 동안 원심분리(4,000rpm)를 시행하여 상층부의 메탄올 가용부 0.63g와 하층부의 메탄올 불용성 분획 11.57g으로 분리하였다(도 1참조).

(2) 저급알콜 불용성 분획의 분리 방법 2

실시예 1에서 수득한 열수추출물 12.2g을 HPLC용 순수 메탄올 3ℓ로 1시간씩 3회 환류 추출하였다. 이 추출액을 모아 여과지(Whatman No.2, 미국)로 여과하여 여과지에 남아 있는 메탄올 불용성 분획에 여과된 메탄올 가용분획을 분리한 후, 걸러진 메탄올 불용성 분획의 4배 부피의 에탄올을 넣고 상등액과 침전물로 분리하고, 침전된 침전물에 증류수(1OO㎖)를 가하여 재용해시킨 후, 이를 다시 동결건조기(삼원냉열 SFDSM24L, 한국)으로 동결건조를 시행하여 에탄올 불용성 분획 (11.50g)을 수득하였다.

(3) 이온교환 컬럼 크로마토그래피법에 의한 고분자 분획의 정제 및 분리

상기 (1) 및 (2)에서 수득한 헛개나무 어린가지 메탄올 불용성으로부터 간보호 활성성분을 규명하고자 이를 분리하기 위하여 이온 교환 수지 컬럼 크로마토그래피법을 실시하였다. 상기 메탄올 불용성 분획 1g을 정제수 100ml로 상온에서 30분간 교반기를 사용하여 녹였다. 탈염 증류수로 평형화 시킨 토요펄(Toyo pearl^R, 토소(Tosoh)사, 일본) DEAE-650C 이온 교환 수지 160 ㎖을 254nm UV 측정기(제품명, 회사)와 RI 측정기(RI 모니터: RI-10 모델, EYELA사, 일본)가 설치된 저압 액체 크로마토그래피 시스템(Biologic LP, BIO-RAD 러보레이토리사, 미국)의 액체 크로마토그래피 컬럼(35cm 길이, 2.5cm 직경, Glass Econo-컬럼, BIO-RAD 러보레이토리사, 미국)에 충진시키고 다시 탈염 증류수 500㎖를 흘러 보내면서 평형화시켰다. 탈염 증류수에 용해된 메탄올 불용성 분획 100ml를 컬럼의 DEAE-650C 수지 위에 가하고 흘려주어 흡착시켰다. 여기에 0M, 0.1M, 0.2M, 0.3M, 3M 염화나트륨 용액을 500㎖씩 흘려보내는 단계적 용출법에 의해 용출 속도를 2ml/분으로 하여 용출시키고 0M, 0.1M, 0.2M, 0.3M, 3M 염화나트륨 용액에서 가각 용출된 다당체 분획을 분획 1, 분획, 분획 3, 분획 4 및 분획 5로 명명하였다. 용출된 각 분획물의 크로마토그램은 도 2와 같이 모든 용출 분획에서 UV에 흡광하는 물질들이 용출되었지만, RI에 용출되는 분획은 0.3M 분획 이후부터 용출되기 시작하였다. 이 각각의 용출분획 중에 포함된 염화나트륨을 제거하기 위해서 각각을 분자량 2,000이상의 물질들로부터 분자량 1,200이하의 성분들을 걸러서 투과시키는 투석막(평균 편평 두께 32mm, 용량 100ml/ft 벤조일화 투석 튜빙, 시그마사, 미국)으로 4시간 동안 탈염 증류수로 3회 반복하여 투석한 다음, 동결건조기(삼원냉열 SFDSM24L, 한국)로 동결 건조하여 고분자의 다당체 분획물들을 얻었다.

실시예 3: 다당체 분획물들의 특성분석 및 측정

상기 실시예 2의 (3)에서 얻은 다당체 분획물들의 특성을 다음과 같이 분석하였다.

절대분자량의 측정

각 다당체 분획들의 분자량을 측정하기 위해 참고예 1에 기재된 바와 같은 HPSEC(High performance size-exclusion chromatography) 및 MALLS 기기를 사용하여 절대분자량을 측정한 결과, 도 2 내지 도 7에 도시한 바와 같이, 분획 1은 두 개의 피크가 나타났으며 각각의 분자량은 68,040, 36,440이었고, 분획 2는 세 개의 피크가 나타났으며 각각의 분자량은 22,500, 233,300, 200,700이었고, 분획 3은 한 개의 피크로 분자량 32,840이었고, 분획 4는 두 개의 피크로 각각의 분자량은 88,610, 79,190이었으며 분획 5는 한 개의 피크로 구성되어 있었으며 분자량은 216,500으로 나타나 이들이 고분자성 물질임이 증명되었다.

구성성분의 분석

분획 1 내지 5의 다당체 분획들의 총 당류 및 폴리페놀 함량을 페놀-황산법 [듀보이스, 엠 등(Dubois, M.et al.)의 문헌(Anal. Chem. 28, 350∼356. 1956) 참조]에 의해 측정하여, 표 1와 같은 결과를 얻었다.

구성성분	함 량(ppm)
구성성분	분 획 1	분 획 2	분 획 3	분 획 4	분 획 5
탄수화물	1,514	13,720	23,488	9,069	18,372

또한 상기 각 분획들의 구성당 분석 및 확인을 하기 위해서, 메틸화 분석을 사용하였는데, 이 분석법은 하꼬모리법 [Hakomori, S,J. Biochem. Tokyo,55, p205∼209. 1964) 참조]과 웨게법 [Waeghe, T. J et al.,Carbohydr. Res.,123, p281∼304. 1983) 참조]을 사용하였다. 즉 시료(500㎍)의 메틸화후, 에탄올을 흡착시킨 셉-팩 C₁₈카트리지로 메틸화된 시료를 회수하였다. 메틸화 다당중에서 산성당은 THF에 용해되어 있는 LiB(C₂H₅)₃D (수퍼-듀프라이드, 1ml, 상온, 1시간, 알드리히사)으로 환원시킨 후, 다시 셉-팩 C₁₈카트리지로 회수하였다. 이를 1.0M TFA로 121℃에서 2시간동안 가수 분해한 후에 NaBD₄로 환원시켜 아세틸화 반응을 수행하였다. 부분적으로 메틸화된 알디톨 아세테이트는 GLC와 GC-EIMS로 분석하였다. 메틸화된 알디톨 아세테이트들은 이온조각과 상대 용출시간으로 확인하고, 피크는 피크 면적과 FID(Flame ionization detector)의 반응 인자로 측정하였다.

또한 각 다당체 분획들의 구성당 분석을 실시하기 위해서 GC 분석은 바리안 CP-3800 가스 크로마토그래피기기(Varian Co. 미국)를 사용하여 다음의 조건으로 실시하였다[검출기: FID, 컬럼: 0.25mm ID Fused Silica Capillary GC Column(30cm×0.25mm×0.2μm), Supelco SP-2380., 컬럼온도: 230℃, 주입기 온도: 250℃, 검출기 온도: 250℃, 이동상: 헬륨(1.0ml/min)).

실험 결과, 표 2 및 도 8내지 도 12에 도시된 바와 같이, 만노즈, 글루코즈, 갈락토즈. 라마노즈, 아라비노즈, 자일로즈들로 이뤄진 것으로 확인하였다. 각 구성당의 비율은 만노즈 1을 기준으로 환산하여 나타내었다. 표 2에서와 같이 분획 1에서는 만노즈, 글루코즈, 갈락토즈, 아라비노즈, 자일로즈 분획 2는 만노즈, 글루코즈, 라마노즈, 아라비노즈, 분획 3은 만노즈, 라마노즈, 아라비노즈, 자일로즈, 분획 4는 만노즈, 글루코즈, 아라비노즈, 분획 5는 만노즈, 갈락토즈, 아라비노즈, 자일로즈로 구성되어 있음을 확인할 수 있었다.

	만노즈	글루코즈	갈락토즈	라마노즈	아라비노즈	자일로즈
분획1	1	3.14	0.88	-	0.57	0.57
분획2	1	0.92	-	1.4	2.14	-
분획3	1	-	-	0.69	1.23	0.61
분획4	1	0.31	-	-	2.9	-
분획5	1	-	6.84	-	1.5	1.45

위의 결과에 의해서 분획 1은 만노즈, 글루코즈, 갈락토즈, 아라비노즈, 자일로즈로 구성된 분자량 68,040, 36,440의 고분자성 다당체이었고, 분획 2는 만노즈, 글루코즈, 라마노즈, 아라비노즈로 구성된 분자량 22,500, 233,300, 200,700의 고분자성 다당체이었고, 분획 3은 만노즈, 라마노즈, 아라비노즈, 자일로즈로 구성된 분자량 32,840의 고분자성 다당체이었고, 분획 4는 만노즈, 글루코즈, 아라비노즈로 구성된 분자량은 88,610, 79,190의 고분자성 다당체이었으며, 분획 5는 만노즈, 갈락토즈, 아라비노즈, 자일로즈로 구성된 분자량은 216,500의 고분자성 다당체로 나타나 헛개나무 어린가지 저급알콜 불용성 분획들은 고분자성 다당체로 이루어짐을 확인할 수 있었다.

시험예 1: 헛개나무 어린 가지의 저급알콜 불용성 분획의 간독성 해소 효과

상기 헛개나무 어린 가지의 저급 알콜 불용성 분획물들의 간독성 해소효과를 시험하기 위하여 다이나믹 간절편 배양법(Dynamic Liver slice cluture)를 이용한 시험관내 간보호효과시험, 사염화탄소에 의한 간독성에 대한 효과실험[창등의 문헌(Chang, I. M.,et al: Drug and chemical toxicology. 6(5): 443 - 453, 1983)을 하기와 같이 실시하였다.

(1) 실험동물의 준비

동물은 BALB/c 마우스와 스프라그 도울리(SD) 래트를 사용하며, 사료 (Purina Korea)와 물을 자유롭게 먹게 하고, 사육실의 온도는 21-24℃, 상대습도는 40-80%를 유지하였다. 또한 12시간마다 낮과 밤이 반복되도록 사육장내 빛을 조절하였다.

(2) 간절편 배양법을 이용한 시험관내 간독성 실험 전처리

시험관내 간독성 실험모델로서 실제 간조직이 가지는 생리학적 특성을 잘 반영하여 첨단 방법으로 알려진 다이나믹 간절편 배양법을 이용하였는데, 먼저, 랫트로부터 간을 떼어낸 후 브란델/비트론(Brendel/Vitron) 조직 절단기를 사용해 직경 0.8 mm, 두께 200 ㎛ (18 -22 mg 습식 중량)를 가진 디스크 형태의 절편을 만들었다. 공기조건을 O₂/CO₂(95%/5%)를 유지시키면서 다이나믹 기관 배양기(dynamic organ culture incubator)를 사용하여 표면배양(surface culture)을 실시하였다. 여기에 헛개나무 어린가지 저급알콜 불용성 분획들을 실험군으로, 증류수를 대조군으로 하여 간절편에 처리한 후, 한시간 뒤에 사염화 탄소(4mM), 브로모 벤젠(1mM), 또는 디-갈락토사민(500μM) 등의 간손상물질을 5시간 동안 O₂/CO₂(95%/5%)를 유지시키면서 다이나믹 기관 배양기에서 처리하여 간손상을 유발시킨 후, 그 배양중의 LDH (락틱산 디히드로게나제) 유리양 및 단백질 합성양을 측정하여 저급알콜 불용성 분획의 간독성 해소효능을 평가하였다.

(3) 간 절편에서 락틱산 디히드로게나제(LDH)의 측정

사염화탄소, 디-갈락토사민 및 브로모벤젠에 의한 자가독성 및 시료에 의한 독성 보호작용을 측정하기 위하여 간 절편 배양에서 배양액으로 유출되는 LDH의 양을 UV측정기(시그마 키트 340-UV)를 사용하여 측정하여 항피로효과와 간보호 효과를 평가하였다.

그 측정 결과, 헛개나무 어린가지 저급알콜 불용성분획이 간 절편에서 간독성지표인 젖산 탈수소효소(LDH)의 방출을 도 13에 도시한 바와 같이 대조군에 비하여 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었으며, 또한 디-갈락토사민과 브로모벤젠에 의해 유도된 간독성에서도 스트레스에 의한 전신피로와 관련이 큰 것으로 보고된 젖산탈수소효소(LDH)의 양을 도 15와 도 17에 도시한 바와 같이 대조군에 비하여 효과적으로 억제하여 헛개나무 어린가지 저급알콜 불용성 분획이 항피로효과가 있는 것으로 나타났다.

(4) 간 절편에서 단백질 합성량의 측정

간세포 내의 단백질 합성량은 보니 등(Bonney et al)의 방법(Some characteristics and function of adult rat liver primary culture, in Gene Expression and Carcinogenesis in Cultured Liver,Gerschenson, E and Thompson, E. B.(Eds), Academic Press, New York, pp. 24-45, 1975 참조)에 따라 측정하였다.

세포배양액에³H-류신(5μCi/플레이트, 0.38mM)을 첨가하여 2시간 동안 라벨링시킨 후 세포를 채취하여 동일양의 20% 트리클로로아세트 산(TCA)를 가하여 2,000×g 에서 10분 원심분리 후 침전물을 10% TCA로 2번 세척하고 1N 수산화 나트륨으로 디제스쳔(digestion)시켜 방사능을 측정함으로써 단백질 합성량을 측정하여 헛개나무 어린가지 저급알콜 분획들의 지방간, 간염, 간독성 해소에 대한 치료효과를 평가하였다.

그 결과 도 14에 도시한 바와 같이, 헛개나무 어린가지 저급알콜 불용성분획이 사염화탄소에 의해 손상된 간 세포의 단백질 합성량을 증진시켜 사염화탄소에 의한 간독성을 해독하는 효과를 나타내 지방간 치료효과가 우수한 것으로 나타났다.

도 16에 도시한 바와 같이, 헛개나무 어린가지 저급알콜 불용성분획이 디-갈락토사민에 의해 손상된 간세포의 단백질 합성량을 증진시켜 디갈락토사민에 의한간독성을 해독하는 효과를 나타내 간질환 치료효과가 우수한 것으로 나타났다.

또한, 도 18에 도시한 바와 같이, 헛개나무 어린가지 저급알콜 불용성분획이 브로모벤젠에 의해 손상된 간 세포의 단백질 합성량을 증진시켜 브로모벤젠에 의한 간독성을 해독하는 효과를 나타내 간독성 해소효과가 우수한 것으로 나타났다.

(5) 숙취해소작용

혈중알콜농도의 측정

40% (w/v) 알콜을 10 ml/kg가 되도록 랫트에 경구 투여하고, 헛개나무 어린가지 저급알콜 불용성분획과 용해성 분획을 알콜처리 1 시간 후에 경구 투여하였다. 알콜 투여 4시간 후, 꼬리정맥 또는 심장으로부터 혈액을 채취하여 혈중알콜농도 측정 키트(Sigma 332, UV, Endpoint method, 미국)를 이용하여 혈중 알콜농도를 측정하였다.

40% 알콜을 투여한 후 1시간 후에 헛개나무 어린가지 저급알콜 불용성분획과 용해성 분획을 랫트에 투여하고 4시간 후에 심장에서 채혈한 혈액의 혈중알콜농도를 측정한 결과 도 19와 같이 대조군과 비교하여 약 1/2가량으로 혈중알콜농도를 떨어뜨리는 것으로 확인되었다.

알콜 디히드로게나제 활성도 측정

헛개나무 어린가지 저급알콜 불용성분획과 용해성 분획의 숙취해소 효과에 대한 작용기작을 규명하고자 래트에 40% 알콜(0.3mM) 투여 후 1시간 후에 각 분획들을 0.3ml(500mg/ml)씩 투여하고 4시간 후에 간의 알콜 디히드로게나제 효소활성을 다음과 같이 측정하였다.

랫트를 이산화탄소로 질식사시킨 후, 간을 적출하였다. 적출한 간을 생리 식염수로 잘 세척한 다음 무게를 재고, 약 10배의 0.154M KCl을 함유한 0.1M 인산 칼륨 완충액(pH 7.4)에 넣고, 테프론-글래스 호모게나이저를 이용하여 균질화 시켰다. 균질화된 간을 4℃에서 9,000 x g로 30분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 취하여 다시 110,000 x g로 1시간 동안 4℃에서 초원심분리하여 상층액을 시토졸 분획으로 사용하였다. 알콜 디히드로게나제 활성도는 과량의 알콜의 존재하에서 환원되는 NAD의 양을 일정시간 동안 흡광도의 변화를 기록하여 측정하며 반응 혼합액은 55mM 소듐 피로포스페이트 완충액(pH 7.4), 20mM 에탄올, 0.2mM NAD로 구성되며 약 2-3mg의 시토졸성 단백질을 가하였다. 340nm 에서 3분간 흡광도의 변화를 기록하여 기울기로부터 활성도를 계산하였다.

실험 결과, 도 20과 같이 저급알콜 불용성 분획이 투여된 랫트에서 간의 알콜 디히드로게나제 효소활성이 증가하는 것으로 나타나 숙취해소에 효과가 있는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 저급알콜 불용성 분획 및 그로부터 분리된 다당체 분획들은 단독 또는 약제학적으로 사용되는 부형제들과 함께 약제학적으로 통상으로 사용되는 방법에 따라 산제, 정제, 캡슐제, 주사제 및 액제 등과 같은 제제형태로 제제화하여 사용될 수 있다.

하기에 제제 실시예를 예시한다.

[제제실시예]

[산제의 제조]

분획 2 건조 추출물 2g

유당 1g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

[정제의 제조]

분획 2 건조 추출물 100mg

옥수수전분 100mg

유 당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

상기의 성분을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다

[캡슐제의 제조]

분획 2 건조 추출물 100mg

옥수수전분 100mg

유 당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

상기의 성분을 혼합한 후 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

[주사제의 제조]

분획 2 건조 추출물 100mg

주사용 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 활성성분을 주사용 증류수에 용해하고 pH를 약 7.5로 조절한 다음 전체를 주사용 증류수로 2ml 용량의 앰플에 충진하고 멸균시켜서 주사제를 제조한다.

또한 하기와 같은 방법으로 건강식품을 제조한다.

[선식의 제조]

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 만들었다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 만들었다.

본 발명의 헛개나무 저급알콜 불용성 분획을 진공 농축기에서 감압, 농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60메쉬로 분쇄하여 추출물 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 헛개나무 추출분획 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 과립을 만들었다.

[곡물류 : 현미 30중량%, 율무 15중량%, 보리 20중량%,

종실류 : 들깨 7중량%, 검정콩 8중량%, 검정깨 7중량%,

헛개나무 저급알콜 불용성 분획 건조분말 : 3 중량%, 영지 0.5중량%, 지황 0.5중량%]

또한 하기와 같은 방법으로 건강음료를 제조한다.

설탕 5~10%, 구연산 0.05~0.3%, 카라멜 0.005~0.02%, 비타민 C 0.1~1%의 첨가물을 혼합하고 여기에 79~94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85~98℃에서 20~180초간 살균하여 냉각수와 1 : 4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5~0.82%를 주입하여서 되는 헛개나무 저급알콜 불용성 분획 분말을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

액상과당 (0.5%), 올리고당 (2%), 설탕 (2%), 식염 (0.5%), 물 (75%)과 같은 부재료와 헛개나무 저급알콜 불용성 분획 건조추출물을 균질하게 배합하여 순간살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

헛개나무 어린 가지의 저급알콜 불용성 분획 및 이로부터 분리된 다당체 분획은 우수한 간독성, 항피로 및 숙취 해소효과를 나타내므로 각종 간 질환의 예방 및 치료제로서 유용하다.

Claims

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헛개나무(Hovenia dulcisThunb.)의 1년 내지 4년생 가지를 가압 열수 추출하여 얻어진 추출물에 메탄올, 에탄올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 저급알콜을 가하여 얻어진 저급알콜 불용성 분획물을 염화나트륨 용액을 용출액으로 하는 이온 교환 수지 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 얻어지는 20,000 D 이상의 분자량을 갖는 고분자성 다당체.
제3항에 있어서,

이온 교환 수지 컬럼 크로마토그래피법을 수행시 O M 염화나트륨 용액에서 용출되고 만노즈, 글루코즈, 갈락토즈. 아라비노즈 및 자일로즈로 구성되는 분자량 68,040 D, 36,440 D의 고분자성 다당체.
제3항에 있어서,

이온 교환 수지 컬럼 크로마토그래피법을 수행시 0.1 M 염화나트륨 용액에서 용출되고 만노즈, 글루코즈, 라마노즈 및 아라비노즈로 구성되는 분자량 22,500 D, 233,300 D, 200,700 D의 고분자성 다당체.
제3항에 있어서,

이온 교환 수지 컬럼 크로마토그래피법을 수행시 0.2 M 염화나트륨 용액에서 용출되고, 만노즈, 라마노즈, 아라비노즈 및 자일로즈로 구성되며 분자량 32,840 D의 고분자성 다당체.
제3항에 있어서,

이온 교환 수지 컬럼 크로마토그래피법을 수행시 0.3 M 염화나트륨 용액에서 용출되고, 만노즈, 글루코즈, 아라비노즈로 구성되며 분자량 88,610, 79,190의 고분자성 다당체
제3항에 있어서,

이온 교환 수지 컬럼 크로마토그래피법을 수행시 3 M 염화나트륨 용액에서 용출되고 만노즈, 갈락토즈, 아라비노즈, 자일로즈로 구성되며 분자량 216,500 D의 고분자성 다당체.
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헛개나무의 1년 내지 4년생 가지를 가압 열수 추출하는 단계; 얻어진 가압 열수 추출물에 메탄올, 에탄올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 저급알콜을 가하여 저급알콜 불용성 분획을 얻는 단계; 및 얻어진 저급알콜 불용성 분획을 염화나트륨 용액을 용출액으로 하는 이온교환수지 컬럼 크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는, 제 3 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 다당체 물질의 제조방법.
제10항에 있어서,

저급알콜이 메탄올인 제조방법.
제10항에 있어서,

이온교환수지가 약염기성 음이온 교환수지인 토요펄 DEAE 형 교환수지인 제조방법.
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제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 다당체 물질을 약제학적으로 허용하는 담체와 함께 포함하는, 간질환 해소, 피로 및 숙취 예방 또는 치료용 조성물.
제14항에 있어서,

간질환이 지방간, 간염 또는 간경화인 조성물.
제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 다당체 물질을 식품학적으로 허용되는 첨가제와 함께 포함하는, 간질환 예방용 건강식품.
제16항에 있어서,

음료형태인 건강식품.