KR100356501B1

KR100356501B1 - 고도호열성 미생물 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰ａｗ-1(ｋｆｃｃ 11115)

Info

Publication number: KR100356501B1
Application number: KR1020000022684A
Authority: KR
Inventors: 변유량; 남개원; 이동우; 김병찬
Original assignee: 변유량
Priority date: 2000-04-28
Filing date: 2000-04-28
Publication date: 2002-10-18
Also published as: KR20010100338A

Abstract

본 발명은 신규한 고도호열성 미생물에 관한 것이다. 본 발명자들은 산업적으로 유용한 고도호열성 미생물을 분리하고자, 고온환경에서 채취한 시료로부터 AW1 균주를 순수분리하였다. 전기 AW1 균주를 동정한 결과, 지금까지 보고된 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰과는 다른 신규한 고도호열균임을 확인하고, '퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW1(Fervidobacterium islandicumAW1)'이라 명명하였다. 본 발명의 신규한 고도호열성 미생물 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW1은 극한성 미생물로서, 고온에서도 성장이 가능할 뿐만 아니라, 닭깃털, 모발 등을 분해하는 효소를 생산함으로써 산업적으로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

고도호열성 미생물 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 ＡＷ-1(ＫＦＣＣ 11115){Extreme Thermophile of Fervidobacterium islandicum AW-1(KFCC 11115)}

본 발명은 신규한 고도호열성 미생물에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 고온환경시료로부터 분리된 신규한 고도호열성 미생물 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW1(Fervidobacterium islandicumAW1)에 관한 것이다.

고도호열성 미생물(extreme thermophile)이란 70℃ 이상의 고온에서도 증식할 수 있는 극한성 미생물이다. 이러한, 고도호열균에 대한 연구는 최근 미국과 유럽에서 활발히 진행되어 새로운 미생물들이 계속해서 분리되고 있으며, 가까운 wkd래에 이들 균주로부터 생산된 각종 호열성 및 내열성 효소와 대사산물들이 산업에 직접 응용될 수 있다는 측면에서 가치를 지닌다.

고도호열성 미생물로부터 생산된 효소의 경우, 일반효소와 비교하여 내열성 이나 유기용매에 대한 내성이 우수한 점 등 산업적으로 요구되는 많은 장점을 지니고 있어, 그 응용범위 또한 매우 다양하다. 따라서, 이들에 대한 연구는 여러 산업적인 화학반응공정과 생물반응공정 사이의 거리를 줄일 수 있을 것으로 기대되고 있는 바, 이미, 미국, 일본, 독일 등에서는 이들 극한미생물의 중요성을 인식하여, 이들의 분리 및 동정을 통한 새로운 미생물의 발견과 이를 통한 새로운 유전정보의 확보에 주력하고 있다.

한편, 케라틴(keratin)은 가금류 깃털의 불용성 구조단백질로서, 일반적인 단백질 분해효소에 의하여 가수분해되지 않은 매우 안정한 단백질이다. 케라틴 가수분해효소를 이용한 생물공학 기술에 의하여, 닭털, 모발 등 폐기 부산물의 재이용 및 자원화할 수 있다면, 고영양사료화, 유용희귀 아미노산(예를 들어, 시스테인(cysteine), 세린(serine), 프롤린(proline) 등)과 펩타이드의 생산이 가능하므로, 산업적으로나 환경적인 측면에서 중요한 과제라 할 것이다.

이에, 본 발명자들은 산업적으로 많은 가치를 지니는 고도호열성 미생물을 분리하고자 예의 연구노력한 결과, 고온환경 시료로부터 고도호열성 미생물을 분리 및 동정함으로써, 전기 미생물이 깃털을 분해한다고 보고된 균주들과는 다른 새로운 균주임을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 신규한 고도호열성 미생물 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW1(Fervidobacterium islandicumAW1)(KFCC 11115)를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 고도호열균 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW1의 전자현미경 사진이다.

도 2a는 본 발명의 고도호열균 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW1 생육의 배양온도에 대한 영향을 나타낸 그래프이다.

도 2b는 본 발명의 고도호열균 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW1 생육의 pH에 대한 영향을 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명의 고도호열균 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW1의 배양시간에 따라 깃털을 분해하는 모습을 나타낸 사진이다.

도 4는 본 발명의 고도호열균 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW1의 배양시간에 따른 세포수와 깃털의 주성분인 케라틴분해활성의 관계를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명자들은 산업적으로 유용한 고도호열성 미생물을 분리하기 위하여, 각종 고온환경에서 채취한 시료를 멸균증류수에 희석하고 혐기성 배지를 사용하여 혐기적 배양 방법으로 배양하였다. 그런 다음, 희석방법 및 단일 콜로니 분리방법에 의하여 콜로니를 순수분리하고, 종래의 고도호열성 균주들과 다른 미생물학적 특성을 가지는 새로운 균주 AW1을 선별하였다.

전기 순수분리된 AW1 균주는 절대 혐기성, 고도호열성의 특성을 가지며, 케라틴을 분해할 수 있는 세균으로서, 회전타원체 모양으로 운동성을 지니며, 균주의 끝부분에 토가(Toga)라고 하는 풍선모양의 형태가 형성되어 있다. 또한, 전기 미생물은 그람음성균이며, 대수증식기에 홀로 존재하거나 쌍으로 존재하고, 24시간 배양후에 때때로 균주가 길어지고 실처럼 연결된 형태가 관찰되기도 한다. 아울러, 40 내지 80℃의 범위에서 생육이 관찰되나, 최적생육온도는 70℃이고, pH 5 내지 9의 범위에서 생육이 관찰되나, 최적생육 pH는 7이다.

또한, AW1 균주는 화학유기영양체(chemoorganotroph)로서 아라비노오스(arabinose), 갈락토오스(galactose), 포도당(glucose), 과당(fructose), 자일로오스(D-xylose), 락토오스(lactose), 말토오스(maltose), 만노오스(mannose), 갈락토오스(galactose), 셀룰로오스(cellulose), 라피노오스(raffinose), 리보오스(ribose), 가용성 전분(soluble starch), 글리세롤(glycerol), 파이루베이트(pyruvate-Na), 젤라틴(gelatin) 등의 다양한 기질을 자화할 수 있다.

아울러, AW1 균주 DNA의 (G+C)함량은 41mol%이며, 16S 리보솜 DNA의 염기서열 분석 결과, 서모토게일(Thermotogale) 속의 미생물과 가장 높은 상동성을 가지며, 16s 리보솜 DNA의 분석 결과 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰(Fervidobacterium islandicum)과 98.4%의 상동성을 가진다. 그러나, 지금까지 보고된 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰은 닭털을 분해한다는 보고가 없었으므로, 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰과 DNA-DNA 하이브리다이제이션(hybridization)을 시행한 결과, 92.4%의 상동성을 나타내었다. 이를 토대로 본 발명의 AW1균주는 지금까지 발견되지 않은 새로운 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 균주임을 확인하고, 새로이 '퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW1(Fervidobacterium islandicumAW-1)'이라 명명하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 고도호열균의 순수분리

고온환경지역에서 채취한 시료로부터 70℃ 이상에서 닭털을 분해할 수 있는 고도호열균을 혐기성 배지(참조: 표 1)를 사용하여 혐기적 배양 방법에 의하여 배양하고, 희석방법(serial dilution method)에 의하여 본 발명의 균주를 순수분리하였다. 도 1는 순수분리된 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW1의 외부형태 전자현미경 사진이다. AW1균주는 대수증식기에 길이가 3∼5㎛ 정도되는 일반적인 회전운동체모양으로 운동성을 지니는 것으로 관찰되었다. 또한, 세포주위에 풍선모양의 형태로서 토가(toga)도 관찰됨으로써, 전형적인 서모토게일(Thermotogale)과에 속함을 알 수 있었다.

혐기성 배지의 조성

배 지 성 분	첨 가 량(g/L)
NaCl	2.0
CaCl₂·2H₂O	0.5
MgSO₄·7H₂O	0.5
MgCl₂·6H₂O	0.5
KH₂PO₄	0.5
K₂HPO₄	0.1
(NH₄)₂SO₄	0.5
KCl	0.1
KBr	0.1
H₃BO₃	0.03
SrCl₂·6H₂O	0.03
Na₂WO₄	0.033㎎
Na₂SeO₃	0.026㎎
효모 추출물	1.0
닭 털	5.0
Na₂S(25%, w/v)	3㎖/L

실시예 2: AW1 균주의 생육특성

AW1 균주의 생육특성을 알아보기 위하여, 생육온도와 배지의 pH에 따른 미생물 생육에의 영향을 관찰하였다. 깃털분해효소의 생산을 최적화하기 위한 최적배지조건(참조: 표 2)에서 온도의 영향을 알아보기 위하여, 표 2에 개시된 배지조성에 따라 pH 6.8에서 40℃부터 5℃ 또는 10℃ 간격으로 80℃까지 배양하고, 그 생육속도를 혈구계수기(haemocytometer)를 사용한 직접계수법을 사용하여 측정하였다. 이에, 생육속도는 하기 식에 의하여 측정하였다:

μ = (ln N2 - ln N1)/(t2-t1)

상기 식에서,

N2와 N1은 세포의 수를 나타내며; 및,

t2와 t1는 그 각각의 시간을 으로 나타낸다.

이어, 미생물이 모세포로부터 딸세포로 완전히 이분되는데 걸리는 시간(generation time)을 td = (ln 2)/μ로 계산한 결과, 최적배양온도는 70℃이며(참조: 도 2a), 이 온도에서 pH를 달리하며 배양하였을 때 최적 pH는 7.0이고(참조: 도 2b), 이때 딸세포로 이분되는데 걸리는 시간은 130분이었다.

깃털분해효소생산을 위한 혐기성 배지의 조성

배 지 성 분	첨 가 량(g/L)
K₂HPO₄	1.6
NaH₂PO₄·H₂O	1.0
MgSO₄·7H₂O	0.16
Na₂S·9H₂O	0.6
효모추출물	0.1
닭털	8.0
미량원소 용액	10ml
비타민 용액	10ml
레사주린(resazurin)	1mg

실시예3: AW1 균주의 동정

AW1 균주는 버지스(Bergeys)의 방법 및 슬레페키(Slepecky)와햄필(Hemphill)의 방법에 따라, 형태학적, 배양학적, 생화학적 특성을 조사하였으며(참조: Slepecky, R. A., Hemphill, H. E., The Genus Bacillus-Nonmedical., The Procaryotes 2nd ed., ch76, 1991), 페이슬리(Paisley)의 방법에 의하여 균체의 세포막의 지방산 조성을 GC MIDI 동정시스템으로 분석하였다(참조: Paisley, R. R., MIS Whole Cell Fatty Acid Analysis by Gas Chromatography, Training Manual, 1997). 선별된 균주의 부분 16S rDNA의 염기서열을 결정한 후, 인터넷에서 지원하는 GenBank^TM에서 종래의 공지된 박테리아의 염기서열과 비교하였다.

이어, 카션(Cashion)의 방법에 의해서 DNA를 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 크로마토그래피에 의해 분리하였다(참조: Cashion, P. et al., A Rapid Method for the Base Ratio Determination of Bacterial DNA, Anal. Biochem., Vol. 81. 1997). 드 레이(De Ley)가 보고한 방법(참조: De Ley, J. et al., The Quantitave Measurement of DNA Hybridization from Renaturation Rates, Eur. J. Biochem., Vol. 12. 1970)과 허스(Huss)의 변형된 방법(참조: Huss, V. A. R. et al., Studies on the Spectrophotometric Determination of DNA Hybridization from Renaturation Rates, J. Syst. Appl. Microbiol., Vol. 4. 1983), 에스카라(Escara)와 허튼(Hutton)의 분광계(spectrophotometer)를 이용한 방법(참조: Escara, J. F. and Hutton, J. R., Thermal Stability and Renaturation of DNA in Dimethylsulphoxide Solution: Accelation of Renaturation Rate, Biopolymers, Vol. 19. 1980)에 의하여, DNA-DNA 하이브리다이제이션(hybridization)을 행하였다. 리네이쳐레이션(renaturation) 속도는 장크(Jahnke)에 의해 프로그램된 TRANSFER.BAS를 사용하여 컴퓨터로 나타내었다(참조: Jahnke, K. D., Basic Computer Program for Evolution of Spectroscopic DNA Renaturation from GILFORD System 2600 Spectrometer on a PC/XT/AT type Personal Computer, J. Microbiol. Methods, Vol. 15, 1992)

본 발명의 미생물은 서모토게일과(Thermotogaleorder)에 속하며, 가장 가까운 속(genus)은 퍼미도박테리움속(Fervidobacteriumgenus)이고, 종(species)은 아이슬란디쿰(islandicum)으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 AW1 균주는 지금까지 발견된 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰에 새로운 고도호열균임을 확인하였고, 새로이 '퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW1(Fervidobacterium islandicumAW1)'이라 명명하고, 그를 1999년 11월 23일 사단법인 한국종균협회(KFCC)에 기탁번호 KFCC 11115으로 기탁하였다.

실시예 4: AW1 균주의 그람염색 및 깃털분해효소 생산분석

AW1 균주를 후커(Hucker)의 방법으로 그람염색을 실시하여, 그람음성균임을 확인하였다(참조: Hucker's method, Brock & Madigan, 1988).

표 2에 개시된 배지 10㎖에 AW1균주 5%(w/v)를 접종하고, 깃털 0.8%(w/v)를 넣은 후, 70℃에서 배양하여 깃털의 분해시간을 측정하였다(참조: 도 3). 도 3에서 1번 시험관은 깃털을 넣은 직후의 상태, 2번 시험관은 깃털을 넣은 후 12시간이 경과한 상태, 3번 시험관은 깃털을 넣은 후 24시간이 경과한 상태를 각각 나타내었는 바, 24시간이 경과하면 깃털이 완전히 분해됨을 알 수 있었다.

표 2에 개시된 배지 1ℓ에 AW1균주 5%(w/v)를 접종하고, 깃털 0.8%(w/v)를 넣은 후, 70℃에서 36시간동안 배양하며, 각 시간별로 세포수와 깃털의 주성분인 케라틴의 분해활성을 측정하였다(참조: 도 4). 케라틴의 분해활성을 측정하기 위하여, 깃털을 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시켜서 수득한 수용성 케라틴을 수득하고, 수용성 케라틴과 AW1균주를 배양한 배양액을 혼합한 후, 90℃에서 1시간동안 반응시켰다. 이어, 10% TCA(tricholoroacetic acid)를 첨가하여 단백질을 침전시킨 다음, 이를 원심분리하여 상등액을 수득하고, 280nm에서 수득한 상등액의 흡광도(O.D.)를 측정하고, O.D.가 0.1 증가하는 것을 1unit로 정의하였다. 도 4에서, (■)는 세포수를 나타내고, ()는 깃털의 주성분인 케라틴의 분해활성을 나타낸다. 도 4는 배양에 따른 세포수의 증가와 비례하여 케라틴의 분해활성이 증가함을 나타내므로, 케라틴의 분해활성이 AW1균주의 생장에 의존함을 알 수 있었다.

본 발명의 AW1 균주는 일반적으로 깃털을 열처리를 통하여 분해시키는 데, 효소를 같이 첨가하여 분해되지 못하는 부분까지도 분해할 수 있다는 점에서, 순수한 깃털분해효소 생산균주로서 산업적으로 응용될 수 있을 것이다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 신규한 고도호열성 미생물 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW1(Fervidobacterium islandicumAW1)을 제공한다. 본 발명의 신규한 고도호열성 미생물 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW1은 극한성 미생물로서, 고온에서도 성장이 가능하다는 특성으로 인하여 산업적으로 유용하게 활용될 것이다. 예를 들면, 본 발명의 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW1은 W종래의 가금류 깃털을 이용하여 가축의 사료로 사용하는 방법은 열처리를 통하여 생산하였지만, 열처리를 하더라도 깃털이 완전히 분해되지 않아 가축들의 소화에 불완전하였다. 그러나, 본 발명의 고온에서 생육하는 AW1균주를 열처리에 같이 이용하면, 깃털이 완전히 분해될 수 있는 장점을 가지는 바, 순수한 깃털분해효소 생산균주로서 산업적으로 응용될 수 있을 것이다.

Claims

고도호열성 미생물 퍼비도박테리움 아이슬란디쿰 AW1(Fervidobacterium islandicumAW1)(KFCC 11115).