KR100203545B1

KR100203545B1 - 폴리펩티드 정제방법

Info

Publication number: KR100203545B1
Application number: KR1019910701714A
Authority: KR
Inventors: 도시히코 가미누마; 도시이 이이다; 마사히로 다지마
Original assignee: 겜마 아키라; 가부시키가이샤 시세이도
Priority date: 1990-03-30
Filing date: 1991-11-29
Publication date: 1999-06-15
Also published as: DE69124561D1; CA2057014C; CA2057014A1; DE69124561T2; EP0480048A1; AU7548291A; US5612454A; AU645794B2; ES2097806T3; WO1991015502A1; EP0480048A4; EP0480048B1

Abstract

본 발명에서는 역상 고성능 액체 크로마토그래피용 패킹 물질을 사용하여 폴리펩티드를 정제하는 개선된 방법이 제공되고 있다. 폴리펩티드를 정제하는 방법은, 다양한 세포에 의해 생성된 폴리펩티드를 예정된 상태로 예비-처리하여 수득한 폴리펩티드를 함유하는 수용액을 특정 pH값으로 조정하고 불순물을 제거시킨 후 역상 고성능 액체 크로마토그래피용 패킹물질로 처리함을 특징으로 한다.

Description

[발명의 명칭]

폴리펩티드 정제방법

[도면의 간단한 설명]

제1a도 내지 제1e도는 단계 순서에 따라 본 발명에 따른 방법으로 정제한 사람 칼씨토닌 전구체 용액의 HPLC용출 패턴을 나타내고,

제2도는 냉동건조시킨 후 제1e도 시료의 HPLC용출 패턴을 나타내며,

제3도는 제2도의 용액을 분배시켜 수득한 고도로 순수한 정제된 사람 칼씨토닌 전구체의 HPLC용출 패턴을 나타내고,

제4도는 이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 사용한 사람 칼씨토닌 융합된 폴리펩티드의 용출 패턴을 나타내며,

제5도는 본 발명의 방법에 따라 정제한 용출물의 HPLC용출 패턴을 나타내고,

제6도는 본 발명의 방법에 따라 정제한 멜라닌 세포-자극호르몬 용출물의 PHLC용출 패턴을 나타낸다.

[발명의 상세한 설명]

[기술적 영역]

본 발명은 폴리펩티드를 정제하기 위한 개선된 방법, 보다 특히는, 폴리펩티드를 함유하는 목적 물질을 예비처리한 후 이로부터 생성된 조

폴리펩티드 수용액을 역상 고성능 액체 크로마토그래피용 충진제로 처리하여 수행하는 정제 방법에 관한 것이다.

[배경 기술]

미생물, 동물세포, 및 식물세포로부터 제조된 포리펩티드를 이의 생리학적활성을 고도로 유지시키면서 정제하는 데는 대단히 복잡한 과정이 요구된다. 결과적으로, 현재의 방법은 개선시켜야 할 필요가 있다. 예를 들어, 형질전환된 미생물에 의해 생산되는 사람 성장 호르몬 방출인자(human growth hormone releasing factor)의 정제는, 10단계의 공정을 거침으로써 대량 생산은 이루어지지만 생검정을 수행하기에는 수율이 너무 낮다[참조 : Vincent Geli et al., Gene, 80, 129-136(1989)]. 사람 칼씨토닌의 정제를 위해서는, 6가지 타입의 칼럼을 사용하는 8단계 정제방법이 수행된다고 보고된 바 있다[참조 : J.P. Gilligan et al., Biochromatography, 2(1), 20-27 (1987)].

그러나, 이들 정제 단계는 대단히 복잡하므로, 그 결과 폴리펩티드의 분해가 일어나며 정제동안에 폴리펩티드의 생리학적 활성이 상실된다고 여겨지고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은, 단순한 공정을 수행하여 안정한 형태로 폴리펩티드를 분리하고 고수율로 폴리펩티드를 분리 및 정제함으로써 상기의 문제점을 해결할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

[발명의 기술]

과거 수년간, 사람 성장 호르몬 및 사람 칼씨토닌으로 대표되는 다양한 생리학적으로 활성인 폴리펩티드가, 유전적 공정으로 제조한 다양한 세포의 도움으로 다량제조되어 왔다. 이중, 천연적으로 발견되는 타입인 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 자체 이외에도, 다른 단백질 잔기가 융합된 폴리펩티드(또한 키메라 단백질로도 부름)로서 제조되는 많은 폴리펩티드도 있다. 물론 이들이 통상적인 분리/정제의 방법을 사용하여 정제될 수도 있지만, 융합된 폴리펩티드를 생리학적으로 활성인 이의 잔기 및 이에 융합된 기타의 단백질 잔기로 분해시킨 후 아무런 탈활성화없이 목적하는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드를 효율적으로 회수하기 위한 방법의 개발이 특히 요구되어 왔다. 본 발명자들은, 상기 언급한 융합된 폴리펩티드의 분해물질을 특정의 pH 수준하에서 처리하고, 이로써 수득된 처리된 액체를 역상 고성능 액체 크로마토그래피용 충진제로 처리하면, 목적하는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드를 효율적으로 수득할 수 있으며, 또한 이 방법이 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 자체를 함유하는 샘플을 정제하는데 유리하게 사용할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 언급한 목적은, 다음의 단계를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 정제방법을 제공함으로써 성취할 수 있다. 즉, 본 발명은 (a) 조 폴리펩티드를 함유하는 수용액의 pH범위를 1 내지 4로 조정하여 불순물이 침전되도록 하고 이어서 이들 불순물을 제거하는 단계 및 (b) 상기 언급한 단계 (a)에서 수득한 상등액을 역상 고성능 액체 크로마토그래피용 충진제상에 흡착시킨 후 목적한 폴리펩티드를 용출시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

[발명의 최선 실시 형태]

본 발명에 따라 정제되는 폴리펩티드는 미생물, 동물 세포 및 식물세포 기원이거나 또는 전술한 폴리펩티드를 생산하기 위해 유전자 공정을 수행한 바 있는 세포들로부터 유래한 것일 수 있다. 결국, 본 발명의 목적은 처리한 물질(예 : 균질물) 및/또는 상기 언급한 세포들의 배양물 정제 방법에 있다.

이들 처리한 물질 및/또는 배양물을 본 발명에 따른 방법으로 처리하기 전에, 세포 균질화 물질 또는 세포 자체를 제거하고 목적하는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드를 수성 매질 중에 용해시키며, 임의로 농축시키고 공지된 분리/정제 방법으로서 정제해야 한다. 융합된 폴리펩티드 형태로서의 상기 언급한 기원으로부터 생리학적으로 활성인 폴리펩티드가 수득되면, 이들을 본 발명에 따른 방법으로 정제하여, 융합된 폴리펩티드 형태로 상당히 고도로 저에한 후 생리학적으로 활성인 잔기와 다른 단백질 잔기로 분해시킨다. 따라서, 본원에서 사용된 조 폴리펩티드를 함유하는 수용액이란 상기 언급한 기원으로부터 유래된 다양한 처리된 액체를 포함하며, 이는 본 발명의 효과가 나타나는 한 정제중의 어떤 단계에라도 적용시킬 수 있다. 본 발명에 따른 방법으로 유리하게 처리할 수 있는 용액의 한가지는, 융합된 폴리펩티드가 생리학적으로 활성인 잔기와 기타 단백질 잔기로 분해된 후의 반응 용액을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 언급한 세포의 처리된 물질 및/또는 배양물은 폴리펩티드를 제조하는 자체 공지된 방법으로 제조할 수 있다.

예를 들어, 발현 벡터를 사용한 폴리펩티드의 제조에 대한 개요는 다음과 같다:

폴리펩티드를 암호화한 유전자를 발현시키는 숙주로서는 미생물(예 : 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 효모) : 동물세포, 예를 들어 곤충, 포유류 및 양서류로부터 기원된 세포 및 식물세포가 언급될 수 있다. 발현 벡터로서는, 세포 중에서 목적 폴리펩티드를 포함하는 유전자를 효과적으로 발현시킬 수 있는한, 어떠한 플라스미드라도 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 다음의 문헌에 기술된 플라스미드 중에서 적절하게 선택할 수 있다 : Vector DNA, the lst press(1986), edited by Yoshiyuki Sakaki., Kodansha : Zoku Seikagaku Jikken Koza I. Idenshi Kenkyuhou II(How to Research Gene II), -Kumikae DNA Gijutsu(DNA Recombination Technique)-, Chapter 7, Kumikaetai no Hatsugen(Expression of Recombinants), edited by Society of Biochemical Society of Japan, Tokyo Kagaku Dojin : Recombinant DNA, Part D, Section II, Veotors for Expression of Cloned Gene, (1987), edited by Ray Wu and Lawrence Grossman., Academic Press, INC : Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Ed, Book 3.(1989), edited by J. Sambrook, E. P. P. Pritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press; etc.

예를 들어, 이. 콜라이의 경우는 pMb, pBR 및 pUC타입의 벡터가, 효모의 경우는 YIp, YRp 또는 YEp 타입의 벡터, 바실러스 서브틸리스의 경우는 pUB, pBC 또는 pBD 타입의 벡터가 사용될 수 있다. 동물세포의 경우는 SV 40, BKV 또는 BPV타입이 사용될 수 있다. 식물세포의 경우는, 프로모터가 식물체 상에서 작동할 수 있게 변화된 것을 제외한, E. coli의 경우에 해당하는 벡터를 사용할 수 있다. 식물체상에서 작동할 수 있는 프로모터의 예로는 클로로필 a-b 결합 단백질, 컬리플라워 모자이크바이러스 35S등이 있다.

이들 벡터의 재조합 및 숙주세포를 재조합 플라스미드로 형질 전환 및 형질 도입시키는 것은 각각 상기 언급한 문헌에 기술된 공지된 방법 자체로서 수행할 수 있다. 이로써 수득한 형질전환된 세포들은 처리할 세포들을 생장시키기 위해 통상 사용하는 배양조건하의 배지중에서 배양할 수 있다.

상기의 배양된 물질로부터 폴리펩티드 및/또는 융합된 폴리펩티드가 세포외적으로 분비되면, 세포를 제거하고, 이들 물질이 세포내에 축적되면, 배양물을 제거한 후 폴리펩티드 및/또는 융합된 폴리펩티드는 세포 균질화 방법 등으로 수거한다.

제한하려는 의도는 아니자만, 본 발명에 다른 정제에 있어서의 폴리펩티드는 둘 또는 그 이상의 아미노산이 펩티드-결합한 폴리펩티드가 목표이다. 폴리펩티드란 용어는 또한 본원에서, 변형된 폴리펩티드 즉, 당 도는 인산이 이들의 아미노산에 결합한 폴리펩티드 및 N-말단 측면이 아미드화된 것 등의 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 15,000이상의 분자량을 가지며, 여기에는 예를 들어 호르몬 및 성장 인자, 예를 들면 인슐린, 성장 호르몬 방출인자(GRF : growth hormone release factor). 상피성장인자(EGF : epidermal growth factor), 심방성 나트륨이뇨성 펩티드(ANP : atrial natriuretic peptide), 티모신 α₁, 티모신 β_4,티모포이에틴, 형질전환 성장인자(TGF-α), 부신피질자극성 호르몬(ACTH), 칼씨토닌 유전자-연관 펩티드(CGRP) 및 연골인자(CDF) : 사이토키닌, 예를 들어 인터루킨-2 및 인터루킨-3이 있다. 이들 폴리펩티드외에 본 발명의 방법에 바람직하게 적용할 수 잇는 폴리펩티드는 아래 나열한 폴리펩티드를 포함한다.

폴리펩티드에 대한 설명으로서 아미노산 및 기타의 것이 약어로 표현되어 있을 경우, 이들은 IUPAC 규정에 따라 나타내거나 또는 당해 분야에서는 통상적인 부호로 나타내었다. 이들 중 일부의 예로써는 다음과 같다.

Ser : L-세린 Leu : L-루이신

Arg : L-아르기닌 Cys : L-시스테인

Gln : L-글루타민 Lys : L-라이신

Ile : L-이소루이신

Pro : L-프롤린 Val : L-발린

His : L-히스티딘 Met : L-메티오닌

Ala : L-알라닌 Gly : 글라이신

Phe : L-페닐알라닌

Asp : L-아스파르트산

Asn : L-아스파라긴

Glu : L-글루탐산

Trp : L-트롭토판

Thr : L-트레오닌

Tyr : L-티로신

x : 상기한 아미노산중의 어느 하나

hCT : 사람 칼씨토닌

HPLC : 고성능 액체 크로마토그래피

(1) 혈관수축제 또는 혈압 상승제로서 사용될 수 있는 안지오텐신 Ⅱ[말(equine)에서 유래]

Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe

(L.T. Skeggs et al., J. Exptl. Med, 106, 439, 1957)

(2) 혈압 강하제로 알려진 안지오텐신 Ⅱ 길항제

Ser-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Ala

(3) 안지오텐신Ⅲ

Arg-Val-Tyr-Ile-Hie-Pro-Phe

(Campbell. W. B. et al., Science, 184, 994, 1974)

(4) 과칼륨혈중 치료제로 알려진 칼씨토닌의 C-말단 글라이신 첨가물(C-말단 아미드화용 전구체)

(사람)

(돼지)

(소)

(연어)

(래빗)

(조류)

(5) 멜라닌세포-자극효과를 갖는 멜라닌세포-자극 호르몬, α-MSH

(6) 멜라닌세포-자극 호르몬, β-MSH(곱상어과)

(7) 트립신억제제

(사람)

(소)

(8) 칼슘 방출효과를 갖는 부갑상선 호르몬

(돼지)

(9) 회피 유도성 뇌하수체 펩티드

(돼지)

(10) 프로인슐린 C펩티드

(소)

[N-말단이 Gly-Pro-인 폴리펩티드]

(11) 세포 성장 촉진 인자로 알려진 인슐린-유사 성장 인자Ⅰ

(12) 췌장 폴리펩티드

(조류)

(13) 칼시토닌 유전자-관련된 펩티드의 C-말단 아미노산 잔기에서 글리신 그륩이 결합된 펩티드(C-말단 아미드화용 전구체)

(사람 α형)

(사람 β형)

(랫트 α형)

(랫트 β형)

(14) 안지오텐신 및 폭식 효과를 지닌 호르몬(신경 펩티드, NPY)

(15) 성장 호프몬-방출인자(GRF)

(16) 분비

(17) 혈압강하 효과를 지닌 호르몬(VIP)

(18) 맥관 확장 효과 및 인슐린-분비 촉진성 효과를 지닌 호르몬(펩티드 HI)

(19) 가스트린-방출 펩타이드(GRP)

(20) 콜레시스토키닌(CCK)

(21) 췌장액 분비 억제 호르몬 PYY

(22) 위-운동 활성-자극 호르몬(모틸린)

결국, 상기 언급한 생리학적으로 활성인 폴리펩티드를 암호화한 유전자가 적절한 숙주세포내에서 발현되는 경우, 본 발명의 융합된 폴리펩티드는 유전자 생성물이며 여기서, 옐를 들면, 단백질을 암호화하는 유전자는 (필요에 따라, 적절한 분해 가능한 부위를 포함) 이들을 용이하게 검출하게 해주며, 상기 언급한 유전자는 인위적으로 연결된다. 이러한 단백질은 β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 등을 포함한다.

상기한 바와 같이 제조한 조 폴리펩티드의 수용액을 활용하고, RIA 방법 또는 HPLD 방법을 사용하여 목적하는 폴리펩티드를 모니터링하면서 바람직하게는 본 발명의 방법을 수행한다. 융합된 폴리펩티드가 목적한 폴리펩티드의 전구체로서 수득될 경우, 상술한 바와 같이 목적 폴리펩티드에 융합된 목적 폴리펩티드 잔기와 다른 단백질 잔기를 분해시켜, 본 발명의 조 폴리펩티드를 함유하는 수용액을 제조할 필요가 있다. 이런 분해를 위한 기술은 폴리펩티드의 타입에 따라서 선택될 수 있으나 일반적으로 CNBr, 트립신, 콜라게나제 등을 처리하는 방법이 적용가능하다. 이런 경우, 비-특이적인 펩티다제 활성을 억제시키기 위해, 적절한 양의 단백질 분해효소 억제제(예 : N-에틸말레이미드(NEM), 디티오트레이툴(DTT), 2-머캅토에탄올(2-ME), 에틸렌디아민테트라아세트나(EDTA) 또는 페닐메탄설포닐플루오라이드(PMSF)를 가하는 것이 바람직하다.

그 후, 반응 생성물 즉, 본 발명의 조 폴리펩티드를 함유하는 수용액을 정제단계에서 정제한다. 예를 들어, 콜라게나제를 사용하여 분해함으로써 수득한 조 폴리펩티드의 반응 용액에, 포름산, 아세트산, 염산 또는 이들의 수용액을 가하여 pH를 1 내지 4, 바람직하게는 약 pH 2로 조정한다. 만일 pH 수준이 4를 초과하면, 콜라게나제중에 공존할 가능성이 있는 내재성 단백질 분해 효소 또는 비-특이적 단백질 분해 효소가 목적하는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 안정성에 악영향을 끼치게 되고, 제거되야 할 불순물은 충분히 병형되지도 침전되지도 않는다. 만일, pH수준이 1미만이라면, 목적하는 폴리펩티드의 침전이 발생하며, 이것은 더 악화된 회수율로 나타난다. 산으로서는 포름산이 가장 바람직하다. 이렇게 침전된 불순물은 여과시키거나 또는 원심분리시킨다. 예를 들면, 용액을 정치시킨후, 원심분리로 침전시킨 불순물을 제거함으로써, 이중에 용해된 목적하는 폴리펩티드를 갖는 상등액을 수득한다. 이 단계에서 원심분리의 회전수는 유리하게는 1000 내지 100000, 바람직하게는 5000 내지 30000에서 수행한다.

만일 분리를 1000미만의 회전수에서 수행한다면, 불순물이 불완전하게 제거될 수 있다. 비록 회전수가 100000이상이 된다해도 현저한 효과가 수득되진 않는다.

상기 언급한 단계는 바람직하게는 보통의 실온과 동일하거나 또는 낮은 온도에서, 특히 1℃ 내지 15℃에서 수행한다. 만일 온도가 0℃미만이라면, 용액은 냉각되며, 폴리펩티드의 안정성은 이들이 다시 녹게될 때 악화되게 된다. 한편, 온도가 15℃이상이 되더라도, 목적하는 폴리펩티드의 안정성은 악화되게 된다. 산으로 처리하느 시간은 수분 내지 수시간이며, 보통 약 30분 정도에서 충분한 효과가 수득된다. 만일 처리 시간이 수분 미만이라면, 불순물이 불완전하게 제거된다. 수시간 이상의 처리시간이 현저한 추가적 효과를 나타내진 않는다.

전 단계에서, 수득한, 용해된 목적하는 폴리펩티드를 갖는 산용액은 그후 역상 고성능 액체 크로마토그래피용 충진제에 흡착시킨다. 담체를 용액중의 폴리펩티드와 접촉시킬 수 있도록 할 수 있는 어떤 흡착법이라도 흡착 수단으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 적정량의 담체를 목적하는 폴리펩티드가 용해되어 있는 용액 중에 혼입시키고 흡착될 것들을 교반시키거나 진탕시켜 접촉을 촉진시키는 흡착법, 담체를 적절한 물질로 만들어진 튜브내에 패킹시키고 폴리펩티드 용액을 튜브를 통해 통과시켜 흡착시키는 흡착법, 담체를 필터 층으로서 고정시키고 펩티드 용액을 통과시켜 이것을 담체상에 부음으로써 담체상에 흡착시키는 흡착법 등이 언급될 수 있으나, 폴리펩티드를 담체와 접촉하도록하여 담체에 펩티드를 흡착시키는 한, 상기 방법으로 제한되지는 않는다.

역상 고성능 액체 크로마토그래피용 충진제로서는 표면에 다양한 탄소수의 치환체를 갖는 시아놀 그룹이 결합된 물질이 사용될 수 있다. 시판되고 있는 제품의 예로써는 CAPCELL PAKC₁₈SG 300, CAPCELL PAK C₈SG 300, CAPCELL PAK C₁₈AG 120 및 CAPCELL PAK C₈AG 120(모두 시세이도사 제품), Superpacks ferisoap OD52(파마시아 제품), TSK 젤 ODS-80TM, TSK 젤 ODS-120A 및 TSK 젤 ODS-120T(모두 토소사 제품), Hipore RP-304 C₄및 Hipore RP-318 C₁₈(모두 바이오-라드 래보라토리 제품) 및 기타가 있다.

흡착된 폴리펩티드의 용출은, 극성용매(예 : 아세토니트릴, 메탄올 또는 부탄올)로 흡착된 폴리펩티드의 극성을 변화시켜 0.1%의 트리플루오로아세트산 수용액(아미노산 분석시)으로 세척한 후 수행할 수 있다.

[실시예]

본 발명은 하기의 실시예를 참조로 더 자세히 설명될 것이나, 본 발명이 이로써 제한되지는 않는다.

[실시예]

형질전환시킨 이.콜라이에 의해 생산된 사람 칼씨토닌 전구체의 정제

융합된 폴리펩티드의 제조(참조실시예)

사람 칼시토닌 전구체(이는 이후 C 말단에서 아미드화되어 사람 칼씨토닌이 된다)를 수득하기 위해, 사람 칼씨토닌 콜라게나제 분해 부위 펩티드-β-갈락토시다제 융합된 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 작제하고, 이 유전자를 발현시킬 이. 콜라이 내에 도입시킨다. 이 형질전환된 미생물을 하기 기술한 방법으로 배양한다.

플라스미드 pZT32로 형질전환시킨 특이적인 이. 콜라이 M15(일본국 특허원 제63-226288호) 균주를 30ℓ의 자퍼멘터(히다치 세이샤쿠쇼 제조)를 사용하여 20ℓ의 양으로 배양한다.

다음의 배지가 사용된다.

Na₂HPO₄·12H₂O 1.8%

KH₂PO₄0.2%

(NH₄)₂SO₄0.2%

효모 추출물 0.5%

펩톤(Difco) 0.5%

MgSO₄·7H₂O 0.01%

글루코스 0.5%

암피실린 150㎍/㎖

150㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB-배지 상에서 30℃로 밤새 예비배양시킨 500㎖의 진균 액[참조 : T. Maniatis et al. : Molecular Cloning p4891982)]를 상기 언급한 배지 500㎖에 옮겨 30℃에서 배양한다. 공기를 1vvm으로 환기시키면서 배양을 지속시키고 배지의 pH는 수산화나트륨을 사용하여 7.0으로 조정한다. 이를 3시간 동안 배양하면 OD₆₆₀이 1이 되며, 이때 IPTG를 1mM의 농도로 가한다. 배양을 6시간 더 계속하면 OD₆₆₀이 10에 달하게 되고, 진균은 원심분리로 수거한다. 멸균수로 세척한 후, 진균체를 10mM 트리스-HCI 완충액((pH 8.0)/1mM EDTA/0.1mM DTT중에 현탁시키고 10℃에서 균질화기 15HR(고링 제조)로 균질화시킨다. 원심분리시켜 수득한 상등액을 세포 추출 용액으로 간주한다.

지표로서 β-갈락토시다제를 사용하여 사람 칼씨토닌-융합된 폴리펩티드를 정제한다.

여기에서, 1단위의 β-갈락토시다제는, pH7.0의 28℃에서 o-니트로페놀 β-D-갈락토사이드상에 작용하여 1분 동안에 1nmol의 o-니트로페닐을 방출할 수 있는 역가로서 규정한다.

상기 언급한 처리에 의한 특이적 활성의 추이는 표 1과 같다.

비활성은 약 3.5배 증가하고 222,000U/㎎단백질이었다.

[융합된 폴리펩티드의 특이적 분해에 의한 조 폴리펩티드의 제조]

상기 언급한 사람 칼씨토닌-콜라게나제 분해 부위 펩티드-β-갈락토시다제 융합된 폴리펩티드를 콜라게나제로 특이적 분해시켜 사람 칼씨토닌의 C-말단 글라이신 첨가물을 수득한다. 사용된 콜라게나제는 시판되는 것이다(시그마 제품, 타입 Ⅶ). 반응용액의 조성물은 다음과 같다 :

5mM 염화 칼슘

50mM 트리스-HCI 완충액, pH7.5

250μM 염화 아연

10mM 디티오트레이톨

10mM 2-머캅토에탄올

1㎎/㎖ 표준으로 정제된 융합 단백질

100단위/㎖ 콜라게나제

효소 반응을 37℃에서 3시간 수행하고 반응 생성물을 HPLC로 확인한다. 이 반응 용액을 조 폴리펩티드를 함유하는 수성 용액으로 나타낸다. HPLC 분석조건은 다음과 같다.

칼럼으로써 CAPCELL PAK CSG 300(6mm×35mm)(시세이도 제조)을 사용하고, 용출제로서 수성 0.1% 트리플루오로아세트산 용액/0.085% 트리플루오로아세트산 아세토니트릴 용액을 사용하고, 0.085% 트리플루오로아세트산 아세토니트릴 용액의 농도를 60%까지 20분 이상에 걸쳐 1.5㎖/분의 유속으로 직선적으로 증가시키고, 칼씨토닌 전구체를 약 40% 농도의 아세토니트릴로 용출시킨다. 이때의 검출 파장은 214nm이다.

[실시예 1]

조 폴리펩티드의 정제

조 폴리펩티드를 함유하는 상기 언급한 반응 용액에 2% 농도까지 포름산을 가하고, 이 용액을 교반시키며, 이후 이를 4℃에서 30분간 정치시켜 둔다. 불순물이 충분히 제거되었음을 확인한 후, 이 용액을 12000rpm에서 10분간 원심분리시켜 상등액을 수득한다. 이때의 상등액 HPLC 용출 패턴은 제1(a)도와 같다. 필터 페이퍼(토요 로시 제조, No. 2)를 마그네트 부흐너 깔때기(magnet Buchner funnel)에 위치시키고, 이 위에 10g의 CAPCELL PAK GSG 300 분말(시세이도 제조)을 넣고, 깔때기를 흡인 병에 위치시킨다. 흡인하에 상등액을 조심스럽게 상기 언급한 부흐너 깔때기로 붓는다. 이때의 비-흡착 분획의 HPLC 용출 패턴은 제1(b)도와 같다. 흡인완료 후, 잔사를 두 분획 중에서 50㎖ 수성 0.1% 트리플루오로아세트산 용액(아미노산 분석용으로서 와꼬 준야쿠에서 제조)으로 세척한다[이 용출물의 HPPLC 용출 패턴은 제1(c)도와 같다]. 그후 이를 두 분획 중에서 50㎖수성 0.1% 트리플루오로아세트산/20% 아세토니트릴 용액을 세척한다[이 용출물의 HPLC 용출 패턴은 제1(d)도와 같다]. 그후, 목적하는 폴리펩티드를 10분의 중에서 5㎖의 수성 0.1%트리플루오로아세트산/60% 아세토니트릴 용액으로 용출시킨다[이 용출물의 HPLC 용출 패턴은 제1(e)도와 같다]. 최종적으로 흡착된 물질을 메탄올(HPLC 분석용, 나카라이 테스크 제조)로 완전히 용출시킨다. 이 정제의 결과는 표2와 같다. 순도는 총 단백질중 사람 칼씨토닌 전구체의 중량 백분율로서 나타냈다. 포름산 처리후의 순도는 제2도의 피크 Ⅰ 및 Ⅱ의 합으로부터 계산한다. 콜라게나제 반응 후 포름산 처리로 순도가 56배까지 개선되었으며, 100%의 사람 칼씨토닌 전구체가 회수될 수 있다. 또한, 추후의 CAPCELL PAK CSG 300 처리로 순도가 70% 이상 추가로 개선되었으며 97%의 회수율을 수득하였다.

제2도는, 동결건조 후 1(e)도의 용출물을 HPLC로 분석한 경우에 용출패턴을 나타낸다. 이 도면에서 명백한 바와 같이, HPLC 분석의 용출 패턴중에서 목적하는 폴리펩티드에 대한 4개의 강한 피크가 발견된다. 이것은 콜라게나제 반응 동안 N-말단 부위의 변화로 인한 것이다. 각각의 피크는 펩티드 서열 분석기(ABI 제조, 모델 471)로 분석한다. 이 분석으로부터, 피크 Ⅰ 및 Ⅱ는 1 내지 33개의 아미노산을 갖는 사람 칼씨토닌 전구체에 상응하는 것이며, 피크 Ⅲ은 N-말단에서 1 내지 7부위가 결실된 것에 상응하는 것이며, 피크 Ⅳ는 N-말단에서 1-8 부위가 결실된 것에 상응하는 것임을 알 수 있다. 또한 피크 Ⅱ는 1- 및 7-위치에서의 S-S 결합이 환원된 것과 상응하는 것임을 알 수 있다.

본 발명의 정제 방법 및 HPLC 분배 방법 모두를 수행한 후, 분석 결과를 제3도에 나타낸다.

한편, 조 폴리펩티드를 함유하는 상기 언급한 반응용액을 사용하여 비교 실시예로서 통상적인 이온교환 칼럼과 PHLC로 폴리펩티드 정제를 수행한다. 이 경우, 정제에 10단계가 요구된다. 각 단계가 2시간을 필요로 하므로, 본 발명에 따른 실시예 1이 필요로 하는 시간의 10배의 시간이 요구된다.

[실시예 2 및 3]

이. 콜라이에 의해 사람 칼씨토닌-콜라게나제 분해 부위 펩티드-β-갈락토시다제 융합된 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 발현 및 실시예 1의 정제 방법에 따라, 안지오텐신 Ⅱ-콜라게나제 분해 부위 펩티드-β-갈락토시다제 융합된 폴리펩티드와 멜라닌세포 자극 호르몬-콜라게나제 분해 부위 펩티드-β-갈락토시다제 융합된 폴리펩티드를 생성시켜 각각의 경우 폴리펩티드를 함유하는 수성 용액을 제조한다. 이 용액을 실시예 1과 동일한 방법으로 처리한다. 안지오텐신 Ⅱ 및 멜라닌세포-자극 호르몬에 대한 용출물의 HPLC 용출 패턴은 각각 제5도 및 제6도와 같다.

[산업상 이용성]

본 발명의 방법은 다양한 폴리펩티드, 특히 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 제조중의 어떠한 정제 단계에서라도 유리하게 수행할 수 있다.

Claims

(a) 목적하는 생리학적으로 활성인 잔기와 이 잔기에 융합된 다른 단백질 부분으로 절단되는 융합된 폴리펩티드를 함유하는 수용액의 pH범위를 1 내지 4로 조정하여 불순물을 침전시키고, 이어서 이 불순물을 제거하는 단계, 및 (b) 단계 (a)로부터 수득한 상등액을 역상 고성능 액체 크로마토그래피용 충진제가 넣어진 부흐너 깔대기내에서 흡착시킨 후 목적하는 폴리펩티드를 용출시키는 단계를 포함하여, 폴리펩티드를 정제하는 방법.