JPWO2019088292A1 - ハイドロゲル粒子およびその製造方法、ハイドロゲル粒子を内包する細胞または細胞構造体、ハイドロゲル粒子を用いた細胞活性の評価方法、並びにハイドロゲル粒子の徐放性製剤としての使用 - Google Patents
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Abstract
Description
[1] 第1のハイドロゲルで構成されるドメインと、
前記ドメインを内包する、前記第1のハイドロゲルとは架橋度または組成の異なる第2のハイドロゲルで構成されるマトリクスと、
少なくとも前記第1のハイドロゲルに担持されている磁性体粒子と
を含む、ハイドロゲル粒子。
[2] 前記磁性体粒子は、前記第1のハイドロゲルおよび前記第2のハイドロゲルに担持されている、[1]に記載のハイドロゲル粒子。
[3] 平均粒径が30nm以上2000nm以下である、[1]または[2]に記載のハイドロゲル粒子。
[4] 前記第1のハイドロゲルおよび前記第2のハイドロゲルの少なくとも一方がゼラチンである、[1]〜[3]のいずれか一項に記載のハイドロゲル粒子。
[5] 前記第2のハイドロゲルがゼラチンである、[4]に記載のハイドロゲル粒子。
[6] 前記第1のハイドロゲルの細胞内分解性が、前記第2のハイドロゲルよりも低い、[1]〜[5]のいずれか一項に記載のハイドロゲル粒子。
[7] 前記磁性体粒子の平均粒径が2nm以上25nm以下である、[1]〜[6]のいずれか一項に記載のハイドロゲル粒子。
[8] 前記磁性体粒子が、Fe3O4である、[1]〜[7]のいずれか一項に記載のハイドロゲル粒子。
[9] 前記第1のハイドロゲルおよび前記第2のハイドロゲルの少なくとも一方に担持された少なくとも1種の薬剤をさらに含む、[1]〜[8]のいずれか一項に記載のハイドロゲル粒子。
[10] 前記薬剤が核酸である、[9]に記載のハイドロゲル粒子。
[11] 前記核酸がsiRNAである、[10]に記載のハイドロゲル粒子。
[12] 少なくとも1種の追加ドメインをさらに含み、前記追加ドメインは、前記第1のハイドロゲルおよび第2のハイドロゲルとは架橋度または組成の異なる他のハイドロゲルで構成され、前記他のハイドロゲルは、磁性体粒子および薬剤からなる群より選ばれる少なくとも1種が担持されている、[1]〜[11]のいずれか一項に記載のハイドロゲル粒子。
[13] 前記磁性体粒子、または前記磁性体粒子と薬剤を細胞内で徐放する、[1]〜[12]のいずれか一項に記載のハイドロゲル粒子。
[14] 前記ハイドロゲル粒子が少なくとも2種の薬剤を含み、前記少なくとも2種の薬剤は、それぞれ独立に、細胞内で徐放される、[13]に記載のハイドロゲル粒子。
[15] 第1のハイドロゲルと磁性体粒子とを混合して、前記第1のハイドロゲルと前記磁性体粒子とを含む第1のスラリーを得、
前記第1のスラリーを加温する、または前記第1のスラリーに相分離誘起剤を添加し、前記磁性体粒子を含む第1のハイドロゲルを粒状化して、磁性体粒子含有微粒子を得、
前記第1のハイドロゲルとは架橋度または組成の異なる第2のハイドロゲルと、前記磁性体粒子含有微粒子とを混合して、前記第2のハイドロゲルと前記磁性体粒子含有微粒子とを含む第2のスラリーを得、
前記第2のスラリーを加温する、または前記第2のスラリーに相分離誘起剤を添加し、前記磁性体粒子含有微粒子を含む第2のハイドロゲルを粒状化する、
ハイドロゲル粒子の製造方法。
[16] [1]〜[14]のいずれか一項に記載のハイドロゲル粒子を細胞膜の内側に有する、ハイドロゲル粒子内包細胞。
[17] [16]のハイドロゲル粒子内包細胞を含む、ハイドロゲル粒子内包細胞構造体。
[18] 複数の細胞がシート状に凝集した細胞シート、複数の細胞が球状に凝集したスフェロイド、細胞集団を膜で包んだ細胞ビーズ、およびビーズ表面に細胞を接着した細胞ビーズからなる群より選ばれる少なくとも1種である、[17]に記載のハイドロゲル粒子内包細胞構造体。
[19] 前記ハイドロゲル粒子内包細胞構造体が、[16]のハイドロゲル粒子内包細胞と、高分子溶液との混合物から形成されたものである、[17]または[18]に記載のハイドロゲル粒子内包細胞構造体。
[20] 第1のハイドロゲルで構成されるドメインと、前記ドメインを内包する、前記第1のハイドロゲルとは架橋度または組成の異なる第2のハイドロゲルで構成されるマトリクスと、少なくとも前記第1のハイドロゲルに担持されている磁性体粒子とを含むハイドロゲル粒子を生細胞に導入し、
前記磁性体粒子に由来する信号を用いて、前記生細胞のMRI画像を得、
得られたMRI画像に基づき、前記生細胞の細胞活性を評価する方法。
[21] 前記ハイドロゲル粒子が、前記第1のハイドロゲルおよび前記第2のハイドロゲルの少なくとも一方に担持された少なくとも1種の薬剤をさらに含む、[20]に記載の方法。
[22] 第1のハイドロゲルで構成されるドメインと、
前記ドメインを内包する、前記第1のハイドロゲルとは架橋度または組成の異なる第2のハイドロゲルで構成されるマトリクスと、
少なくとも前記第1のハイドロゲルに担持されている磁性体粒子と
前記第1のハイドロゲルおよび前記第2のハイドロゲルの少なくとも一方に担持された少なくとも1種の薬剤と
を含む、ハイドロゲル粒子の、徐放性製剤としての使用。
本実施形態は、第1のハイドロゲルで構成されるドメインと、当該ドメインを内包する、第1のハイドロゲルとは架橋度または組成の異なる第2のハイドロゲルで構成されるマトリクスと、少なくとも第1のハイドロゲルに担持されている磁性体粒子とを含む、ハイドロゲル粒子に係る。初めに、ハイドロゲルを構成する原料について説明する。
上記ハイドロゲルとは、水を溶媒としてゲルを形成可能な材料であり、典型的には、網目構造を形成する親水性の高分子と、上記網目構造に取り込まれた水とを含むものである。本発明のハイドロゲル粒子に含まれるハイドロゲルとしては、細胞内で加水分解されるか、または細胞内で分泌される酵素やライソゾームにより分解される材料であればよい。
本発明に使用する磁性体粒子とは、MRIなどの磁場(磁化量)を検出する手法によってその存在を検出可能な化合物であればよく、ガドリニウム(Gd)や、磁性を有する金属酸化物粒子などが挙げられる。
ハイドロゲル粒子は、薬剤をさらに含んでいてもよい。薬剤とは、薬学的活性を有する化合物、薬学的活性を有すると考えられる化合物、栄養補助食品などであり、作製するハイドロゲル粒子の用途に応じて適宜選択することができる。例えば、薬学的活性を有する化合物の具体例には、抗がん剤、抗生物質、抗ウィルス性薬剤、抗細菌性薬剤、ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)免疫抑制剤、臓器の機能改善薬、抗酸化剤等が含まれる。栄養補助食品の具体例には、ビタミンA(レチノイド)、ビタミンD3およびビタミンD3類似体等のビタミン類等が含まれる。
生細胞自らによって細胞内に取り込まれやすくして、取り込みの際の生細胞の損傷などを抑制する観点からは、ハイドロゲル粒子の平均粒径は、30nm以上2000nm以下であることが好ましく、40nm以上500nm以下であることがより好ましく、50nm以上200nm以下であることがさらに好ましい。
ハイドロゲル粒子の有するドメインの平均粒径は、磁性体粒子(および薬剤)の収容量を大きくする観点から、10nm以上1000nm以下が好ましく、15nm以上50nm以下がより好ましく、20nm以上50nm以下がさらに好ましい。ドメインの平均粒径が10nm以上であれば、磁性体粒子(および薬剤)の収容量および分解に要する時間が、徐放性を達成するのに適当である。一方、1000nm以下であれば、ハイドロゲル粒子が適当な数のドメインを内包することができる。
本実施形態は、上記ハイドロゲル粒子の製造方法に係る。
本実施形態は、ハイドロゲル粒子を細胞膜の内側に有する、ハイドロゲル粒子内包細胞、および当該細胞を含む、ハイドロゲル粒子内包細胞構造体に係る。
本実施形態に係る細胞(以下、単に「ハイドロゲル粒子内包細胞」ともいう。)は、本発明のハイドロゲル粒子を細胞膜の内側に有する細胞である。
ハイドロゲル粒子内包細胞は、ハイドロゲル粒子を上記細胞に導入して、製造することができる。ハイドロゲル粒子を細胞に導入する方法の例には、液体中にハイドロゲル粒子と細胞とを添加して、エンドサイトーシスによる取り込みなどの細胞自らの活動によって取り込ませる方法、および外部からの操作によって導入する方法が含まれる。細胞自らの活動によって取り込ませる方法の例には、ハイドロゲル粒子と細胞とを液中で撹拌する方法や、ハイドロゲル粒子が含まれる細胞培養液中で細胞を培養する方法が含まれる。なお、上記ハイドロゲル粒子は、細胞自らによる取り込み効率が高いため、細胞への取り込みを促進するために他の成分との複合体を形成させる操作は特に必要ない。細胞の活性の低下を最小限に抑える観点からは、上記のうち、ハイドロゲル粒子と細胞とを液中で混合し培養する方法が好ましい。上記外部からの操作によって導入する方法の例には、エレクトロポレーション法およびマイクロインジェクション法が含まれる。これらのうち、ハイドロゲル粒子を導入させる際に細胞の活性を低下させにくくする観点からは、細胞自らの活動によって導入する方法が好ましく、上記複合体を形成せずに細胞に取り込ませる方法がより好ましい。
本実施形態は、ハイドロゲル粒子を生細胞に導入し、前記ハイドロゲル粒子に含まれる磁性体粒子に由来する信号を用いてMRI画像を得、得られたMRI画像に基づき、前記細胞の細胞活性を評価する方法に係る。
1−1.原料
磁性体粒子内包ハイドロゲル粒子の作製には、以下の原料を使用した。
(ハイドロゲル)
豚表皮ゼラチン:豚皮水溶性ゼラチン(酸)(ニッピ社製)
魚皮ゼラチン:魚皮酸処理ゼラチン(ニッピ社製)
シリコーン:ポリジメチルシロキサン(和光純薬製)
PVA(ポリビニルアルコール):PVA−617(クラレ製)
Fe3O4ナノ粒子(1nm):品番790508(シグマアルドリッチ製)を遠心分離機で分級し、中心粒径1nmのスラリーを調整した。
Fe3O4ナノ粒子(5nm):品番790508(シグマアルドリッチ製)
Fe3O4ナノ粒子(10nm):品番747254(シグマアルドリッチ製)
Fe3O4ナノ粒子(20nm):品番900088(シグマアルドリッチ製)
Fe3O4ナノ粒子(30nm):品番900062(シグマアルドリッチ製)
NiOナノ粒子(10nm):コアフロント社製
Mn3O4ナノ粒子(10nm):イオックス社製
siRNA:ND−L02−s0201(日東電工/Quark Pharmaceuticals製)
肝庇護薬:グリチルリチン
グルタルアルデヒド:Wako純薬製
グリシン:Wako純薬製
オルトケイ酸テトラエチル(TEOS):Wako純薬製
下記表1に示した組成となるように、ハイドロゲル、磁性体粒子、および溶媒を混合し、超音波分散機で30分間分散した。薬剤を含むゲルドメインを作製する場合には、続いて、表1に記載した薬剤を20nmol投入し、10分間撹拌した。得られた混合物に1MのNaOHを2mL加え、続いて表1に記載の架橋剤を加えて、5分間撹拌した。尚、表中に「グルタルアルデヒド/グリシンキャップ」と記載している場合、0.5gのグルタルアルデヒドを加えて5分間撹拌した後に、さらに0.1Mのグリシンを50mL加えて1時間撹拌することで、アルデヒド基をキャップした。
下記表2に示した組成となるように、ハイドロゲルと溶媒、所望により磁性体粒子を混合し、超音波分散機で30分間分散した。次に、先に作製したゲルドメインとなる微粒子を4g、または4gの当該微粒子と20nmolの表2に記載の薬剤とを投入し、10分間撹拌した。得られた混合物に1MのNaOHを2mL加え、続いて表2に記載の架橋剤を加えて、5分間撹拌した。次に、表2に記載の再沈殿溶媒を内径100μmのシリンジを用いて、合計250mL滴下することで、ゲルドメインを内包したハイドロゲル粒子を得た。
上記方法によって、表1に示した組成のゲルドメインを、表2に示したゲルマトリクス内に内包するハイドロゲル粒子を得た。
上記で作製したハイドロゲル粒子の平均粒径を次の方法で測定した。
ハイドロゲル粒子を走査型電子顕微鏡(SEM)で撮像した。撮像された画像をMountech社製画像解析式粒度分布ソフトウェアMac−Viewを用いて解析することにより、任意に選択した20個の粒子の短径および長径を測定し、それらの平均値を求めて、平均粒子径とした。
測定した平均粒子径は、各ハイドロゲル粒子の組成と共に、表3および表4に記載した。
ハイドロゲル粒子1〜21を以下の方法(1)〜(4)に従って評価し、その結果を表3および表4に示した。
(1)細胞活性の長期イメージング
細胞培養皿に正常なマウスの肝細胞を播種し、リン酸バッファ中で培養した。続いて、上記で作製したハイドロゲル粒子1〜21(100mg/mL、即ち、500μL)をそれぞれ細胞培養皿へ滴下し、24時間静置した。こうすることで、細胞のエンドサイトーシスによる粒子の細胞内導入を行った。続いて、細胞内に導入されなかったハイドロゲル粒子をリン酸バッファで洗い流し、得られた細胞を、粒子を内包した細胞とした。
粒子の導入から1時間後と7日後に、MRI装置(M10、プライムテック社製)でT2値を計測し、以下の基準に基づき、細胞内の磁性体量の変化を評価した。
○: T2値(1時間後)/T2値(7日後)が0.4以上
△: T2値(1時間後)/T2値(7日後)が0.05以上0.4未満
×: T2値(1時間後)/T2値(7日後)が0.05未満
(2a)薬剤がsiRNAの場合
粒子内に薬剤として導入したsiRNA(ND−L02−s0201)に相補的な10塩基対のオリゴマーを用意し、それをローダミン系色素で標識して蛍光タグとした。続いて、磁性体粒子のみ、または磁性体粒子と薬剤を内包したハイドロゲル粒子1〜21を正常な肝細胞に導入した。ハイドロゲル粒子を導入した細胞に、リン酸バッファで5μMに希釈した蛍光タグ2mLを滴下し、2時間インキュベートすることで、siRNAの蛍光標識を行った。続いて、リン酸バッファで細胞を洗浄し、未結合の蛍光タグを除去した。今後、リン酸バッファによる細胞の洗浄を1日1回行う操作を14日間行った。
この際に、蛍光プレートリーダー(Spark(商標) 10M、テカンジャパン社製)で、細胞に蛍光タグを導入してから1時間後と7日後の蛍光タグ由来の蛍光強度を測定し、下記の基準で薬剤の長期間徐放性評価を行った。
○: 蛍光強度(7日後)/蛍光強度(1時間後)が0.3以上
△: 蛍光強度(7日後)/蛍光強度(1時間後)が0.1以上0.3未満
×: 蛍光強度(7日後)/蛍光強度(1時間後)が0.1未満
炭素の同位体であるC14を含む原料を用いて合成したグリチルリチンを用意し、これを用いて、上記薬剤を内包したハイドロゲル粒子を調製した。磁性体粒子のみ、または磁性体粒子と薬剤を内包したハイドロゲル粒子1〜21を正常な肝細胞に導入した。続いて、リン酸バッファによる細胞の洗浄を1日1回行う操作を14日間行った。
この際に、同位体比質量分析計(253 Plus 10 kV、サーモフィッシャーサイエンス社製)で、細胞にハイドロゲル粒子を導入してから1時間後と7日後の炭素同位体C14由来のシグナル強度を測定し、下記の基準で薬剤の長期間徐放性評価を行った。
○: シグナル強度(7日後)/シグナル強度(1時間後)が0.3以上
△: シグナル強度(7日後)/シグナル強度(1時間後)が0.1以上0.3未満
×: シグナル強度(7日後)/シグナル強度(1時間後)が0.1未満
ハイドロゲル粒子に複数の異なる薬剤(siRNAおよび肝庇護薬)が含まれる場合、さらに薬剤の多段階放出評価を次のように実施した。
上記(2a)の蛍光強度計測および(2b)の同位体比計測を1時間おきに行い、各薬剤について、放出量のピーク時間を求め、下記の基準で薬剤の多段階放出評価を行った。
○: 各薬剤の放出ピーク時間の差が3時間以上
△: 各薬剤の放出ピーク時間の差が1時間以上3時間未満
×: 各薬剤の放出ピーク時間の差が1時間未満
上記(1)と同様に、ハイドロゲル粒子1〜21を細胞に導入し、細胞膜の内側に取り込まれたハイドロゲルが確認できるか否かを観察し、以下の基準によって粒子導入細胞の割合を評価した。
培養した細胞に1%パラホルムアルデヒド1mlを加えて細胞固定化処理を行った。次いで、下記組成のFe染色液1mlを加えてFeを染色した。さらに、下記の濃度に調整した核染色液1mlを加えて細胞を染色した。
培養した細胞に1%パラホルムアルデヒド1mlを加えて細胞固定化処理を行った。次いで、下記組成のNi/Mn染色液1mlを加えてNiまたはMnを染色した。さらに、下記の濃度に調整した核染色液1mlを加えて細胞を染色した。
下記の2液を同体積混合してFe染色液を調製した。
・20体積% HCL(濃塩酸を5倍希釈したもの)
・10質量% K4(Fe(CN6))水溶液(100mg/ml)
PhenanGreen SK,Diacetate(フナコシ製)の100mg/ml溶液を調製し、NiおよびMnの染色液とした。
硫酸アンモニウム5質量部と、Nuclear fast red 0.1質量部とを、蒸留水100質量部に混合して核染色液を調製した。
染色された細胞を光学顕微鏡で観察して、任意に選択された細胞20個の中に青く染色されたFeが含まれているかどうかを評価した。
△: 上記20個の細胞のうち、10%以上50%未満(2個以上10個未満)の細胞で、細胞膜の内側にゼラチンが取り込まれていることが確認できた
×: 上記20個の細胞のうち、10%未満(2個未満)の細胞で、細胞膜の内側にゼラチンが取り込まれていることが確認できた
染色された細胞を光学顕微鏡で観察して、任意に選択された細胞20個の中に緑に染色されたNiまたはMnが含まれているかどうかを評価した。
△: 上記20個の細胞のうち、10%以上50%未満(2個以上10個未満)の細胞で、細胞膜の内側にゼラチンが取り込まれていることが確認できた
×: 上記20個の細胞のうち、10%未満(2個未満)の細胞で、細胞膜の内側にゼラチンが取り込まれていることが確認できた
ハイドロゲル粒子1〜21を正常なマウス肝細胞に導入した。リン酸バッファによる細胞の洗浄を1日1回行う操作を14日間行った。続いて、各粒子を導入した細胞について、原子吸光法で磁性体由来の残留金属元素(Fe量、Ni量またはMn量)を計測した。対照として、粒子を導入していない細胞中の金属元素量(Fe量、Ni量またはMn量)測定し、この値を、粒子導入細胞の残留金属元素から差し引き、磁性体由来の留金属元素量を得た。この値を元に、以下の基準で細胞内での粒子の完全代謝を評価した。
○: 磁性体由来残留金属元素量が1ng/細胞未満
△: 磁性体由来残留金属元素量が1ng/細胞以上10ng/細胞未満
×: 磁性体由来残留金属元素量が10ng/細胞以上
10mLのリポソーム分散液(Plain DPPC/CHOL Liposomes、フナコシ社製)に、1mLの10w%磁性体(Fe3O4)分散液および50nmolのsiRNAを加え、室温下で2時間撹拌することで、磁性体および薬剤を内包したリポソームを得た。得られたリポソームの平均粒子径を上記1−4と同様にして測定し、さらに上記1−5と同様に評価した。
10mLの10w%のスクロース水溶液に、1mLの10w%磁性体(Fe3O4)分散液および50nmolのsiRNAを加え、室温下で2時間撹拌し、混合物を得た。続いて、得られた混合物を凍結粉砕機(日本分析工業社製JFC−2000)で微粒子化することで、磁性体および薬剤を内包した糖粒子を得た。得られた糖粒子の平均粒子径を上記1−4と同様にして測定し、さらに上記1−5と同様に評価した。
培養皿に播種した、肝硬変を起こしていない正常なマウス肝細胞に、評価方法(1)と同様の方法で、磁性体粒子を含むが、薬剤を含まないハイドロゲル粒子3を導入した。粒子の導入から1時間後と7日後に、MRI装置(M10、プライムテック社製)でT2値を計測したところ、T2値(1時間後)/T2値(7日後)=0.5であった。
これらの結果から、正常肝細胞ではゼラチン粒子内の磁性体が細胞の代謝機能により分解され、経時的に磁性体の磁化量が低下するが、一方、肝硬変を起こした細胞では、細胞の代謝機能の低下により、磁性体の分解がごくわずかとなっていることがわかる。
四塩化炭素の投与によって作製した肝硬変モデルマウスについて、肝硬変となった部位の細胞を採取し、細胞培養皿に播種後、リン酸バッファ中で培養した。続いて、上記で作製した、磁性体粒子と薬剤(siRNAと肝庇護薬)を含むハイドロゲル粒子9(100mg/mL、即ち500μL)を細胞培養皿へ滴下し、24時間静置した。こうすることで、細胞のエンドサイトーシスによるハイドロゲル粒子の細胞内導入を行った。続いて、細胞内に導入されなかったハイドロゲル粒子をリン酸バッファで洗い流し、得られた細胞を、ハイドロゲル粒子9を内包した異常肝細胞とした。
T2値(1時間後)/T2値(3時間後)=0.9
T2値(1時間後)/T2値(1日後)=0.8
T2値(1時間後)/T2値(3日後)=0.7
T2値(1時間後)/T2値(7日後)=0.6
東京女子医大・岡野教授らによる文献(Nature Medicine 13, 880−885 (1 July 2007))と同様の方法により、細胞構造体として、マウスの肝細胞シートを培養皿中に作製した。続いて、磁性体粒子および薬剤を内包したハイドロゲル粒子9(100mg/mL、即ち500μL)を細胞培養皿へ滴下し、24時間静置した。こうすることで、細胞のエンドサイトーシスによるハイドロゲル粒子の細胞内導入を行った。続いて、細胞内に導入されなかったハイドロゲル粒子をリン酸バッファで洗い流し、得られた細胞シートを、ハイドロゲル粒子を内包した細胞シートとした。
ハイドロゲル粒子9を内包した細胞シートについても、上記1−5と同様に評価し、評価結果を表6に示した。表6の結果から明らかなように、ハイドロゲル粒子は、異常肝細胞内に導入することが可能であり、細胞活性の長期イメージング、および薬剤の長期徐放が達成された。また、細胞内での完全代謝も良好であった。
下記表7に示した組成となるように、ハイドロゲル、磁性体粒子、薬剤および溶媒を混合し、超音波分散機で30分間分散した。得られた混合物に1MのNaOHを2mL加えた。
粒子25bは、0.1gのグルタルアルデヒドを加えて5分間撹拌した後に、さらに0.1Mのグリシンを50mL加えて1時間撹拌することで、アルデヒド基をキャップした。
粒子26aについては、表中の架橋剤を加えて、5分間撹拌した。
粒子26bは架橋させなかった。
下記表8に示した組成となるように、ハイドロゲルとして魚皮ゼラチン 4g、溶媒として水200mL、および磁性体粒子として粒径10nmのFe3O4 0.8gを混合し、超音波分散機で30分間分散した。次に、先に作製したゲルドメインとなる2種類の微粒子(25aと25b、または26aと26b)をそれぞれ4gずつと、20nmolの肝庇護薬とを投入し、10分間撹拌した。得られた混合物に1MのNaOHを2mL加え、続いて上記と同様に、グルタルアルデヒドによる架橋およびグリシンによる処理を行った。表8に記載の再沈殿溶媒(アセトン/水=8/2)を内径100μmのシリンジを用いて、合計250mL滴下することで、2種のゲルドメインを内包したハイドロゲル粒子25および26を得た。
MRI装置(M10、プライムテック社製)でハイドロゲル粒子のリン酸バッファ懸濁液100μL(100mg/mL)のT2値を計測し、「ハイドロゲル粒子の1粒子辺りのT2値」を求めた。
また、上記(1)と同様に、正常なマウスの肝細胞に対して、ハイドロゲル粒子の導入処理を施した。処理から1時間後の細胞について、上記同様にT2値を測定し、「細胞に導入されたハイドロゲル粒子に由来するT2値」を得た。
○: 1細胞当たりのハイドロゲル粒子導入量が20粒子以上
△: 1細胞当たりのハイドロゲル粒子導入量が5粒子以上、20粒子未満
×: 1細胞当たりのハイドロゲル粒子導入量が5粒子未満
Claims (22)
- 第1のハイドロゲルで構成されるドメインと、
前記ドメインを内包する、前記第1のハイドロゲルとは架橋度または組成の異なる第2のハイドロゲルで構成されるマトリクスと、
少なくとも前記第1のハイドロゲルに担持されている磁性体粒子と
を含む、ハイドロゲル粒子。 - 前記磁性体粒子は、前記第1のハイドロゲルおよび前記第2のハイドロゲルに担持されている、請求項1に記載のハイドロゲル粒子。
- 平均粒径が30nm以上2000nm以下である、請求項1または2に記載のハイドロゲル粒子。
- 前記第1のハイドロゲルおよび前記第2のハイドロゲルの少なくとも一方がゼラチンである、請求項1〜3のいずれか一項に記載のハイドロゲル粒子。
- 前記第2のハイドロゲルがゼラチンである、請求項4に記載のハイドロゲル粒子。
- 前記第1のハイドロゲルの細胞内分解性が、前記第2のハイドロゲルよりも低い、請求項1〜5のいずれか一項に記載のハイドロゲル粒子。
- 前記磁性体粒子の平均粒径が2nm以上25nm以下である、請求項1〜6のいずれか一項に記載のハイドロゲル粒子。
- 前記磁性体粒子が、Fe3O4である、請求項1〜7のいずれか一項に記載のハイドロゲル粒子。
- 前記第1のハイドロゲルおよび前記第2のハイドロゲルの少なくとも一方に担持された少なくとも1種の薬剤をさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のハイドロゲル粒子。
- 前記薬剤が核酸である、請求項9に記載のハイドロゲル粒子。
- 前記核酸がsiRNAである、請求項10に記載のハイドロゲル粒子。
- 少なくとも1種の追加ドメインをさらに含み、前記追加ドメインは、前記第1のハイドロゲルおよび第2のハイドロゲルとは架橋度または組成の異なる他のハイドロゲルで構成され、前記他のハイドロゲルは、磁性体粒子および薬剤からなる群より選ばれる少なくとも1種が担持されている、請求項1〜11のいずれか一項に記載のハイドロゲル粒子。
- 前記磁性体粒子、または前記磁性体粒子と薬剤を細胞内で徐放する、請求項1〜12のいずれか一項に記載のハイドロゲル粒子。
- 前記ハイドロゲル粒子が少なくとも2種の薬剤を含み、前記少なくとも2種の薬剤は、それぞれ独立に、細胞内で徐放される、請求項13に記載のハイドロゲル粒子。
- 第1のハイドロゲルと磁性体粒子とを混合して、前記第1のハイドロゲルと前記磁性体粒子とを含む第1のスラリーを得、
前記第1のスラリーを加温する、または前記第1のスラリーに相分離誘起剤を添加し、前記磁性体粒子を含む第1のハイドロゲルを粒状化して、磁性体粒子含有微粒子を得、
前記第1のハイドロゲルとは架橋度または組成の異なる第2のハイドロゲルと、前記磁性体粒子含有微粒子とを混合して、前記第2のハイドロゲルと前記磁性体粒子含有微粒子とを含む第2のスラリーを得、
前記第2のスラリーを加温する、または前記第2のスラリーに相分離誘起剤を添加し、前記磁性体粒子含有微粒子を含む第2のハイドロゲルを粒状化する、
ハイドロゲル粒子の製造方法。 - 請求項1〜14のいずれか一項に記載のハイドロゲル粒子を細胞膜の内側に有する、ハイドロゲル粒子内包細胞。
- 請求項16のハイドロゲル粒子内包細胞を含む、ハイドロゲル粒子内包細胞構造体。
- 複数の細胞がシート状に凝集した細胞シート、複数の細胞が球状に凝集したスフェロイド、細胞集団を膜で包んだ細胞ビーズ、およびビーズ表面に細胞を接着した細胞ビーズからなる群より選ばれる少なくとも1種である、請求項17に記載のハイドロゲル粒子内包細胞構造体。
- 前記ハイドロゲル粒子内包細胞構造体が、請求項16のハイドロゲル粒子内包細胞と、高分子溶液との混合物から形成されたものである、請求項17または18に記載のハイドロゲル粒子内包細胞構造体。
- 第1のハイドロゲルで構成されるドメインと、前記ドメインを内包する、前記第1のハイドロゲルとは架橋度または組成の異なる第2のハイドロゲルで構成されるマトリクスと、少なくとも前記第1のハイドロゲルに担持されている磁性体粒子とを含むハイドロゲル粒子を生細胞に導入し、
前記磁性体粒子に由来する信号を用いて、前記生細胞のMRI画像を得、
得られたMRI画像に基づき、前記生細胞の細胞活性を評価する方法。 - 前記ハイドロゲル粒子が、前記第1のハイドロゲルおよび前記第2のハイドロゲルの少なくとも一方に担持された少なくとも1種の薬剤をさらに含む、請求項20に記載の方法。
- 第1のハイドロゲルで構成されるドメインと、
前記ドメインを内包する、前記第1のハイドロゲルとは架橋度または組成の異なる第2のハイドロゲルで構成されるマトリクスと、
少なくとも前記第1のハイドロゲルに担持されている磁性体粒子と
前記第1のハイドロゲルおよび前記第2のハイドロゲルの少なくとも一方に担持された少なくとも1種の薬剤と
を含む、ハイドロゲル粒子の、徐放性製剤としての使用。
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