JPWO2016121829A1 - Therapeutic or prophylactic agent for dermatitis comprising as an active ingredient nanoparticles - Google Patents

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Abstract

アトピー性皮膚炎等の皮膚炎を治療又は予防できる新規な手段が開示されている。 Novel means that can be treated or prevented dermatitis such as atopic dermatitis is disclosed. 本発明による皮膚炎の治療又は予防剤は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも1種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子(アミノ酸系分子含有ナノ粒子)を有効成分として含有する。 Therapeutic or prophylactic agent for dermatitis according to the present invention, amino acids, amino acid derivatives, and comprises at least one member selected from the group consisting of oligomers and polymers, cyanoacrylate polymer particles having an average particle diameter of less than 1000 nm (amino acids containing system molecules containing nanoparticles) as an active ingredient. アミノ酸系分子含有ナノ粒子は、I型とIV型のアレルギー反応を抑制する作用を有するので、例えばI型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応が関与する皮膚炎等のアレルギー症状の治療又は予防剤としても有用である。 Amino acid-based molecules containing nanoparticles, because they have action to inhibit allergic reactions of type I and type IV, such as therapeutic or prophylactic agent for allergic symptoms dermatitis such as type I allergic or type IV allergic reaction is involved it is useful.

Description

本発明は、ナノサイズのシアノアクリレートポリマー粒子を有効成分とする皮膚炎の治療又は予防剤に関する。 The present invention relates to a therapeutic or prophylactic agent for dermatitis comprising as an active ingredient a cyanoacrylate polymer nano-sized particles.

主としてヒトの医薬に応用すべく、薬物のデリバリーシステム(DDS)や徐放化による薬物の効果向上を目的に、薬剤の微粒子化の研究が進んでおり、例えばシアノアクリレートポリマー粒子に薬剤を抱合させたDDSが公知である(特許文献1、2及び非特許文献1)。 Mainly in order to apply to human medicine, for the purpose of improving the effect of the drug by delivery system (DDS) or sustained release of the drug, and they have become the study of micronized drug, for example, by conjugating the drug to cyanoacrylate polymer particles was DDS is known (Patent documents 1 and 2 and non-Patent Document 1). 本願発明者も、現在までに、粒径のばらつきが少ないシアノアクリレートポリマー粒子の製造方法、抗菌剤抱合粒子、及びプラスミド抱合粒子を開示している(特許文献3〜5)。 The present inventors have also to date, a method of manufacturing a grain size variation is small cyanoacrylate polymer particles, discloses antibacterial agents conjugated particles, and the plasmid conjugation particles (Patent Documents 3 to 5). 従来のポリマー粒子合成法では、シアノアクリレートのアニオン重合反応の開始及び安定化の目的で、重合反応系内に糖類やポリソルベートを共存させる。 In conventional polymer particles synthesis method, for the purpose of starting and stabilization of the anionic polymerization reaction of the cyano acrylate, coexist saccharides and polysorbates in the polymerization reaction system. これらの過去の研究は、薬物のDDSと徐放化が目的であった。 These past studies, DDS and sustained release of the drug was an object.

その後、本願発明者は、シアノアクリレートポリマー粒子そのものにグラム陽性細菌に対する抗菌活性があることを見出した(特許文献6)。 Then, the present inventors have found that there is antibacterial activity against Gram-positive bacteria cyanoacrylate polymer particles themselves (Patent Document 6). さらに、アミノ酸を抱合したシアノアクリレートポリマー粒子が抗がん活性を有するほか(特許文献7)、グラム染色性を問わず各種の細菌に対し抗菌力を発揮できることを見出した(特許文献8、9)。 Furthermore, in addition to cyanoacrylate polymer particles conjugated with an amino acid has anti-cancer activity (Patent Document 7), with respect to various bacteria regardless of Gram stain was found to be able to exert antibacterial activity (Patent Documents 8 and 9) . ナノサイズのポリマー粒子は、細菌表面(細胞壁)に特異的に接着し、細菌を溶菌に導く。 Polymer nano-sized particles, specifically adhere to the bacterial surface (cell wall), guide the bacteria lysis. シアノアクリレートナノ粒子は、抗生物質とは全く異なる作用機序で抗菌活性を発揮し、MRSA(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)やVRE(Vancomycin resistant enterococcus)等の多剤耐性菌に対しても有効である。 Cyanoacrylate nanoparticles exhibit a completely different mechanism of action antimicrobial activity and antibiotics, is effective against multi-drug resistant bacteria such as MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) and VRE (Vancomycin resistant enterococcus) .

しかしながら、アトピー性皮膚炎等の皮膚炎に対するシアノアクリレートポリマー粒子の効果は知られていない。 However, the effect of the cyanoacrylate polymer particles for dermatitis such as atopic dermatitis is not known.

アトピー性皮膚炎は、日本国内でも有病率が高い皮膚疾患である。 Atopic dermatitis is a skin disease is high prevalence rate in Japan. 近年増加傾向にあり、患者は多くの精神的・身体的苦痛を強いられる。 There been increasing in recent years, the patient is strong a lot of mental and physical pain.

アトピー性皮膚炎の薬物療法の基本は、重症度に合わせた強度のステロイド外用薬、カルシニューリン阻害外用薬、必要に応じて抗ヒスタミン・抗アレルギー内服薬が併用され、最重症の場合にはさらに必要に応じてステロイド内服薬、カルシニューリン阻害内服薬が用いられる(非特許文献2)。 Basic drug therapy of atopic dermatitis, topical steroid of combined intensity severity, calcineurin inhibitors ointment, in combination antihistamine, antiallergic oral medicine if necessary, further is required if the most severe steroids oral medicine, is calcineurin inhibitor oral medicine used depending (non-Patent Document 2). しかしながら、ステロイド剤の大量連用による副作用を恐れてステロイド剤を忌避する患者が多く、また免疫抑制による易感染性の問題もあるため、新たな治療手段が求められている。 However, many patients fear the side effects caused by large amounts chronic use of steroids repel steroids, and because there also compromised problems with immunosuppressive, has been demanded a new therapeutic means.

特表平11−503148号公報 Kohyo 11-503148 JP 特表2002−504526号公報 JP-T 2002-504526 JP 特開2008−127538号公報 JP 2008-127538 JP 国際公開第2008/126846号公報 WO 2008/126846 No. 特開2008−208070号公報 JP 2008-208070 JP 国際公開第2009/084494号公報 WO 2009/084494 No. 国際公開第2010/101178号公報 WO 2010/101178 No. 国際公開第2012/133648号公報 WO 2012/133648 No. 国際公開第2013/108871号公報 WO 2013/108871 No.

本発明は、アトピー性皮膚炎等の皮膚炎を治療又は予防できる新規な手段を提供することを目的とする。 The present invention aims at providing a novel means for treating or preventing dermatitis such as atopic dermatitis.

本願発明者らは、皮膚炎モデルマウスを用いて鋭意研究した結果、抗菌活性が知られているナノサイズのシアノアクリレートポリマー粒子が皮膚炎に対しても有効であることを見出し、本願発明を完成した。 The present inventors have made intensive studies with a dermatitis model mice, found that cyanoacrylate polymer nano-sized particles that antimicrobial activity is known is also effective against dermatitis, completed the present invention did.

すなわち、本発明は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも1種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子を有効成分として含有する、皮膚炎の治療又は予防剤を提供する。 That is, the present invention is an amino acid, amino acid derivative, and comprises at least one member selected from the group consisting of oligomers and polymers, containing cyanoacrylate polymer particles having an average particle size of less than 1000nm as an active ingredient, the skin It provides a therapeutic or prophylactic agent for flame. また、本発明は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも1種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子を有効成分として含有する、I型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応の抑制剤を提供する。 Further, the present invention is an amino acid, amino acid derivative, and comprises at least one member selected from the group consisting of oligomers and polymers, containing cyanoacrylate polymer particles having an average particle size of less than 1000nm as an active ingredient, I providing an inhibitor of type allergic or type IV allergic reactions. さらに、本発明は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも1種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子を有効成分として含有する、I型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応が関与するアレルギー症状の治療又は予防剤を提供する。 Furthermore, the present invention is an amino acid, amino acid derivative, and comprises at least one member selected from the group consisting of oligomers and polymers, containing cyanoacrylate polymer particles having an average particle size of less than 1000nm as an active ingredient, I type allergic or type IV allergic reaction to provide a therapeutic or prophylactic agent for allergic symptoms involved. さらに、本発明は、治療すべき皮膚病変部、又は皮膚炎の発生の予防が望まれる皮膚領域に、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも1種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子の有効量を投与することを含む、皮膚炎の治療又は予防方法を提供する。 Furthermore, the present invention includes a skin lesion to be treated, or the skin area prevention of the occurrence of dermatitis is desired, amino acids, amino acid derivatives, and at least one member selected from the group consisting of oligomers and polymers It includes average particle diameter administering an effective amount of cyanoacrylate polymer particles is less than 1000 nm, provides a method of treating or preventing dermatitis. さらに、本発明は、それを必要とする対象に対し、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも1種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子の有効量を投与することを含む、I型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応の抑制方法を提供する。 Furthermore, the present invention is to a subject in need thereof, an amino acid, amino acid derivative, and comprises at least one member selected from the group consisting of oligomers and polymers, cyanoacrylate polymers average particle size of less than 1000nm comprising administering an effective amount of particles, to provide a method of inhibiting type I allergic or type IV allergic reactions. さらに、本発明は、それを必要とする対象に対し、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも1種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子の有効量を投与することを含む、I型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応が関与するアレルギー症状の治療又は予防方法を提供する。 Furthermore, the present invention is to a subject in need thereof, an amino acid, amino acid derivative, and comprises at least one member selected from the group consisting of oligomers and polymers, cyanoacrylate polymers average particle size of less than 1000nm comprising administering an effective amount of particles, I-type allergic reaction or type IV allergic reaction provides a method for treating or preventing allergic symptoms involved.

本発明により、ステロイド系薬剤とは異なる新規な皮膚炎の治療又は予防手段が提供される。 The present invention, treating or preventing means different novel dermatitis there is provided a steroidal drug. 本発明の治療又は予防剤の有効成分であるシアノアクリレートナノ粒子は、薬剤のDDSとして用いられるのではなく、粒子それ自体が皮膚炎の治療及び予防効果を現す。 Cyanoacrylate nanoparticles as an active ingredient of the therapeutic or prophylactic agent of the present invention, rather than being used as a DDS drug, the particle itself reveal the therapeutic and preventive effect of dermatitis. ステロイド系薬剤に不安を抱く患者や、副作用のためステロイド系薬剤を使用できない患者、さらには易感染性を示す免疫能低下を認める患者に対しても、本発明の治療又は予防剤を好ましく使用することができる。 And patients anxious about the steroidal drugs, patients who can not use steroidal drug because of side effects, even to patients further admit reduced immunity showing a compromised, treating or preventing agent preferably used in the present invention be able to.

NC/NgaSlcマウスに対する処置スケジュールを示す(検討1)。 Showing a treatment schedule for NC / NgaSlc mouse (study 1). 図1に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたNC/NgaSlcマウスの皮膚病変部の写真である。 Is a photograph of the skin lesions of NC / NgaSlc mice to induce dermatitis schedule shown in FIG. Aは、初回テープストリッピングから3週間後の病変部。 A is, lesions after 3 weeks from the initial tape stripping. Bは、ナノ粒子水又は滅菌水の噴霧処置開始から2日目の病変部。 B is a lesion on the second day from the spray treatment initiation nanoparticle water or sterilized water. Cは、ナノ粒子水又は滅菌水の噴霧処置開始から8日目の病変部。 C is a lesion of 8 days after the spray treatment initiation nanoparticle water or sterilized water. Dは、DNFB塗布開始から3日目の病変部。 D is, lesions of the third day from the DNFB application start. 皮膚炎誘導部における皮膚表面の細菌数を測定した結果である。 It is the result of measuring the number of bacteria skin surface in dermatitis induced unit. 図2に示した病変部の皮膚炎症状をスコア化したグラフである。 Dermatitis symptoms of a lesion as shown in FIG. 2 is a graph scored. 図1に示すスケジュールで、テープストリッピング誘発性皮膚炎を観察した後に、DNFBを塗布して8日目のNC/NgaSlcマウスの背部皮膚組織のHE染色像である。 In schedule shown in FIG. 1, after observing the tape stripping induced dermatitis, HE-stained image of the dorsal skin tissue of NC / NgaSlc mice 8 days by applying DNFB. 図1に示したスケジュールで皮膚炎を誘発させたNC/NgaSlcマウスの血中IgE濃度を測定した結果である。 The results of measuring the blood levels of IgE NC / NgaSlc mice to induce dermatitis at the indicated schedule in FIG. 実験開始時(採血1)及び終了時(採血2)の比較を示す。 Shows a comparison of the experimental start (blood 1) and end (blood 2). 皮膚炎予防モデルにおけるナノ粒子水の効果を検討した、BALB/cマウスに対する処置スケジュールを示す(検討2)。 Was examined the effect of nanoparticles water in dermatitis prevention model, shows the treatment schedule for BALB / c mice (Study 2). 図7に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたBALB/cマウスの皮膚病変部の写真である。 Is a photograph of the skin lesions of BALB / c mice to induce dermatitis schedule shown in FIG. 図8に示した病変部の皮膚炎症状をスコア化したグラフである。 Dermatitis symptoms of a lesion as shown in FIG. 8 is a graph scored. 図7に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたBALB/cマウスの血中IgE濃度を測定した結果である(day0, day22, day24)。 The results of measuring the blood levels of IgE BALB / c mice to induce dermatitis schedule shown in FIG. 7 (day0, day22, day24). 図7に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたBALB/cマウスの背部皮膚組織のHE染色像である。 Is a HE staining image of the dorsal skin tissue of BALB / c mice to induce dermatitis schedule shown in FIG. DNFB塗布後3日目の背部皮膚を、塗布した頭側と塗布していない尾側で比較した。 The third day of the dorsal skin after DNFB application, were compared in the tail side that is not coated with the coated head side. 図7に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させた皮膚炎予防モデル群のBALB/cマウスの背部頭側(DNFB塗布あり)及び尾側(DNFB塗布なし)の皮膚における各種サイトカインの発現量を調べた結果である。 Examined the expression of various cytokines in the skin of the back head side of BALB / c mice induced allowed the dermatitis prevention model group dermatitis (DNFB has applied) and caudal (DNFB no coating) the schedule shown in FIG. 7 it is the result. 皮膚炎治療モデルおよび予防モデルとして検討したBALB/cマウスに対する処置スケジュールを示す(検討3)。 Shows the treatment schedule for BALB / c mice was examined as dermatitis model and prophylactic model (Study 3). 図13に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたBALB/cマウスの皮膚病変部の写真である。 Is a photograph of the skin lesions of BALB / c mice to induce dermatitis schedule shown in FIG. 13. 図14に示した病変部の皮膚炎の程度をスコア化したグラフである。 The extent of dermatitis lesions shown in FIG. 14 is a graph scored. 図13に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたBALB/cマウスの血中IgE濃度を測定した結果である(day0, day22, day24)。 The results of measuring the blood levels of IgE BALB / c mice to induce dermatitis schedule shown in FIG. 13 (day0, day22, day24). 図13に示すスケジュールで、予防モデルとして、ナノ粒子水あるいは水を噴霧後、皮膚炎を誘発させたBALB/cマウスの背部皮膚組織のHE染色像である。 Figure 13 schedule shown in, as a prophylactic model, after spraying the nanoparticle water or water, HE-stained image of the dorsal skin tissue of BALB / c mice to induce dermatitis. 予防モデルへの皮膚炎を誘発するため、背部尾側にDNFBを塗布して3日目の組織である。 To induce dermatitis preventive model, it is then applied to DNFB to the dorsal caudal third day of tissue. 比較のため、治療モデルとして、実験開始時にDNFBに塗布した背部頭側の皮膚も染色した。 For comparison, as a treatment model, it was also stained the back head on the side of the skin that was applied to the DNFB at the start of the experiment. 図13に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたBALB/cマウスの背部頭側(治療モデルとして実験開始時にのみDNFBを塗布し、以後ナノ粒子水あるいは水を噴霧したもの)及び尾側(予防モデルとして、ナノ粒子水あるいは水を噴霧し、実験終了前にDNFBを塗布し、3日目)における各種サイトカインの発現量を調べた結果である。 Back head side of BALB / c mice to induce dermatitis schedule shown in FIG. 13 (a DNFB only at the beginning of the experiment as a therapeutic model is applied, subsequently those that have been sprayed nanoparticle water or water) and caudal (prevention model as was sprayed nanoparticle water or water, coated with DNFB before the end of the experiment, the results obtained by examining the expression level of various cytokines in 3 days). テープストリッピング誘発性皮膚炎モデルとしたBALB/cマウスに対する処置スケジュールを示す(検討4)。 Shows the treatment schedule for BALB / c mice with tape stripping induced dermatitis model (Study 4). 図19に示すスケジュールに従い、テープストリッピングを繰り返して皮膚炎を誘発させたBALB/cマウスの皮膚炎の程度をスコア化したグラフである。 According to the schedule shown in FIG. 19 is a graph scoring the degree of dermatitis BALB / c mice to induce dermatitis repeated tape stripping. 図19に示すスケジュールに従い、繰り返しテープストリッピングにより皮膚炎を誘発させたBALB/cマウスの皮膚炎誘導部における水分蒸散量を測定した結果である。 According to the schedule shown in FIG. 19, the results of measuring the water loss in the dermatitis induction of BALB / c mice to induce dermatitis by repeated tape stripping. 図19に示すスケジュールに従い、繰り返しテープストリッピングにより皮膚炎を誘発させたBALB/cマウスの背部皮膚組織のHE染色像である(day14)。 According to the schedule shown in FIG. 19 is a HE staining image of the dorsal skin tissue of BALB / c mice to induce dermatitis by repeated tape stripping (day 14). ナノ粒子水あるいは水噴霧群それぞれから、無作為に選んだ2匹の組織を示す。 From each nanoparticle water or water spray group, showing the two dogs of tissue randomly selected. 図19に示すスケジュールで繰り返しテープストリッピングにより皮膚炎を誘発させたBALB/cマウスの背部皮膚における各種サイトカインの発現量を調べた結果である。 The results obtained by examining the expression level of various cytokines in the dorsal skin of BALB / c mice to induce dermatitis by tape stripping repeating the schedule shown in FIG. 19. 同じ処置をした頭側および尾側の皮膚について、それぞれ測定した。 For cranial and caudal skin the same treatment, it was measured. 繰り返しDNFB塗布によるハプテン誘発性慢性皮膚炎モデルとして検討した、ヘアレスマウスに対する処置スケジュールを示す(検討5)。 Studied as hapten-induced chronic dermatitis model with repeated DNFB application, showing a treatment schedule for hairless mice (Study 5). 図24に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたヘアレスマウス各群の個体について、皮膚炎症状をスコア化し、スコアの変化を調べた結果である。 For hairless mice each group of individuals to induce dermatitis schedule shown in FIG. 24, the dermatitis symptom scored, the results of investigating changes in the scores. 図24に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたヘアレスマウスの皮膚病変部の写真である(day33)。 Is a photograph of the skin lesions of hairless mice to induce dermatitis schedule shown in FIG. 24 (day33). 図24に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたヘアレスマウス各群の個体について、耳介の厚さの変化を調べた結果である。 For hairless mice each group of individuals to induce dermatitis schedule shown in FIG. 24, a result of investigating changes in the thickness of the auricle. 図24に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたヘアレスマウス各群の個体について、頭側背部皮膚の水分蒸散量の変化を調べた結果である。 For hairless mice each group of individuals to induce dermatitis schedule shown in FIG. 24, a result of investigating changes in the water loss of cranial dorsal skin. 図24に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたヘアレスマウス各群の個体について、頭側背部皮膚の保水度の変化を調べた結果である。 For hairless mice each group of individuals to induce dermatitis schedule shown in FIG. 24, a result of investigating changes in the water retention value of cranial dorsal skin. 図24に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたヘアレスマウスの、day33における代表的な炎症状態及び炎症誘発部位のHE染色像である。 Hairless mice to induce dermatitis schedule shown in FIG. 24 is a HE staining image of a representative inflammatory conditions and proinflammatory sites in Day33. A〜DがそれぞれA群〜D群を示す。 A~D indicates Group A ~D groups respectively. 中央のA-1〜D-1が右耳介皮膚組織、右のA-2〜D-2が頭側背部皮膚組織である。 Central A-1 to D-1 is the right auricle skin tissue, the right A-2~D-2 is a cranial dorsal skin tissue. 組織像中のバーは100μmを示す。 Bars in the histology shows a 100 [mu] m. 図24に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたヘアレスマウスの、炎症誘発部位における各種サイトカインの、HPRTに対する相対的発現量である(day34)。 Hairless mice to induce dermatitis schedule shown in Figure 24, the various cytokines in proinflammatory site is a relative expression level for HPRT (day34). 図24に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたヘアレスマウス各群の個体について、血清中の抗DNP IgG抗体をELISAにより測定した結果である(day34)。 For hairless mouse individuals of each group was induced dermatitis schedule shown in FIG. 24, the results measured by ELISA of anti-DNP IgG antibodies in serum (day34). 図24に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたヘアレスマウス各群の個体について、背部頭側の皮膚表在細菌数の変化を調べた結果である。 For hairless mice each group of individuals to induce dermatitis schedule shown in FIG. 24, a result of investigating changes in the dorsal cranial skin superficial bacterial counts. 図24に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたヘアレスマウス各群の個体について、還元血清中の抗S.aureus抗体(主としてIgG)の凝集価を調べた結果である。 For hairless mice each group of individuals to induce dermatitis schedule shown in FIG. 24, the results obtained by examining the aggregation number of anti-S.aureus antibody in reducing serum (mainly IgG).

本発明で用いる粒子は、シアノアクリレートモノマーをアニオン重合して得られるナノサイズ(平均粒径1000 nm未満)のポリマー粒子であり、アミノ酸、アミノ酸誘導体、それらのオリゴマー及びポリマー(以下、これらを総称して「アミノ酸系分子」ということがある)から選択される少なくとも1種を含む。 Particles used in the present invention is a polymer nano-sized particles obtained by anionic polymerization of cyanoacrylate monomer (average particle size of less than 1000 nm), amino acids, amino acid derivatives, their oligomers and polymers (hereinafter, collectively referred to Te containing at least one selected from is referred to as "amino acid-based molecules"). さらに、糖及びポリソルベートからなる群より選択される少なくとも1種を含んでいてよい。 Further, it may comprise at least one member selected from the group consisting of sugars and polysorbate.

アミノ酸系分子、糖及びポリソルベートは、シアノアクリレートモノマーのアニオン重合の重合開始・安定剤として使用できることが知られている。 Amino acid-based molecules, sugars and polysorbate are known to be used as the polymerization initiator, stabilizer anionic polymerization of the cyanoacrylate monomer. 例えば、糖及び/又はポリソルベートを重合開始・安定剤として用いるナノ粒子製造法は、特許文献3、特許文献4(抗菌剤抱合粒子)、特許文献5(プラスミド抱合粒子)等に記載され公知である。 For example, sugars and / or nanoparticle preparation using polysorbate as a polymerization initiator, stabilizer, patent document 3, patent document 4 (antibacterial agent conjugated particles) are known as described in Patent Document 5 (plasmid conjugation particles), etc. . アミノ酸系分子を重合開始・安定剤として用いるナノ粒子製造法は、特許文献8、9(アミノ酸系分子の単独使用)等に記載され公知である。 Nanoparticles prepared methods using amino acid-based molecules as a polymerization initiator, stabilizers are known are described in such Patent Documents 8 and 9 (sole use of amino acid-based molecules). また、特許文献7には、アミノ酸と糖類・ポリソルベートを併用する製造法が記載されている。 Further, Patent Document 7, the preparation used together with amino acids Sugar polysorbate is described. これらの重合開始・安定剤は、いずれか1種のみを使用してもよいし、2種以上を組み合わせて使用してもよい。 These polymerization initiators, stabilizers, may be used only one kind may be used in combination of two or more.

本発明において、「アミノ酸」とは、分子内にアミノ基とカルボキシ基とを持つ化合物をいい、一般的なアミノ酸の定義の通り、アミノ基の水素が分子内の他の部分と置換して二級アミンとなった環状化合物であるイミノ酸も包含する。 In the present invention, the term "amino acid" refers to a compound having an amino group and a carboxyl group in the molecule, and as defined in the general amino acid, hydrogen of an amino group substituted with the rest of the molecule two also encompasses imino acid is a cyclic compound became grade amines. 本発明で使用できるアミノ酸の代表的な例としては、天然のタンパク質を構成する20種のα−アミノ酸(アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、イソロイシン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、シスチン又はシステイン、グルタミン、アスパラギン、プロリン、メチオニン)が挙げられるが、これらに限定されず、β−、γ−及びδ−アミノ酸系分子も包含される。 Representative examples of amino acids that can be used in the present invention, 20 types of α- amino acids (arginine which constitute natural proteins, histidine, lysine, aspartic acid, glutamic acid, alanine, glycine, leucine, valine, isoleucine, serine, threonine, phenylalanine, tryptophan, tyrosine, cystine or cysteine, glutamine, asparagine, proline, methionine), but include, but are not limited to, beta-, also encompassed γ- and δ- amino acid-based molecules. 具体例を挙げると、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、イソロイシン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、シスチン又はシステイン、グルタミン、アスパラギン、プロリン、メチオニン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸(GABA;神経伝達物質)、カルニチン、γ−アミノレブリン酸、γ−アミノ吉草酸などが挙げられる。 Specific examples, arginine, histidine, lysine, aspartic acid, glutamic acid, alanine, glycine, leucine, valine, isoleucine, serine, threonine, phenylalanine, tryptophan, tyrosine, cystine or cysteine, glutamine, asparagine, proline, methionine, beta - alanine, .gamma.-aminobutyric acid (GABA; neurotransmitters), carnitine, .gamma.-aminolevulinic acid, etc. .gamma.-amino valeric acid. 好ましいアミノ酸の例として、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、イソロイシン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、シスチン又はシステイン、グルタミン、アスパラギン、プロリン、及びメチオニンから選択される少なくとも1種、中でも特に、グリシン及びアスパラギン酸からなる群より選択される少なくとも1種を挙げることができるが、これらに限定されない。 Examples of preferred amino acids include arginine, histidine, lysine, aspartic acid, glutamic acid, alanine, glycine, leucine, valine, isoleucine, serine, threonine, phenylalanine, tryptophan, tyrosine, cystine or cysteine, glutamine, asparagine, proline, and methionine at least one selected, among others, it can be mentioned at least one selected from the group consisting of glycine and aspartic acid, and the like.

「アミノ酸誘導体」とは、上記定義によるアミノ酸においていずれかの基が修飾又は置換された構造を有する化合物をいう。 By "amino acid derivative" refers to a compound having any of the groups have been modified or substituted structures in the amino acid as defined above. 生物体成分として天然に存在するアミノ酸誘導体は、通常、本発明で好ましく使用することができる。 Naturally occurring amino acid derivatives as organism component can usually be preferably used in the present invention. 使用可能なアミノ酸誘導体の具体例を挙げると、クレアチン(アルギニン誘導体で1-メチルグアニジノ酢酸)、オルニチン(アルギニン誘導体で尿素サイクル産物)、サイロキシン(芳香族アミノ酸類であるトリヨウドサイロニン;T4)、デスモシン(角質エラスチンやコラーゲンの構成成分;3分子のアリシンの側鎖と1分子のリシンの側鎖が結合した構造)、ヒドロキシプロリン及びヒドロキシリジン(ゼラチンやコラーゲン構成成分)、ホスホセリン(セリンとリン酸のエステル;カゼイン構成成分)、テアニン(茶成分、グルタミン酸誘導体)、カイニン酸(海人草の虫下し成分)、トリコロミン酸(シメジの成分)やサルコシン(卵黄・ハム・豆類成分;Nメチルグリシン)等が挙げられるが、これらに限定されない。 Specific examples of amino acid derivatives can be used, creatine (arginine derivative l-methyl-guanidino acetic acid), ornithine (urea cycle products arginine derivative), thyroxine (aromatic amino acids tri iodide thyronine; T4), desmosine (horny component elastin and collagen; 3 side chain of a lysine side chain and 1 molecule of allicin molecules bound structure), hydroxyproline and hydroxylysine (gelatin or collagen component), phosphoserine (serine phosphate esters; casein components), theanine (brown component, glutamic acid derivatives), vermifuge component of kainic acid (Macri), components of Torikoromin acid (mushroom) and sarcosine (yolk ham legumes component; N-methylglycine) and the like They include, but are not limited to.

アミノ酸の「オリゴマー」とは、10個以下のアミノ酸残基がペプチド結合により結合したオリゴペプチドをいい、アミノ酸の「ポリマー」とは、11個以上のアミノ酸残基がペプチド結合により結合したポリペプチドをいう。 The "oligomer" of an amino acid refers to oligopeptide 10 or fewer amino acid residues linked by peptide bonds, the term "polymer" of an amino acid, a polypeptide 11 or more amino acid residues linked by peptide bonds Say. いずれも、アミノ酸だけではなくアミノ酸誘導体を残基として含んでいてよい。 Both may comprise an amino acid derivative as well as amino acid as residue. ポリペプチドの残基数の上限は特に限定されないが、例えば500残基以下であり得る。 The upper limit of the residues of the polypeptide is not particularly limited but can be, for example, 500 residues or less. ポリペプチドとしては、11〜100残基、11〜50残基、11〜30残基、11〜20残基、あるいは11〜15残基のものが好ましく用いられ得る。 The polypeptides, 11-100 residues, 11 to 50 residues, 11-30 residues, 11 to 20 residues, or 11 to 15 those residues can be used preferably.

オリゴペプチドはポリペプチドよりも好ましく用いられ得る。 Oligopeptides may be preferably used than a polypeptide. 中でも、2〜7残基、2〜5残基、あるいは2又は3残基のオリゴペプチドがより好ましく用いられ得る。 Among them, 2-7 residue, 2-5 residue, or 2 or 3 residues of the oligopeptide may be used more preferably.

上記した特許文献8〜9に記載されている通り、天然のタンパク質を構成する20種のα−アミノ酸のいずれでも、糖類やポリソルベートを使用しない条件でナノサイズ(1000nm未満)のシアノアクリレートポリマー粒子を合成できる。 As described in Patent Document 8-9 described above, any of 20 kinds of α- amino acids constituting natural proteins, the cyanoacrylate polymer nano-sized particles (less than 1000 nm) under conditions that do not use the sugars and polysorbate It can be synthesized. 中性・酸性・塩基性アミノ酸のいずれでも、そして直鎖・芳香族・イミノ・含硫黄構造のいずれでも、糖類もポリソルベートも使用せずにナノ粒子を製造できることが示されている。 Either neutral, acidic, basic amino acids and any of linear, aromatic-imino-sulfur structure, have been shown to be capable of producing nanoparticles without also be used polysorbate sugars. 従って、20種のα−アミノ酸のみならず、上記したその他のアミノ酸及びアミノ酸誘導体もナノ粒子合成に使用することができるし、また、オリゴペプチドやポリペプチドも分子内にアミノ酸構造を有するので、やはりナノ粒子合成に使用することができる。 Therefore, not only the 20 kinds of α- amino acids, it can be used for other amino acids and amino acid derivatives nanoparticles synthesized as described above, also, because it has an amino acid structure to an oligopeptide or polypeptide in the molecular still it can be used for nanoparticle synthesis.

「糖」には、水酸基を有する単糖類(例えばグルコース、マンノース、リボース及びフルクトース等)、水酸基を有する二糖類(例えばマルトース、トレハロース、ラクトース及びスクロース等)及び水酸基を有する多糖類(例えばデキストランやマンナン等)が包含される。 The "sugar", monosaccharides (e.g. glucose, mannose, ribose and fructose) having a hydroxyl group, a disaccharide (such as maltose, trehalose, lactose and sucrose, etc.) polysaccharides (e.g. dextran and mannan with and hydroxyl groups having a hydroxyl group etc.) are included. これらの糖は、環状、鎖状のいずれの形態であってもよく、また、環状の場合、ピラノース型やフラノース型等のいずれであってもよい。 These sugars, cyclic, may be in any form of chain, and when cyclic, may be any of such pyranose or furanose form. また、糖には種々の異性体が存在するがそれらのいずれでもよい。 Also, it may be either of them there are various isomers sugar.

「ポリソルベート」には、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(商品名 Tween 20)、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(商品名 Tween 80)等の各種のTween系界面活性剤が包含される。 The "polysorbate" is polyoxyethylene sorbitan monolaurate (trade name Tween 20), various Tween series surfactants such as polyoxyethylene sorbitan monooleate (trade name Tween 80), and the like.

単糖類、二糖類及び多糖類並びにポリソルベートは、単独で用いることもできるし、2種以上を組み合わせて用いることもできる。 Monosaccharides, disaccharides and polysaccharides and polysorbates, may be used alone, it may be used in combination of two or more. 上記した糖及びポリソルベートのうち、グルコース、デキストラン、Tween 20(商品名)が安価に入手できコスト面で有利である。 Of the above-mentioned sugars and polysorbate, glucose, dextran, Tween 20 (trade name) is a cost advantage available inexpensively. デキストランとしては、平均分子量5万程度以上の重合度であるデキストランが好ましい。 The dextran, dextran is the average molecular weight of about 50,000 or more polymerization degree is preferred. デキストランの分子量の上限は特にないが、通常、分子量50万程度以下である。 It is no particular upper limit of the molecular weight of dextran, but is usually less molecular weight of about 500,000.

本発明で用いるナノ粒子としては、重合開始・安定剤としてアミノ酸系分子を使用し、糖及びポリソルベートのいずれも使用せずに合成した粒子(すなわち、アミノ酸系分子を含み、糖及びポリソルベートのいずれも含まない粒子)、並びに、重合開始・安定剤としてアミノ酸系分子及び糖を併用し、ポリソルベートを使用せずに合成した粒子(すなわち、アミノ酸系分子及び糖を含み、ポリソルベートを含まず、SDS等のその他の界面活性剤も含まない粒子)が好ましい。 The nanoparticles used in the present invention, using the amino acid-based molecules as a polymerization initiator, stabilizer, synthetic particles without any sugar and polysorbate (i.e., include amino acid-based molecules, both sugar and polysorbate free particles), as well as the amino acid-based molecules and sugar in combination as a polymerization initiator, stabilizer, synthetic particles without the use of polysorbate (i.e., include amino acid-based molecules and sugars, free of polysorbate, for SDS etc. particles that do not contain other surfactants) are preferred.

シアノアクリレートモノマーとしては、アルキルシアノアクリレートモノマーが好ましい。 The cyanoacrylate monomer, an alkyl cyanoacrylate monomer. アルキル基の炭素数は好ましくは1〜8、より好ましくは2〜6、さらに好ましくは3〜5であり、直鎖でも分岐でもよい。 The number of carbon atoms in the alkyl group is preferably 1 to 8, more preferably 2 to 6, still more preferably 3 to 5, and may be either linear or branched. またアルキル基を構成する炭素原子の少なくとも1つがハロゲン原子(塩素、臭素、ヨウ素)で置き換わっていてもよい。 The at least one halogen atom of the carbon atoms constituting the alkyl group (chlorine, bromine, iodine) may be replaced by. 好ましいシアノアクリレートモノマーの具体例としては、メチル−2−シアノアクリレート、エチル−2−シアノアクリレート、n−プロピル−2−シアノアクリレート、i−プロピル−2−シアノアクリレート、n−ブチル−2−シアノアクリレート、i-ブチル-2-シアノアクリレート、n-ペンチル-2-シアノアクリレート、n−ヘキシル-2-シアノアクリレート、n−ヘプチル-2-シアノアクリレート、n-オクチル-2-シアノアクリレート等を挙げることができる。 Specific examples of the preferred cyanoacrylate monomer, methyl 2-cyanoacrylate, ethyl-2-cyanoacrylate, n- propyl-2-cyanoacrylate, i- propyl-2-cyanoacrylate, n- butyl-2-cyanoacrylate , i- butyl-2-cyanoacrylate, n- pentyl-2-cyanoacrylate, n- hexyl-2-cyanoacrylate, n- heptyl-2-cyanoacrylate, and the like n- octyl-2-cyanoacrylate, etc. it can. これらの中でも特に、外科領域において傷口の縫合のための接着剤として従来用いられている、下記式で表されるn-ブチル-2-シアノアクリレート(nBCA)を好ましく用いることができる。 Among these, conventionally used as an adhesive for suturing the wound in the surgical field, it can be preferably used n- butyl-2-cyanoacrylate represented by the following formula (nBCA).

ナノ粒子の製造工程では、適当な溶媒中に少なくとも1種の重合開始・安定剤を溶解させた後、撹拌下にて少なくとも1種のシアノアクリレートモノマーを加え、適宜撹拌を続けて重合反応を進行させればよい。 In the manufacturing process of the nanoparticles were dissolved at least one type of polymerization initiator, a stabilizer in a suitable solvent, at least one cyanoacrylate monomer under agitation was added, promoting the polymerization reaction was continued stirring as appropriate it is sufficient to. 本発明で用いるナノ粒子の製造においては、少なくとも1種のアミノ酸系分子を重合開始・安定剤として使用する。 In the production of the nanoparticles used in the present invention, at least one type of amino acid-based molecules as a polymerization initiator, stabilizers. さらに糖及びポリソルベートからなる群より選択される少なくとも1種の重合開始・安定剤を組み合わせて用いてもよい。 It may further be used in combination of at least one polymerization initiator, stabilizer selected from the group consisting of sugars and polysorbate. シアノアクリレートモノマーは、1種類のみ用いてもよいし、2種類以上を用いてもよい。 Cyanoacrylate monomers may be used only one kind may be used two or more kinds.

重合開始・安定剤として糖及び/又はポリソルベートを使用する場合、反応開始時の重合反応液中の糖及び/又はポリソルベートの濃度(複数種類用いる場合はその合計濃度)は、特に限定されないが、通常、0.5%〜10%程度、好ましくは0.75%〜7.5%程度である。 When using the sugar and / or polysorbate as a polymerization initiator, stabilizer, sugar and / or polysorbate concentration in the polymerization reaction mixture at the start of the reaction (the total concentration when a plurality of types used) is not particularly limited, usually , about 0.5% to 10%, preferably about 0.75% to 7.5%. なお、糖の濃度はw/v%、ポリソルベートの濃度はv/v%を意味し、例えば糖を単独で用いる場合には、上記した濃度範囲はそれぞれ「0.5w/v%〜10w/v%」、「0.75w/v%〜7.5w/v%」を意味する。 The concentration of sugar w / v%, the concentration of polysorbate means v / v%, for example in the case of using sugar alone, each concentration range above "0.5w / v% ~10w / v% ", it means" 0.75w / v% ~7.5w / v% ". また、糖を5w/v%、ポリソルベートを1v/v%で併せて用いる場合には、これらの合計濃度を6%というものとする。 Also, sugar 5w / v%, when used in conjunction with polysorbate at 1 v / v%, the total of these concentrations will be referred to 6%. ただし、単糖類(例えばグルコース)のみを用いる場合には、2.5w/v%〜10w/v%程度で用いることが好ましい。 However, in case of using only monosaccharides (e.g. glucose) it is preferably used at about 2.5w / v% ~10w / v%.

重合開始・安定剤としてアミノ酸系分子を使用する場合、反応開始時の重合反応液中のアミノ酸系分子の濃度(複数種類用いる場合はその合計濃度)は、特に限定されないが、通常0.1w/v%〜3w/v%程度である。 When using amino acid-based molecules as a polymerization initiator, a stabilizer, the concentration of amino acid-based molecules in the polymerization reaction mixture at the start of the reaction (the total concentration when a plurality of types used) is not particularly limited, usually 0.1 w / v %, which is the ~3w / v% approximately. 糖及び/又はポリソルベートと併用する場合、アミノ酸系分子の使用濃度はこれより低い濃度であっても差し支えない。 When used with sugar and / or polysorbate, no problem even in lower concentrations than this concentration is the amino acid-based molecules.

重合反応の溶媒としては、水を主体とする水性溶媒(例えば水、低級アルコール水溶液など)を使用することができ、アミノ酸系分子含有粒子の製造の場合は、通常、水が好ましく用いられる。 The solvent for the polymerization reaction, an aqueous solvent (e.g. water, a lower alcohol solution, etc.) made mainly of water can be used, in the case of production of amino acid-based molecules containing particles, usually, water is preferable. アニオン重合は水酸イオンにより開始されるので、反応液のpHは重合速度に影響する。 Because anionic polymerization is initiated by hydroxide ion, pH of the reaction solution affects the polymerization rate. 反応液のpHが高い場合には、水酸イオンの濃度が高くなるので重合が速く、pHが低い場合には重合が遅くなる。 When the pH of the reaction solution is high, the concentration of hydroxide ion is increased polymerization is fast, the polymerization becomes slow when the pH is low. アミノ酸系分子含有粒子を製造する場合には、通常、pHが1.5〜3.0程度の酸性下で適度な重合速度が得られる。 In the production of amino acid-based molecules containing particles, usually, pH is moderate polymerization rate under acidic conditions of about 1.5 to 3.0 is obtained. 反応液を酸性にするために添加する酸は特に限定されず、無機酸及び有機酸のいずれでも使用することができる。 Acid added to the reaction solution acidic is not particularly limited, and can be used with any of the inorganic and organic acids. 例えば、塩酸は、反応に悪影響を与えず、反応後に揮散することから、アミノ酸系分子含有粒子の製造において好ましく用いることができるが、使用可能な酸はこれに限定されない。 For example, hydrochloric acid does not adversely affect the reaction, since volatilization after the reaction, can be preferably used in the production of amino acid-based molecules containing particles, usable acid is not limited thereto. 塩酸等の酸の濃度は、特に限定されないが、0.0005N〜0.5N程度の範囲で適宜選択可能である。 The concentration of acid such as hydrochloric acid is not particularly limited, it can be appropriately selected in the range of about 0.0005N~0.5N.

アミノ酸を重合開始剤としてシアノクリレートモノマーを重合し、ナノサイズのポリマー粒子を合成する方法として、ミニエマルジョン法と呼ばれる手法が知られているが(Weiss, CK et al., Preparatio, Macromolecules, 2007, Vol. 40, p. 928-938; WO 2008/003706 A1)、この手法では、ヘキサデカン等の親油性溶媒を含むO相と塩酸等を含むW相の2相で構成されるミニエマルジョン中でアニオン重合が行われ、SDS等の界面活性剤の使用も必須である。 Amino polymerizing cyano chestnut rates monomer as a polymerization initiator, a method of synthesizing a polymer nano-sized particles, although a technique called mini-emulsion method is known (Weiss, CK et al., Preparatio, Macromolecules, 2007 , Vol 40, p 928-938;.. WO 2008/003706 A1), in this method, a mini emulsion composed of 2 phases of W phase containing O phase and hydrochloric acid containing lipophilic solvent hexadecane anionic polymerization is carried out, the use of surfactants such as SDS also essential. 本願発明者が開発した上記の方法によれば、O相を含まない単相の水性溶媒中での重合反応によりナノポリマー粒子を合成できるので、溶媒として有機溶媒や界面活性剤を使用する必要が無い。 According to the above method the present inventors have developed, it is possible to synthesize the nano-polymer particles by a polymerization reaction of a single-phase aqueous solvent containing no O phase, it requires the use of organic solvents and a surfactant as the solvent no. また、本願発明者の方法では、重合開始・安定剤としてポリソルベート以外のものを使用してナノポリマー粒子を製造することもできるので、Tween系の界面活性剤を含め、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、及び非イオン界面活性剤のいずれの界面活性剤も含有しないナノ粒子を調製することができる。 Further, in the present invention's method, it is also possible to produce a nano-polymer particles with the existing polysorbate as a polymerization initiator, a stabilizer, including Tween series surfactants, anionic surfactants, cationic ionic surfactants, amphoteric surfactants, and any surfactant of nonionic surfactants may also be prepared nanoparticles containing no. もっとも、ミニエマルジョン法により合成されたナノポリマー粒子の皮膚炎に対する効果は不明である。 However, the effect on dermatitis of nano polymer particles synthesized by miniemulsion process is unknown.

反応開始時の重合反応液中のシアノアクリレートモノマーの濃度は、特に限定されないが、通常、0.5v/v%〜2.0v/v%程度、好ましくは0.8v/v%〜1.2v/v%程度である。 The concentration of the cyanoacrylate monomer in the polymerization reaction mixture at the start of the reaction is not particularly limited, usually, 0.5v / v% ~2.0v / v%, preferably about 0.8v / v% ~1.2v / v% approximately it is.

反応温度は、特に限定されないが、室温で行なうことが簡便で好ましい。 The reaction temperature is not particularly limited, preferable is convenient to perform at room temperature. 反応時間は、反応液のpH、溶媒の種類等に応じて反応速度が異なるため、これらの要素に応じて適宜選択される。 The reaction time, pH of the reaction solution, the reaction rate differs depending on the type of solvent or the like, and is appropriately selected according to these factors. 特に限定されないが、通常、反応時間は10分〜5時間程度、好ましくは30分〜4時間程度である。 It is not particularly limited, usually, the reaction time is about 10 minutes to 5 hours, preferably about 30 minutes to 4 hours. 得られたアミノ酸系分子含有粒子は、通常、中性の粒子として用いられるので、反応終了後、水酸化ナトリウム水溶液等の塩基を反応液に添加して中和することが好ましい。 The resulting amino acid-based molecules containing particles, usually because it is used as neutral particles, after completion of the reaction, it is preferable to neutralize by adding a base such as sodium hydroxide solution to the reaction solution. 反応終了後の反応液をフィルター濾過し、適宜滅菌水で洗浄して粒子を回収すればよい。 The reaction solution after completion of the reaction was filtered through a filter, may be recovered particles were washed with an appropriate sterile water.

上記の方法によれば、平均粒径が1000nm未満であるナノサイズのシアノアクリレートポリマー粒子を容易に製造することができる。 According to the above method, it is possible to average particle diameter is easily manufactured cyanoacrylate polymer nano-sized particles is less than 1000 nm. 粒子サイズの下限は特に限定されないが、上記の重合反応で製造される粒子の粒径は通常7nm程度以上となる。 But the lower limit of particle size is limited, the particle diameter of the particles produced by the above polymerization reaction is usually more than about 7 nm. 好ましくは、粒子の平均粒径は20nm〜600nm、より好ましくは50nm〜550nmである。 Preferably, the average particle diameter of the particles 20Nm~600nm, more preferably 50Nm~550nm. 粒子のサイズは、反応液中のシアノアクリレートモノマーの濃度やpH、反応時間を調節することによって調節することができる。 The size of the particles can be adjusted by adjusting the concentration and pH of the cyanoacrylate monomer in the reaction solution, and the reaction time. また、重合開始・安定剤として糖及びポリソルベートから選択される少なくとも1種を用いる場合には、該重合開始・安定剤の濃度や種類を変えることによっても、粒子サイズを調節することができる(特許文献3、4等参照)。 In the case of using at least one selected from sugars and polysorbate as a polymerization initiator, a stabilizer, also by changing the concentration and type of the polymerization initiator, stabilizer, it is possible to adjust the particle size (Patent references 3, 4 etc.). 一般に、反応液のpHを高めた場合、反応時間を長くした場合、及び反応液の糖濃度を低くした場合には粒子サイズが大きくなり、重合開始・安定剤としてポリソルベートを用いた場合には粒子サイズが小さくなる。 Generally, when increased the pH of the reaction solution, when longer reaction times, and the greater the particle size in the case of low sugar concentration of the reaction solution, in the case of using polysorbate as a polymerization initiator, stabilizer particles size decreases. これらの反応条件を適宜組み合わせることで、所望のサイズの粒子を製造することができる。 By combining these reaction conditions appropriately, it is possible to produce particles of the desired size.

ナノ粒子の電荷(ゼータ電位)は、特に限定されないが、通常-50mV〜0mV程度である。 Charge of the nanoparticles (zeta potential) is not particularly limited, is usually about -50MV~0mV. ゼータ電位とは、粒子表面の電荷を示すもので、粒子の分散性の指標となる。 The zeta potential indicates the charge on the particle surface, the dispersibility of the indicator particles. 粒子サイズとゼータ電位は、例えばHe・Neレーザーを用いた市販の装置(例えばMalvern Inst.UK社製のゼータサイザー等)を用いて容易に測定することができる。 Particle size and zeta potential can be easily measured using for example a commercially available apparatus using the He · Ne laser (e.g. Malvern Inst.UK Co. Zetasizer etc.).

アミノ酸系分子を重合開始・安定剤として用いて製造されたナノ粒子では、アミノ酸系分子が単に粒子に付着して含有されるのみならず、アミノ酸構造中の-COO基がシアノアクリレートのエチレン末端の炭素に結合し、共有結合により粒子に含有されていると考えられる。 The nanoparticles produced using the amino acid-based molecules as a polymerization initiator, stabilizer, not only amino acid-based molecule is simply contained by adhering to the particles, -COO group of the amino acid structure is ethylene-terminal cyanoacrylate bonded to the carbon, it is considered as being contained in the particles by a covalent bond. なお、上記方法で得られる粒子のアミノ酸系分子の含有率は、通常約20%〜約65%程度である。 Incidentally, the content of amino acid-based molecules of the particles obtained by the above method is usually about 20% to about 65%. アミノ酸系分子の含有率は、重合後にフィルター洗浄したときのフィルター通過液の吸光度を適当な波長で測定し、フィルター通過液中のアミノ酸系分子の量(すなわち粒子に結合しなかったアミノ酸系分子の量)を吸光度法により求めた後、下記の式によって算出することができる。 The content of amino acid-based molecules, the filter effluent absorbance upon filter washed measured at the appropriate wavelength after polymerization, the amino acid-based molecules of the filter effluent in amount (i.e., amino acid-based molecules that did not bind to the particles after the amount) was determined by spectrophotometry, it can be calculated by the following equation.
アミノ酸系分子含有量=(アミノ酸系分子添加量)−(フィルター通過液中のアミノ酸系分子の量) Amino acid-based molecular content = (amino acid-based molecular amount) - (the amount of amino acid-based molecules of the filterability solution)
アミノ酸系分子含有率(%)=アミノ酸系分子含有量÷アミノ酸系分子添加量×100 Amino acid-based molecule content (%) = amino acid based molecules content ÷ amino acid-based molecular amount × 100

本発明で用いるアミノ酸系分子含有ナノ粒子は、細菌類に対する抗菌活性成分を含まない。 Amino acid-based molecules containing nanoparticles used in the present invention does not contain antimicrobial active ingredients against bacteria. アミノ酸を含有するシアノアクリレートポリマーナノ粒子がグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の両者に対して抗菌活性を発揮できることは、特許文献8、9に記載される通り公知であり、細菌表面(細胞壁)への特異的接着性により細菌を溶菌に導くことで抗菌作用を発揮する。 The cyanoacrylate polymer nanoparticles containing amino acids can demonstrate antibacterial activity against both Gram-positive and Gram-negative bacteria are known as described in Patent Documents 8 and 9, to the bacterial surface (cell wall) It exerts antibacterial action by directing bacteria lysed by specific adhesion properties. ナノ粒子が有する細胞障害活性は、正常な哺乳動物細胞に対しては発揮されず、ナノ粒子にはin vivo毒性もないことが確認されている。 Cytotoxic activities of the nanoparticles is not exerted against normal mammalian cells, it has been confirmed no in vivo toxicity to the nanoparticles. また、本発明で用いるアミノ酸系分子含有ナノ粒子は、真菌に対する抗菌活性成分も含まない。 Further, amino acid-based molecules containing nanoparticles used in the present invention does not comprise antimicrobial active ingredients against fungi.

ここでいう「抗菌活性成分」とは、細菌又は真菌の代謝経路ないしは生理機能に生化学的に作用して該細菌の発育を阻止することができる化学物質成分をいい、具体的には、細菌又は真菌の抗菌に利用可能な抗生物質その他の化学物質成分を言う。 The "antimicrobial active ingredient", refers to a chemical component that can be a bacterial or metabolic pathways or physiological functions of fungal act biochemically inhibiting the growth of bacteria, specifically, bacterial or it refers to an antibiotic other chemicals ingredients available antimicrobial fungi. 「抗菌活性成分を含まない」とは、抗菌活性成分を全く含まないか、含んでいたとしてもごく微量であって、その抗菌活性成分に対し感受性である細菌又は真菌を抗菌することができない程度の微量にしか該抗菌活性成分を含んでいないことをいう。 The degree of "Free of antimicrobial active ingredient", or does not contain any antimicrobial active ingredient, a trace amount as contained, it is impossible to antimicrobial bacteria or fungi are sensitive to the antimicrobial active ingredient It means that only trace amounts do not contain antimicrobial active ingredients. 本発明で用いるナノ粒子は、細菌類及び真菌類に対する抗菌活性成分を「実質的に含まない」ということもできる。 Nanoparticles used in the present invention, the antimicrobial active ingredient against bacteria and fungi can also be "substantially free". 「抗菌することができない程度の微量」とは、粒子単位体積当たりに含まれる粒子中の抗菌活性成分量を粒子中の含有濃度と定義し、この含有濃度と同濃度の抗菌活性成分を粒子に含有させず単独で感受性細菌又は真菌に作用させた場合に、該感受性細菌又は真菌の発育を阻止できない量のことを意味する。 The "small amount of an extent that can not be antibacterial" antibacterial amount of active ingredient in the particles contained per volume particle unit is defined as the concentration of the in the particles, the antimicrobial active ingredient of the content level and the concentration of particles when allowed to act alone in susceptible bacteria or fungi not contain means that amount which can not prevent the growth of the sensitive bacteria or fungi. 本発明で用いるナノ粒子は、抗生物質等の抗菌活性成分を全く含まない粒子であり得る。 Nanoparticles used in the present invention may be a particle that does not contain any antimicrobial active ingredients such as antibiotics.

また、アミノ酸系分子含有ナノ粒子は、従来用いられている皮膚炎の治療薬のような、皮膚炎に対する治療又は予防活性を有する化学物質成分を含まない。 Further, amino acid-based molecules containing nanoparticles, such as a therapeutic agent for dermatitis which is conventionally used, contains no chemical substances ingredient having therapeutic or prophylactic activity against dermatitis. ここでいう「含まない」も上記と同様であり、そのような化学物質成分を全く含まないか、含んでいたとしてもごく微量であって、皮膚病変部の治療及び予防効果を発揮することができない程度の微量にしか該化学物質成分を含んでいないことを意味する。 Is similar to the "free" is also the here, is that such chemical substances or ingredients contains no, a trace amount as contained, exert a therapeutic and preventive effect of the skin lesions It means that only a slight amount can not be do not contain the chemical components. 本発明で用いるナノ粒子は、皮膚炎治療薬のDDSではなく、ナノ粒子それ自体が皮膚バリア機能の向上と表在細菌数制御の関与する免疫応答とを介して皮膚炎症反応を制御し、皮膚炎の治療及び予防効果を奏する。 Nanoparticles used in the present invention, not the DDS dermatitis therapeutic agents, nanoparticles themselves control the skin inflammatory response via the immune response involved in improving the superficial bacterial count control of skin barrier function, the skin achieve therapeutic and prophylactic effects of the flame.

本発明において対象となる皮膚炎は、特に限定されないが、第一には掻痒を伴う皮膚炎(掻痒性皮膚炎)であり得る。 Dermatitis of interest in the present invention is not particularly limited, the first may be a dermatitis with pruritic (pruritic dermatitis). 掻痒性皮膚炎の具体例としては、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、感染性皮膚炎、乾癬や自己免疫機序による皮膚炎、薬疹等を挙げることができるが、これらに限定されない。 Specific examples of pruritic dermatitis, atopic dermatitis, contact dermatitis, infectious dermatitis, dermatitis psoriasis and autoimmune mechanisms, there may be mentioned a medicine 疹等, without limitation.

また、対象となる皮膚炎は、第二には皮膚傷害に関連した皮膚炎であり得る。 Further, dermatitis of interest, the second may be a dermatitis associated with skin damage. そのような皮膚炎の具体例としては、放射線性皮膚炎、熱傷、じょく瘡等を挙げることができるが、これらに限定されない。 Specific examples of such dermatitis, radiation dermatitis, burns, may be mentioned Juck acne, and the like.

下記実施例において確認されている通り、アミノ酸系分子含有ナノ粒子はI型とIV型のアレルギー反応を抑制する作用を有する。 As has been confirmed in the following examples, the amino acid-based molecules containing nanoparticles have an action to suppress the allergic reaction of type I and type IV. 従って、アミノ酸系分子含有ナノ粒子を有効成分とする本発明の剤は、I型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応の抑制剤として、例えばI型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応が関与する皮膚炎等のアレルギー症状の治療又は予防剤として有用である。 Accordingly, the present invention as an active ingredient an amino acid-based molecules containing nanoparticles agent as an inhibitor of type I allergic reaction or type IV allergic reactions, for example dermatitis such as type I allergic or type IV allergic reaction is involved it is useful as a therapeutic or prophylactic agent for allergic symptoms. 上記した掻痒性皮膚炎は、I型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応が関与し得ることが知られている。 Pruritic dermatitis described above, I-type allergic reaction or type IV allergic reactions are known to be involved.

上述した通り、本発明で用いるナノサイズのシアノアクリレートポリマー粒子には細菌に対する抗菌活性があることが知られている(特許文献8、9)。 As described above, the cyanoacrylate polymer nano-sized particles used in the present invention is known to have antibacterial activity against bacteria (Patent Documents 8 and 9). 感染性皮膚炎等の感染を主因とする皮膚炎に対しては、粒子の抗菌活性が感染した細菌に対しても効果を発揮すると期待されるため、感染を主因とする皮膚炎に対しても本発明の剤を使用することができるが、本発明で対象とする皮膚炎は、細菌感染を主因とする皮膚炎以外の皮膚炎であり得る。 For dermatitis mainly due to infection, such as infectious dermatitis, since the antibacterial activity of the particles is expected to also effective against infection with bacteria, even for dermatitis that mainly due to infection Although it is possible to use agents of the present invention, dermatitis, which is the target of the present invention may be a dermatitis non dermatitis mainly due to bacterial infection.

本発明の剤は、治療すべき皮膚病変部、又は皮膚炎の発生の予防が望まれる皮膚領域に局部投与して用いられる。 Agents of the present invention, the skin lesion to be treated, or prevention of the occurrence of dermatitis are used by local administration to the skin area to be desired. 局部投与方法としては、注射剤・点滴剤等による皮内投与、軟膏剤・クリーム剤・貼付剤等による局所適用等が挙げられる。 The local administration, intradermal administration by injection, drip infusions and the like, topical application, and the like by ointments, creams, plasters. 投与量は、症状、年齢、体重、投与方法等に応じて適宜選択され、特に限定されないが、通常、対象動物に対し有効成分であるアミノ酸系分子含有粒子の量として1日0.01μg〜10000mg程度、例えば1μg〜100mg程度であり、1回ないし数回に分けて投与される。 Dose, symptoms, age, body weight, is suitably selected according to the administration method and the like are not particularly limited, usually, 1 day 0.01μg~10000mg about as the amount of amino acid-based molecules containing particles as an active ingredient to a subject animal , for example, about 1Myuji~100mg, it is administered in once or several times. 症状の改善の程度に応じ、数日ないし数ヶ月間にわたり、毎日1回若しくは数回、ないしは数日おきに1日若しくは数回、定期的に投与してもよいし、あるいは、症状が発生した時に投与してもよい。 Depending on the degree of improvement in symptoms, over several days to several months, once or several times daily, or daily or several times every few days, it may be administered periodically or symptoms occurs sometimes it may be administered.

本発明の剤の投与対象は哺乳動物であり、例えばヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター等が挙げられる。 Subject of administration of the agent of the present invention is a mammal, e.g., humans, dogs, cats, rabbits, hamsters, and the like.

本発明の剤は、単独で用いてもよいし、他の掻痒性皮膚疾患の治療又は予防剤等と併せて用いることもできる。 Agents of the present invention may be used alone or may be used in conjunction with therapeutic or prophylactic agent other pruritic dermatoses. 掻痒性皮膚疾患に従来用いられている標準的治療薬はステロイド剤、カルシニューリン阻害薬や抗ヒスタミン薬であるが、本発明の剤はこれらの標準的治療薬とは作用機序が異なると考えられるので、本発明の剤とステロイド剤等とを組み合わせて用いることも可能である。 Standard therapy conventionally used in pruritic dermatoses steroid, is a calcineurin inhibitor or antihistamines, agents of the present invention are believed to mechanism of action is different from those of standard therapy since, it is also possible to use a combination of the agent and a steroid agent or the like in the present invention.

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。 Hereinafter, more specifically explained on the basis of the present invention embodiment. もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 However, the present invention is not limited to the following examples.

1. 1. アミノ酸含有ナノ粒子の製造 国際公開第2012/133648号公報および国際公開第2013/108871号公報に記載されている方法に準じて、アミノ酸及びデキストランを含有するナノサイズのポリマー粒子を製造した。 According to the method described in Preparation WO 2012/133648 publications and WO 2013/108871 Publication amino-containing nanoparticles were produced polymer nano-sized particles containing the amino acid and dextran. 具体的な手順は以下の通りである。 The specific procedure is as follows.

10 mLの0.01N HClに、100mgのデキストラン60K及び100mgのアミノ酸を溶解し、その液性pHを要時1N塩酸を用いてpH=3に調整した。 To 10 mL of 0.01 N HCl, was dissolved amino dextran 60K and 100mg of 100mg, and adjust the liquid pH to pH = 3 with Yotoki 1N hydrochloric acid. アミノ酸としては、グリシン及びアスパラギン酸を使用した。 The amino acid was used glycine and aspartic acid.

デキストラン及びアミノ酸を溶解させた上記の溶液を撹拌下、100μLのnBCAを加え、3時間撹拌し重合反応を実施した。 Under stirring a solution of the above prepared by dissolving dextran and amino acids, added 100μL of nBCA, was carried out stirring polymerization reaction for 3 hours. 1N NaOHを滴下して反応溶液を中和後(pH7.8)、さらに30分撹拌することで、アミノ酸及びデキストランを含有するナノサイズのポリマー粒子を得た。 Dropwise 1N NaOH after neutralizing the reaction solution (pH 7.8), by further stirring for 30 minutes to obtain a polymer nano-sized particles containing the amino acid and dextran. 得られた粒子は、ミリポア社限外濾過器及びポール社製ワクチン製造向け透析限外濃縮装置にて2段階の限外濾過処理に付し、粒子精製品(粒子濃度2mg/mlのコロイド水溶液)を得た。 The resulting particles are given by Millipore ultrafilter and Paul Co. vaccine production for dialysis ultrafiltration concentrator to ultrafiltration in two stages, the particles purified product (an aqueous colloidal solution of particle concentration 2 mg / ml) It was obtained.

市販のゼータサイザー(Malvern Inst.UK社製)を用いてナノ粒子の平均粒径及びゼータ電位を測定した。 Commercial Zetasizer (manufactured by Malvern Inst.UK Corporation) to measure the average particle size and zeta potential of nanoparticles using. また、フィルター洗浄時のフィルター通過液中のアミノ酸分子の量を吸光度法により求め、粒子のアミノ酸含有率を算出した。 Further, it determined by absorbance method the amount of amino acid molecules passing through the filter fluid during filter cleaning was calculated amino acid content of the particles. 結果を表1に示す。 The results are shown in Table 1.

2. 2. マウス皮膚炎モデルにおけるナノ粒子の治療及び予防効果の検討1 Study of therapeutic and prophylactic effects of nanoparticles in mouse dermatitis model 1
上記で製造したアスパラギン酸含有ナノ粒子を用いて実験を行なった。 Experiments were performed using the aspartic acid-containing nanoparticles prepared above. ナノ粒子は、滅菌水に懸濁してナノ粒子水(0.3%(w/v)に希釈、粒子濃度6μg/ml)を調製し、実験に用いた。 Nanoparticles were suspended in sterile water (diluted to 0.3% (w / v), particle concentration 6 [mu] g / ml) nanoparticles water was prepared and used in the experiment. 以下に用いたマウスはすべて、高知大学動物実験委員会で承認された実験計画に沿って実施し、SPFの環境下で飼育、実験を行った。 All of the mice used in the following, conducted along the approved experimental design in Kochi University Animal Care and Use Committee, reared in an environment of SPF, an experiment was conducted.

[方法] [Method]
NC/NgaSlcマウス(日本SLC、静岡)は、背部の剃毛および除毛後、テープストリッピングにより皮膚炎を自然発症することが知られており、アトピー性皮膚炎のモデルとして使われている(Matsuda, M., et.al. Int. Immunol. 9:461, 1997)。 NC / NgaSlc mice (Nippon SLC, Shizuoka) after the back of the shaving and hair removal, are known to spontaneously develop dermatitis by tape stripping, it has been used as a model for atopic dermatitis (Matsuda , M., et.al. Int Immunol 9:.. 461, 1997). 本実験では、5週齢のNC/NgaSlcマウス雄5匹を使用し、図1に示すスケジュールで処置を行なった。 In this experiment, using a five 5-week-old NC / NgaSlc male mice were subjected to treatment with schedule shown in FIG. NC/NgaSlcマウスの背部をシェーバーで剃毛した後、除毛クリーム(Epilat、クラシエホームプロダクツ株式会社、東京)にて除毛した。 After the back of the NC / NgaSlc mouse was shaved with shaver, it was shaved by hair removal cream (Epilat, Kracie Home Products Co., Ltd., Tokyo). 除毛クリームをふき取り、翌日に粘着テープによりテープストリッピング(Scotchメンディングテープ、cat.no.810-3-24、スリーエムジャパン株式会社、東京)を8回行い、皮膚炎を誘発した。 Depilatory wipe the cream, tape stripping by the adhesive tape on the next day do (Scotch mending tape, cat.no.810-3-24, 3M Japan Co., Ltd., Tokyo) eight times, was induced dermatitis. 途中毛が生えたら同様の操作を繰り返し行った。 Hair was repeated the same operation After growing the middle. 3週間後、いずれのマウスにおいても背部の広範囲にわたり皮膚炎の発症が確認された(図2A)。 After three weeks, the onset of dermatitis over a wide range of back was observed in any of the mice (Figure 2A).

皮膚炎を発症したマウス5匹のうち、3匹をナノ粒子水噴霧群、2匹を水噴霧群とした。 Of five mice that developed dermatitis, 3 animals nanoparticles water spray group, the 2 animals were water spray group. 病変部を含む背部皮膚に、2日毎にナノ粒子水又は滅菌水を噴霧した。 The dorsal skin including the lesion was sprayed nanoparticles water or sterilized water every 2 days. マウス1匹の背中8〜10cm 2に対して総液量0.3〜0.4mL(ナノ粒子の量として1.8〜2.4μg)を噴霧した。 It was sprayed with total volume 0.3~0.4mL (1.8~2.4μg as the amount of nanoparticles) to the one mouse back 8~10cm 2. 2日目、6日目および8日目に背部中央部の細菌数を測定した。 Day 2 was measured number of bacteria back central part on day 6 and day 8 days. 具体的には、マウスの背部中央部に生菌数測定用標準寒天培地(ぺたんチェック、栄研化学)を5秒間押し当てた後、37℃フラン器で24時間培養し、6cm 2の区画あたりのコロニー数をカウントした。 Specifically, a mouse standard agar medium for viable cell count measured back central part of the (Petain check, Eiken) was pressed for 5 seconds, incubated for 24 hours at 37 ° C. incubator, partitions per 6 cm 2 I was counting the number of colonies. 寒天培地に触れた皮膚を水で湿らせたティシューペーパーで拭いた後、ナノ粒子水又は蒸留水を噴霧して1時間放置し、乾かした。 The skin touched agar medium after wiping with Tissue paper moistened with water, and allowed to stand for one hour while spraying an nanoparticles or distilled water, allowed to dry. 皮膚病変については、2日目(図2B)及び8日目(図2C)に写真撮影を行なった。 The skin lesions were performed photographed on day 2 (Fig. 2B) and day 8 (Figure 2C).

図1の30日目より2週間放置後、さらにハプテン誘発性IV型アレルギー反応を惹起させる目的で、全てのマウスについて再度背部の剃毛と除毛を行なった。 2 weeks after leaving from day 30 of FIG. 1, in order to further induce hapten-induced type IV allergic reactions, were performed shaving and hair removal again back for all mice. 翌日(1日目)と2日目に、マウスの背部頭側に0.5%ジニトロフルオロベンゼン(1-fluoro-2,4-dinitrobenzene、DNFB)(ナカライテスク株式会社、京都)を溶かしたオリーブ油−アセトン溶液(油:アセトン=1:4)を20μL塗布した。 The next day and the second day (Day 1), 0.5% dinitrofluorobenzene to the back head side of the mouse (1-fluoro-2,4-dinitrobenzene, DNFB) olive oil was dissolved (Nacalai Tesque, Inc., Kyoto) and - Acetone the solution (oil: acetone = 1: 4) was 20μL applied. ナノ粒子水噴霧および水噴霧は、除毛をした44日目より毎日行った。 Nanoparticles water spraying and water spraying was carried out every day from 44 days after the hair removal. DNFB塗布した場合はDNFBが乾燥した後に行った。 If you DNFB application was carried out after DNFB it has dried. DNFB塗布後2日目に写真撮影を行なった(図2D)。 It was carried out for a photo shoot on the second day after the DNFB application (Fig. 2D). DNFB塗布後6日目に血清サンプルを採取後、安楽死させ、DNFBを塗布した頭側背部の皮膚とDNFBを塗布していない尾基部付近の皮膚を採取し、ヘマトキシリン−エオジン(HE)染色を行った(図5A-5D)。 After collecting the serum sample to 6 days after DNFB application, euthanized, collected the skin near the base of the tail that is not coated with the skin and DNFB of the head side back coated with DNFB, hematoxylin - eosin (HE) staining I went (Figure 5A-5D).

また、下記表2に示した基準で図2に示したA〜Dのマウスの皮膚炎の程度をスコア化した。 Moreover, the degree of dermatitis mouse A~D shown in FIG. 2 by the reference shown in Table 2 was scored. スコア化はFanらの報告した文献(Fan et al., Exp Biol Med, 226, 1045-1050, 2001)に基づき、3つの皮膚病変について、程度を0〜3のスコアで評価した。 Scoring the literature reported in Fan et al. (Fan et al., Exp Biol Med, 226, 1045-1050, 2001) based on, for three skin lesions, and evaluate the extent a score of 0-3.

[結果] [result]
皮膚炎発症マウスの背部中央部の細菌数をカウントした結果を表3及び図3に示す。 The results obtained by counting the number of bacteria back center portion of dermatitis development mice are shown in Table 3 and Figure 3. ナノ粒子水噴霧群では表在細菌数がおよそ半分程度に減少した。 The nanoparticle water spray group was reduced to about half superficial bacteria count approximately.

寒天培地のコロニー数は、ナノ粒子水噴霧群は5個、7個、8個であったのに対して蒸留水噴霧群は48個、85個であった。 The number of colonies agar, nanoparticle water spray group 5, 7, 48 distilled water spray group whereas was 8, was 85 pieces. ナノ粒子水の抗菌能力は噴霧後の早い時間から発揮されることが確認された。 Antibacterial ability of the nanoparticles water that has been confirmed to be exhibited from the early hours after spray.

NC/NgaSlcマウスにテープストリッピングで惹起した皮膚炎の治癒の速度や程度には両群の間で大きな差は見られなかったが(図2A〜2C、図4)、繰り返し除毛とテープストリッピングを行い、0.5%DNFB溶液を20μL塗布して惹起したハプテン誘導性皮膚炎においては、水噴霧群における皮膚炎の程度はナノ粒子水噴霧群皮膚炎よりも重症であった(図2D、図4)。 NC / The speed and extent of healing of dermatitis was induced by tape stripping to NgaSlc mice but significant difference was observed between the two groups (Fig. 2A-2C, FIG. 4), repeating hair removal and tape stripping perform, in a hapten-induced dermatitis which elicited 0.5% DNFB solution was 20μL coating, the degree of dermatitis in water spray group was severe than nanoparticle water spray group dermatitis (FIG. 2D, FIG. 4) .

HE染色皮膚切片を観察すると(図5)、ナノ粒子水噴霧群および水噴霧群いずれにおいても、DNFB塗布部位(図5A, C)では非塗布部位(図5B, D)に比べて、表皮肥厚と真皮内細胞浸潤、線維化が認められた。 Observation of the HE-stained skin sections (5), in any nanoparticle water spray group and water spray group, DNFB application site (Fig. 5A, C) in the non-coated portion (FIG. 5B, D) as compared to, acanthosis and intradermal cells infiltration, fibrosis was observed. しかし、水噴霧群の方がナノ粒子水噴霧群よりもDNFB塗布による表皮肥厚、真皮の病変の程度が著明であった(図5Aと5C)。 However, towards the water spray group acanthosis by DNFB application than nanoparticle water spray group, the degree of lesions of the dermis was significantly (Figures 5A and 5C). さらに、水噴霧群でみられたDNFB非塗布部位の軽度の表皮肥厚は、ナノ粒子水噴霧群では完全に抑制されていた(図5Bと5D)。 Moreover, mild acanthosis of DNFB uncoated sites seen with water spray group was completely suppressed in the nanoparticulate water spray groups (Figure 5B and 5D).

また、I型アレルギー反応にナノ粒子が及ぼす影響を調べる目的で、DNFB塗布開始前(図1、44日目)及びDNFB初回塗布から8日目(52日目の実験終了時)のマウス血中のIgE濃度を固相化抗体(rat anti-mouse IgE, Southern Biotech, AL, USA)と酵素標識抗体(HRP-conjugated goat anti-mouse IgE antibody, BETHYL, TX, USA)で構成されたサンドイッチELISA法にて測定した。 Further, for the purpose of examining the impact of nanoparticles type I allergic reaction, DNFB application start before (Fig. 1, day 44) and DNFB Mice blood of 8 days after the first application (at day 52 of the experiment ended) of IgE concentrations immobilized antibody (rat anti-mouse IgE, Southern Biotech, AL, USA) with an enzyme-labeled antibody (HRP-conjugated goat anti-mouse IgE antibody, BETHYL, TX, USA) sandwich ELISA constructed by It was measured by. その結果、水噴霧群では、実験開始時のIgE量と比較して、実験終了時には5倍近くIgE量の上昇を示したのに対し、ナノ粒子水噴霧群ではIgE量の上昇は2-3倍程度にとどまっていた(表4、図6)。 As a result, the water spray group as compared to the IgE level at the beginning of the experiment, whereas showed elevated 5 times more IgE amount at the end of the experiment, the increase in IgE level in the nanoparticle water spray group 2-3 It was only about fold (Table 4, Figure 6). ナノ粒子水噴霧はIV型アレルギー反応にのみならずI型アレルギー反応の制御にも有効であることが確認された。 Nanoparticles water spray was confirmed to be effective in the control of type I allergic reaction not only to the type IV allergic reactions.

[結論] [Conclusion]
ナノ粒子水の有する殺菌作用は、テープストリッピングにより誘導したNC/NgaSlcマウスの皮膚炎に対する治療促進効果とDNFB塗布による皮膚炎誘導に対する予防効果を有することが示された。 Bactericidal action with the nanoparticle water has been shown to have a preventive effect against dermatitis induced by therapeutic promoting effect and DNFB application of NC / NgaSlc mice induced by tape stripping for dermatitis. その効果は、殺菌作用によるバリア機能回復の促進と炎症反応の制御に基づくことが示唆された。 The effect was suggested based on the control of the accelerator and the inflammatory response of barrier function recovery by bactericidal action.

3. 3. マウス皮膚炎モデルにおけるナノ粒子の治療及び予防効果の検討2 Study of therapeutic and prophylactic effects of nanoparticles in mouse dermatitis model 2
ナノ粒子の効果をさらに検証するため、MHC遺伝子型が知られているBALB/cマウスを用いて実験を行なった。 To further verify the effect of nanoparticles, an experiment was conducted using BALB / c mice MHC genotypes are known. まずは、ナノ粒子水による皮膚炎の予防効果をみる実験を行った。 First, an experiment was conducted to see the effect of preventing skin inflammation caused by nanoparticles water. 図7に示すスケジュールでテープストリッピングにより炎症を誘導し、一定期間後DNFB塗布により皮膚炎を再誘導した。 Induced inflammation by tape stripping the schedule shown in FIG. 7, was re-induce dermatitis by DNFB application after a certain period of time. この皮膚炎に対するナノ粒子水の治療効果について、皮膚炎症状態の経過観察、血中IgE濃度測定、およびHE組織染色標本観察を行い評価した。 This for therapeutic effect of nanoparticles water for dermatitis, observation of skin inflammatory conditions, blood IgE concentrations measured, and were conducted evaluating the HE staining specimens observed.

[方法] [Method]
BALB/cマウス(雌、8週齢)6匹の尾から採血した後、背部をシェーバーとクリームにより剃毛および除毛した。 BALB / c mice was bled (females, 8 weeks old) in six tail was shaved and depilated with shaver and cream back. 水でクリームをふき取り皮膚を乾燥した後、スコッチテープで8回ストリッピングし写真撮影をした(図8、day0)。 After drying the skin wipe the cream with water and eight times stripped and photographed by Scotch tape (Fig. 8, day0).

6匹のマウスはナノ粒子水噴霧群(3匹)と水噴霧群(3匹)の2群に分けて実験を行った。 6 mice were subjected to experiments in two groups of nanoparticles water spray group (3 mice) and water spray group (3 mice). 1日目に噴霧処理(ナノ粒子水噴霧は、マウス1匹の背中8〜10cm 2に対して総液量0.3〜0.4mL、ナノ粒子量として1.8〜2.4μgを噴霧)をした後、2日目以降は20日目まで1日おきに噴霧処理を行なった。 Sprayed (nanoparticle water spray, total volume relative to one mouse back 8~10cm 2 0.3~0.4mL, spraying 1.8~2.4μg as amount nanoparticles) on the first day after a 2 day since eye was subjected to spray treatment every other day until day 20. 22日目と23日目にDNFB処理(マウス背部頭側に0.5%DNFBのオリーブ油−アセトン溶液(油:アセトン=1:4)を20μL塗布)を行なった。 Day 22 and Day 23 to DNFB treatment (olive oil 0.5% DNFB to the mouse dorsal cranial - acetone solution (oil: acetone = 1: 4) to 20μL coating) was performed.

写真撮影は0、3、7、11、13、15、22、23、24日目に行ない、上記表2に示した基準で皮膚炎をスコア化した。 Photography 0, 3, 7, 11, 13, 15, 22, 23, carried on day 24 was scored dermatitis criteria shown in Table 2. 背部頭側と尾側を分けてスコア化し、その合計値によって評価した。 Scored by dividing the back head side and the tail side, it was evaluated by the total value.

採血は、テープストリッピングする前(図7、採血1)、テープストリッピング誘導後22日目(図7、採血2)、DNFB塗布で再誘導開始後2日目(図7、採血3)に行ない、その血清分画のIgE量をサンドイッチELISAにより測定した。 Blood collection, before tape stripping (Figure 7, blood collection 1) performs the 22 days after the induction tape stripping (Figure 7, blood 2), 2 days after re-initiation of induction with DNFB application (Figure 7, blood 3), the amount of IgE in the serum fraction was measured by sandwich ELISA.

24日目の実験終了時、マウスの背部頭側及び尾側の皮膚組織を採取した。 At the end of the 24 day experiment, they were taken back head side and the tail side of the skin tissue of a mouse. 皮膚組織の一部は、HE組織染色評価に用いた。 Part of the skin tissue was used to HE staining evaluation. また残りの一部は、mRNAを抽出し、定量的RT-PCRにより各種サイトカイン発現量(IL-1α、TNF-α、IL-6、IL-17A、IL-4、IFN-γ)を調べた。 The portion of the remaining extracts mRNA, were investigated various cytokines expression level by quantitative RT-PCR (IL-1α, TNF-α, IL-6, IL-17A, IL-4, IFN-γ) . 発現量は、HPRT遺伝子に対してノーマライズし、相対発現量で評価した。 Expression levels, normalized to HPRT gene was evaluated in relative expression level. 表5に各マウスサイトカインに対するプライマー配列を示す。 The primer sequences for each mouse cytokines in Table 5.

[結果] [result]
1. 皮膚炎症状の判定結果 テープストリッピング後、すべてのマウス背部に多数の糜爛を伴う紅斑を認めた(図8、day0)。 1. After determination result tape stripping of dermatitis symptoms were observed multiple erythema with erosions All mice back (Fig. 8, day 0). テープストリッピングのみにより誘導された皮膚炎は、ナノ粒子水噴霧群では水噴霧群と比べて紅斑の消失が早く、糜爛も認められなかった(図8、day3)。 Tape stripping only by induced dermatitis, a nanoparticle water spray group early disappearance of erythema as compared to the water spray group, erosion was not observed (FIG. 8, day3). 両群の皮膚に明瞭な浮腫は認められなかった。 Clear edema in both groups of the skin was observed. 一週間目以降はナノ粒子水噴霧群、水噴霧群ともに(番号8のマウス以外は)も炎症症状はほぼ同程度に回復した(図8、day7〜day15)。 Week onward nanoparticle water spray group, both water spray groups (except mice No. 8) inflammatory condition was restored to almost the same extent (Figure 8, Day7~day15). 経過日数に対する皮膚炎スコアの変化を図9に示す。 The change in dermatitis score for the number of days elapsed is shown in FIG. ナノ粒子水噴霧群の方が水噴霧群のマウスと比べて、より早期から炎症程度が改善されることがスコアにおいて認められた。 Towards the nanoparticle water spray group as compared to the mice of water spray group, the order of inflammation is showed improvement in score from earlier.

DNFB塗布により再刺激した場合に誘導される皮膚炎の程度はナノ粒子水噴霧群の方が水噴霧群よりも軽度であり、予防効果が示唆された。 The extent of dermatitis induced when restimulated by DNFB application were mild than it is water spray groups nanoparticle water spray group, preventive effect was suggested. 特に、DNFB塗布前のシェーバーおよび除毛クリームによる剃毛による皮膚のダメージは、皮膚病変スコア(図9)に示したように、ナノ粒子水噴霧群の方が低かった。 In particular, the damage of the skin by shaving by shaver and hair removing cream before DNFB application, as shown in skin lesion scores (Figure 9), was lower nanoparticle water spray group.

2. 血中IgE濃度 実験開始時(0日目)、DNFBを塗布し皮膚炎を再誘導開始時(22日目)、および実験終了時(24日目)に採血した血中のIgE濃度を測定した結果を図10に示す。 2. Blood IgE levels start of experiment (Day 0), redirecting start the coated dermatitis DNFB (22 days), and the IgE concentration in the blood bled at the end of the experiment (24 days) the measurement results shown in FIG. 10. ナノ粒子水噴霧群と水噴霧群との間で有意な差は認められなかった。 Significant difference between the nanoparticle water spray unit and the water spray group was observed.

3. HE皮膚病理組織像 炎症再誘導後の皮膚組織のHE染色像を図11に示す。 3. Figure 11 shows the HE staining images of HE skin histopathological inflammatory redirection after skin tissue. DNFB塗布した背部頭側の表皮肥厚および真皮の炎症は、ナノ粒子水噴霧群では水噴霧群と比較して軽度であった。 Epidermal thickening and inflammation of the dermis of DNFB coated back head side, the nanoparticle water spray groups were mild as compared with the water spray group. DNFB非塗布の背部尾側においても、表皮肥厚はナノ粒子水噴霧群では著明に抑制され、炎症細胞浸潤も認めなかった。 Also in the back caudal DNFB uncoated, acanthosis is suppressed markedly in the nanoparticle water spray group was also observed inflammatory cell infiltration.

4. サイトカイン発現量 背中の皮膚炎誘導部を背部頭側(DNFB塗布あり)及び尾側(DNFB塗布なし)に分けて各種サイトカイン発現量を調べた結果を図12に示す。 4. cytokine expression amount back dermatitis induction unit dorsal cranial (DNFB there coating) and FIG. 12 shows divided into caudal (DNFB no coating) results of examining the various cytokines expression level. DNFB塗布により再刺激した場合、IL-1α, TNF-α, IL-6などのバリア機能破壊と関連したサイトカインは、ナノ粒子水噴霧の有無を問わず、DNFB塗布された背部頭側およびDNFB非塗部の尾側共に発現が認められた。 When re-stimulated by DNFB application, IL-1α, TNF-α, a cytokine associated with barrier function disruption, such as IL-6, with or without nanoparticles water spray, DNFB coated back head side and DNFB non expression caudal both the coating portion was observed. DNFB塗布により再刺激した場合、T細胞の産生するサイトカインであるIL-17A, IL-4, IFN-γは、ナノ粒子水噴霧の有無を問わず、頭側、尾側皮膚ともに発現が低かった。 When re-stimulated by DNFB application, cytokine and is IL-17A produced in T cells, the IL-4, IFN-γ, or without nanoparticles water spray, cranial, expression was low in both caudal skin .

[結論] [Conclusion]
NC/NgaSlcマウスの場合と同様に、BALB/cマウスにおいても、マクロ的な評価ばかりでなく、ミクロ的な評価でもナノ粒子水噴霧群の方が蒸留水噴霧群よりも治療の効果は優れていると結論付けられる。 As with the NC / NgaSlc mice, in BALB / c mice, macroscopic evaluation as well, the effect of treatment than it is distilled water spray group nanoparticle water spray unit in microscopic evaluation excellent it is concluded that there. さらに、ナノ粒子水噴霧群は蒸留水噴霧群と比較して表皮肥厚、真皮炎症は軽度であり、さらに、再度のDNFB塗布による皮膚炎誘導後においても病変は軽度であることから、ナノ粒子水噴霧が繰り返しの炎症誘導に対してこれを制御し皮膚を保護する役割を果たすと考えられる。 Furthermore, the nanoparticle water spray group as compared to distilled water spray group acanthosis, dermal inflammation were mild, further, since the lesions after induction dermatitis DNFB applied again mild, nanoparticle water controls hand spray repeated inflammation induced thought to play a role of protecting the skin.

実験終了時における血中のIgE量は実験開始時や再度の炎症誘導前の血中IgE量に比べて有意に上昇したが、NC/NgaSlcマウスの場合と異なり、BALB/cマウスにおいてはナノ粒子水噴霧群と水噴霧群との間には有意な差がみられなかった。 Although IgE level in blood at the end of the experiment were significantly elevated compared to the blood IgE level of proinflammatory induction experiments started or again unlike the NC / NgaSlc mice nanoparticles in BALB / c mice It was not a significant difference between the water spray unit and the water spray group.

4. 4. マウス皮膚炎モデルにおけるナノ粒子の治療及び予防効果の検討3 Study of therapeutic and prophylactic effects of nanoparticles in mouse dermatitis model 3
テープストリッピングやDNFB塗布による皮膚炎誘導後の表皮肥厚軽減および皮膚炎を再誘導した場合の炎症制御にナノ粒子水噴霧が有効であることが、先の皮膚炎の予防効果をみる実験で示された。 It nanoparticles water sprayed inflammation control in the case of re-induce epidermal thickening relief and dermatitis after induction dermatitis tape stripping or DNFB application is valid, indicated by experiments to see preventive effect of previous dermatitis It was. この効果が、すでに皮膚炎が起こっているマウスに対しても見られるかどうか、また、それが皮膚バリア機能に関係するかどうかを明らかにする目的で、MHC遺伝子型が知られている純系のBALB/cマウスを用いて検証した。 This effect is already whether also seen for mice occurred dermatitis, also, in order to clarify whether it is related to the skin barrier function, pure line of MHC genotypes are known It was verified by using a BALB / c mouse.

BALB/cマウスにテープストリッピングとDNFB塗布で誘導した皮膚炎に対する治療効果とDNFB塗布による再誘導に対する予防効果を検討するため以下の項目を調べた。 It was examined the following items for the preventive effect on BALB / c mice to re induction by therapeutic and DNFB application to the skin inflammation induced with tape stripping and DNFB application.
(1) 皮膚炎の程度の記録とスコア化 (1) Recording and scoring of degree of dermatitis
(2) DNFB塗布による皮膚炎再誘導後の血中IgE量測定 (2) DNFB blood IgE level measured after re-induction dermatitis coating
(3) DNFB塗布による皮膚炎再誘導後の皮膚HE染色組織観察 (3) DNFB skin HE stained tissue observed after re-induction dermatitis coating
(4) DNFB塗布による皮膚炎再誘導後の皮膚炎関連炎症性サイトカイン発現量測定 (4) DNFB dermatitis associated inflammatory cytokine expression amount measurement after redirecting dermatitis coating

[方法] [Method]
図13に示すスケジュールでBALB/cマウス(雌、8週齢)を処置した。 We were treated BALB / c mice (females, 8 weeks old) in the schedule shown in FIG. 13. まず、マウスの背部をシェーバーとクリームにより剃毛および除毛し、8回のテープストリッピングを行い、皮膚のバリア破壊を行った。 First, the back of the mouse was shaved and shaved by the shaver and cream, for 8 times of tape stripping, was barrier disruption of the skin. 先にハプテン誘発性皮膚炎を誘発し、ナノ粒子水あるいは水噴霧による治療効果を検討する実験では、テープストリッピングの後、マウス背部頭側へDNFBを塗布(1日目及び2日目)して皮膚炎を誘導した。 Previously induces hapten-induced dermatitis, experiments to study the therapeutic effects of nanoparticles water or water spray, after tape stripping, applying DNFB Mice dorsal cranial (day 1 and day 2) to It was induced dermatitis. ナノ粒子水又は蒸留水の噴霧は、1日目及び2日目のDNFB塗布後と、それ以降は20日目まで1日おきに実施した。 Spray nanoparticle water or distilled water, and 1 day and 2 days of DNFB after coating, since it was carried out every other day until 20 days. ナノ粒子水あるいは水噴霧の皮膚炎に対する予防効果を検討する目的で、21日目に再度除毛処理をし、22日目と23日目にマウス背部尾側に0.5%DNFBのオリーブ油−アセトン溶液(油:アセトン=1:4)を20μL塗布することで皮膚炎の誘導を行なった。 To investigate the preventive effect on the nanoparticle water or water spray dermatitis, again the hair removal process on day 21, day 22 and day 23 to 0.5% DNFB olive oil mice dorsal caudal - acetone solution (oil: acetone = 1: 4) were subjected to induction of dermatitis by 20μL coating.

写真撮影は0、3、7、11、13、15、22、23、24日目に行ない、皮膚炎症に対する治療効果を観察し、上記表2に示した基準で皮膚炎の程度をスコア化した。 Photography performed in 0, 3, 7, 11, 13, 15, 22, 23, 24 days, to observe the therapeutic effects on skin inflammation were scored the degree of dermatitis in the criteria shown in Table 2 . 背部頭側(治療モデル)と尾側(予防モデル)とに分けてスコア化し、評価した。 Back head side is divided into the (treatment model) and caudal (prevention model) were scored, it was evaluated.

血液サンプルの採取は0日目(採血1)、22日目(採血2)及び24日目(採血3)に行ない、血清分画のIgE量をサンドイッチELISAにより測定した。 Blood samples taken day 0 (blood 1) performs day 22 (blood 2) and day 24 (blood collecting 3), the amount of IgE in the serum fraction was measured by sandwich ELISA.

24日目の実験終了時、マウスの背部頭側(治療モデル)及び尾側(予防モデル)の皮膚組織を採取し、HE組織染色観察及びサイトカイン発現量測定を行なった。 At the end of the 24 day experiment, the back head side of the mouse skin tissue (treatment model) and caudal (prevention model) were collected and subjected to HE staining observed and cytokine expression level measurement.

[結果] [result]
1. 皮膚炎症状の判定結果 マウス背部の写真を図14に、炎症状態のスコア評価結果を図15に示す。 1. Interested determination result mouse dorsal dermatitis symptoms are shown in FIGS score evaluation results of the inflammatory condition. テープストリッピングとDNFB塗布により誘導した皮膚炎に対する治療効果は、ナノ粒子水噴霧は水噴霧よりも優れていた。 Therapeutic effect for dermatitis induced by tape stripping and DNFB application, the nanoparticles water spray was superior water spray. DNFB塗布により再刺激した場合に誘導される皮膚炎の程度はナノ粒子水噴霧群の方が水噴霧群よりも低く、予防効果に優れていた。 The extent of dermatitis induced when restimulated by DNFB coating towards the nanoparticle water spray unit is lower than the water spray group was excellent in preventive effect. 特に、DNFB塗布前にシェーバーおよび除毛クリームによる剃毛を行なった際の皮膚のダメージは、皮膚炎スコア(図15)に示したように、ナノ粒子水噴霧群の方が低かった。 In particular, the damage of the skin at the time of performing shaving by shaver and hair removing cream before DNFB application, as shown in dermatitis scores (FIG. 15), was lower nanoparticle water spray group.

2. 血中IgE濃度 実験開始時(0日目)、背中後半部へのDNFB塗布による炎症再誘導開始時(22日目)、および実験終了時(24日目)に採血した血中のIgE濃度を測定した結果を図16に示す。 2. Blood IgE levels start of experiment (Day 0), during inflammation redirected initiation by DNFB application to the back half portion (22 days), and IgE in blood collected in the experiment at the end (day 24) the result of measuring the concentration shown in FIG. 16. DNFB塗布により再刺激した場合の血中IgE濃度程度は、ナノ粒子水噴霧群の方が水噴霧群よりも低い傾向が認められた。 About blood IgE concentration when restimulated by DNFB application, the direction of nanoparticle water spray group was observed is less tendency than water spray group.

3. HE組織染色像 炎症誘導後の皮膚病理組織のHE染色像を図17に示す。 3. HE tissue stained HE-stained image of the skin histopathology after inflammation induction are shown in Figure 17. 皮膚炎の予防モデルとして、先にナノ粒子水又は水の噴霧を行い、実験終了前に皮膚炎の誘導を行なった背部尾側の表皮肥厚は、ナノ粒子噴霧群の方が水噴霧群よりも軽度であった。 As a prophylactic model of dermatitis, previously subjected to spraying of nanoparticles or water, acanthosis back caudal was subjected to induction of dermatitis before the end of the experiment, than it is water spray group of nanoparticles spray group It was mild. 皮膚炎の治療モデルとして、先にDNFB塗布を行い、追ってナノ粒子水又は水の噴霧を続けた背部頭側の皮膚についても、表皮肥厚はナノ粒子噴霧群の方が水噴霧群よりも軽度であった。 As a treatment model of dermatitis, previously subjected to DNFB application, Otte regard to the dorsal skin cranial was continued spraying of nanoparticles or water, acanthosis is milder than it is water spray group of nanoparticles spray group there were.

4. サイトカイン発現量 背部皮膚を頭側(先にDNFB塗布、続いてナノ粒子水又は水を噴霧する治療モデル)及び尾側(先にナノ粒子水又は水を噴霧、最後にDNFB塗布をする予防モデル)に分けて各種サイトカイン発現量を調べた結果を図18に示す。 4. Cytokine expression level back skin cranial (previously DNFB application, followed by spraying nanoparticles or water treatment model) and caudal (spraying previously nanoparticles or water, preventing that the last DNFB application the result of examining various cytokine expression amount divided into model) shown in FIG. 18.

IL-1α, TNF-α, IL-6などのバリア機能破壊と関連したサイトカインは、ナノ粒子噴霧の有無を問わず、皮膚炎の予防モデルとして、実験終了前にDNFBを塗布して誘導した背部尾側部、および先に存在する皮膚炎に対する治療モデルとして最初にDNFB塗布を行い、実験終了直前にはDNFB塗布をしていない背部頭側部のいずれにおいても発現が認められた。 Back IL-1α, TNF-α, a cytokine associated with barrier function disruption, such as IL-6 is that with or without nanoparticles spray, as a prophylactic model of dermatitis was induced by applying DNFB before the end of the experiment is performed first DNFB application as a therapeutic model for the tail side, and dermatitis pre- existing, expressed in any of the back head side portions that are not the DNFB application were observed in the experiment just before the end. さらに、皮膚採取前にDNFB塗布をした背部尾側において、発現が高い傾向が認められた。 Further, the back caudal where the DNFB applied before skin harvesting, the expression high tendency was observed.

皮膚炎の予防モデルとして、最初にナノ粒子水又は水の噴霧を繰り返し、実験終了前にDNFBを塗布して皮膚炎を惹起した場合、T細胞の産生するサイトカインIL-17A, IL-4, IFN-γは、ナノ粒子噴霧の有無を問わず、DNFBを実験終了前に塗布した背部尾側は、実験終了前にはDNFB塗布をしていない頭側に比べて発現が上昇した。 As a prophylactic model of dermatitis, first repeated spraying of nanoparticles or water, if elicited dermatitis by applying DNFB before the end of the experiment, the cytokine IL-17A produced in T cells, IL-4, IFN -γ is, regardless of the presence or absence of nano-particles spraying, the is back tail side was applied before the end of the experiment DNFB, expression was increased in comparison with the head side before the end of the experiment is not the DNFB application. 加えて、IFN-γの発現は、ナノ粒子水噴霧群の方が水噴霧群の方と比べて発現量が上昇する傾向が認められた。 In addition, the expression of IFN-gamma is a tendency that towards the nanoparticle water spray group is increased expression level compared to the direction of group water spray was observed.

[結論] [Conclusion]
NC/Ngaマウスの場合と同様にBALB/cにおいてもナノ粒子水の有する殺菌作用はテープストリッピング+DNFB塗布により誘導した皮膚炎に対する治療効果とDNFB塗布による皮膚炎誘導に対する予防効果があることが示された。 Bactericidal action with the nanoparticle water even when similarly to BALB / c of NC / Nga mice has been shown to have a protective effect against dermatitis induced by therapeutic and DNFB application to the dermatitis induced by tape stripping + DNFB application It was.

NC/Ngaマウスの場合と同様にBALB/cにおいてもその効果は殺菌作用によるバリア機能回復の促進とそれに関連する炎症反応の制御に基づくことを示唆する結果が得られた。 NC / For Nga mice that effect in the same manner as BALB / c results suggest that under the control of the inflammatory response and associated promotion of barrier function recovery by bactericidal action is obtained.

5. 5. マウス皮膚炎モデルにおけるナノ粒子水の治療及び予防効果の検討4 Study of therapeutic and prophylactic effects of nanoparticles water in mouse dermatitis model 4
ナノ粒子水噴霧がバリア機能の保持と炎症性応答制御に関与しているかどうかをさらに詳細に調べるために、12週齢BALB/cマウスに繰り返しテープストリッピングを行い、次の項目について調べた。 To nanoparticle water spray investigate whether further detail involved in holding the inflammatory response control barrier function, repeatedly performs tape stripping 12-week-old BALB / c mice were examined for the following items.
(1) 繰り返しテープストリッピングをする過程の皮膚炎症状態のスコア変化 (1) Score changes in skin inflammatory conditions of the process of the repeated tape stripping
(2) 繰り返しテープストリッピングをする過程の水分蒸散量変化 (2) water loss change in the course of the repeated tape stripping
(3) 繰り返しテープストリッピング後の皮膚HE染色組織観察 (3) skin HE stained tissue observed after repeated tape stripping
(4) 繰り返しテープストリッピング後の皮膚炎関連炎症性サイトカイン発現量測定 (4) repeating dermatitis associated inflammatory cytokine expression amount measurement after tape stripping

図19に示すスケジュールで繰り返しテープストリッピングを行った。 It was subjected to a tape stripping repeatedly in the schedule shown in FIG. 19. 12週齢BALB/cマウスの背部を剃毛および除毛した後、水分蒸散量(皮膚バリア機能の指標)を測定しながらその値が30から50g/hm 2の範囲になるようにテープストリッピング(3〜5回)をした。 After the back of 12-week-old BALB / c mice was shaved and depilated, water loss tape stripping as its value is in the range of 30 to 50 g / hm 2 while measuring (indication of skin barrier function) ( 3 to 5 times) were. 水分蒸散量の測定には、Courage + Khazaka electronic GmbH社(独国ケルン)のThe Multi Probe Adapter System(略称MPA5)(ソフトウェア:CK-MPA-multi-probe version 1.5.1.4)に蒸散量測定用のプローブTewameter(登録商標) probe(TM300MP)を接続したものを用いた。 The measurement of the water loss is, Courage + Khazaka electronic GmbH Co. The Multi Probe Adapter System of (Germany, Cologne) (abbreviation MPA5) (Software: CK-MPA-multi-probe version 1.5.1.4) in the transpiration rate measurement for probe Tewameter was used to connect the (R) probe (TM300MP). 測定に際してはプローブを左足付け根部分にずれないように押し当てて行った。 Was carried out by pressing so as not to shift the probe to the left foot base part is for the measurement. 麻酔後に写真撮影と、その写真に基づいた皮膚炎症状態のスコア化、及び皮膚蒸散量の測定を行い、その後にナノ粒子水または蒸留水を噴霧した(各群4匹ずつ)。 And photographs taken after anesthesia, the score of skin inflammation state based on the photography, and perform the measurement of skin transpiration rate, then was sprayed nanoparticles or distilled water (four per group). 皮膚炎症の状態のスコア化は、上述の検討2、3と同様に、背部頭側部と尾側部とに分けてスコア化し、それぞれ、合計値によって評価した。 Scoring the state of skin inflammation, as well as the study 2 and 3 above, were scored separately on a back head side portions and tail side were respectively evaluated by the total value. ナノ粒子水噴霧群の水分蒸散量が10g/hm 2前後の値を示した4日目、8日目および11日目に再び除毛とテープストリッピングを行った。 Day 4 water loss of nanoparticles water spray group showed a value of about 10 g / hm 2, was performed again depilatory and tape stripping to 8 days and 11 days. 14日目に写真撮影と水分蒸散量測定を行い、その後に採血と皮膚組織のサンプリング(凍結切片、固定標本およびRT-PCR用のRNA調製)を行った。 Perform photography and water loss measurements on day 14 were performed followed by sampling of blood and skin tissue (frozen sections, RNA preparation for fixed specimens and RT-PCR).

皮膚炎状態をスコア評価した結果を図20に示す。 The results of the dermatitis condition and scoring are shown in Figure 20. ナノ粒子噴霧群および水噴霧群共に、テープストリッピング毎にスコアは12程度まで上昇し、その翌日には2〜3程度まで低下するという、バリア破壊と組織修飾の繰り返しが観察された。 Nanoparticles spray group and water spray group together, the score for each tape stripping increases to about 12, that decreases to 2-3 about its next day, repeated barrier disruption and tissue modification was observed. 14日目の皮膚炎症状態は、ナノ粒子水噴霧群と水噴霧群との間に大きな差はなかった。 14 days of skin inflammatory conditions, there was no significant difference between the nanoparticle water spray unit and the water spray group.

一方、皮膚の水分蒸散量を測定したところ(結果を図21に示す)、テープストリッピングを繰り返していると、テープストリッピング毎に水噴霧群は60〜70 g/hm 2まで上昇するが、ナノ粒子水噴霧群のほうは最大50 g/hm 2程度までしか上昇しなかった。 Meanwhile, measurement of the amount of water evaporation in the skin (results shown in FIG. 21), when being repeatedly tape stripping, water spray group for each tape stripping rises to 60 to 70 g / hm 2, nanoparticles more of the water spray group did not increase only up to a maximum of about 50 g / hm 2. テープストリッピング後、翌日には、ナノ粒子水噴霧群は10 g/hm 2程度まで蒸散量が低下しているのに対し、テープストリッピングを繰り返していると、水噴霧群では、次第に蒸散量の回復が不十分となり、その値が徐々に上昇し、14日目には20 g/hm 2以上を示した。 After tape stripping, the next day, whereas the nanoparticles water spray group transpiration amount up to about 10 g / hm 2 is lowered and is repeated tape stripping, a water spray unit, gradually recovering transpiration is insufficient, increased its value gradually, the day 14 showed a 20 g / hm 2 or more. このことは、繰り返しテープストリッピング後、皮膚バリア破壊後の修復機能は水噴霧群のほうがナノ粒子水噴霧群よりも劣っていることを示している。 This is after repeated tape stripping, repair function after skin barrier destruction indicates that more of the water spray groups are inferior nanoparticles water spray group.

またこのことは、図22に示すように、14日目に採取した皮膚のHE染色標本において、表皮の肥厚化程度がナノ粒子水噴霧群に比べて水噴霧群のほうが大きいことからも支持される。 Also this is, as shown in FIG. 22, in the HE stained specimen of skin taken on day 14, approximately thickening of the epidermis is also supported by the fact that the larger water spray group as compared to the nanoparticle water spray group that.

さらに、繰り返しテープストリッピング後のIL-1α, TNF-α, IL-6などの表皮バリア機能破壊と関連したサイトカインの発現量をRT-PCR法で調べてみると(結果を図23に示す)、ナノ粒子水噴霧の有無を問わず、背部尾側および頭側のいずれにおいても同程度の発現が認められた。 Furthermore, IL-l [alpha] after repeated tape stripping, TNF-alpha, the expression level of a cytokine associated with epidermal barrier function disruption, such as IL-6 and Examining by RT-PCR (results shown in FIG. 23), with or without nanoparticles water spray, the expression degree even same in either dorsal caudal and cranial was observed. 一方、T細胞の産生するサイトカイン発現量はIL-4, IFN-γはその発現量は低く両者の群の間には大きな差がみられなかったが、表皮の破壊と関連性の高いIL-17Aは水噴霧群のほうがナノ粒子水噴霧群に比べて発現量が高く、皮膚バリア機能は水噴霧群のほうがナノ粒子水噴霧群よりも障害されていることを示唆していた。 On the other hand, cytokine expression amount of production of T cells but did not larger differed between the IL-4, IFN-γ is the group of the expression level is low both relevant and destruction of the epidermis IL- 17A has a higher expression level than the nanoparticles water spray groups towards the water spray unit, the skin barrier function was suggested that more of the water spray unit is impaired than nanoparticle water spray group.

ナノ粒子水の有する殺菌・保水作用は、繰り返しテープストリッピングによる皮膚損傷に対する治療と、該処理により誘導されうる皮膚炎症に対する予防に効果があることが示された。 Sterilization water holding action having the nanoparticles water, a treatment for skin damage caused by repeated tape stripping, the effectiveness of the protection against skin inflammation which can be induced by the treatment was shown.

6. 6. マウス皮膚炎モデルにおけるナノ粒子水の治療及び予防効果の検討5(ヘアレスマウスを用いた、ハプテン誘導性慢性皮膚炎モデルでの検討) Study of therapeutic and prophylactic effects of nanoparticles water in mouse dermatitis model 5 (using hairless mice, study of a hapten-induced chronic dermatitis model)
剃毛、除毛に伴う物理的な皮膚バリア機能破壊の影響を避けるため、ヘアレスマウス(Hos:HR-1、日本SLC)を用い、また、アトピー性皮膚炎をはじめとする人の慢性皮膚炎に近い動物モデルを使ってナノ粒子水の抗菌、保水効果の検討を行うため、ハプテンを繰り返し塗布するマウス慢性皮膚炎モデルを作製し(Nakajima, S. et al., J. Invest. Dermatol, 134, 2122-2130, 2014らの方法をDNFBの抗原系に改変)、下記の8項目について調べた。 Shaving, in order to avoid the influence of physical skin barrier function disruption caused by depilation, hairless mice (Hos: HR-1, Japan SLC) used, also, chronic dermatitis of human, including atopic dermatitis to perform antimicrobial nanoparticles water using animal models, the study of the water retention effect close to, to produce a mouse chronic skin inflammation model repeatedly applying hapten (Nakajima, S. et al., J. Invest. Dermatol, 134 , 2122-2130, modify the 2014's method to the antigen system of DNFB), were examined for 8 the following items. 背部皮膚にDNFBを塗布する実験群では、四肢による掻把の影響が少ないと思われる肩甲骨の位置の皮膚に塗布した。 In the experimental group of applying DNFB to the dorsal skin was applied to the skin of the position of the scapula which seem to be less affected 掻把 by limb.

<評価項目> <Evaluation item>
(1) 皮膚炎症状態のスコア化:肉眼的な皮膚炎症程度の評価 (1) Score of skin inflammation conditions: Evaluation of about macroscopic skin inflammation
(2) 両耳介の厚さ測定:耳介の炎症反応程度の評価 (2) The thickness of Ryomimikai Measurements: Evaluation of approximately inflammatory response of the auricle
(3) 皮膚の水分蒸散量と保水度の測定:上背部皮膚表皮のバリア機能の破壊・回復程度の評価 (3) Measurement of water loss and water retention value of the skin: upper back Evaluation of about destruction and restoration of the skin epidermal barrier function
(4) HE組織染色標本観察:顕微鏡観察による皮膚炎症程度の評価 (4) HE staining specimen observation: Rating about skin inflammation by microscopic observation
(5) 皮膚内に発現するサイトカインの種類と量の測定:背部頭側の皮膚と右耳介に発現するサイトカインの種類と発現量の評価 (5) Measurement of the type and amount of cytokines expressed in the skin: Evaluation of the type of cytokine that is expressed in skin and the right auricle back cranial expression level
(6) 血清中の抗Hapten抗体量の測定:血清中の抗DNP IgG抗体量の評価 (6) Measurement of anti-Hapten antibody levels in the serum: evaluation of anti-DNP IgG antibody levels in the serum
(7) 頭側背部皮膚の表在細菌数の測定:頭側背部皮膚の表在細菌数の評価 (7) head side back superficial bacterial count of the measurement of skin: Table evaluation of standing bacterial count of cranial dorsal skin
(8) 血清中の黄色ブドウ球菌に対するIgG抗体量の測定:ヘアレスマウスの背部皮膚から分離した黄色ブドウ球菌に対する血清IgG抗体量の評価 (8) Measurement of IgG antibodies amount against Staphylococcus aureus in serum: Evaluation of serum IgG antibody levels against S. aureus isolated from the dorsal skin of hairless mice

<マウス慢性皮膚炎モデルの作製方法> <A method for manufacturing a mouse chronic dermatitis model>
ヘアレスマウス(Hos:HR-1)雌を一群5匹として、表6の通りに4つの実験群を作った。 Hairless mouse: a (Hos HR-1) females as five group, made four experimental groups as shown in Table 6. 処置スケジュールを図24に示す。 The treatment schedule is shown in Figure 24.

皮膚の写真撮影、常在細菌数、耳の厚さ、皮膚水分蒸散量、皮膚保水度、および皮膚炎スコアの測定は、マウスを麻酔してから行ない、これらの測定後にDNFB塗布を行なった。 Skin photography, indigenous bacteria number, ear thickness, skin water loss, skin water retention value, and measurement of dermatitis score performed after mice were anesthetized and were subjected to DNFB applied after these measurements. この間、DNFB塗布の翌日から1日おきにナノ粒子水の噴霧を行った(図24)。 During this period, it was sprayed nanoparticles water every other day from the day after the DNFB application (Figure 24). day33に0.3%DNFBを塗布し、その1日後(day34)に両耳と背部の皮膚の採取と採血をおこなった。 day33 a 0.3% DNFB was applied to, was carried out the collection and blood collection of the skin of both ears and back to the one day after (day34). 右耳介と頭側背部皮膚からはHE染色標本を作成し、また、RT-PCRによる各種サイトカインの測定を行った。 Create a HE-stained specimens from the right ear and head side dorsal skin, and the determination of various cytokines by RT-PCR. 血液からは血清中の抗DNP抗体及び抗S.aureus抗体の凝集価の測定を行った。 From the blood was measured agglutination titer of anti-DNP antibody and anti-S.aureus antibodies in serum.

(1) 皮膚炎症のスコア化 皮膚炎スコアは下記表7のように定義し、皮膚炎の程度をスコア化した。 (1) scored dermatitis scores of skin inflammation is defined as the following Table 7 were scored the degree of dermatitis. スコアは、マウス1匹について、紅斑、鱗屑、糜爛、隆起、痂皮、左耳介の肥厚・変形、右耳介の肥厚・変形の7項目について0〜3の4段階のスコアを付け、合計した。 Score, with about 1 mouse, erythema, scaling, erosion, uplift, crusting, thickening and deformation of the left auricle, the score of the four stages of 0 to 3 for the seven items of thickening and deformation of the right auricle, total did. 1匹当たりの最大スコアは21ポイントである。 Maximum score per animal is 21 points. 各実験群のマウスについて、day5, day12, day19, day26, day33に皮膚炎スコアを測定した。 For mice in each experimental group, day5, day12, day19, day26, was measured dermatitis score Day33.

DNFB塗布後の頭側背部及び両耳介の皮膚炎スコアの変化を追った結果を図25に示す。 The results followed the change of the head side back and dermatitis score Ryomimikai after DNFB application shown in Figure 25. またday33における各実験群の頭側背部皮膚および両耳介の画像を図26に示す。 Also it shows images of the cranial dorsal skin and Ryomimikai of each experimental group in day33 Figure 26. DNFB塗布とともにナノ粒子水噴霧したA群では、ナノ粒子水噴霧をしなかったC群(陽性対照群)や水噴霧B群よりも明らかに皮膚炎スコアが低かった(図25)。 In the group A nanoparticle water sprayed with DNFB application, clearly dermatitis score is lower than the C group was not nanoparticles water spray (positive control) or water spray Group B (Figure 25). D群はDNFB塗布、噴霧いずれも施行しなかった陰性対照を示す。 Group D represents a negative control did not enforce any DNFB application, spraying. 図26に示す通り、B群とC群では皮膚炎、耳介変形が明らかに認められた一方、ナノ粒子水噴霧群(A群)は、陰性対照(D群)同等、著明に症状が抑制された。 As shown in FIG. 26, B group and dermatitis in group C, while the auricle deformation is clearly observed, nanoparticles water spray group (A group), negative control (D group) equivalent, symptoms markedly It was suppressed.

(2) 両耳介の厚さ測定 各実験群のマウスについて、day5, day12, day19, day26, day33に左右耳介の厚さをそれぞれ厚みゲージで測定した。 (2) for measuring the thickness each experimental group of mice Ryomimikai, day5, day12, day19, day26, the thickness of the right and left auricles were measured with respectively the thickness gauge Day33. 左右耳介の測定値の平均値をその個体の測定値としてグラフ化した。 Graph of the mean value of the measured values ​​of the left and right auricles as a measure of the individual.

結果を図27に示す。 The results are shown in Figure 27. 水噴霧群(B群)及び陽性対照群(C群)では、DNFB塗布後のday12頃より耳介が肥厚し始めた一方、ナノ粒子水噴霧群(A群)は肥厚することなくday33には抑制効果が明らかであり、陰性対照群(D群)とほとんど変わらない結果を示した。 Water spray group (B group) and positive control group in (C group), while the auricle from around day12 after DNFB application began thickening, the day33 without nanoparticles water spray group (A group) is thickened inhibitory effect is evident, showing the results of a negative control group and (D group) hardly changes.

(3) 皮膚の水分蒸散量と保水度測定 各実験群のマウスについて、day5, day12, day19, day26, day33に上背部皮膚の水分蒸散量及び保水度を測定した。 (3) mice water loss and water retention value measured each experimental group of skin, day5, day12, day19, day26, day33 was measured water loss and water retention value of the upper back skin. 測定にはCourage + Khazaka electronic GmbH社(独国ケルン)のThe Multi Probe Adapter System(略称MPA5)(ソフトウェア:CK-MPA-multi-probe version 1.5.1.4)を使用した。 To measure The Multi Probe Adapter System of Courage + Khazaka electronic GmbH company (Germany, Cologne) (abbreviation MPA5): it was used (software CK-MPA-multi-probe version 1.5.1.4). 蒸散量の測定では、MPA5に蒸散量測定用のプローブTewameter(登録商標) probe(TM300MP)を接続し、プローブを頭側背部皮膚に押し付けて測定を行なった。 In the measurement of transpiration rate, transpiration measuring probe Tewameter (R) probe (TM300MP) connected to MPA5, was measured against the probe head side back skin. 保水度の測定では、MPA5に保水度測定用プローブCorneometer (CM825MP)を接続し、頭側背部皮膚3か所にプローブを押し付けて保水度を測定し、3か所の測定値の平均値をその個体の測定値とした。 In the measurement of the water retention value, connect the water retention value measuring probe Corneometer (CM825MP) in MPA5, a water retention value measured by pressing a probe in three places cranial dorsal skin that the average value of three points of measurement It was a measure of the individual.

皮膚水分蒸散量の測定結果を図28に示す。 The measurement results of skin water loss shown in FIG. 28. B群及びC群では、DNFB塗布後day12には蒸散量が明らかに上昇し、その後も高い蒸散量を示した。 The B group and C group, rose clearly transpiration amount is DNFB application after day 12, showed after that high transpiration amount. ナノ粒子水噴霧群(A群)では、一時的にわずかな蒸散量の上昇が認められたものの低い値を維持していた。 Nanoparticles water spray unit in (A group), and remained at low values ​​of that temporary increase in small transpiration was observed. day33には、A群はB群およびC群に比べ有意に低値を示した。 The day33, A group was significantly lower than in groups B and C.

保水度の測定結果を図29に示す。 The measurement results of the water retention value shown in FIG. 29. B群及びC群ではDNFB塗布後、経時的に保水度が低下した一方、ナノ粒子水噴霧群(A群)では保水度の低下は全く見られず、無処置群(D群)と同様、保水能が維持された。 After DNFB application in the group B and group C, while over time a water retention value is lowered, not at all a decrease in the water retention value nanoparticle water spray group (A group), similar to the untreated group (D group), water retention ability is maintained. day33には、ナノ粒子水噴霧群(A群)はB群、C群に比べて有意差を示した。 The Day33, nanoparticle water spray group (A group) showed a significant difference compared group B, group C.

(4) HE組織染色標本観察 各実験群のマウスより、day34(33日目にDNFB 0.3%の塗布後1日目)に右耳介と頭側背部皮膚を採取し、HE染色を行なった。 (4) from the mouse of HE staining specimens observed each experimental group, were taken right auricle and cranial dorsal skin Day34 (1 day after the 33 day DNFB 0.3% coating), was performed HE staining.

図30A〜Dは、A群〜D群の代表的な耳介および頭側背部皮膚の症状とHE染色像である。 FIG 30A~D is a symptom and HE staining image of a representative pinna and the head side back skin of group A ~D groups. A-1、B-1、C-1、D-1は右耳介皮膚のHE組織染色写真であり、A-2、B-2、C-2、D-2は頭側背部皮膚のHE組織染色写真である。 A-1, B-1, C-1, D-1 is a HE staining photograph of right auricle skin, A-2, B-2, C-2, D-2 is HE rostral back skin it is a tissue staining photo. 黒のバーは100μmを示す。 Black bars represent 100 [mu] m.

水噴霧群(B群)では、肉眼的に炎症が強く、病理組織では耳介の表皮肥厚、および真皮の炎症、線維化も著明であった。 In water spray group (B group), grossly inflammation strong, the histopathological epidermal thickening of auricle, and inflammation of the dermis, fibrosis was also marked. 一方、ナノ粒子水噴霧群(A群)は臨床症状、病理組織ともに明らかに抑制されていた。 On the other hand, the nanoparticles water spray group (A group) clinical symptoms, histopathological were both clearly suppressed. 背部皮膚の病理組織では、差異は明かではないが、ナノ粒子水噴霧群(A群)では毛包周囲(ヘアレスマウスでは嚢胞状構造が形成される)の炎症細胞浸潤が軽度であった。 Histopathological the dorsal skin, but differences are not clear, inflammatory cell infiltration of the nanoparticles water spray group (A group) in the follicle surrounding (cystic structure is formed in the hairless mouse) was mild.

陽性対照群(C群)でもB群同様、強く皮膚炎症が認められ、A群に比べて耳介、背部皮膚の変化が強く認められた。 Positive control group (C group) even group B similarly observed strong skin inflammation, ear, change in dorsal skin was observed strongly in comparison with A group.

(5) 皮膚内に発現するサイトカインの種類と量の測定 各実験群のマウスよりday34に採取した右耳介組織及び上背部皮膚組織におけるサイトカインの発現を定量的RT-PCRにより測定した。 (5) were measured by quantitative RT-PCR expression of cytokines in the right auricle tissue and upper back skin tissue taken cytokine type and amount of measurement day34 from mice of each experimental group expressed in the skin. プライマーは上記表5に記載のものを用いた。 Primers were used according to Table 5. 発現量は、HPRT遺伝子に対してノーマライズし、相対発現量で評価した。 Expression levels, normalized to HPRT gene was evaluated in relative expression level.

結果を図31に示す。 The results are shown in Figure 31. 耳介(図31右)では、B群、C群の炎症性サイトカイン(IL-6,、IFN-γ)の発現がA群やD群よりも上昇し、B群、C群の耳介の炎症程度と関連性を示していた。 In pinna (Figure 31 right), B group, inflammatory cytokines group C (IL-6,, IFN-γ) rises above expression group A and group D, B group, the group C of the auricle It showed the inflammation about the relevance. 背部皮膚(図31左)では、A群以外にD群にもTNF-αやIL-17などのサイトカインの発現が認められた。 In dorsal skin (Fig. 31 left), the expression of cytokines such as TNF-alpha and IL-17 to D groups other than Group A it was observed. このことは、ヘアレスマウスの場合はTh17細胞を介した皮膚恒常性の維持機構の存在を示唆していた。 This is the case of hairless mice have suggested the existence of skin homeostasis mechanism through Th17 cells.

(6) 血清中の抗hapten抗体量の測定 各実験群のマウスよりday34に血液を採取し、血清中の抗DNP抗体量をDNP-BSAを抗原としたELISAにて測定した。 (6) Blood was collected from mice measured each experimental group of anti-hapten antibody levels in serum Day34, the anti-DNP antibody levels in the serum and the DNP-BSA measured by ELISA with an antigen. 5μg/mLのDNP-BSAでコートしたELISAプレートを使用し、マウス血清の希釈系列をサンプルとしてELISAを行なった。 Using an ELISA plate coated of DNP-BSA 5 [mu] g / mL, were performed ELISA dilution series of mouse serum as a sample. 検出にはHRPO結合ヤギ抗マウスIgGを用いた。 Using HRPO-conjugated goat anti-mouse IgG for detection.

結果を図32に示す。 The results are shown in Figure 32. 抗DNP抗体量は、ナノ粒子水噴霧群(A)、水噴霧群(B)、噴霧なし群(C)の3群間ではあまり変わらず、DNPに対する免疫応答(B細胞とTh細胞の反応)は遜色なく起こっていることが確認された。 Anti-DNP antibody levels, the nanoparticle water spray group (A), water spray group (B), does not change so much among the three groups of unsprayed group (C), the immune response to DNP (reaction of B cells and Th cells) it was confirmed that is going without inferiority. このことから、皮膚に会合したナノ粒子の存在によってDNFBの皮膚への反応性が低下するなどの理由により、ハプテン誘導性免疫応答自体が低下した、という可能性は低いことが示唆された。 Therefore, for reasons such as the reactivity of the skin of DNFB by the presence of the nanoparticles associated to skin is reduced, the hapten-induced immune response itself was reduced, it was low it is suggested the possibility that.

(7) 頭側背部皮膚の表在細菌数の測定 各実験群のマウスについて、day5, day12, day19, day26, day33に上背部皮膚の表在細菌数を測定した。 (7) for mouse cranial dorsal superficial bacterial count measured each experimental group of skin, day5, day12, day19, day26, day33 were counted superficial bacterial upper back skin. 頭側背部皮膚に生菌数測定用標準寒天培地(ペタンチェック、栄研化学)を5秒間押し当てた後、37℃フラン器で24時間培養し、4cm 2の区画あたりのコロニー数をカウントした。 Cranial dorsal skin viable cell count measuring a standard agar medium (Petain check, Eiken) was against the press for 5 seconds, incubated for 24 hours at 37 ° C. incubator, the number of colonies was counted per section of 4 cm 2 .

結果を図33に示す。 The results are shown in Figure 33. ナノ粒子水噴霧群(A群)では、水噴霧群(B群)、噴霧なし群(C群)、前処理もDNFB塗布も行わない無処理群(D群)と比べて細菌数の変動が少なく、かつ低い値を示した。 Nanoparticles water spray unit in (A group), water spray group (B group), unsprayed group (C group), the variation number of bacteria as compared pretreatment also DNFB applied neither performed untreated group and (D group) small and showed a low value.

(8) 血清中の黄色ブドウ球菌に対するIgG抗体量の測定 各実験群のマウスより、day34に採血し、血清を分離した。 (8) from the mouse of measuring each experimental group of IgG antibody levels against S. aureus in the serum, blood was collected Day34, and serum was separated. 血清を非動化した後、血清と当量の0.2M 2-MEを加え37℃で1時間加温した。 After the sera were inactivated, was 1 hour warmed at 37 ° C. was added a 0.2 M 2-ME serum and equivalent. この処理により、腸管系で多くが産生されるIgM自然抗体がモノマー化し、凝集価への寄与が乏しくなる。 This process, IgM natural antibodies many intestinal system is produced is monomerized, the contribution to aggregate value becomes poor. その後、この血清を256倍まで倍々希釈し、これらヘアレスマウスの皮膚から分離したS.aureusを用いて作製した不活化S.aureus菌体液と混合して4℃で一晩反応させた。 Thereafter, the serum was bye-bye diluted to 256-fold and reacted overnight at 4 ° C. is mixed with inactivated S.aureus bacteria fluids prepared using S.aureus isolated from the skin of hairless mice. 凝集が起こらなかった最大希釈倍率を凝集価とし、凝集価をグラフ化した。 The maximum dilution magnification aggregation did not occur and aggregation number and graphed aggregation number.

結果を図34に示す。 The results are shown in Figure 34. ナノ粒子水噴霧群(A群)の凝集価は水噴霧群(B群)及び噴霧なし群(C群)よりも有意に低く、ナノ粒子水噴霧による血清中の抗S.aureus IgG抗体の減少が認められた。 Nanoparticles water spray group aggregation number of (A group) water spray group (B group) and unsprayed group (C group) significantly lower than the decrease in anti-S.aureus IgG antibodies in serum by nanoparticles water spray It was observed. このことから、ナノ粒子水噴霧による皮膚バリア機能の速やかな修復の結果、IgG抗体産生を誘導するような皮膚表在細菌の真皮あるいはそれより深部への侵入が抑えられたことが示唆される。 Therefore, rapid restoration of the result of the skin barrier function by nanoparticles water spray, the penetration of the skin superficial bacterial dermis or even from deep as to induce IgG antibody production is suppressed is suggested.

<検討5まとめ> <Examination 5 Summary>
ナノ粒子水を噴霧した群では、皮膚炎症スコア値は水噴霧群・非噴霧群のそれよりも低値であった。 In the group sprayed nanoparticle water, skin inflammation score value was lower than that of water spray group and non-spray unit. 皮膚炎症スコア値は、免疫応答性の指標である両耳介の肥厚化のみならず、皮膚バリア機能の指標である背部皮膚水分蒸散量と保水度にも関連性が認められた。 Skin irritation score value not only thickening of both auricles which is an indicator of immune responsiveness, relevance was observed even back skin water loss and water retention value is an indicator of the skin barrier function.
ナノ粒子水噴霧群の場合は、表皮増殖関連のサイトカインはTh17細胞系とともに発現し、一方、水噴霧群・噴霧なし群の場合は、皮膚ダメージ関連シグナルを介して発現することが示唆された。 For nanoparticles water spray group, cytokine related epidermal growth is expressed with Th17 cell line, on the other hand, in the case of water spray group and the spray without group, to express through the skin damage associated signal was suggested.
ナノ粒子水噴霧群の表在細菌数は他の3群と比べて一定の低値に制御されていた。 Superficial bacterial count of nanoparticles water spray group had been controlled to a constant low value compared with the other three groups. ナノ粒子水噴霧による表在細菌数制御は、皮膚バリア性の向上との相乗効果により、血清中の抗S.aureus IgG抗体の減少をもたらした。 Nanoparticles water spray superficial bacterial count control by the synergistic effect with the improvement of the skin barrier property, resulted in a reduction of the anti-S.aureus IgG antibodies in serum.
以上の結果より、ナノ粒子水噴霧は皮膚バリア機能の向上と表在細菌数制御の関与する免疫応答とを介して皮膚炎症反応を制御することが示唆された。 These results, nanoparticles water spray was suggested to control the skin inflammatory response via the immune response involved in improving the superficial bacterial count control of skin barrier function.

Claims (19)

  1. アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも1種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子を有効成分として含有する、皮膚炎の治療又は予防剤。 Amino acids, amino acid derivatives, and comprises at least one member selected from the group consisting of oligomers and polymers, containing cyanoacrylate polymer particles having an average particle size of less than 1000nm as an active ingredient, dermatitis therapeutic or prophylactic agent .
  2. 前記粒子は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、及びそれらのオリゴマーからなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項1記載の治療又は予防剤。 The particles, amino acids, amino acid derivatives, and at least one selected from the group consisting of oligomers, therapeutic or prophylactic agent according to claim 1.
  3. 前記粒子は、少なくとも1種のアミノ酸を含む、請求項2記載の治療又は予防剤。 The particles comprise at least one amino acid, the therapeutic or prophylactic agent according to claim 2.
  4. 前記アミノ酸誘導体が、クレアチン、オルニチン、サイロキシン、デスモシン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、ホスホセリン、テアニン、カイニン酸、トリコロミン酸、及びサルコシンからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1又は2記載の治療又は予防剤。 Wherein the amino acid derivative is creatine, ornithine, thyroxine, desmosine, hydroxyproline, hydroxylysine, phosphoserine, theanine, kainic acid is at least one selected from the group consisting of Torikoromin acid, and sarcosine, according to claim 1 or 2, wherein therapeutic or prophylactic agents.
  5. 前記アミノ酸が、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、イソロイシン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、シスチン又はシステイン、グルタミン、アスパラギン、プロリン、メチオニン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、カルニチン、γ−アミノレブリン酸、及びγ−アミノ吉草酸からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1ないし4のいずれか1項に記載の治療又は予防剤。 The amino acid, arginine, histidine, lysine, aspartic acid, glutamic acid, alanine, glycine, leucine, valine, isoleucine, serine, threonine, phenylalanine, tryptophan, tyrosine, cystine or cysteine, glutamine, asparagine, proline, methionine, beta-alanine , .gamma.-aminobutyric acid, carnitine, .gamma.-aminolevulinic acid, and is at least one selected from the group consisting of .gamma. aminovaleric acid, therapeutic or prophylactic agent according to any one of claims 1 to 4.
  6. 前記アミノ酸が、グリシン及びアスパラギン酸からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項5記載の治療又は予防剤。 Wherein the amino acid is at least one selected from the group consisting of glycine and aspartic acid, the therapeutic or prophylactic agent according to claim 5, wherein.
  7. 前記粒子は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも1種が共存する条件下において、シアノアクリレートモノマーをアニオン重合させることにより製造された粒子である、請求項1ないし6のいずれか1項に記載の治療又は予防剤。 The particles, amino acids, amino acid derivatives, and under conditions at least one co-exist is selected from the group consisting of oligomers and polymers are particles produced by anionic polymerization of the cyanoacrylate monomer, claim therapeutic or prophylactic agent according to 1 to any one of 6.
  8. 前記粒子は、糖及びポリソルベートからなる群より選択される少なくとも1種をさらに含む、請求項1ないし7のいずれか1項に記載の治療又は予防剤。 The particle further comprises at least one selected from the group consisting of sugars and polysorbate, therapeutic or prophylactic agent according to any one of claims 1 to 7.
  9. 前記粒子は、少なくとも1種の糖をさらに含む、請求項1ないし7のいずれか1項に記載の治療又は予防剤。 It said particles further comprise at least one sugar, therapeutic or prophylactic agent according to any one of claims 1 to 7.
  10. 前記糖が、水酸基を有する単糖類、水酸基を有する二糖類及び水酸基を有する多糖類からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項8又は9記載の治療又は予防剤。 Wherein the sugar is a monosaccharide having a hydroxyl group is at least one selected from the group consisting of polysaccharides having a disaccharide and hydroxyl groups having a hydroxyl group, therapeutic or prophylactic agent according to claim 8 or 9, wherein.
  11. 前記粒子は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも1種と、糖及びポリソルベートからなる群より選択される少なくとも1種とが共存する条件下において、シアノアクリレートモノマーをアニオン重合させることにより製造された粒子である、請求項1ないし10のいずれか1項に記載の治療又は予防剤。 The particles, amino acids, amino acid derivatives, and at least one member selected from the group consisting of oligomers and polymers under conditions where at least one co-exist is selected from the group consisting of sugars and polysorbate, cyanoacrylates is the particles produced by causing monomers to anionic polymerization, therapeutic or prophylactic agent according to any one of claims 1 to 10.
  12. 前記シアノアクリレートがn−ブチルシアノアクリレートである請求項1ないし11のいずれか1項に記載の治療又は予防剤。 Therapeutic or prophylactic agent according to any one of to the cyanoacrylate claims 1 is n- butyl cyanoacrylate 11.
  13. 前記皮膚炎がアトピー性皮膚炎である請求項1ないし12のいずれか1項に記載の治療又は予防剤。 Therapeutic or prophylactic agent according to any one of from the dermatitis claims 1 to atopic dermatitis 12.
  14. 前記皮膚炎が、I型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応が関与する皮膚炎である、請求項1ないし12のいずれか1項に記載の治療又は予防剤。 Wherein dermatitis is a dermatitis involving Type I allergic or type IV allergic reaction, treating or preventing agent according to any one of claims 1 to 12.
  15. アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも1種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子を有効成分として含有する、I型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応の抑制剤。 Amino acids, amino acid derivatives, and comprises at least one member selected from the group consisting of oligomers and polymers, containing cyanoacrylate polymer particles having an average particle size of less than 1000nm as an active ingredient, I-type allergic reaction or IV inhibitors of allergic reactions.
  16. アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも1種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子を有効成分として含有する、I型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応が関与するアレルギー症状の治療又は予防剤。 Amino acids, amino acid derivatives, and comprises at least one member selected from the group consisting of oligomers and polymers, containing cyanoacrylate polymer particles having an average particle size of less than 1000nm as an active ingredient, I-type allergic reaction or IV therapeutic or prophylactic agent for allergic symptoms allergic reaction is involved.
  17. 治療すべき皮膚病変部、又は皮膚炎の発生の予防が望まれる皮膚領域に、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも1種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子の有効量を投与することを含む、皮膚炎の治療又は予防方法。 Skin lesion to be treated, or the skin area prevention of the occurrence of dermatitis is desired, including amino acids, amino acid derivatives, and at least one member selected from the group consisting of oligomers and polymers, the average particle diameter of 1000nm treatment or prevention of which less than a is comprising administering an effective amount of cyanoacrylate polymer particles, dermatitis.
  18. それを必要とする対象に対し、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも1種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子の有効量を投与することを含む、I型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応の抑制方法。 Administered to a subject in need thereof, an amino acid, amino acid derivative, and comprises at least one member selected from the group consisting of oligomers and polymers, an effective amount of cyanoacrylate polymer particles having an average particle size of less than 1000nm comprising, method for inhibiting type I allergic or type IV allergic reactions.
  19. それを必要とする対象に対し、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも1種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子の有効量を投与することを含む、I型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応が関与するアレルギー症状の治療又は予防方法。 Administered to a subject in need thereof, an amino acid, amino acid derivative, and comprises at least one member selected from the group consisting of oligomers and polymers, an effective amount of cyanoacrylate polymer particles having an average particle size of less than 1000nm treatment or prevention of allergy symptoms including, type I allergic reaction or type IV allergic reactions involving that.
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