JPWO2014069551A1 - Sensor chip and measurement system - Google Patents
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Abstract
使い捨てのセンサチップにおいて,流路詰まりの懸念なく,検体の計量を高精度に行う。検体導入口3014から流体接続部3011に向けて検体を吸引し,その後,流体接続部3011から圧力をかけて,導入した規定量の検体を測定部3017を有する流路に送出し,測定を行う。With a disposable sensor chip, the sample is weighed with high accuracy without the risk of clogging the flow path. A sample is aspirated from the sample introduction port 3014 toward the fluid connection unit 3011, and then pressure is applied from the fluid connection unit 3011, and the introduced specified amount of sample is sent to the flow path having the measurement unit 3017 for measurement. .
Description
本発明は,生体物質を測定するための測定装置とそれに組み込まれて使用されるセンサチップとそれを用いた測定装置及び測定方法に関する。 The present invention relates to a measurement device for measuring a biological substance, a sensor chip incorporated in the measurement device, a measurement device using the same, and a measurement method.
臨床検査は,人や動物の健康状態を把握して病気の早期発見を行ったり,患者の病気の進行状況や原因の分析を行ったりするのに欠かすことができない。従来は検査室や検査センタにおいて専門の技師が大型の自動分析装置を用いて検査を行うのが一般的であった。近年,小型で簡便に使用できる装置が開発されたことにより,患者のそばや自宅で検査を行うポイント・オブ・ケア・テスティング(POCT)が広まりつつある。POCT向けの装置は,大きく分けてドライケミストリと言われる乾燥試薬を保持させたフィルムやメンブレンに検体を添加するものと,流路や分注機構を用いて検体と試薬を混合するものがある。 Laboratory tests are indispensable for understanding the health status of people and animals for early detection of illnesses and for analyzing the progress and causes of illnesses in patients. In the past, it was common for specialists in inspection rooms and inspection centers to perform inspections using large automatic analyzers. In recent years, point-of-care testing (POCT) in which a test is performed near a patient or at home has been spreading due to the development of a small and easy-to-use apparatus. The apparatus for POCT is roughly classified into a device for adding a sample to a film or membrane holding a dry reagent called dry chemistry, and a device for mixing a sample and a reagent using a flow path or a dispensing mechanism.
臨床検査においては通常複数の項目を測定するため,複数の項目を高精度に測定できる装置が求められている。自動分析装置では検体を精密に分注し,様々な試薬と順次混合させていくことで,これを実現していた。POCT向けの装置では,自動分析装置と同様に分注吐出機構を用いて自動で検体を分注して順次測定を行うか,使用者が手動で順次測定を行っていた。 In clinical examinations, a plurality of items are usually measured, so a device capable of measuring a plurality of items with high accuracy is required. Automatic analyzers have achieved this by accurately dispensing samples and mixing them with various reagents in sequence. In the apparatus for POCT, as with the automatic analyzer, the sample is automatically dispensed using the dispensing discharge mechanism and sequentially measured, or the user manually performs the sequential measurement.
発明者は,流路を有する使い捨てのセンサチップを適用することで使用者が煩雑な操作を行うことなく複数項目の精密な測定を行うことができるPOCT向けの小型の装置を考案し,研究開発を行った。 The inventor has devised a small device for POCT that can perform precise measurement of multiple items without complicated operation by applying a disposable sensor chip having a flow path, and research and development. Went.
高精度な測定には検体を高精度に計量する必要があり,使い捨てのセンサチップでは物理形状で規定された計量部に検体を満たすことでこれを実現していた(特許文献1)。しかし,物理形状を規定するために良く用いられる隘路部において検体が詰まることが懸念された。さらに,複数項目を計測するためには,検体を分割する,例えば複数回高精度に計量を行わなければならず,その際にこの詰まりは一層懸念された。 For high-accuracy measurement, it is necessary to measure the sample with high accuracy, and in a disposable sensor chip, this is realized by filling the sample in a measuring part defined by a physical shape (Patent Document 1). However, there was concern about clogging of specimens in the bottleneck that is often used to define the physical shape. Furthermore, in order to measure a plurality of items, it is necessary to divide the specimen, for example, to perform measurement with high accuracy a plurality of times, and this clogging is further concerned.
本発明のセンサチップは,圧力調整機構と複数の装置側流体接続部を備える測定装置の前記複数の装置側流体接続部にそれぞれ接続される複数の流体接続部を有し,測定装置と組み合わせて使用される。 The sensor chip of the present invention has a plurality of fluid connection portions respectively connected to the plurality of device side fluid connection portions of a measurement device including a pressure adjusting mechanism and a plurality of device side fluid connection portions, and is combined with the measurement device. used.
本発明のセンサチップは,第1の流体接続部と第2の流体接続部とを結ぶ第1の流路と,検体を導入するための検体導入口と,第1の流路に設けられた第1の分岐点と検体導入口とを結ぶ第2の流路と,第1の分岐点より第2の流体接続部寄りの位置に設けられた第1の流路の第2の分岐点と第3の流体接続部とを結ぶ第3の流路とを有し,第1の流路には,第1の流体接続部と第1の分岐点との間もしくは第1の分岐点と第2の分岐点との間に検体検出部が配置されており,第3の流路には,検体導入口から導入された検体についての測定を行う測定部が配置されている。 The sensor chip of the present invention is provided in the first flow path connecting the first fluid connection portion and the second fluid connection portion, the sample introduction port for introducing the sample, and the first flow channel. A second flow path connecting the first branch point and the sample introduction port; a second branch point of the first flow path provided at a position closer to the second fluid connection portion than the first branch point; And a third flow path connecting the third fluid connection portion, and the first flow path includes the first fluid connection portion and the first branch point or the first branch point and the first flow point. A sample detection unit is disposed between the two branch points, and a measurement unit that performs measurement on the sample introduced from the sample introduction port is disposed in the third flow path.
第2の流路は,検体導入口と第1の分岐点の間に逆止弁もしくはフィルタを備えるのが好ましい。また,検体検出部は電極を備えるのが好ましい。 The second flow path preferably includes a check valve or a filter between the sample introduction port and the first branch point. Moreover, it is preferable that the specimen detection unit includes an electrode.
また,本発明のセンサチップは,廃液が導入される廃液溜を有し,検体検出部及び測定部に電極を備え,廃液溜が形成された基板の上に電極が形成された基板が配置され,電極が形成された基板の上に第1の流路,第2の流路及び第3の流路が形成された基板が配置された積層構造とすることができる。廃液溜は第1の流路につながっていない第5の流体接続部と第6の流体接続部に接続されている構造とすることができる。この場合,第1の流路の第2の流体接続部を計測装置側に設けた流路を介して第5の流体接続部に接続することで,廃液を廃液溜に導入することができる。あるいは,廃液溜は直接第1の流路に接続する構造としてもよい。 In addition, the sensor chip of the present invention has a waste liquid reservoir into which waste liquid is introduced, includes an electrode in the specimen detection unit and the measurement unit, and the substrate on which the electrode is formed is disposed on the substrate on which the waste liquid reservoir is formed. , A laminated structure in which the substrate on which the first channel, the second channel, and the third channel are formed is disposed on the substrate on which the electrode is formed. The waste liquid reservoir can be structured to be connected to the fifth fluid connection portion and the sixth fluid connection portion that are not connected to the first flow path. In this case, the waste liquid can be introduced into the waste liquid reservoir by connecting the second fluid connection part of the first flow path to the fifth fluid connection part via the flow path provided on the measuring device side. Alternatively, the waste liquid reservoir may be directly connected to the first flow path.
本発明の測定装置は,第1の流体接続部と第2の流体接続部とを結ぶ第1の流路と,検体を導入するための検体導入口と,第1の流路に設けられた第1の分岐点と検体導入口とを結ぶ第2の流路と,第1の分岐点より第2の流体接続部寄りの位置に設けられた第1の流路の第2の分岐点と第3の流体接続部とを結ぶ第3の流路と,第1の流路に接続された圧力調整機構と,第3の流体接続部に接続された試薬導入機構と,装置各部の動作を制御する制御部とを有し,第1の流路には,第1の流体接続部と第1の分岐点との間もしくは第1の分岐点と第2の分岐点との間に検体検出部が配置されており,第3の流路には,検体導入口から導入された検体についての測定を行う測定部が配置されており,制御部は,圧力制御機構を制御して検体を検体導入口から検体検出部に向けて第1の流路内に吸引し,検体検出部が検体を検出したとき圧力制御機構による吸引を停止し,次に圧力制御機構を制御して第1の流路に導入された検体を第3の流路に搬送し,その後,試薬導入機構を制御して第3の流路に試薬を導入する制御を行う。 The measuring device of the present invention is provided in the first flow path connecting the first fluid connection portion and the second fluid connection portion, the sample introduction port for introducing the sample, and the first flow channel. A second flow path connecting the first branch point and the sample introduction port; a second branch point of the first flow path provided at a position closer to the second fluid connection portion than the first branch point; The third flow path connecting the third fluid connection section, the pressure adjusting mechanism connected to the first flow path, the reagent introduction mechanism connected to the third fluid connection section, and the operation of each part of the apparatus A control unit for controlling, and the first flow path includes a specimen detection between the first fluid connection unit and the first branch point or between the first branch point and the second branch point. And a measurement unit for measuring the sample introduced from the sample introduction port is disposed in the third flow path, and the control unit controls the pressure control mechanism to control the sample. Aspiration into the first channel from the body introduction port toward the sample detection unit, and when the sample detection unit detects the sample, the suction by the pressure control mechanism is stopped, and then the pressure control mechanism is controlled to control the first The sample introduced into the flow path is transported to the third flow path, and then the reagent introduction mechanism is controlled to control the introduction of the reagent into the third flow path.
一例として,圧力制御機構は第1の流体接続部に接続された吸引吐出ポンプとすることができる。その場合,制御部は,吸引吐出ポンプを吸引動作させて検体を第1の流路内に吸引し,吸引吐出ポンプを吐出動作させて検体を第3の流路内に吐出させる。 As an example, the pressure control mechanism may be a suction / discharge pump connected to the first fluid connection. In this case, the control unit causes the suction / discharge pump to perform a suction operation to suck the sample into the first channel, and causes the suction / discharge pump to perform a discharge operation to discharge the sample into the third channel.
また,本発明による測定方法は,第1の流路に第2の流路を介して接続された検体導入口から検体を第1の流路に吸引する工程と,第1の流路に設けられた検体検出部が検体を検出したとき吸引を停止して規定量の検体を第1の流路に導入する工程と,第1の流路に圧力をかけて規定量の検体を,第1の流路に接続された測定部を有する第2の流路に導入する工程と,測定部に試薬を供給する工程と,測定部で測定を行う工程と,を有する。 In addition, the measurement method according to the present invention includes a step of sucking a sample into the first channel from a sample inlet connected to the first channel via the second channel, and the first channel. A step of stopping the aspiration and introducing a prescribed amount of the sample into the first flow path when the detected specimen detection unit detects the specimen, and applying a pressure to the first flow path to remove the prescribed amount of the sample from the first flow path. A step of introducing into a second flow path having a measurement unit connected to the flow path, a step of supplying a reagent to the measurement unit, and a step of measuring in the measurement unit.
本発明のセンサチップは,流路と,検体を流路に導入するための検体導入口と,流路に配置された電極と,電極の上流と下流に配置された捕捉物質とを有することを特徴とする。 The sensor chip of the present invention includes a flow channel, a sample introduction port for introducing a sample into the flow channel, an electrode disposed in the flow channel, and a capture substance disposed upstream and downstream of the electrode. Features.
捕捉物質としては,非糖化タンパク質と糖化タンパク質に共通の部位を認識する抗体を用いることができる。当該糖化タンパク質は,HbA1cもしくはグリコアルブミンとすることができる。また,センサチップには,流路に接続された廃液溜を備えるのが好ましい。さらに,検体導入口は検体保持部を備えることができる。 As a capture substance, an antibody that recognizes a site common to non-glycated protein and glycated protein can be used. The glycated protein can be HbA1c or glycoalbumin. The sensor chip preferably includes a waste liquid reservoir connected to the flow path. Further, the sample introduction port can include a sample holding unit.
さらに,糖化タンパク質の測定方法を開示する。測定方法は,非糖化タンパク質と糖化タンパク質に共通の部位を認識する抗体と,糖化部を認識する酵素標識抗体とを用いて,電位測定により検体中の糖化タンパク質の糖化割合を定量化することを特徴とする。 Furthermore, the measuring method of glycated protein is disclosed. The measurement method consists of quantifying the glycation ratio of glycated protein in a sample by measuring the potential using an antibody that recognizes a site common to non-glycated protein and glycated protein and an enzyme-labeled antibody that recognizes the glycated portion. Features.
ここで,本糖化タンパク質の測定方法では,抗体が固相に固定化された固定化抗体であり,固相に検体を供給する工程,試料液中の糖化タンパク質を固定化抗体に結合させる工程,固相に酵素標識抗体を供給する工程,酵素標識抗体を抗体に結合した糖化タンパク質に結合させて固定化抗体―糖化タンパク質―酵素標識抗体複合体を形成する工程,固相に基質を供給する工程,基質を複合体の酵素と反応させて反応産物を生成させる工程,電位測定により反応産物の濃度を測定する工程,反応産物の濃度を試料液中の糖化タンパク質濃度に換算する工程を有することができる。 Here, in the method for measuring glycated protein, the antibody is an immobilized antibody immobilized on a solid phase, a step of supplying a specimen to the solid phase, a step of binding a glycated protein in a sample solution to the immobilized antibody, Supplying an enzyme-labeled antibody to the solid phase, binding the enzyme-labeled antibody to the glycated protein bound to the antibody to form an immobilized antibody-glycated protein-enzyme-labeled antibody complex, supplying the substrate to the solid phase , Having a step of reacting a substrate with a complex enzyme to produce a reaction product, a step of measuring the concentration of the reaction product by measuring potential, and a step of converting the concentration of the reaction product into a glycated protein concentration in the sample solution it can.
本発明によると,物理形状ではなく流路上に設けた検体検出部を用いて検体の計量を行うことで,隘路部などの検体を物理的に阻害する構成を必要最小限として検体を高精度に計量できるため,詰まりを予防することができる。 According to the present invention, the sample is measured using the sample detection unit provided on the flow path instead of the physical shape, so that the configuration of physically obstructing the sample such as a bottleneck is minimized, and the sample is accurately obtained. Because it can be measured, clogging can be prevented.
上記した以外の,課題,構成及び効果は,以下の実施形態の説明により明らかにされる。 Problems, configurations, and effects other than those described above will be clarified by the following description of embodiments.
以下,図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。 Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings.
図1は,本発明のセンサチップの一例を示す概略図である。センサチップ3001は後述する計測装置を用いて測定を行う。センサチップ3001は,計測装置と接続される流体接続部3011,3012,3013,検体が供給される検体導入口3014,計測装置と接続される信号接続部3021を有する。流体接続部3011,3012,3013及び検体導入口3014には流路3024,3025,3026,3027,3028,3029が接続されている。また,それぞれの流路は分岐点3022,3023で接続されている。検体導入口3014に接続されている流路3028には,検体保持部3016が配置されている。検体保持部3016は,検体導入口3014に接するように外側に配置されていてもよい。センサチップ3001の流路,例えば流路3026上には測定部3017が配置されている。測定部3017の上流と下流には,抗体などの補足物質3018が配置されている。好ましくは,センサチップ3001は廃液溜3019を有する。好ましくは,廃液溜3019内には液体吸収体3020が配置されている。
FIG. 1 is a schematic view showing an example of a sensor chip of the present invention. The
図2は,計測装置101と,計測装置101に組み込まれて使用されるセンサチップ102の一例を示す概略図である。
FIG. 2 is a schematic diagram illustrating an example of the
計測装置101は,制御部111,計測部112,流体接続部113,114,115,116,117,信号接続部135を有する。流体接続部113には吸引吐出ポンプ118が配管で接続されている。流体接続部114,115,116にはバルブ119,124,129が接続され,バルブは「閉」,「大気開放」もしくは「試薬供給」を切り替えられる。流体接続部114,115,116は,バルブ119,124,129を「試薬供給」に設定すると,第一試薬121,126,131を供給するためのポンプ120,125,130,又は第二試薬123,128,133を供給するためのポンプ122,127,132に接続される。流体接続部117には,バルブ134が接続され,バルブ134は「閉」と「大気開放」に切り替えられる。
The measuring
吸引吐出ポンプ118やバルブ119,124,129,134は圧力調整機構を構成する。また,バルブ119,124,129,ポンプ120,125,130,122,127,132,第一試薬121,126,131,第二試薬123,128,133は試薬供給機構を構成する。
The suction /
センサチップ102は,計測装置101の流体接続部113,114,115,116,117と接続される流体接続部141,142,143,144,145,検体が供給される検体導入口146,計測装置の信号接続部135と接続される信号接続部157を有する。流体接続部141,142,143,144,145(流体接続部141は第1の流体接続部,流体接続部145は第2の接続部,流体接続部142は第3の接続部,流体接続部143は第4の流体接続部に相当)及び検体導入口146には流路171〜180が接続されており,流体接続部141に接続されている流路171上には検体の到達を検知する検体検出部147が配置されている。ここで,流体接続部141と流体接続部145を結ぶ流路171〜176は第1の流路に,分岐点161は第1の分岐点に,検体導入口146と分岐点161を結ぶ流路177は第2の流路に,分岐点162は第2の分岐点に,流体接続部142と分岐点162を結ぶ流路178は第3の流路に,分岐点163は第3の分岐点に,流体接続部143と分岐点163を結ぶ流路179は第4の流路に相当する。また,流体接続部142と分岐点162を接続する流路178上には検体の到達を検知する検体検出部149及び測定部150が,流体接続部143と分岐点163を接続する流路179上には検体の到達を検知する検体検出部151及び測定部152が,流体接続部144と分岐点164を接続する流路180上には検体の到達を検知する検体検出部153及び測定部154が配置されている。検体導入口146と分岐点161を接続する流路177上には逆止弁148が配置されている。センサチップ102は廃液溜155を有し,廃液溜155の配置位置に特に限定はないが,図2のセンサチップでは一例として,廃液溜155は,一端が分岐点164に接続される流路175に,もう一端が流路176により流体接続部145に接続されている。また,これらの流路175,176から分岐する流路を設けてその分岐した流路に廃液溜を接続してもよい。この場合,廃液溜は閉鎖系としてもかまわないが,さらに別の流路を設けて,廃液を排出できる構造としてもよい。廃液溜155内には,必要に応じて,図2に示すように液体吸収体156を配置してもよい。検体検出部147,149,151,153及び測定部150,152,154は信号接続部157に接続されている。
The
流路178〜180の測定部150,152,154付近には,検体中の測定対象に対応したプローブ,例えば抗体を固定化しておく。また,第一試薬121,126,131は測定対象に対応した標識プローブ例えば酵素標識抗体を有する。そして,第二試薬123,128,133は標識プローブの標識と反応する物質(基質)を有する。これら固定化抗体,酵素標識抗体,基質により酵素結合免疫吸着法(ELISA;Enzyme-Linked ImmunoSorbant Assay)と同様の手法により各測定部で所望の測定対象を測定できる。
In the vicinity of the
図3は,図2に示した測定装置101とセンサチップ102を用いた測定手順の一例を示すフローチャートである。まず,使用者はセンサチップ102を測定装置101にセットする(S201)。これにより,図4に示すように,測定装置101の流体接続部113,114,115,115,117はセンサチップ102の流体接続部141,142,143,144,145と接続され,測定装置101の信号接続部135はセンサチップ102の信号接続部157と接続される。続いて,使用者は検体導入口146に検体をセットする(S202)。採血管に適合するようになっている検体導入口146に採血管401をセットする。
FIG. 3 is a flowchart showing an example of a measurement procedure using the
使用者の操作により測定が開始される(S203)と,これ以降の動作は測定装置101の制御部111から各部への指示に基づいて自動的に行われる。制御部111からの指示でバルブ119,124,129,134が閉じられ(S204),吸引吐出ポンプ118が吸引動作をする(S205)ことで,検体が検体導入口146と流体接続部141を結ぶ流路171に吸引される。制御部111は,検体検出部147まで検体が吸引されたことを検知して(S206)吸引吐出ポンプ118を停止させることで(S207),検体検出部147まで検体を導入することができる。
When measurement is started by a user's operation (S203), the subsequent operations are automatically performed based on instructions from the
次に,制御部111の指示によりバルブ119を開き(S208),吸引吐出ポンプ118で吐出動作を行うと(S209),逆止弁148の働きにより流路171に導入された検体は検体導入口146側には移動できないため,流路171に導入された検体は流体接続部141と流体接続部142を結ぶ流路172,178を流体接続部142に向かって移動する。このとき移動する検体の量は,流路171の分岐点161と検体検出部147との間の容量で規定される。すなわち,流路171の分岐点161と検体検出部147との間の流路は,規定量の検体を計量する計量部として機能する。規定量の検体は,流路171から分岐点162を経て流路178を流れ,制御部111は,検体検出部149まで検体が到達したことを検知して(S210)吸引吐出ポンプ118を停止させることで(S211),検体検出部149まで規定量の検体を搬送することができる。制御部111の指示によりバルブ119を閉じ(S212),流体接続部143,144につながる流路179,180においても同様のことを行うことで(S213),検体検出部151,153まで規定量の検体が搬送される。
Next, when the valve 119 is opened in accordance with an instruction from the control unit 111 (S208) and a discharge operation is performed by the suction / discharge pump 118 (S209), the sample introduced into the
制御部111は,搬送された検体中の測定対象物質と測定部150,152,154付近に固定化されたプローブを反応させるため,規定の時間待機する(S214)。次に,制御部111は,バルブ134を開き(S215),バルブ119を開き(S216),ポンプ120で第一試薬121を供給することで(S217),流体接続部142から測定部150を経由して廃液溜155に第一試薬121を流す。分岐点162と流体接続部141を結ぶ流路171には,流体接続部141側に吸引吐出ポンプが接続されているため流れない。これにより,測定部150付近に固定化されたプローブと結合した成分以外の検体成分が洗い流されるとともに,測定部150付近に第一試薬に含まれる標識プローブが供給される。また,廃液溜に流入した検体成分及び第一試薬は液体吸収体156に吸収される。
The
制御部111は,バルブ119を閉じ(S218),流体接続部143,144につながる流路179,180においても同様のことを行うことで(S219),測定部152,154付近においても固定化プローブと結合しなかった検体成分の洗浄及び各第一試薬126,131に含まれる標識プローブの供給を行う。制御部111は,供給された各第一試薬121,126,131に含まれる標識プローブと測定部150,152,154付近に固定化されたプローブに結合した検体成分とを反応させるため,規定の時間待機する(S220)。
The
制御部111は,再びバルブ119を開き(S221),第一試薬121と同様に第二試薬123をポンプ122で供給することで(S222),流体接続部142から測定部150を経由して廃液溜155に第二試薬121を流す。これにより,未結合の標識プローブが洗い流されるとともに,測定部150付近に第二試薬に含まれる基質が供給される。また,第一試薬及び第二試薬は液体吸収体156に吸収される。次に,制御部111はバルブ119を閉じ(S223),流体接続部143,144につながる流路179,180においても同様のことを行うことで(S224),測定部152,154付近においても未結合の標識プローブが洗い流されるとともに第二試薬に含まれる基質が供給される。制御部111は,供給された各第二試薬123,128,133に含まれる基質と固定化プローブ−検体成分−標識プローブの結合体の標識とを反応させて反応産物を生成させるため,規定の時間待機する(S225)。
The
制御部111は,反応産物を各測定部150,152,154で計測し(S226),計測部112において各測定部で得られた信号から測定対象物質の量を算出し(S227),表示や印字により使用者に結果を伝える。使用者はセンサチップ102を測定装置101から取り外し,廃棄する(S228)。
The
このように検体検出部の検知信号をもとにポンプやバルブを用いて流路の圧力制御を行うことで,複数回一定量の検体を高精度に計量吐出できる。また,液体吸収体を配置した廃液溜を測定部の下流に設けることで,物理形状による阻害を必要最小限として複数回の測定を行う際に懸念される液の逆流を予防することができる。 Thus, by controlling the pressure of the flow path using a pump or a valve based on the detection signal of the sample detection unit, a certain amount of sample can be metered and discharged with high accuracy multiple times. In addition, by providing a waste liquid reservoir in which the liquid absorber is arranged downstream of the measurement unit, it is possible to prevent back flow of liquid that is a concern when performing multiple measurements with the minimum necessary obstruction due to physical shape.
図1,2では検体導入口を流体接続部とは別のものとしたが,既存の若しくは別途設けた流体接続部を検体導入口として用いることもできる。 In FIGS. 1 and 2, the sample introduction port is different from the fluid connection portion, but an existing or separately provided fluid connection portion can also be used as the sample introduction port.
図3のフローチャートでは2種類の試薬を供給する場合について説明をしたものの,試薬が1種類であっても,3種類以上であってもよく,また外部から試薬を供給せずにセンサチップや流路中に試薬が保持されていてもよい。また,免疫を用いた測定方法について説明をしたものの,酵素などの他の化学反応を用いた測定方法であってもよい。 In the flowchart of FIG. 3, the case where two types of reagents are supplied has been described. However, the number of reagents may be one or three or more. A reagent may be held in the path. Moreover, although the measuring method using immunity was demonstrated, the measuring method using other chemical reactions, such as an enzyme, may be sufficient.
図2の構成において図3の手順で測定を行うことで,加えて次のような利点も得られる。検体の計量にピペッターなどの分注吐出機構を用いる場合と比較して,機構を簡素化することができ,測定装置をより小型にすることができる。微細な流路で検体の計量を行うことができるため,検体量をより低減することができる。検体を分割することで,複数項目の測定だけでなく,比較参照データの取得を行うこともできる。検体の搬送がセンサチップ内で閉じているため,検体による汚染リスクを低減したり,キャリーオーバーによる測定誤差を低減したりできる。採血管から直接検体を吸引するため,使用者が採血管から検体を吐出する手間や,そのときに生じる検体飛散による汚染リスクを低減できる。 In the configuration shown in FIG. 2, the following advantages can be obtained by performing the measurement according to the procedure shown in FIG. The mechanism can be simplified and the measuring apparatus can be made smaller compared to the case of using a dispensing discharge mechanism such as a pipetter for measuring the sample. Since the sample can be measured in a fine channel, the amount of the sample can be further reduced. By dividing the sample, not only measurement of a plurality of items but also comparison reference data can be acquired. Since the transport of the specimen is closed in the sensor chip, it is possible to reduce the risk of contamination due to the specimen and to reduce the measurement error due to carry-over. Since the sample is aspirated directly from the blood collection tube, it is possible to reduce the trouble of the user discharging the sample from the blood collection tube and the risk of contamination due to the sample scattering.
検体検出部147,149,151,153には,光学的検出器,電気的検出器,圧力検出器などを用いることができる。
For the
光学的検出器としては,ハロゲンランプ,発光ダイオード,レーザーダイオードなどの光源と,スリット,レンズなどの光学素子,光電子増倍管,フォトダイオードなどの受光素子を組み合わせて,検体の有無による反射光量,透過光量の違いを検出する。検体検出の精度は光を照射するスポットに依存する。例えば,深さ100μm,幅1mmの流路に直径0.8mmのスポットを照射した場合,深さと幅と直径を掛け合わせた0.08μl程度の精度となる。 Optical detectors include light sources such as halogen lamps, light-emitting diodes, and laser diodes, and optical elements such as slits and lenses, photomultiplier tubes, and light-receiving elements such as photodiodes. A difference in the amount of transmitted light is detected. The accuracy of specimen detection depends on the spot that is irradiated with light. For example, when a spot having a diameter of 0.8 mm is irradiated to a flow path having a depth of 100 μm and a width of 1 mm, the accuracy is about 0.08 μl obtained by multiplying the depth, width, and diameter.
計測装置は,圧力検出器を有していてもよい。図4には一例として,流路を隘路とし,吸引吐出ポンプ118と流体接続部113の配管内の圧力を測定する圧力計1601を設けた。吸引吐出ポンプ118で検体の吸引を行い検体が隘路部まで到達すると,隘路部による圧力損失分だけ圧力が変化する。この圧力変化を圧力計で検知することで検体の到達を検知する。フローチャートのステップ209に示したように,この後で吸引吐出ポンプ118は吐出動作をするため,意図的に隘路部を超えて検体を吸引することは行わない。そのため,従来の隘路部を用いた検体の計量で懸念された詰まりの可能性を低く抑えることができる。検体検出の精度は,圧力検知に必要な隘路部の長さに依存する。例えば,深さ100μm,隘路部幅0.1mmの流路において5mmの隘路部で圧力検知を行った場合,深さと幅と隘路部の長さを掛け合わせた0.05μl程度の精度となる。このように隘路部などの検体を物理的に阻害する構成を用いる場合においても,検体が隘路部を通過することのない構成とすることで詰まりを予防することができる。
The measuring device may have a pressure detector. In FIG. 4, as an example, a
電気的検出器としては,電極,電源,電流計を組み合わせて,検体の有無による電極に流れる電流量の違いを検出する。例えば,図5に示すように,流路上に一組の銀塩化銀電極を配置し,交流電源と電流計を接続する。図5(a)は流路の平面の別の位置に電極801,802を配置した場合の例を示し,図5(b)は流路を挟み込むように電極803,804を配置した場合の例を示している。
As an electrical detector, an electrode, a power source, and an ammeter are combined to detect the difference in the amount of current flowing through the electrode depending on the presence or absence of the specimen. For example, as shown in FIG. 5, a pair of silver chloride electrodes are arranged on the flow path, and an AC power source and an ammeter are connected. FIG. 5A shows an example in which the
銀塩化銀電極上に検体が存在しない場合,電流はほとんど流れない。例えば右側から検体が導入されてきて右,左の銀塩化銀電極の順で検体に接触する場合,左の銀塩化銀電極が検体に接触すると検体によって銀塩化銀電極間が電気的に接続され,電流が流れる。検体が吐出されると銀塩化銀電極間の電気的な接続が切れ,再び電流が流れなくなる。従って,複数回の計量に必要な複数回の検出を行うことができる。また,吐出の際に電極表面及び流路表面に若干量の検体が残存することがあるため,銀塩化銀電極間の距離が近いと残存した検体により銀塩化銀電極間に電流が流れることがある。これは検体検出の精度を低下させる要因となるため,銀塩化銀電極間の距離を流路の幅程度離しておくことでこれを抑制するのが良い。銀塩化銀電極以外にも,金,白金などの貴金属電極や,カーボン電極を用いても良い。検体検出の精度は電極の大きさに依存する。例えば,深さ100μm,幅1mmの流路に0.5mm×0.5mmの電極を配置した場合,深さと幅と電極の大きさを掛け合わせた0.05μl程度の精度となる。 When there is no specimen on the silver chloride electrode, almost no current flows. For example, when a specimen is introduced from the right side and contacts the specimen in the order of right and left silver-silver chloride electrodes, the silver-silver chloride electrode is electrically connected by the specimen when the left silver-silver chloride electrode contacts the specimen. , Current flows. When the specimen is ejected, the electrical connection between the silver and silver chloride electrodes is broken, and the current does not flow again. Therefore, multiple detections necessary for multiple measurements can be performed. In addition, since a small amount of specimen may remain on the electrode surface and the channel surface during ejection, current may flow between the silver and silver chloride electrodes due to the remaining specimen if the distance between the silver and silver chloride electrodes is short. is there. Since this causes a decrease in the accuracy of specimen detection, it is better to suppress this by separating the distance between the silver and silver chloride electrodes by about the width of the flow path. In addition to the silver chloride electrode, a noble metal electrode such as gold or platinum, or a carbon electrode may be used. The accuracy of analyte detection depends on the size of the electrode. For example, when an electrode of 0.5 mm × 0.5 mm is arranged in a flow path having a depth of 100 μm and a width of 1 mm, the accuracy is about 0.05 μl obtained by multiplying the depth, width, and electrode size.
複数の検体検出部を並べて配置することで,計量の精度と速度を向上させることができる。図3のフローチャートに示したように,制御部111は,検体検出部147での検体の検知(S206)をもとに吸引吐出ポンプ118での吸引を停止する(S207)。吸引吐出ポンプ118での吸引により流路の圧力は大気圧よりも若干減少し,これが原動力となって検体の吸引が行われる。一方,この圧力の減少は,吸引吐出ポンプ118内の空気及び流体接続部113との間の配管内の空気の膨張を引き起こす。吸引吐出ポンプ118が停止すると流路の圧力は大気圧とほぼ等しくなり,検体の吸引が停止する。一方,この圧力の回復は,吸引吐出ポンプ118内の空気及び流体接続部113との間の配管内で膨張した空気の収縮を引き起こす。この収縮により検体の吸引が生じるため,規定量よりも若干多い量の検体が吸引されてしまう可能性がある。例えば,深さ100μm,幅1mmの流路において2mm多く検体を吸引した場合,規定量よりも0.2μl多く検体を計量してしまう。吸引吐出ポンプ118での吸引速度を抑制することで吸引時の流路圧力低下を低減でき,検体の過剰な吸引を抑制することができるものの,吸引速度の抑制は計量に要する時間を長くしてしまう。
By arranging a plurality of specimen detection units side by side, the accuracy and speed of measurement can be improved. As shown in the flowchart of FIG. 3, the
図6に示すように,吸引吐出ポンプと接続する流体接続部と流路の交点161との間に複数の検体検出部901,902を配置することで,吸引速度と計量精度を両立させることができる。制御部111は吸引吐出ポンプ118で高速な吸引を行い,検体導入口146に近い側の検体検出部902で検体の到達を検知したら,吸引吐出ポンプ118による吸引を低速に切り替える。そして,検体導入口146から遠い側の検体検出部901での検体検知をもって計量を行う。これにより,高速な吸引による計量時間の短縮と低速な吸引による高精度な計量を両立させることができる。例えば,検体検出部901と902の距離を3mm離しておくと,検体検出部902での検体の検知の後に2mm多く検体を吸引したとしても,その後の低速な吸引で検体検出部901の検体検出の誤差範囲内に収めることができる。図5では,2つの検体検出部を設けて吸引速度と計量精度を両立させる効果が得られる例を示したが,検体検出部を3つ以上設けても良い。
As shown in FIG. 6, by arranging a plurality of
逆止弁148としては,一般的な弁の他に,フィルタペーパーを用いることができる。検体吸引時(S205)には流体接続部141に陰圧がかかり,流体接続部142,143,144,145が閉じているため,唯一の開口部である検体導入口146からフィルタペーパーを通して流路に検体が吸引される。一方,検体吐出時(S209)には流体接続部141に陽圧がかかり,流体接続部142が大気開放されている。フィルタペーパーの圧力損失により検体導入口146には検体は押し出されず,計量した検体は流体接続部142に向かって搬送される。このように,フィルタペーパーが逆止弁と同様の働きをする。フィルタペーパーとして血球分離フィルタを用いると,全血試料を検体に用いた時に検体中の血球を除去することができる。逆止弁に替えて,隘路部とすることでも圧力損失を増大させ,同様の効果が得られる。その場合,つまりを抑制するため幅の狭い流路を複数並べるのが望ましい。
As the
測定部150,152,154には,吸光度センサ,発光センサ,蛍光センサ,表面プラズモン共鳴(SPR)センサなどの光センサ,水晶発振子マイクロバランス(QCM)センサなどの物理センサ,電流計測(WO 03/076937 A2),電位差計測(特開2008−128803号公報),イオン感応型電界効果トランジスタ(ISFET),イオン選択性電極などの電気化学センサを用いることができる。
図7は,これらの測定部の一例を示した図である。図7(a)は吸光度センサの一例を示している。1801で示された部分がセンサチップを示していて,それ以外の部分は測定装置に内蔵される光学系(レンズ,受光素子など)である。図7(b)は発光センサの一例を示している。1802で示された部分がセンサチップを示していて,それ以外の部分は測定装置に内蔵される光学系(レンズ,受光素子など)である。図7(c)は蛍光センサの一例を示している。1803で示された部分がセンサチップを示していて,それ以外の部分は測定装置に内蔵される光学系(レンズ,受光素子など)である。図7(d)はSPRセンサの一例を示している。1804で示された部分がセンサチップを示していて,それ以外の部分は測定装置に内蔵される光学系(レンズ,受光素子など)である。
FIG. 7 is a diagram showing an example of these measurement units. FIG. 7A shows an example of an absorbance sensor. A portion denoted by
図7(e)は,QCMセンサもしくは電気化学センサの一例を示す模式図である。測定部はセンサチップ内に配置される。1805は電極などのセンサ感応部を,1806はセンサ感応部に接続された配線を示している。配線は,センサチップと測定装置のコネクタを経由して測定装置に内蔵される制御部に電気的に接続される。これらの図を比較すると分かるように,QCMセンサや電気化学センサなどの配線で接続される測定部の場合,測定部と測定装置が電気的に接続されさえすれば良いため,比較的自由にセンサチップ内で測定部を配置することができる。
FIG. 7E is a schematic diagram showing an example of a QCM sensor or an electrochemical sensor. The measurement unit is disposed in the sensor chip.
図8は,センサチップの流路を酵素や抗体によって修飾する方法の一例を示す模式図である。図8(a)のように,流路底部に電極1401,1402を配置し,その反対の上面を酵素や抗体1403で修飾する。これにより,流路上面で酵素反応や免疫反応が生じ,その反応の結果が電極1401,1402で測定できる。また,図8(b)のように,電極1401,1402の配置された部位とは異なる部位を酵素や抗体1403で修飾してもよい。この場合,酵素や抗体で修飾された部位で反応を生じさせた後に反応液を電極の配置された部位まで搬送し測定を行うのが良い。酵素や抗体による修飾には,物理吸着,共有結合,ビオチン−アビジン結合,ラテックスビーズなどのビーズに固定化してからそのビーズを吸着,磁気ビーズに固定化してから磁石を用いて磁気ビーズを保持する方法などを用いることができる。
FIG. 8 is a schematic diagram showing an example of a method for modifying the flow path of the sensor chip with an enzyme or an antibody. As shown in FIG. 8A,
図9は,検体検出部の別の配置例を示す概略図である。図2では流体接続部141と分岐点161を結ぶ流路上に検体検出部147を配置していたのに対し,図9(a)では分岐点161と廃液溜155を結ぶ流路上に検体検出部147を配置している。この場合,フローチャートのステップ205の吸引吐出ポンプ118での検体の吸引に替えて,測定装置の流体接続部117へ新たに接続した圧力調整機構としての吸引ポンプを用いて流体接続部145から吸引を行う。例えば,図9(b)のように検体が吸引される。この場合は,検体検出部147は隘路部を持たないようにする。
FIG. 9 is a schematic diagram illustrating another arrangement example of the specimen detection units. In FIG. 2, the
図3に示したフローチャートでは,計量した検体を測定部150,152,154の順で導入した。しかし,最初の計量と2回目以降の計量では流路側面への検体成分の吸着による流路濡れ性の変化が主要因となり計量にズレが生じることがある。最初の計量は測定部の配置された流路に導入せず廃液溜に捨てることで,これを未然に防ぐことができる。具体的には,フローチャートのステップ208〜212に替えて,バルブ134を「大気開放」,吸引吐出ポンプ118で吐出,バルブ134を「閉」とする。これにより,最初に計量された検体は廃液溜155に搬送され,液体吸収体156に吸収される。その後は,ステップ205〜212を通常通り繰り返す。
In the flowchart shown in FIG. 3, the weighed specimens are introduced in the order of the
図10は,測定装置1101とセンサチップ1102の別の例を示す概略図である。図2との違いは,図2の例ではセンサチップ内の流路が廃液溜155も含めてひとつながりであったのに対し,図10の例ではセンサチップ内の流路が廃液溜とそれ以外(検体の計量と測定を行う部位)に分かれていることである。
FIG. 10 is a schematic diagram illustrating another example of the
検体の計量と測定を行うセンサチップの部位は流体接続部1121(第2の流体接続部に相当)につながっており,測定装置の流体接続部1111と流体接続部1112をつなぐバルブを「開」とすることで廃液溜につながっている流体接続部1122(第5の流体接続部に相当)につながる。排出された液は廃液溜に吐出され,その分だけ廃液溜から通気口1123(第6の流体接続部に相当)を通じて廃液溜内の空気が押し出される。吸引吐出ポンプ118と検体検出部147を用いた計量や搬送を行う際には,バルブ1113を「閉」とする。これにより,検体の計量と測定を行う部位と比較的容量の大きな廃液溜との接続を断ち,吸引吐出ポンプ118による圧力変動によって生じる廃液溜内の空気の膨張収縮の影響を抑制し,精度を向上させることができる。
The part of the sensor chip for measuring and measuring the sample is connected to the fluid connection part 1121 (corresponding to the second fluid connection part), and the valve connecting the
さらに,廃液を行うとき以外にはバルブ1113を「閉」とすることで,廃液溜からの廃液の逆流を抑制することができる。但し,図10のような構成とすると,検体が測定装置の配管に接触する。使い捨てのセンサチップとは異なり,測定装置は複数回使用するため,測定装置の配管への検体の接触は測定対象物質のキャリーオーバーの原因となりうる。しかし,図10の例に示した構成では検体の接触する配管の下流には廃液溜のみで計測を行う部位は存在しないため,装置配管でのキャリーオーバーの計測へ与える影響はほとんどない。
Furthermore, the backflow of the waste liquid from the waste liquid reservoir can be suppressed by closing the
図11は,センサチップの一例を示す概略図である。図11(a)はセンサチップを上から見た模式図であり,図11(b)はセンサチップを横から見た模式図である。この例のセンサチップは,電極基板1201,流路基板1202,廃液溜1203の3つの部位が積層された構造を有する。
FIG. 11 is a schematic diagram illustrating an example of a sensor chip. FIG. 11A is a schematic view of the sensor chip as viewed from above, and FIG. 11B is a schematic view of the sensor chip as viewed from the side. The sensor chip of this example has a structure in which three portions of an
電極基板1201にはガラスエポキシ樹脂のプリント基板,半導体チップ埋め込んだプラスチック基板などを用いることができ,検体の検知を行うための電極対1211,1212,1213,1214,測定部となる金電極と銀塩化銀電極の電極対1215,1216,1217,これら電極と測定装置の計測部を接続するためのコネクタ電極1218を有する。
The
流路基板1202にはアクリル,塩化ビニル,ポリエチレン,ポリスチレン,ポリプロピレン,シリコーンゴムなどのプラスチック,ガラスなどを用いる。流路基板1202は流路1229,流体接続部1219〜1226(流体接続部1219は第1の流体接続部に,流体接続部1226は第2の流体接続部に,流体接続部1220は第3の流体接続部に,流体接続部1221は第4の流体接続部に,流体接続部1225は第5の流体接続部に,流体接続部1224は第6の流体接続部に相当),検体導入口1227を有する。この例では,流体接続部1219〜1226はテーパー状の凹形状となっており,測定装置のテーパー状で凸形状の流体接続部と適合する。検体導入口1227には採血管がセットできる。検体はフィルタ1230を通して流路に導入される。
For the
廃液溜1203にも流路と同様のプラスチックを用いる。廃液溜1203にはポリアクリル酸ナトリウムなどの高分子吸収体1228が配置されており,流体導入部1225から導入された廃液が吸収される。通常,廃液は流体接続部1226から排出され,測定装置内の配管を経て,流体接続部1225からセンサチップの廃液溜1203に導入される。また,流体接続部1225へ廃液を導入したことにより,廃液溜1203に接続された流体接続部1224から空気が排出される。流体接続部1223は,本例のチップではセンサチップ内の流路には接続されていない。高分子吸収体1228に替えて,フィルタペーパーやメンブレンなどの液体吸水体を用いても良い。
The
廃液溜1203を検体の計量と測定を行う流路とは別に電極基板1201の裏面に設けることで,以下の利点が得られる。センサチップを測定装置にセットした際に流路よりも廃液溜が鉛直下側に位置するため,廃液が流路に逆流する可能性が低い。検体微量化のために流路を100μm程度と薄くした際にも,流路の厚みに依存せず十分な大きさの廃液溜を設けることができる。流路と廃液溜を多層構造とすることができ,センサチップを小型化できる。廃液溜を電極基板の裏面に設ける場合,測定部と検体検出部に電気計測法を用いることが望ましい。なぜなら,廃液溜が裏面にあるため,光学的検出法の場合,裏面からの計測が困難となるためである。
By providing the
図12は,センサチップの他の例を示す概略図である。図12(a)はセンサチップを上から見た模式図であり,図12(b)はセンサチップを横から見た模式図である。本例のセンサチップは,電極基板1901,流路基板1902,廃液溜1903の3つの部位を積層した構成を有する。
FIG. 12 is a schematic diagram illustrating another example of a sensor chip. FIG. 12A is a schematic view of the sensor chip as viewed from above, and FIG. 12B is a schematic view of the sensor chip as viewed from the side. The sensor chip of this example has a configuration in which three portions of an
電極基板1901にはガラスエポキシ樹脂のプリント基板,半導体チップを埋め込んだプラスチック基板などを用いることができ,検体の検知を行うための電極対1911,1912,1913,1914,測定部となる金電極と銀塩化銀電極の電極対1915,1916,1917,これら電極と測定装置の計測部を接続するためのコネクタ電極1918を有する。
As the
流路基板1902にはアクリル,塩化ビニル,ポリエチレン,ポリスチレン,ポリプロピレン,シリコーンゴムなどのプラスチック,ガラスなどを用いる。流路基板1902は流路1929,流体接続部1919〜1926(流体接続部1919は第1の流体接続部に,流体接続部1926は第2の流体接続部に,流体接続部1920は第3の流体接続部に相当),検体導入口1927を有する。この例では,流体接続部1919〜1926はテーパー状の凹形状となっており,測定装置のテーパー状で凸形状の流体接続部と適合する。検体導入口1927には採血管がセットできる。検体はフィルタ1931を通して流路に導入される。
A plastic substrate such as acrylic, vinyl chloride, polyethylene, polystyrene, polypropylene, or silicone rubber, glass, or the like is used for the
廃液溜1903にも流路と同様のプラスチックを用いる。廃液溜1903にはポリアクリル酸ナトリウムなどの高分子吸収体1928が配置されており,貫通流路1930から導入された廃液が吸収される。貫通流路1930から廃液を導入したことにより,廃液溜1903に接続された流体接続部1926から空気が排出される。流体接続部1923〜1925は本チップではセンサチップ内の流路には接続されていない。高分子吸収体1928に替えて,フィルタペーパーやメンブレンなどの液体吸水体を用いても良い。
The
図13は,センサチップの他の例を示す模式図である。図13(a)は平面模式図,図13(b)は側面模式図である。本例のセンサチップは,図11に示したセンサチップと似た構成であり,電極基板1511,流路基板1512,廃液溜1513の3つの部位から構成されが,検体導入の方法が若干異なる。図11の例では検体導入口1227に採血管をセットするのに対し,本例のセンサチップでは検体導入口1501から検体を注入する。注入したい検体を検体導入口1501に接触させると,界面張力によって検体保持部1503に検体が導入され,同時に検体保持部1503の空気が空気口1502から押し出される。検体を検体保持部に導入してからは,前述の手順でフィルタ1504を通して流路に検体が導入される。
FIG. 13 is a schematic diagram illustrating another example of a sensor chip. FIG. 13A is a schematic plan view, and FIG. 13B is a schematic side view. The sensor chip of this example has a configuration similar to that of the sensor chip shown in FIG. 11, and is composed of three parts: an
図14は,測定装置にセンサチップを装着した状態の一例を示す模式図である。図14(a)は全体図,図14(b)は測定装置のセンサチップの接続部分の拡大模式図,図14(c)はセンサチップと測定装置の流体接続部の斜視図,図14(d)はセンサチップと測定装置の流体接続部の断面模式図である。 FIG. 14 is a schematic diagram illustrating an example of a state in which a sensor chip is attached to the measurement apparatus. 14 (a) is an overall view, FIG. 14 (b) is an enlarged schematic view of the connection part of the sensor chip of the measuring device, FIG. 14 (c) is a perspective view of the fluid connection part of the sensor chip and the measuring device, and FIG. d) is a schematic cross-sectional view of the fluid connection part of the sensor chip and the measuring device.
測定装置1301にセンサチップ1302をセットし,フタ1303を閉じる。すると,テーパー型凸形状の測定装置の流体接続部1304とテーパー型凹形状のセンサチップの流体接続部1305が接続され,同時に,測定装置のコネクタ端子1306とセンサチップのコネクタ電極1307が電気的に接続される。流体接続部は,図14(c),(d)に図示されるようにテーパー状の凸凹形状が適合し,装置配管とセンサチップ流路が確実に接続される。このとき,測定装置側のガイド1308が位置合わせに効果的である。
The
また,測定装置の流体接続部1304をアクリル,ポリスチレン,ポリエチレンなどの硬質プラスチックとし,センサチップの流体接続部1305をシリコーンゴムなどの軟質プラスチックとすることで,接続の確実性は向上する。Oリングを用いて平面同士を接続する場合に比べて,接触面積が向上させられる,多少の位置ずれが自動的に修正される,接続部のデッドボリュームが低減できるなどの利点がある。また,センサチップの流体接続部1305を薄膜で封じ,凸形状の測定装置の流体接続部1304の挿入で破られるようにすることで,流路内への異物混入が予防できる。また,測定が終了しセンサチップを取り外した際に,流体接続部に付着した液体がセンサチップ側の凹形状により保持されやすいため,廃棄までの間に飛散しにくくなる。
Further, the reliability of the connection is improved by making the
測定装置とセンサチップの流体接続部の凹凸の関係は,図14の場合と逆であってももちろん良い。センサチップの同一面に流体接続部を集約し,センサチップの流体接続部と測定装置の流体接続部の一方を凹とし一方を凸とすることで,測定装置とセンサチップの接続を確実に行うことができ,物理形状による阻害を必要最小限として,測定装置が有するポンプやバルブなどによる圧力制御によりセンサチップ内で液体を駆動することができる。 Of course, the unevenness relationship between the fluid connection portion of the measuring device and the sensor chip may be the reverse of the case of FIG. Consolidate the fluid connection parts on the same surface of the sensor chip, and make sure that one of the fluid connection part of the sensor chip and the fluid connection part of the measurement device is concave and the other is convex, so that the measurement device and sensor chip are securely connected. It is possible to drive the liquid in the sensor chip by controlling the pressure by a pump, a valve, or the like included in the measuring device with the minimum necessary obstruction due to the physical shape.
図15は,測定装置2001とセンサチップ2002の別の例を示す概略図である。図2との違いは,図2の例では第1の流体接続部に相当する流体接続部141と第2の流体接続部に相当する流体接続部145を結ぶ流路上に廃液溜155が配置されていたのに対し,図15の例ではセンサチップ内の流路が第1の流体接続部に相当する流体接続部141と第2の流体接続部に相当する流体接続部2021を結ぶ流路とは分岐点2023で分岐した流路2024に廃液溜が接続され,さらに別の流体接続部2022に接続されていることである。流体接続部2021,2022は使用時それぞれ測定装置の流体接続部2011,2012に接続される。また,流体接続部2011,2012に接続される流路にはバルブ2013,2014が接続されている。
FIG. 15 is a schematic diagram illustrating another example of the
ヘモグロビンA1c(HbA1c)やグリコアルブミン(GA)などの糖化タンパク質の量は長期(数週間〜数ヶ月)の血糖値を反映した安定した指標であるため,糖尿病の診断及び治療のために行う血糖コントロールの成否を判定するのに有用である。糖化タンパク質はヘモグロビンやアルブミンといった特定の非糖化タンパク質が血糖値に応じて糖化されたものであるため,特定のタンパク質あたりの糖化タンパク質の存在比は長期の血糖値を反映する。例えば,HbA1cの場合はヘモグロビンに対するHbA1cの存在比(HbA1c/ヘモグロビン比)が,GAの場合はアルブミンに対するGAの存在比(GA/アルブミン比)が長期の血糖値の指標となる。 The amount of glycated protein such as hemoglobin A1c (HbA1c) and glycoalbumin (GA) is a stable index reflecting long-term (several weeks to several months) blood glucose level, so blood glucose control for diagnosis and treatment of diabetes It is useful for determining the success or failure of Since the glycated protein is obtained by glycating a specific non-glycated protein such as hemoglobin or albumin according to the blood glucose level, the abundance ratio of the glycated protein per specific protein reflects a long-term blood glucose level. For example, in the case of HbA1c, the abundance ratio of HbA1c to hemoglobin (HbA1c / hemoglobin ratio), and in the case of GA, the abundance ratio of GA to albumin (GA / albumin ratio) is an indicator of long-term blood glucose level.
本発明においては,HbA1cやグリコアルブミンなどの糖化タンパク質の割合を測定・定量化する場合,固定化抗体と酵素標識抗体には特徴的なペアを用いることができる。 In the present invention, when measuring and quantifying the proportion of glycated protein such as HbA1c or glycoalbumin, a characteristic pair can be used for the immobilized antibody and the enzyme-labeled antibody.
すなわち,あるタンパク質における糖化タンパク質の割合を測定するには,糖化の有無に依らない部位を認識する抗体を固定化抗体として用い,糖化部位を認識する抗体を酵素標識抗体に用いる。換言すると,固定化抗体としては,糖化タンパク質と非糖化タンパク質に共通の部位を認識する抗体を用い,酵素標識抗体としては,糖化タンパク質の糖化部を認識する抗体を用いる。たとえば,HbA1cを測定する場合,固定化抗体に抗Hb抗体を,酵素標識抗体に抗HbA1c抗体を用いることができる。グリコアルブミンを測定する場合,固定化抗体に抗アルブミン抗体を,酵素標識抗体に抗グリコアルブミン抗体を用いることができる。固定化抗体の量は,検体中に含まれる非糖化タンパク質と糖化タンパク質の量よりも十分,例えば健常人の基準値に対して1/10相当量以下とするのが好ましい。 That is, in order to measure the ratio of glycated protein in a certain protein, an antibody that recognizes a site that does not depend on the presence or absence of glycation is used as an immobilized antibody, and an antibody that recognizes a glycated site is used as an enzyme-labeled antibody. In other words, an antibody that recognizes a site common to the glycated protein and the non-glycated protein is used as the immobilized antibody, and an antibody that recognizes the glycated portion of the glycated protein is used as the enzyme-labeled antibody. For example, when measuring HbA1c, an anti-Hb antibody can be used as the immobilized antibody, and an anti-HbA1c antibody can be used as the enzyme-labeled antibody. When measuring glycoalbumin, an anti-albumin antibody can be used as the immobilized antibody, and an anti-glycoalbumin antibody can be used as the enzyme-labeled antibody. The amount of the immobilized antibody is preferably more than the amount of the non-glycated protein and the glycated protein contained in the sample, for example, 1/10 equivalent or less with respect to the reference value of a healthy person.
図16は,本発明に用いたGA/アルブミン比の測定例を図示したものである。固相2101に抗ヒトアルブミン抗体2102が固定化されており,抗ヒトアルブミン抗体2102には試料液中のヒトアルブミン2103及びGA2104が捕捉される。アルカリホスファターゼ(AP)標識された抗GA抗体(以下,酵素標識抗GA抗体)2105は捕捉されたGA2104の糖化部位(図16では○で模式的に表している)を認識して結合する。基質2106を添加すると,酵素標識抗GA抗体2105の標識酵素(この場合,アルカリホスファターゼ)により産物2107に変換される。試料溶液中のGA/アルブミン比が高い場合と低い場合をそれぞれ図16(a),図16(b)に表した。GA/アルブミン比に応じて抗ヒトアルブミン抗体2102に捕捉されるGA2104の量が異なり,それに応じて結合する酵素標識抗GA抗体2105の量が変わるため,産物2107量を比較することでGA/アルブミン比を求めることができる。なお,抗ヒトアルブミン抗体2102を固相に固定化できるものであれば,固相2101の代わりにビーズなどを用いてもよい。
FIG. 16 illustrates a measurement example of the GA / albumin ratio used in the present invention.
図17は,GA/アルブミン比を測定する手順の概略を示したものである。 FIG. 17 shows an outline of the procedure for measuring the GA / albumin ratio.
ステップ1:試料溶液を添加し,固相2101に固定した抗ヒトアルブミン抗体2102に試料溶液中のヒトアルブミン2103とGA2104を捕捉させる
ステップ2:洗浄により,抗体と結合していない試料溶液中のヒトアルブミン2103及びGA2104を除く
ステップ3:酵素標識抗GA抗体2105を加え,抗ヒトアルブミン抗体2102に捕捉されたGA2104に結合させる
ステップ4:洗浄により,結合していない過剰な酵素標識抗GA抗体2105を除く
ステップ5:アルカリホスファターゼ用の基質2106を加え,産物2107の量から酵素活性を測定する
このとき,一般的な抗原抗体反応では試料溶液中のヒトアルブミンよりも過剰量の捕捉抗体である抗ヒトアルブミン抗体を用いるが,本発明では試料溶液中のヒトアルブミンよりも少ない抗ヒトアルブミン抗体を固相に固定することを特徴とする。抗ヒトアルブミン抗体の固定化密度が同じである条件下では,試料溶液中のヒトアルブミン濃度が,抗ヒトアルブミン抗体のすべてにヒトアルブミンが結合し得る濃度以上であれば,固相上に捕捉されるヒトアルブミン総量は抗ヒトアルブミン抗体と同等量で一定となり,測定毎に一定量のヒトアルブミンを分取することができる。抗原抗体反応における複合体の濃度は式(1)で表せる。
[式1]
Step 1: Sample solution is added, and
[Formula 1]
例えば,Ab=10-8(M),kon=105(M-1s-1),koff=10-4(s-1),tb=10(min),tw=1(min)とすると,Ag=10-6(M)の場合はXb=9.93×10-9(M),Ag=10-5(M)の場合はXb=9.94×10-9(M)となる。For example, Ab = 10 −8 (M), k on = 10 5 (M −1 s −1 ), k off = 10 −4 (s −1 ), t b = 10 (min), t w = 1 ( min), X b = 9.93 × 10 −9 (M) when Ag = 10 −6 (M), and X b = 9.94 × 10 − when Ag = 10 −5 (M). 9 (M).
ここで抗体濃度Abは,抗体の固定密度D,反応場の容量V,反応場における抗体固定面積Sを用いて式(2)で表せる。
[式2]
Here, the antibody concentration Ab can be expressed by equation (2) using the antibody fixing density D, the reaction field volume V, and the antibody fixing area S in the reaction field.
[Formula 2]
式(2)より,容量が100μl,抗体固定面積が154mm2の反応場において,抗ヒトアルブミン抗体を固定密度6.5×10-9mol/m2で固定した条件は抗体濃度10-8Mに相当する。血中のヒトアルブミン濃度は5.6〜7.4×10-4M(37〜49mg/ml)であるため,固定密度6.5×10-9mol/m2で抗ヒトアルブミン抗体を固定した反応場(反応場の容量100μl,抗体固定面積154mm2)にとって,血清試料は固相上の抗ヒトアルブミン抗体のすべてにヒトアルブミンが結合するのに十分なアルブミン濃度である。From the equation (2), the conditions under which the anti-human albumin antibody was immobilized at a fixed density of 6.5 × 10 −9 mol / m 2 in a reaction field having a volume of 100 μl and an antibody immobilization area of 154 mm 2 were as follows: antibody concentration 10 −8 M It corresponds to. Since the human albumin concentration in blood is 5.6 to 7.4 × 10 −4 M (37 to 49 mg / ml), the anti-human albumin antibody is immobilized at a fixed density of 6.5 × 10 −9 mol / m 2. For the reaction field (
抗ヒトアルブミン抗体の固定密度は1.7×10-14〜3.6×10-4mol/m2であるとよい。1.7×10-14よりも抗ヒトアルブミン抗体の固定密度が低いと,測定値の有効数字3桁が確保できなくなってしまう。逆に,3.6×10-4mol/m2よりも高い固定密度で抗ヒトアルブミン抗体を固定した反応場は,抗体の性能にもよるが血清試料に含まれるヒトアルブミンがすべて抗ヒトアルブミン抗体に結合してしまうため,固相上に捕捉されるヒトアルブミンの総量は血清試料中のヒトアルブミン濃度によって変動してしまい,測定毎に一定量のヒトアルブミンを捕捉することはできない。The immobilization density of the anti-human albumin antibody is preferably 1.7 × 10 −14 to 3.6 × 10 −4 mol / m 2 . If the fixed density of the anti-human albumin antibody is lower than 1.7 × 10 −14 , 3 significant digits of the measured value cannot be secured. Conversely, in the reaction field in which the anti-human albumin antibody is immobilized at a fixed density higher than 3.6 × 10 −4 mol / m 2 , depending on the performance of the antibody, all human albumin contained in the serum sample is anti-human albumin. Since it binds to the antibody, the total amount of human albumin captured on the solid phase varies depending on the concentration of human albumin in the serum sample, and a certain amount of human albumin cannot be captured for each measurement.
図18は,抗ヒトアルブミン抗体2102を固定化した固相2101を用いることで,試料液中のヒトアルブミン濃度が一定以上であれば一定量のヒトアルブミンを抗体で捕捉できることを示している。詳細な実験手順を以下に示す。
FIG. 18 shows that by using the
ビオチン化したモノクローナル抗ヒトアルブミン抗体(捕捉抗体)をストレプトアビジンコートされたマイクロプレートに加え,固定した。0.1%Tween20含有Tris Buffer Saline(以下,TBSTという)で洗浄後,2%ウシ血清アルブミン(BSA)含有TBSTを加えてブロッキングした。TBSTで洗浄し,抗ヒトアルブミン抗体固定プレートを作製した。 A biotinylated monoclonal anti-human albumin antibody (capture antibody) was added to a microplate coated with streptavidin and immobilized. After washing with 0.1% Tween20-containing Tris Buffer Saline (hereinafter referred to as TBST), 2% bovine serum albumin (BSA) -containing TBST was added for blocking. The plate was washed with TBST to prepare an anti-human albumin antibody fixed plate.
ヒトアルブミン(GA含有)とTBSTを混合した希釈系列を用意し,試料溶液とした。抗ヒトアルブミン抗体固定プレートに試料溶液を導入し,試料溶液中のヒトアルブミン及びGAを捕捉抗体と反応させ,TBSTで過剰なヒトアルブミンを洗浄した。アルカリホスファターゼ修飾したモノクローナル抗ヒトアルブミン抗体(検出用抗体)をプレートに加え反応させた後,TBSTで過剰な抗体を洗浄した。 A dilution series prepared by mixing human albumin (containing GA) and TBST was prepared as a sample solution. The sample solution was introduced into the anti-human albumin antibody fixed plate, human albumin and GA in the sample solution were reacted with the capture antibody, and excess human albumin was washed with TBST. An alkaline phosphatase-modified monoclonal anti-human albumin antibody (detection antibody) was added to the plate and reacted, and then the excess antibody was washed with TBST.
アルカリホスファターゼの発色性基質であるブロモクロロインドリルリン酸(BCIP)と発色剤ニトロブルーテトラゾリウム(NTB)を添加し,反応させた後,エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を加えて反応を停止させ,595nmの吸光度を測定した。試料溶液中のヒトアルブミン濃度と吸光度の関係を図17に示す。ヒトアルブミン濃度0.05mg/ml以上でほぼ一定の吸光度となっており,捕捉抗体により一定量のヒトアルブミンが捕捉できたことが分かる。 Bromochloroindolyl phosphate (BCIP), which is a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, and a color former, nitro blue tetrazolium (NTB), were added and reacted, then ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) was added to stop the reaction, and 595 nm. The absorbance was measured. FIG. 17 shows the relationship between the human albumin concentration in the sample solution and the absorbance. The absorbance was almost constant at a human albumin concentration of 0.05 mg / ml or more, indicating that a certain amount of human albumin could be captured by the capture antibody.
図19は,抗ヒトアルブミン抗体で捕捉されたヒトアルブミンに含まれるGAを抗GA抗体で検出することにより,総ヒトアルブミン濃度への依存性を小さく抑えてGA/アルブミン比を測定できることを示す図である。詳細な実験手順を以下に示す。 FIG. 19 is a diagram showing that the GA / albumin ratio can be measured with a small dependence on the total human albumin concentration by detecting GA contained in human albumin captured by the anti-human albumin antibody with the anti-GA antibody. It is. Detailed experimental procedures are shown below.
図18での測定と同様にして抗ヒトアルブミン抗体固定プレートを作製した。GA/アルブミン比既知の血清検体とTBSTを混合して血清検体を100倍希釈及び1000倍希釈し,試料溶液とした。このとき,試料溶液中のヒトアルブミン濃度は固定した抗ヒトアルブミン抗体のすべてにヒトアルブミンが結合し得る濃度以上であることが望ましい。すなわち,容量が100μl,抗体固定面積が154mm2の反応場に抗ヒトアルブミン抗体を固定密度6.5×10-9mol/m2で固定した場合であれば,5000倍までなら希釈できる。An anti-human albumin antibody fixed plate was prepared in the same manner as the measurement in FIG. A serum specimen having a known GA / albumin ratio and TBST were mixed to dilute the serum specimen 100-fold and 1000-fold to obtain a sample solution. At this time, the human albumin concentration in the sample solution is desirably equal to or higher than the concentration at which human albumin can bind to all of the immobilized anti-human albumin antibodies. That is, when the anti-human albumin antibody is immobilized at a fixed density of 6.5 × 10 −9 mol / m 2 in a reaction field having a volume of 100 μl and an antibody immobilization area of 154 mm 2 , the dilution can be performed up to 5000 times.
抗ヒトアルブミン抗体固定プレートに試料溶液を導入し,検体液中のヒトアルブミン及びGAを抗ヒトアルブミン抗体と反応させ,TBSTで過剰な検体を洗浄した。アルカリホスファターゼ修飾したモノクローナル抗GA抗体(検出用抗体)を加え,抗ヒトアルブミン抗体に捕捉されているGAに反応させた後,TBSTで洗浄した。一般的な抗原抗体反応では検出用抗体の濃度は捕捉抗体の10分の1程度だが,本発明では捕捉抗体である抗ヒトアルブミン抗体のすべてにヒトアルブミンが捕捉されているため,検出用抗体である抗GA抗体の濃度は抗体の性能にもよるが固定した抗ヒトアルブミン抗体の濃度より高いことが望ましい。例えば,抗ヒトアルブミン抗体の固定密度が2.1×10-8mol/m2,反応場の容量が100μl,固定面積が154mm2であれば,抗GA抗体の濃度は33nM以上であるとよい。また,抗GA抗体は複数種のモノクローナル抗体を混合したものでもよく,ポリクローナル抗体でもよい。ヒトアルブミンの糖化部位は複数個所存在するため,エピトープの異なるモノクローナル抗GA抗体を複数種混合することで,感度や再現性を向上させられる。The sample solution was introduced into the anti-human albumin antibody fixed plate, human albumin and GA in the sample solution were reacted with the anti-human albumin antibody, and the excess sample was washed with TBST. Monoclonal anti-GA antibody (detection antibody) modified with alkaline phosphatase was added, reacted with GA captured by anti-human albumin antibody, and then washed with TBST. In a general antigen-antibody reaction, the concentration of the detection antibody is about one-tenth that of the capture antibody. However, in the present invention, human albumin is captured by all of the anti-human albumin antibodies that are capture antibodies. The concentration of a certain anti-GA antibody is preferably higher than the concentration of the immobilized anti-human albumin antibody depending on the antibody performance. For example, if the fixed density of the anti-human albumin antibody is 2.1 × 10 −8 mol / m 2 , the reaction field volume is 100 μl, and the fixed area is 154 mm 2 , the concentration of the anti-GA antibody should be 33 nM or more. . The anti-GA antibody may be a mixture of a plurality of types of monoclonal antibodies or may be a polyclonal antibody. Since there are multiple glycation sites of human albumin, sensitivity and reproducibility can be improved by mixing multiple types of monoclonal anti-GA antibodies with different epitopes.
なお,捕捉抗体の密度と検出抗体の濃度の関係は式(1)及び式(2)を用いて一般化できる。前述したように試料溶液中のヒトアルブミン濃度が抗ヒトアルブミン抗体のすべてに結合し得る濃度以上であれば,固相上に捕捉されるヒトアルブミン総量は抗ヒトアルブミン抗体の分子数で近似できる。したがって,式(1)において抗体に捕捉されたヒトアルブミン濃度Agに式(2)の抗ヒトアルブミン抗体濃度Abを代入することで,捕捉抗体の密度と検出抗体の濃度の関係を1つの式(3)で表せる。
[式3]
The relationship between the density of the capture antibody and the concentration of the detection antibody can be generalized using the equations (1) and (2). As described above, if the human albumin concentration in the sample solution is equal to or higher than the concentration capable of binding to all of the anti-human albumin antibodies, the total amount of human albumin captured on the solid phase can be approximated by the number of molecules of the anti-human albumin antibodies. Therefore, by substituting the anti-human albumin antibody concentration Ab of the formula (2) into the human albumin concentration Ag captured by the antibody in the formula (1), the relationship between the density of the capture antibody and the concentration of the detection antibody can be expressed by one formula ( It can be expressed by 3).
[Formula 3]
BCIP及びNTBを添加し,反応させた後,EDTAを加えて反応を停止させ,595nmの吸光度を測定した。試料溶液中のGA/アルブミン比と吸光度の関係をまとめたグラフを図19に示す。何らかのバックグラウンドシグナルが加わっているものの,GA/アルブミン比に応じた吸光度が得られた。式(3)によると,理論的にはGA/アルブミン比とGA・抗GA抗体複合体の濃度は図20に示すような線形の関係にある。図19においてもGA/アルブミン比と吸光度の関係は線形で表せており,理論に従ってGA/アルブミン比が測定できた。さらに,100倍希釈と1000倍希釈の吸光度で大きな差は見られず,10倍アルブミン濃度が違うにも関わらず,検量線から求めたGA/アルブミン比は1.1〜1.4倍の変化に抑制できた。固定化した抗ヒトアルブミン抗体を用いてヒトアルブミンを捕捉したため,10倍のヒトアルブミン濃度の違いにも関わらず,ほぼ一定のヒトアルブミンが捕捉された効果である。したがって,検体を希釈する際に希釈倍率の変動があったとしても,その変動の影響を抑制してGA/アルブミン比を測定できる。 After BCIP and NTB were added and reacted, EDTA was added to stop the reaction, and the absorbance at 595 nm was measured. A graph summarizing the relationship between the GA / albumin ratio and the absorbance in the sample solution is shown in FIG. Although some background signal was added, absorbance corresponding to the GA / albumin ratio was obtained. According to the equation (3), the GA / albumin ratio and the GA / anti-GA antibody complex concentration theoretically have a linear relationship as shown in FIG. Also in FIG. 19, the relationship between the GA / albumin ratio and the absorbance can be expressed linearly, and the GA / albumin ratio could be measured according to the theory. Furthermore, there is no significant difference in absorbance between the 100-fold dilution and the 1000-fold dilution, and the GA / albumin ratio obtained from the calibration curve varies 1.1 to 1.4 times despite the 10-fold albumin concentration being different. I was able to suppress it. Since human albumin was captured using the immobilized anti-human albumin antibody, almost constant human albumin was captured despite the 10-fold difference in human albumin concentration. Therefore, even if there is a change in the dilution ratio when the specimen is diluted, the GA / albumin ratio can be measured while suppressing the influence of the change.
検体を100倍及び1000倍希釈した例を示したのに対し,無希釈及び低希釈倍率でも同様にして検体溶液中のGA/アルブミン比を求めることができる。ただし,無希釈や低希釈倍率の場合,ヒトアルブミンの非特異吸着により測定値が変動しやすいため,ある程度の希釈を行うのが望ましい。 In contrast to the example in which the specimen is diluted 100 times and 1000 times, the GA / albumin ratio in the specimen solution can be obtained in the same manner even at undiluted and low dilution ratios. However, in the case of undiluted or low dilution ratio, the measured value is likely to fluctuate due to non-specific adsorption of human albumin.
図21に示すように,図21(a)のように抗GA抗体で検出した後に,捕捉抗体とは異なるエピトープを認識する酵素標識抗ヒトアルブミン抗体2108を添加して,図21(b)のように固定化した抗ヒトアルブミン抗体に捕捉されたヒトアルブミン量を測定することにより,固相化抗体の活性が変動するなどしても抗GA抗体での測定値を補正して変動をさらに抑制できる。
As shown in FIG. 21, after detecting with an anti-GA antibody as shown in FIG. 21 (a), an enzyme-labeled
固相上に結合したヒトアルブミンを抗GA抗体でGA濃度を測定した後に,抗ヒトアルブミン抗体でヒトアルブミン総量の濃度を求めGA/アルブミン比を補正する方法は,静電相互作用や疎水性相互作用などの物理吸着により固相上にヒトアルブミンを一定量吸着させて規格化する場合にも応用できる。物理吸着によるヒトアルブミン総量の変動を補正するステップがあるため,特開2004−242522号公報のような固相への吸着によりヒトアルブミン総量の規格化を行っている従来法よりも精度よく測定できる。 After measuring the GA concentration of human albumin bound on a solid phase with an anti-GA antibody, and determining the total amount of human albumin with the anti-human albumin antibody and correcting the GA / albumin ratio, electrostatic interaction or hydrophobic interaction It can also be applied to normalization by adsorbing a certain amount of human albumin on a solid phase by physical adsorption such as action. Since there is a step of correcting the fluctuation of the total amount of human albumin due to physical adsorption, it can be measured with higher accuracy than the conventional method in which the total amount of human albumin is standardized by adsorption to a solid phase as in JP-A-2004-242522. .
図22は,GA比測定用のセンサチップの一例を示す図である。図22(a)は平面模式図,図22(b)〜(d)は断面模式図である。センサチップは,固相2701,流路部2702,液体保持部2703から構成され,固相2701は,溶液導入検知用電極2713,2714,電位測定用電極2715,抗体固定部位2716,端子2724〜2726を有し,流路部2702は,検体導入口2712,試薬供給口2717,2718,2727,2728,廃液溜め接続口2720を有し,液体保持部2703は検体保持部2711,廃液溜め2719,空気穴2721,境界部2722,2723を有する。試薬供給口2717から流路をたどってそれぞれの位置関係を説明すると,溶液導入検知用電極2713,抗体固定部位2716,電位測定用電極2715,抗体固定部位2716,溶液導入検知用電極2714の順に流路内側に設けられている。また,抗体固定部位2716と検体導入検知用電極2714の間の流路上部には,検体導入口2712がある。センサチップの概寸は20mm×10mmで,流路は幅1mm×長さ13mm×高さ0.25mmとした。
FIG. 22 is a diagram illustrating an example of a sensor chip for GA ratio measurement. 22A is a schematic plan view, and FIGS. 22B to 22D are schematic cross-sectional views. The sensor chip includes a
固相2701には,シリコンなどの半導体基板や,ガラスエポキシなどの回路用基板や,ポリエチレンテレフタレート(PET),ポリプロピレン(PP),ポリカーボネート(PC),ポリイミド(PI)などのフィルム状基板を用いることができる。流路部2702には,ポリエチレン(PE),ポリエチレンテレフタレート(PET),ポリプロピレン(PP),ポリカーボネート(PC),ポリイミド(PI)などのフィルムを積層したものや,エチレン酢酸ビニルコポリマー(EVA)などの熱可塑性樹脂や,エポキシ樹脂や,ポリジメチルシロキサン(PDMS)などのシリコーン樹脂を用いることができる。液体保持部2703には,アラミド繊維製,ガラス繊維製,セルロース繊維製,ナイロン繊維製,ビニロン繊維製,ポリエステル繊維製,ポリオレフィン繊維製,レーヨン繊維製のろ紙や不織布や多孔質繊維を用いることができる。
For the
検体保持部2711は図22(b)に示すように検体導入口2712の外側にあってもよいし,図22(c)に示すように検体導入口2712と流路の間にあってもよく,図22(d)に示すように流路中にあってもよい。なお,図22(b)や図22(c)では検体保持部2711が流路と外部を隔てているため,圧力損失が大きく検体導入口2712を測定時に塞ぐ必要がない。境界部2722,2723には,低密度ポリエチレン(LDPE)樹脂や,エチレン酢酸ビニル(EVA)樹脂や,ポリアミド樹脂やポリエチレンテレフタレート(PET)樹脂を用いることができる。抗体固定部位2716には抗ヒトアルブミン抗体などの抗体が固定化されており,固定化方法は物理吸着であっても,化学結合であってもよく,まずアビジンを固定化した後にビオチン化抗体をアビジン−ビオチン結合により固定化してもよく,ビオチン修飾した分子を固定化した後にアビジンを介して抗体を固定化してもよい。
The
図23は,図22のセンサチップで測定を行うための装置の一例を示す図である。図23(a)はセンサチップ2801と装置2802の位置関係を上から見た図を示し,図23(b)はセンサチップ2801と装置2802の試薬供給口及び電極・端子の接続関係を横から見た図を示している。装置2802にセンサチップ2801をセットすることで,センサチップ2801の試薬供給口2717,2718,2727,2728と装置2802の試薬供給口2811,2812,2816,2817が流体的に接続され,センサチップ2801の端子2724〜2726と装置2802の端子2813〜2815が電気的に接続される。試薬供給口2811には,ポンプ2825によって抗体試薬液2826が供給され,試薬供給口2812には,ポンプ2823によって検体希釈液2824が供給され,試薬供給口2816には,ポンプ2827によって洗浄液2828が供給され,試薬供給口2817には,ポンプ2821によって基質液2822が供給される。検体希釈液2824と洗浄液2828は同じ組成の溶液でもよい。また,試薬供給口は1から3箇所で,試薬供給洪に接続している流路を分岐させることで複数の試薬が供給されるようにしてもよい。端子2814と端子2815には交流電源2833と交流電流計2834が接続されている。端子2813には電圧計2832が接続されており,電圧計2832のもう一方の端子は試薬供給口2817に接続された流路に配置されている参照電極2831に接続されている。ポンプ2821,2823,2825,2827の制御は制御部2803によって行われ,交流電源2833,交流電流計2834,電圧計2832の制御と計測は計測部2804によって行われる。装置2802は測定結果やメッセージを表示するための表示部2805,ユーザが操作を入力する入力部2806を有する。ポンプ2821,2823,2825,2827は,ペリスタポンプであっても,シリンジポンプであっても,ダイアフラムポンプであってもよい。参照電極2831は一定の電位を示すものであれば,内部液型の銀塩化銀参照電極や,むき出しの銀塩化銀電極や,もしくは,イオン選択電極であってもよい。
FIG. 23 is a diagram showing an example of an apparatus for performing measurement with the sensor chip of FIG. FIG. 23A shows a top view of the positional relationship between the
図24は,グリコアルブミン測定キットの一例を示す図である。本例のグリコアルブミン測定キット2901は,図22に示す抗アルブミン抗体が固定化された抗体固定化部位2716及び電位測定用電極2715が設けられた固相2701と,図23に示す抗体試薬液2826を収容した容器からなる。
FIG. 24 is a diagram showing an example of a glycoalbumin measurement kit. The
図25は,測定装置にセンサチップを装着した状態の一例を示す模式図である。測定装置3001にセンサチップ3002をセットし,フタ3003を閉じると,センサチップ3002と装置3001の試薬供給口及び電極・端子が接続される。
FIG. 25 is a schematic diagram illustrating an example of a state in which a sensor chip is attached to the measurement apparatus. When the
図26は,図22のセンサチップと図23の装置を用いた測定方法の一例を示す図である。流路上に設けられた検体導入口2712に検体を添加する(S2201)。検体としては,生体試料から採取した体液等そのものや,必要に応じて遠心分離やろ過,希釈等の前処理をしたものであってもかまわない。検体保持部2711はろ紙のような吸収体でできており,さらに,検体保持部2711の周囲は境界部2722で囲まれているため,添加した検体は検体保持部2711で保持される。センサチップは装置にセットされ,ポンプ2823を用いて装置の試薬供給口2812からセンサチップの試薬供給口2718に検体希釈液2824を導入する(S2202)。検体希釈液はTris Buffered Saline(以下,TBSという)やPhospahte Buffered Saline(以下,PBSという)などの緩衝液を用いる。検体導入口2712まで検体希釈液2824を導入するため,溶液導入検知用電極2713と2714を用いる。例えば,交流電源2833を用いて溶液導入検知用電極2713と2714の間に交流電圧を印加しておくと,検体希釈液2824導入前はほぼゼロであった電流が,検体希釈液2824が溶液導入検知用電極2714まで達すると溶液導入検知用電極2713と2714が電気的に接続されるために増大する。この電流の増大を計測部2804で監視することで検体希釈液2824が溶液導入検知用電極2714に到達したことを検知できる。溶液導入検知用電極2714で検体希釈液2824の到達を検知したら(S2203),試薬供給口2718からの検体希釈液2824の導入を停止する(S2204)。
26 is a diagram illustrating an example of a measurement method using the sensor chip of FIG. 22 and the apparatus of FIG. A sample is added to the
検体保持部2711と検体希釈液2824が接触した状態で一定時間保持する(S2205)と,検体保持部2711に保持された検体中の成分が検体希釈液2824中に拡散する。検体希釈液2824中に拡散する検体中の成分量は保持時間に依存するため,保持時間により検体の希釈倍率を制御できる。試薬供給口2718から検体希釈液2824を若干量吸引し,検体希釈液2824中に拡散した検体の成分を抗体固定部位2716まで搬送する(S2206)と,検体中のヒトアルブミンが抗体固定部位2716に固定された抗ヒトアルブミン抗体に捕捉される。一定時間保持した後に,試薬供給口2718からさらに検体希釈液を導入するなどして,廃液溜め接続口2720を通じて検体を含む検体希釈液2824を廃液溜め2719に廃棄する(S2207)。試薬供給口2727から導入した洗浄液2828で流路を洗浄し(S2208),抗体固定部位2716に固定された抗ヒトアルブミン抗体に捕捉されていないヒトアルブミンを除去する。洗浄に用いた洗浄液2828も廃液溜め2719に廃棄される。
When the
ポンプ2825を用いて装置の試薬供給口2811からセンサチップの試薬供給口2717に抗体試薬液2826を導入する(S2209)。抗体試薬液2826にはアルカリホスファターゼ標識抗GA抗体(標識抗GA抗体)などを含む液を用いる。すると,抗体試薬液2826中の標識抗GA抗体は抗ヒトアルブミン抗体に捕捉されたGAに結合する。一定時間保持した後,試薬供給口2718から洗浄液2828を導入し,流路を洗浄する(S2210)ことで,未結合の標識抗GA抗体を除去する。抗体試薬液2826や洗浄液2828は廃液溜め2719に廃棄される。ポンプ2821を用いて装置の試薬供給口2817からセンサチップの試薬供給口2728に基質液2822を導入する(S2211)。基質液には,アルカリホスファターゼの基質であるアスコルビン酸リン酸とメディエータであるフェリシアン化カリウムを含む液などを用いる。抗体固定部位2716に存在する抗ヒトアルブミン抗体−GA−標識抗GA抗体の複合体のアルカリホスファターゼにより基質液2824中のアスコルビン酸リン酸が加水分解され,生成したアスコルビン酸がフェリシアン化カリウムと反応してフェロシアン化カリウムを生成し,電位測定用電極2715の電位が変化する。そのため,電圧計2832で電位測定用電極2715と参照電極2831の間の電位差を測定する(S2212)ことで,捕捉されたGA量すなわち検体中のGA/アルブミン比が求まる。より精度よくGA/アルブミン比を求めるために,別に用意したセンサチップにおいてGA/アルブミン比が既知の試料を用いてGA/アルブミン比と測定電位の関係を表す検量線を作成し,GA/アルブミン比が未知の試料の値を計算してもよい。
The
図27を用いて,S2201〜S2206におけるセンサチップ流路への検体の導入方法について実施例の詳細を示す。図27はセンサチップ流路への検体の導入方法の詳細を示す説明図である。ステップ1として,流路の一部に設けたフィルタ等からなる検体保持部2711に検体3201を滴下する。ステップ2として,流路に緩衝液2824を導入して検体保持部2711に接触させ一定時間保持する。ステップ3として,検体保持部2711に保持された検体の成分が緩衝液中に拡散する。この操作により緩衝液で検体を希釈した場合と同等の希釈検体液が得られる。希釈検体液の希釈倍率は緩衝液の保持時間で制御できる。最後にステップ4として,希釈検体液を抗体固定部位2716に搬送し,抗原抗体反応を行う。緩衝液を導入する側を上流として,抗体固定部位2716が検体保持部2711よりも上流にあるため,その後のS2207〜S2212における溶液の導入において,検体保持部2711より溶液に拡散した検体成分が抗体固定部位2716を通過することを抑制できる。
With reference to FIG. 27, the details of the embodiment will be described with respect to the method for introducing the sample into the sensor chip channel in S2201 to S2206. FIG. 27 is an explanatory diagram showing details of a method for introducing the specimen into the sensor chip flow path. As
図27において,緩衝液を導入する側を上流として,抗体固定部位2716が検体保持部2711よりも下流にあっても構わない。図27と同様の手順で抗体固定部位2716に希釈検体液を搬送することができる。抗体固定部位2716が検体保持部2711よりも下流にあるため,希釈液を流し続けても検体保持部2711から拡散した検体成分が抗体固定部位2716に供給される。そのため,ステップ2〜3のように希釈液を保持する代わりに,希釈液を送液し続けてもよく,その場合送液速度により供給される希釈検体液の希釈倍率を制御する。
In FIG. 27, the side where the buffer solution is introduced may be upstream, and the
検体の導入にフィルタなどからの拡散を利用するため,検体を流路中に導入する場合に懸念される流路のつまりや流路への非特異的な検体成分の吸着を抑制することができる。また,100倍程度の高い希釈倍率を実現するときの課題となり得る微量検体の計量が不要である。また,毛管力によって検体保持部2711に検体が保持されるため,センサチップを取り扱う際の検体の飛散を抑制できる。
Since diffusion from a filter or the like is used for sample introduction, it is possible to suppress adsorption of non-specific sample components in the flow channel, which is a concern when introducing the sample into the flow channel, or in the flow channel. . Further, it is not necessary to measure a small amount of sample that can be a problem when realizing a high dilution factor of about 100 times. In addition, since the sample is held in the
検体保持部2711は,アラミド繊維製,ガラス繊維製,セルロース繊維製,ナイロン繊維製,ビニロン繊維製,ポリエステル繊維製,ポリオレフィン繊維製,レーヨン繊維製のろ紙や不織布や多孔質繊維を用いることができる。他には,一つや複数の細孔を代わりに用いることもできる。これらの材料を用いることで,検体保持部2711でセンサチップ流路の詰まりの原因となり得る検体中の物質を除去もしくは低減することができる。また,これらの材料に活性炭や疎水性樹脂を混合することで,免疫反応系の阻害の要因と成り得る検体中の脂質などを除去もしくは低減することができる。このとき,これらの材料はヒトアルブミン及びGAの存在量の極度な減少,GA/アルブミン比の変動を防ぐため,タンパク質や糖質に対する反応性の低い物質であることが望ましい。
The
図28を用いて,以下にS2212における電気化学センサを用いた電位測定方法について実施例の詳細を示す。抗原抗体反応の検出ステップにおいて,検出抗体の修飾酵素アルカリホスファターゼの基質であるアスコルビン酸リン酸と,メディエータであるフェリシアン化カリウムを添加することで,抗原抗体反応を電気化学的な信号として検出できる。アルカリホスファターゼによりアスコルビン酸リン酸は加水分解されてアスコルビン酸となる。その後,アスコルビン酸からデヒドロアスコルビン酸が生成するとともに,フェリシアン化カリウムが還元されフェロシアン化カリウムが生成する。その結果,反応溶液中の酸化物質と還元物質の濃度比が変わり反応液の電位が変動する。図28(a)は流路内に存在するアルカリホスファターゼの作用によって時間経過に伴い変動した電位の測定結果を示す。ただし,アルカリホスファターゼの代わりにネガティブコントロールであるBSAが存在しても電位は変動しない。また図28(b)は,電位をネルンストの式(4)を用いて生成したフェロシアン化カリウムの濃度に換算したグラフである。
[式4]
With reference to FIG. 28, the details of the example of the potential measuring method using the electrochemical sensor in S2212 will be described below. In the detection step of the antigen-antibody reaction, the antigen-antibody reaction can be detected as an electrochemical signal by adding ascorbic acid phosphate, which is a substrate of the detection antibody-modifying enzyme alkaline phosphatase, and mediator, potassium ferricyanide. Ascorbic acid phosphate is hydrolyzed by alkaline phosphatase into ascorbic acid. Thereafter, dehydroascorbic acid is produced from ascorbic acid, and potassium ferricyanide is reduced to produce potassium ferrocyanide. As a result, the concentration ratio of the oxidizing substance and the reducing substance in the reaction solution changes and the potential of the reaction solution fluctuates. FIG. 28 (a) shows the measurement results of the potential that fluctuated with time due to the action of alkaline phosphatase present in the flow path. However, the potential does not fluctuate even if BSA, which is a negative control, is present instead of alkaline phosphatase. FIG. 28B is a graph in which the potential is converted into the concentration of potassium ferrocyanide generated using Nernst equation (4).
[Formula 4]
あらかじめ決まったGA/アルブミン存在比のアルブミン・GA混合試料を用いて行った測定結果をキャリブレーションに利用し,検体の測定結果から検体中のGA/アルブミン存在比を求める。用いる測定結果としては,一定時間後の生成フェロシアン化カリウム濃度,単位時間当たりのフェロシアン化カリウム生成量の他に,図28(a)に示すような変曲点を用いることもできる。この変曲点は式(4)によればフェリシアン化カリウムとフェロシアン化カリウムが等量ある点である。任意の時刻における電位からフェロシアン化カリウム濃度を求めるのには標準電極電位が必要なのに対し,変曲点では必ず標準電極電位となる。そのため,変曲点を用いた測定では,測定ごとに生じる標準電極電位の変動の影響を受けない。 A measurement result obtained by using an albumin / GA mixed sample having a predetermined GA / albumin abundance ratio is used for calibration, and a GA / albumin abundance ratio in the specimen is obtained from the measurement result of the specimen. As a measurement result to be used, an inflection point as shown in FIG. 28A can be used in addition to the produced potassium ferrocyanide concentration after a certain time and the amount of produced potassium ferrocyanide per unit time. This inflection point is an equivalent amount of potassium ferricyanide and potassium ferrocyanide according to equation (4). To obtain the potassium ferrocyanide concentration from the potential at an arbitrary time, the standard electrode potential is required, but at the inflection point, it always becomes the standard electrode potential. Therefore, the measurement using the inflection point is not affected by the fluctuation of the standard electrode potential that occurs at each measurement.
電位計測法は測定感度が測定体積に依存しないため,酸化還元電流法や吸光光度法と比べて測定感度に影響せず測定試料を微量化できる。また,電位計測法は酵素標識抗体の濃度の対数に比例した信号が得られるため,酵素標識抗体の濃度に比例した信号が得られる酸化還元電流法や吸光光度法と比べて広いダイナミックレンジが得られる。 Since the measurement sensitivity of the potential measurement method does not depend on the measurement volume, the measurement sample can be made smaller without affecting the measurement sensitivity compared to the oxidation-reduction current method and the spectrophotometry. In addition, since the potential measurement method obtains a signal proportional to the logarithm of the concentration of the enzyme-labeled antibody, a wider dynamic range can be obtained compared to the oxidation-reduction current method and the spectrophotometric method, which can obtain a signal proportional to the concentration of the enzyme-labeled antibody. It is done.
検出のための抗体の修飾酵素,その基質及びメディエータの組み合わせはアルカリホスファターゼとアスコルビン酸リン酸,フェリシアン化カリウムといった加水分解酵素と基質の組み合わせに限らず,グルコースオキシダーゼとグルコース,フェリシアン化カリウムといった酸化還元酵素と酸化還元物質の組み合わせでもよい。メディエータの濃度は基質濃度よりも低いことが望ましく,基質とメディエータの濃度比により測定感度を調節できる。 The combination of antibody modifying enzyme for detection, its substrate and mediator is not limited to the combination of hydrolyzing enzyme and substrate such as alkaline phosphatase, ascorbic acid phosphate and potassium ferricyanide, but also oxidoreductase such as glucose oxidase and glucose and potassium ferricyanide. A combination of redox substances may also be used. The mediator concentration is preferably lower than the substrate concentration, and the measurement sensitivity can be adjusted by the concentration ratio of the substrate to the mediator.
電位測定用電極2715としては電気化学計測が可能なものとして,金,白金などの貴金属,グラファイト,カーボンブラックなどのカーボン素材のもの,カーボン素材と貴金属を混合したものを用いる。電極面積が測定電流に影響を与える電流計測と違い,電位計測では電極の大きさを厳密に調整する必要はない。
As the
図29を用いて,電位計測用電極2715と抗体固定部位2716の関係を説明する。図29(a)は電極上にのみ抗体を固定化した場合,図29(b)は電極を含む電極よりも広い範囲に抗体を固定化した場合,図29(c)は電極には抗体を固定せず電極を中心として流路の上流と下流方向から挟む位置に抗体を固定化した場合を示す。それぞれのグラフは,固定化抗体−抗原−酵素標識抗体の複合体が形成された状態で基質を添加したときの反応生成物の濃度を示している。
The relationship between the
添加された基質は固定化抗体−抗原−酵素標識抗体の複合体の酵素によって分解され反応生成物が生じ,拡散によって広がる。電極上にのみ抗体を固定した場合,反応生成物の分布は図29(a)のように電極上で濃度差が生じる。この図の例では,電極の端では電極の中央の半分程度である。これに対し,電極を含む電極よりも広い範囲に抗体を固定化した場合,図29(b)のように電極上での濃度差は抑制され,ほぼ一定濃度となる。また,図29(c)のように,電極には抗体を固定せず電極を中心として流路の上流と下流方向から挟む位置に抗体を固定化した場合,電極上で若干の濃度差は生じるものの,その差はこの例では7%と図29(a)のように電極上にのみ抗体を固定した場合よりも小さい。電位計測において,電位は反応生成物の濃度に応じて変動するため,電極上で反応生成物の濃度が一定になるように,抗体固定部位2716は図29(b)もしくは図29(c)のように電極よりも広い領域で電極を囲むように配置するのが望ましい。他にも,抗体固定部位2716は図29(d)や図29(e)のように電極を四方から囲むように配置してもよく,電極上にも抗体が固定されていても構わない。抗体固定部位で電極を挟み込む場合においても,電極を囲む場合においても,抗体固定部位2716は電極に隣接していることが望ましい。
The added substrate is decomposed by the enzyme of the complex of the immobilized antibody-antigen-enzyme labeled antibody to produce a reaction product, and spreads by diffusion. When the antibody is immobilized only on the electrode, the distribution of the reaction product has a concentration difference on the electrode as shown in FIG. In the example of this figure, the end of the electrode is about half of the center of the electrode. On the other hand, when the antibody is immobilized in a wider range than the electrode including the electrode, the concentration difference on the electrode is suppressed as shown in FIG. In addition, as shown in FIG. 29 (c), when the antibody is not fixed to the electrode and the antibody is fixed at the position sandwiched from the upstream and downstream directions of the flow path centering on the electrode, a slight concentration difference occurs on the electrode. However, the difference is 7% in this example, which is smaller than when the antibody is immobilized only on the electrode as shown in FIG. In the potential measurement, since the potential fluctuates according to the concentration of the reaction product, the
図30は,抗ヘモグロビン抗体で捕捉されたヘモグロビンに含まれるHbA1cを抗HbA1c抗体で検出することにより,HbA1c/ヘモグロビン比を測定できることを示す図である。HbA1c/ヘモグロビン比が既知の検体に,ドデシルトリメチルアンモニウムボロマイドやスクロースモノラウレートのような界面活性剤を添加して,抗HbA1c抗体の認識部位であるヘモグロビンのβ鎖N末端のバリン残基を露出させた試料溶液を作製した。この試料溶液を用いて,図19の場合と同様の手法で測定を行い,図30に示すような試料溶液中のHbA1c/ヘモグロビン比に応じた吸光度を得た。 FIG. 30 is a diagram showing that the HbA1c / hemoglobin ratio can be measured by detecting HbA1c contained in hemoglobin captured by the anti-hemoglobin antibody with the anti-HbA1c antibody. To a specimen with a known HbA1c / hemoglobin ratio, a surfactant such as dodecyltrimethylammonium boromide or sucrose monolaurate is added, and the β-chain N-terminal valine residue of hemoglobin, which is the recognition site of the anti-HbA1c antibody, is added. An exposed sample solution was prepared. Using this sample solution, measurement was performed in the same manner as in FIG. 19, and absorbance corresponding to the HbA1c / hemoglobin ratio in the sample solution as shown in FIG. 30 was obtained.
なお,本発明は上記した実施例に限定されるものではなく,様々な変形例が含まれる。例えば,上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり,必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また,ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり,また,ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また,各実施例の構成の一部について,他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。 In addition, this invention is not limited to an above-described Example, Various modifications are included. For example, the above-described embodiments have been described in detail for easy understanding of the present invention, and are not necessarily limited to those having all the configurations described. Further, a part of the configuration of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment, and the configuration of another embodiment can be added to the configuration of one embodiment. In addition, it is possible to add, delete, and replace other configurations for a part of the configuration of each embodiment.
101 計測装置
102 センサチップ
111 制御部
112 計測部
113〜117 流体接続部
118 吸引吐出ポンプ
119,124,129,134 バルブ
120,122,125,127,130,132 ポンプ
121,126,131 第一試薬
123,128,133 第二試薬
135 信号接続部
141,142,143,144,145 流体接続部
(141 第1の流体接続部,145 第2の流体接続部,142 第3の流体接続部,143 第4の流体接続部)
146 検体導入口
147,149,151,153 検体検出部
150,152,154 測定部
155 廃液溜
156 液体吸収体
157 信号接続部
161,162,163,164 分岐点(161 第1の分岐点,162 第2の分岐点,163 第3の分岐点)
171,172,173,174,175,176,177,178,179,180 流路(171〜176 第1の流路,177 第2の流路,178 第3の流路,179 第4の流路)
401 採血管
801,802,803,804 電極
1121,1122 流体接続部(1121 第2の流体接続部,1122 第5の流体接続部)
1123 通気口(第6の流体接続部)
1201 電極基板
1202 流路基板
1203 廃液溜
1601 圧力計
2021,2022 流体接続部(2021 第2の流体接続部)
2023 分岐点
2024 流路
2101 固相
2102 抗ヒトアルブミン抗体
2103 ヒトアルブミン
2104 GA
2105 酵素修飾抗GA抗体
2106 基質
2107 産物
2108 酵素修飾抗アルブミン抗体
2701 固相
2702 流路部
2703 液体保持部
2711 検体保持部
2712 検体導入口
2713,714 溶液導入検知用電極
2715 電位測定用電極
2716 抗体固定部位
2717,718,727,728 試薬供給口
2719 廃液溜め
2720 廃液溜め接続口
2721 空気穴
2722,2723 境界部
2724〜2726 端子
2801 センサチップ
2802 装置
2803 制御部
2804 計測部
2805 表示部
2806 入力部
2811,2812,2816,2817 試薬供給口
2813〜2815 端子
2821,2823 ポンプ
2822 基質液
2824 検体希釈液
2825,2827 ポンプ
2826 抗体試薬液
2828 洗浄液
2831 参照電極
2832 電圧計
2833 交流電源
2834 交流電流計
2901 グリコアルブミン測定キット
3001 センサチップ
3011,3012,3013 流体接続部
3014 検体導入口
3016 検体保持部
3017 測定部
3019 廃液溜
3020 液体吸収体
3021 信号接続部
3024,3025,3026,3027,3028,3029 流路
3022,3023 分岐点
3201 検体DESCRIPTION OF
146
171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180 channel (171-176 first channel, 177 second channel, 178 third channel, 179 fourth channel Road)
401
1123 Vent (sixth fluid connection)
1201
2023 Branching
2105 Enzyme-modified
Claims (25)
検体を前記流路に導入するための検体導入口と,
前記流路に配置された電極と,
前記電極の上流と下流に配置された捕捉物質とを有することを特徴とするセンサチップ。A flow path,
A sample inlet for introducing a sample into the flow path;
An electrode disposed in the flow path;
A sensor chip comprising a capture substance disposed upstream and downstream of the electrode.
前記捕捉物質は非糖化タンパク質と糖化タンパク質に共通の部位を認識する抗体であることを特徴とするセンサチップ。The sensor chip of claim 1,
The sensor chip, wherein the capture substance is an antibody that recognizes a site common to non-glycated protein and glycated protein.
前記糖化タンパク質はHbA1cもしくはグリコアルブミンであることを特徴とするセンサチップ。The sensor chip according to claim 2,
The sensor chip, wherein the glycated protein is HbA1c or glycoalbumin.
前記流路に接続された廃液溜を有することを特徴とするセンサチップ。The sensor chip according to claim 1,
A sensor chip comprising a waste liquid reservoir connected to the flow path.
前記検体導入口は検体保持部を備えることを特徴とするセンサチップ。The sensor chip according to claim 1,
The sensor chip, wherein the sample introduction port includes a sample holding unit.
前記抗体が固相に固定化された固定化抗体であり,前記固相に前記検体を供給する工程,前記試料液中の糖化タンパク質を前記固定化抗体に結合させる工程,前記固相に前記酵素標識抗体を供給する工程,前記酵素標識抗体を前記抗体に結合した糖化タンパク質に結合させて固定化抗体−糖化タンパク質−酵素標識抗体複合体を形成する工程,前記固相に基質を供給する工程,前記基質を前記複合体の酵素と反応させて反応産物を生成させる工程,電位測定により前記反応産物の濃度を測定する工程,前記反応産物の濃度を試料液中の糖化タンパク質濃度に換算する工程を順に有することを特徴とする糖化タンパク質の測定方法。The measurement method according to claim 6,
The antibody is an immobilized antibody immobilized on a solid phase, the step of supplying the specimen to the solid phase, the step of binding a glycated protein in the sample solution to the immobilized antibody, the enzyme on the solid phase Supplying a labeled antibody, binding the enzyme-labeled antibody to a glycated protein bound to the antibody to form an immobilized antibody-glycated protein-enzyme-labeled antibody complex, supplying a substrate to the solid phase, Reacting the substrate with the enzyme of the complex to produce a reaction product, measuring the concentration of the reaction product by measuring potential, and converting the concentration of the reaction product into a glycated protein concentration in a sample solution. A method for measuring a glycated protein characterized by comprising in order.
糖化タンパク質はHbA1cもしくはグリコアルブミンであることを特徴とする糖化タンパク質の測定方法。In the measuring method according to claim 6 or 7,
The method for measuring a glycated protein, wherein the glycated protein is HbA1c or glycoalbumin.
検体を導入するための検体導入口と,
前記第1の流路に設けられた第1の分岐点と前記検体導入口とを結ぶ第2の流路と,
前記第1の分岐点より前記第2の流体接続部寄りの位置に設けられた前記第1の流路の第2の分岐点と第3の流体接続部とを結ぶ第3の流路とを有し,
前記第1の流路には,前記第1の流体接続部と前記第1の分岐点との間もしくは前記第1の分岐点と前記第2の分岐点との間に検体検出部が配置されており,
前記第3の流路には,前記検体導入口から導入された検体についての測定を行う測定部が配置されていることを特徴とするセンサチップ。A first flow path connecting the first fluid connection and the second fluid connection;
A sample inlet for introducing the sample;
A second flow path connecting the first branch point provided in the first flow path and the sample inlet;
A third flow path connecting the second branch point of the first flow path and the third fluid connection section provided at a position closer to the second fluid connection section than the first branch point; Have
In the first flow path, a sample detection unit is disposed between the first fluid connection unit and the first branch point or between the first branch point and the second branch point. And
A sensor chip according to claim 3, wherein a measurement unit for measuring the sample introduced from the sample introduction port is disposed in the third flow path.
廃液溜を有することを特徴とするセンサチップ。The sensor chip according to claim 9, wherein
A sensor chip having a waste liquid reservoir.
前記廃液溜は前記第1の流路の前記第2の分岐点と前記第2の流体接続部の間に有ることを特徴とするセンサチップ。The sensor chip according to claim 10,
The sensor chip, wherein the waste liquid reservoir is located between the second branch point of the first flow path and the second fluid connection portion.
前記廃液溜内には液体吸収体が配置されていることを特徴とするセンサチップ。The sensor chip according to claim 10,
A sensor chip, wherein a liquid absorber is disposed in the waste liquid reservoir.
前記第2の流路は,前記検体導入口と前記第1の分岐点の間に逆止弁もしくはフィルタを備えることを特徴とするセンサチップ。The sensor chip according to claim 9, wherein
The sensor chip, wherein the second flow path includes a check valve or a filter between the sample introduction port and the first branch point.
前記検体検出部は電極を備えることを特徴とするセンサチップ。The sensor chip according to claim 9, wherein
A sensor chip, wherein the specimen detection unit includes an electrode.
前記第1の流路には,前記第1の流体接続部と前記第1の分岐点との間もしくは前記第1の分岐点と前記第2の分岐点との間に複数の検体検出部が配置されていることを特徴とするセンサチップ。The sensor chip according to claim 9, wherein
In the first flow path, a plurality of specimen detection units are provided between the first fluid connection unit and the first branch point or between the first branch point and the second branch point. A sensor chip which is arranged.
前記第2の分岐点より前記第2の流体接続部寄りの位置に設けられた前記第1の流路の第3の分岐点と第4の流体接続部とを結ぶ第4の流路とを有し,
前記第4の流路には,前記検体導入口から導入された検体についての測定を行う測定部が配置されていることを特徴とするセンサチップ。The sensor chip according to claim 9, wherein
A fourth flow path connecting the third branch point of the first flow path and the fourth fluid connection section provided at a position closer to the second fluid connection section than the second branch point. Have
The sensor chip according to claim 4, wherein a measurement unit for measuring the sample introduced from the sample introduction port is disposed in the fourth flow path.
前記測定部は検体検出部を備えることを特徴とするセンサチップ。The sensor chip according to claim 9, wherein
The sensor chip, wherein the measurement unit includes a sample detection unit.
前記第1の流路に接続されない第5の流体接続部と第6の流体接続部とを備え,前記第5の流体接続部と前記第6の流体接続部に接続した廃液溜が設けられていることを特徴とするセンサチップ。The sensor chip according to claim 9, wherein
A waste fluid reservoir having a fifth fluid connection portion and a sixth fluid connection portion that are not connected to the first flow path, and connected to the fifth fluid connection portion and the sixth fluid connection portion; A sensor chip.
廃液が導入される廃液溜を有し,
前記検体検出部及び測定部は電極を備え,
前記廃液溜が形成された基板の上に前記電極が形成された基板が配置され,前記電極が形成された基板の上に前記第1の流路,前記第2の流路及び前記第3の流路が形成された基板が配置された積層構造を有することを特徴とするセンサチップ。The sensor chip according to claim 9, wherein
A waste liquid reservoir into which the waste liquid is introduced;
The sample detection unit and the measurement unit include electrodes,
A substrate on which the electrode is formed is disposed on the substrate on which the waste liquid reservoir is formed, and the first flow path, the second flow path, and the third flow path are disposed on the substrate on which the electrode is formed. A sensor chip having a laminated structure in which a substrate on which a channel is formed is disposed.
前記廃液溜は前記第1の流路につながっていない第5の流体接続部と第6の流体接続部に接続されていることを特徴とするセンサチップ。The sensor chip according to claim 20,
The sensor chip, wherein the waste liquid reservoir is connected to a fifth fluid connection portion and a sixth fluid connection portion that are not connected to the first flow path.
前記廃液溜は前記第1の流路に接続されていることを特徴とするセンサチップ。The sensor chip according to claim 20,
The sensor chip, wherein the waste liquid reservoir is connected to the first flow path.
検体を導入するための検体導入口と,
前記第1の流路に設けられた第1の分岐点と前記検体導入口とを結ぶ第2の流路と,
前記第1の分岐点より前記第2の流体接続部寄りの位置に設けられた前記第1の流路の第2の分岐点と第3の流体接続部とを結ぶ第3の流路と,
前記第1の流路に接続された圧力調整機構と,
前記第3の流体接続部に接続された試薬導入機構と,
装置各部の動作を制御する制御部とを有し,
前記第1の流路には,前記第1の流体接続部と前記第1の分岐点との間もしくは前記第1の分岐点と前記第2の分岐点との間に検体検出部が配置されており,
前記第3の流路には,前記検体導入口から導入された検体についての測定を行う測定部が配置されており,
前記制御部は,前記圧力制御機構を制御して検体を前記検体導入口から前記検体検出部に向けて前記第1の流路内に吸引し,前記検体検出部が検体を検出したとき前記圧力制御機構による吸引を停止し,次に前記圧力制御機構を制御して前記第1の流路に導入された検体を前記第3の流路に搬送し,その後,前記試薬導入機構を制御して前記第3の流路に試薬を導入することを特徴とする測定装置。A first flow path connecting the first fluid connection and the second fluid connection;
A sample inlet for introducing the sample;
A second flow path connecting the first branch point provided in the first flow path and the sample inlet;
A third flow path connecting a second branch point of the first flow path and a third fluid connection portion provided at a position closer to the second fluid connection portion than the first branch point;
A pressure adjusting mechanism connected to the first flow path;
A reagent introduction mechanism connected to the third fluid connection;
A control unit for controlling the operation of each part of the device,
In the first flow path, a sample detection unit is disposed between the first fluid connection unit and the first branch point or between the first branch point and the second branch point. And
In the third flow path, a measurement unit for measuring the sample introduced from the sample introduction port is disposed,
The control unit controls the pressure control mechanism to suck the sample from the sample introduction port toward the sample detection unit into the first flow path, and the pressure is detected when the sample detection unit detects the sample. The suction by the control mechanism is stopped, and then the pressure control mechanism is controlled to transport the sample introduced into the first channel to the third channel, and then the reagent introduction mechanism is controlled. A measuring apparatus for introducing a reagent into the third flow path.
前記圧力制御機構は前記第1の流体接続部に接続された吸引吐出ポンプであり,
前記制御部は,前記吸引吐出ポンプを吸引動作させて前記検体を前記第1の流路内に吸引し,前記吸引吐出ポンプを吐出動作させて前記検体を前記第3の流路内に吐出させることを特徴とする測定装置。The measuring device according to claim 23,
The pressure control mechanism is a suction / discharge pump connected to the first fluid connection;
The controller causes the suction / discharge pump to perform a suction operation to suck the sample into the first channel, and causes the suction / discharge pump to perform a discharge operation to discharge the sample into the third channel. A measuring device.
前記第1の流路に設けられた検体検出部が検体を検出したとき吸引を停止して規定量の検体を前記第1の流路に導入する工程と,
前記第1の流路に圧力をかけて前記規定量の検体を,前記第1の流路に接続された測定部を有する第2の流路に導入する工程と,
前記測定部に試薬を供給する工程と,
前記測定部で測定を行う工程と,
を有することを特徴とする測定方法。A step of aspirating a sample into the first channel from a sample inlet connected to the first channel via a second channel;
A step of stopping aspiration when a sample detection unit provided in the first channel detects a sample and introducing a specified amount of sample into the first channel;
Applying a pressure to the first flow path to introduce the specified amount of the sample into a second flow path having a measurement unit connected to the first flow path;
Supplying a reagent to the measuring unit;
A step of measuring in the measuring unit;
A measuring method characterized by comprising:
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