JPWO2010131660A1 - 生体試料中のエクオールを免疫法により測定する方法、その測定のためのキット、および被験者のエクオール産生能を判定する方法 - Google Patents
生体試料中のエクオールを免疫法により測定する方法、その測定のためのキット、および被験者のエクオール産生能を判定する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2010131660A1 JPWO2010131660A1 JP2011513349A JP2011513349A JPWO2010131660A1 JP WO2010131660 A1 JPWO2010131660 A1 JP WO2010131660A1 JP 2011513349 A JP2011513349 A JP 2011513349A JP 2011513349 A JP2011513349 A JP 2011513349A JP WO2010131660 A1 JPWO2010131660 A1 JP WO2010131660A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- equol
- antigen
- biological sample
- antibody
- labeled
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
項1.生体試料中のエクオールを免疫法により測定する方法であって、検量線の作成に使用する標準抗原および生体試料中のエクオールと競合する標識化抗原からなる群より選択される少なくとも一方の抗原として、S−エクオールを用いることを特徴とする方法。
項2.S−エクオールに対する交差性を100%とした場合、ダイゼインに対する交差性が10%以下、ゲニステインに対する交差性が10%以下、グリシテインに対する交差性が10%以下、ジヒドロダイゼインに対する交差性が20%以下、およびデヒドロエクオールに対する交差性が20%以下である抗エクオール抗体を一次抗体として使用する、項1に記載の方法。
項3.前記標識化抗原の標識物が、酵素、放射性同位体、色素、蛍光物質、ラテックスおよび金属コロイドからなる群より選択される少なくとも1種である、項1に記載の方法。
項4.前記免疫法が、ELISA法、ラジオイムノアッセイ法およびイムノクロマト法からなる群より選択される少なくとも1種である、項1に記載の方法。
項5.前記生体試料が、尿および血液からなる群より選択される少なくとも1種である、項1に記載の方法。
項6.前記生体試料中のエクオールの抱合体が脱抱合処理されることなく測定されることを特徴とする、項1に記載の方法。
項7.生体試料中のエクオールを免疫法により測定するためのキットであって、検量線の作成に使用する標準抗原および試料中のエクオールと競合する標識化抗原からなる群より選択される少なくとも一方の抗原として、S−エクオールを含むことを特徴とする、キット。
項8.更に、S−エクオールに対する交差性を100%とした場合、ダイゼインに対する交差性が10%以下、ゲニステインに対する交差性が10%以下、グリシテインに対する交差性が10%以下、ジヒドロダイゼインに対する交差性が20%以下、およびデヒドロエクオールに対する交差性が20%以下である抗エクオール抗体を一次抗体として含む、項7に記載のキット。
項9.前記免疫法が、ELISA法、ラジオイムノアッセイ法およびイムノクロマト法からなる群より選択される少なくとも1種である、項7に記載のキット。
項10.前記生体試料が、尿および血液からなる群より選択される少なくとも1種である、項7に記載のキット。
項11.被験者のエクオール産生能を判定する方法であって、
(1)検量線の作成に使用する標準抗原および生体試料中のエクオールと競合する標識化抗原からなる群より選択される少なくとも一方の抗原としてS−エクオールを用いた免疫法により、大豆イソフラボンを摂食させた被験者由来の生体試料中のエクオールを測定する工程、および
(2)前記工程(1)で得られたエクオールの測定値に基づいて、被験者のエクオール産生能を判定する工程、
を含む判定方法。
項12.前記工程(1)において、生体試料中のエクオールの抱合体が脱抱合処理されることなく測定されることを特徴とする、項11に記載の判定方法。
1.生体試料中のエクオールを免疫法により測定する方法
本発明の、生体試料中のエクオールの濃度を免疫法により測定する方法(以下、これを免疫測定法と記載する場合がある)は、検量線の作成に使用する標準抗原および生体試料中のエクオールと競合する標識化抗原からなる群より選択される少なくとも一方の抗原に、S−エクオールを用いることを特徴とする。本発明の免疫測定法について、以下、説明する。
本発明の測定対象であるエクオールは低分子のハプテン抗原であるため、それ自体では免疫原性を有していない。そのため、免疫測定法に用いる抗体を得るためには、エクオールと抗原支持物質との結合体を合成し、免疫抗原を作製することが好ましい。
抗体の存在を検出する標識化ハプテン抗原については、前記抗原支持物質の代わりに標識物を用いることにより、同様に作製することができ、ハプテン抗原と標識物の間にスペーサー化合物を導入することにより、検出する抗体との親和性を調整することができる。
本発明に用いる一次抗体は、エクオールに特異的に結合できる限り制限されず、ポリクローナル抗体を用いてもよく、モノクローナル抗体を用いてもよい。また、エクオールとの特異性を維持する限り、その抗体断片を一次抗体として使用してもよい。また、一次抗体として、抗血清を使用することもできる。
ダイゼインに対する交差性:10%以下、好ましくは1%以下、更に好ましくは0.1%以下;
ゲニステインに対する交差性:10%以下、好ましくは1%以下、更に好ましくは0.1%以下;
グリシテインに対する交差性:10%以下、好ましくは1%以下、更に好ましくは0.1%以下;
ジヒドロダイゼインに対する交差性:20%以下、好ましくは5%以下、更に好ましくは1.1%以下;及び
デヒドロエクオールに対する交差性:20%以下、好ましくは5%以下、更に好ましくは1%以下。
交差性(%)=(S−エクオールのIC20/各々のイソフラボン類等のIC20)×100
本発明に使用する二次抗体は、上記一次抗体に対して特異的に結合する抗体であり、該二次抗体は公知の方法に従い作製できる。
また、本発明において、前記した方法により作製した抗体を用いて生体試料中のエクオールを測定するときに、検量線の作成に使用する標準抗原および/または試料中のエクオールと競合する標識化抗原に、S−エクオールを用いることにより、精確なエクオールの測定値を得ることが可能となる。すなわち、本発明では、検量線の作成に使用する標準抗原および試料中のエクオールと競合する標識化抗原の少なくとも一方にS−エクオールが使用されるが、生体試料中のエクオールの測定精度を高めるという観点から、検量線の作成に使用する標準抗原および試料中のエクオールと競合する標識化抗原の双方にS−エクオールを使用することが望ましい。
エクオールを測定する生体試料としては、動植物を含む生体に由来する試料であってエクオールの測定が求められるものである限り特に制限されないが、例えば、尿、血液(例えば血清の他、血漿)、便、組織抽出物、細胞抽出物、食材等が挙げられる。生体試料として、好ましくはヒト由来の生体試料であり、さらに好ましくはヒト由来の尿および血液であり、特に好ましくはヒト由来の尿である。
前記生体試料に含まれるエクオールは、通常、抱合体の形態で存在する。このため、該生体試料を抗原抗体反応に供する前に、エクオールを脱抱合させるための前処理に供してもよい。
生体試料および標準抗原の希釈に使用される希釈液は、測定に悪影響を及ぼさない限り制限されず、一般的な免疫法において使用されている希釈液を使用することができる。本発明において使用される希釈液の好適な一例として、塩化ナトリウム、ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝液(pH7.5)を含有する混合溶液、100%チャコール処理ヒト血清等が例示される。より具体的には、希釈液として、150mM塩化ナトリウム、1.0%ウシ血清アルブミン含有0.1Mリン酸緩衝液(pH7.5)の混合溶液が例示される。
次に、エクオールを測定するための免疫法の具体例を以下に示すが、本発明の本質はこれらの例により限定されるものではない。
本発明の、生体試料中のエクオールの濃度を免疫法により測定するためのキットは、検量線の作成に使用する標準抗原および試料中のエクオールと競合する標識化抗原からなる群より選択される少なくとも一方の抗原として、S−エクオールを含むことを特徴とする。本発明のキットは、更に、S−エクオールに特異的に結合する一次抗体を含んでもよい。
標準抗原としては、前述のものが同様に使用できる。該標準抗原は、溶液の形態でキットに含まれていてもよい。例えば、標準抗原としてS−エクオールを使用する場合、S−エクオール、塩化ナトリウム、ウシ血清アルブミン含有りん酸緩衝液(pH7.5)を含有する標準エクオール溶液の形態にあってもよい。標準エクオール溶液として、例えば、810ng/mL S−エクオール、150mM塩化ナトリウム、0.1%ウシ血清アルブミン、0.1%含有0.01Mりん酸緩衝液(pH7.5)が例示される。また、別の標準エクオール溶液として、S−エクオール及び100%チャコール処理ヒト血清の混合溶液等が例示される。
標識化抗原としては、前述のものが同様に使用できる。好ましくはパーオキシダーゼ標識S−エクオールが、特に好ましくは西洋ワサビパーオキシダーゼ標識S−エクオールが例示される。
標識物に対する基質としては、従来公知の基質が使用でき、従来公知の標識物との組み合わせで使用される。例えば、西洋ワサビパーオキシダーゼの場合には、基質として過酸化水素が例示される。該基質は、後述する溶解液に溶解された後に使用されることが好ましい。
溶解液は、必要に応じて溶解することを目的として使用される。該溶解液は、基質を好適に溶解でき、かつ測定に悪影響を及ぼさない限り制限されず、従来公知の緩衝液が使用でき、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液等が例示される。該溶解液は、基質を予め含む形態で提供することができる。
一次抗体としては、前述のものが同様に使用できる。好ましくは抗血清が使用され、更に好ましくはウサギ抗血清が使用される。該抗血清は、必要に応じて、後述する抗血清溶解緩衝液で希釈された後に使用される。該抗血清は、該抗血清希釈緩衝液で希釈された状態で、キットに含まれていてもよい。
二次抗体としては、前述のものが同様に使用できる。一次抗体としてウサギ抗体またはウサギ抗血清を使用する場合、二次抗体として、好ましくはヤギ抗ウサギIgG抗体が使用される。また、ELISA法における競合法を採用する場合には、二次抗体はマイクロプレートのウェルに固相化されていることが好ましい。該マイクロプレートは、従来公知のものが使用でき、固相化は従来公知の方法に従い実施すればよい。
抗血清希釈緩衝液は、前述の抗血清を必要に応じて希釈することを目的として使用される。該抗血清希釈緩衝液は、抗血清を好適に希釈でき且つ測定に悪影響を及ぼさない限り制限されず、前述のものが同様に使用できる。該抗血清希釈緩衝液は、抗血清を希釈した状態で、キットに含まれていてもよい。
生体試料を前処理(脱抱合)するための酵素液としては、前述のものが同様に使用できる。
生体試料(検体)および標準抗原の希釈液としては、前述のものが同様に使用できる。
標識物質と基質の反応を停止させるための反応停止液は、これらの反応を停止させることができ、測定結果に影響を与えない限り制限されず、従来公知の反応停止液が使用できる。反応停止液として、硫酸、塩酸、硝酸等が例示される。
洗浄液は、抗原抗体反応終了後、基質の分注前に、余分な生体試料および抗体等をウェル等から除去することを目的として使用される。該洗浄液は、好適に洗浄でき、かつ測定に悪影響を及ぼさない限り制限されず、従来公知の洗浄液が使用でき、そのままで使用されてもよく、精製水等で希釈して使用されてもよい。洗浄液として、精製水、界面活性剤を緩衝液で希釈した溶液等が例示される。
本発明の被験者のエクオール産生能を判定する方法(以下、判定方法と記載する場合がある)は、(1)検量線の作成に使用する標準抗原および生体試料中のエクオールと競合する標識化抗原からなる群より選択される少なくとも一方の抗原としてS−エクオールを用いた免疫法により、大豆イソフラボンを摂食させた被験者由来の生体試料中のエクオールを測定する工程、ならびに(2)前記工程(1)で得られたエクオールの測定値に基づいて、被験者のエクオール産生能を判定する工程を含む。以下に、本発明の判定方法について、工程毎に説明する。
本工程(1)では、検量線の作成に使用する標準抗原および生体試料中のエクオールと競合する標識化抗原からなる群より選択される少なくとも一方の抗原にS−エクオールを用いた免疫法により、大豆イソフラボンを摂食させた被験者由来の生体試料中のエクオールを測定する。
本第2工程では、前記工程(1)で得られたエクオールの測定値に基づいて、被験者のエクオール産生能を判定する。
1.前記免疫法により生体試料中のエクオール濃度を測定する。
2.同一の生体試料中のダイゼイン濃度を測定する。該測定は、既存の測定法(HPLC法、GC−MS法など)を用いて測定する。
3.生体試料毎にダイゼイン濃度に対するエクオール濃度の対数比を算出する。
エクオールはダイゼインの代謝産物であるため、該対数値を算出することで、生体内でどの程度のエクオールが産生されているかを把握することができる。
4.HPLC法により、生体試料中のS−エクオール濃度及びダイゼインを測定する。
5.前記4の測定値に基づき、生体試料毎にダイゼイン濃度に対するエクオール濃度の対数比を算出する。
6.前記5で得られた対数比により設定される基準値と、前記3で得られた対数比とを比較し、前記3についてエクオール産生/非産生の結果に分類する。これに基づきエクオール非産生者/産生者の誤判定率が最も低くなるエクオール濃度を決定し、該濃度をカットオフ値とする。
<試験例1>
・実施例1
標識化抗原および標準抗原にS−エクオールを用いた測定キットによる測定
1.生体試料
生体試料として、尿を使用した。生体試料数は5である。
免疫抗原の合成
100mgのエクオールを400μLのDMSOに溶解し、58μLのMethyl Bromoacetateおよび140mgのK2CO3を加えて、25℃で4時間反応させる。反応終了後に塩酸を用いて酸性に調整した後、酢酸エチルを用いて抽出を行い、脱水後に蒸発乾固した。
合成した免疫抗原エクオール−CME−BSA(2.5mg/mL)とFreund’s complete adjuvantを等量混和し、免疫剤を作製した。該免疫剤を用い、3週間毎に1mL/回をウサギの背部の数箇所に皮下注射した。免疫開始12週目から3週間毎に採血を開始し、5回の部分採血の後に全採血を実施した。採血した抗血清の抗体価を表1に示す。この全採血して得られた抗血清を抗血清希釈緩衝液で適宜希釈して以下の試験に使用した。
96穴マイクロプレートの各ウェルに10μg/mLのヤギ抗ウサギIgG抗体溶液を100μL加える。4℃で2晩静置した後にヤギ抗ウサギIgG抗体溶液を吸引除去した。
100mgのS−エクオール(S−equol)を400μLのDMSOに溶解し、58μLの4−Bromo−n−butylic Acidおよび140mgのK2CO3を加えて、25℃で4時間反応させる。反応終了後に塩酸を用いて酸性に調整した後、酢酸エチルを用いて抽出を行い、脱水後に蒸発乾固した。
標準抗原として、S−エクオールを用いた。なお、0、30、90、270または810ng/mL S−エクオール及び100%チャコール処理ヒト血清の混合溶液の標準エクオール溶液を使用した。
生体試料(検体)および標準抗原の希釈液として、100%チャコール処理ヒト血清(SERACON II:CD INTERGEN社)を用いた。
150mM塩化ナトリウム、0.5%ウシ血清アルブミン、0.01%Tween20含有0.1Mりん酸緩衝液(pH7.5)を抗血清希釈緩衝液とした。なお、Tweenは登録商標である。
100mM塩化ナトリウム、0.025%Tween20含有0.3mMりん酸緩衝液(pH7.5)を洗浄液とした。
6%β−グルファターゼ(株式会社日本バイオテスト研究所製)含有0.1M酢酸緩衝液(pH5.5)を酵素液とした。
0.05%過酸化水素水、2.2mg/mL OPD(o−フェニレンジアミン二塩酸塩)含有50mMくえん酸緩衝液(pH5.5)を基質(基質液)とした。
3N硫酸を反応停止液とした。
尿検体20μLに検体希釈液200μLを加えて、11倍希釈尿検体を調製した。抗ウサギIgGヤギ抗体固相化プレートのウェルに、11倍希釈尿検体20μL、酵素及び標識化抗原の混合液50μL(標識化抗原液1に対して、酵素液10)を加え、攪拌後に25℃で30分間静置した。その後、抗エクオールウサギ抗血清溶液50μLを加え、攪拌後に25℃で1時間静置した。
標識化抗原にS−エクオールを用いた測定キットによる測定
実施例1の中より、「標準抗原」をS−エクオールからエクオール(S−エクオールおよびR−エクオールの混合物)に変更した他は、実施例1と同様に実施した。
標準抗原にS−エクオールを用いた測定キットによる測定
実施例1の中より、「西洋ワサビパーオキシダーゼ標識S−エクオールの作製」を以下のようにS−エクオールからエクオール(S−エクオールおよびR−エクオールの混合物)に変更した他は、実施例1と同様に実施した。
100mgのエクオール(Equol)を400μLのDMSOに溶解し、58μLの4−Bromo−n−butylic Acidおよび140mgのK2CO3を加えて、25℃で4時間反応させる。反応終了後に塩酸を用いて酸性に調整した後、酢酸エチルを用いて抽出を行い、脱水後に蒸発乾固した。
標識化抗原および標準抗原にエクオールを用いた測定キットによる測定
実施例1の中より、「標準抗原」のS−エクオールを実施例2に記載のエクオールに、「西洋ワサビパーオキシダーゼ標識S−エクオールの作製」のS−エクオールを実施例3に記載のエクオールに変更した他は、実施例1と同様に実施した。
HPLC法との測定値の比較(パネル検体)
HPLC法によりエクオール濃度既知の尿試料5検体について、実施例1、実施例2、実施例3および比較例により測定した結果を表2に示し、HPLC法による測定値を100%とした各測定値の比を表3に示す。
HPLC法との相関(測定値)
HPLC法によりエクオール濃度既知の尿試料50検体について、実施例1、実施例2、実施例3および比較例と同様にして測定した結果とHPLC法による測定結果との相関図を、各々、図1、図2、図3および図4に示す。該尿試料は、前日に大豆イソフラボン摂取(イソフラボンアグリコンとして26mg)させ、早朝第一尿を使用した
比較例による測定結果では、相関係数r=0.973と相関性が高いものの、回帰式の傾きが0.664とHPLC法での測定値の半分近くになっている。
交差反応性
本試験例では、ELISA法における競合法を採用し、且つ、標準抗原および標識化抗原にS−エクオールを用いた場合の、一次抗体の交差反応性について調べた。具体的には、以下のようにして交差反応性について調べた。
後述の表4に示す各々のイソフラボン類等を100%チャコール処理ヒト血清で溶解し、試料とした。
一次抗体として、実施例1と同様に、抗エクオールウサギ抗血清を使用した。該抗血清は、後述の抗血清希釈緩衝液で適宜希釈して試験に使用した。
二次抗体として、実施例1と同様に、ヤギ抗ウサギIgG抗体を使用した。該抗体は、実施例1と同様に固相化させて、ヤギ抗ウサギIgG抗体固相化プレートとした。
標識化抗原として、実施例1と同様に、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識S−エクオールを使用した。
標準抗原として、実施例1と同様に、S−エクオールを用いた。なお、0、30、90、270および810ng/mL S−エクオール及び100%チャコール処理ヒト血清の混合溶液の標準エクオール溶液を使用した。
試料および標準抗原の希釈液として、100%チャコール処理ヒト血清を用いた。
150mM塩化ナトリウム、0.5%ウシ血清アルブミン、0.01%Tween20含有0.1Mりん酸緩衝液(pH7.5)を抗血清希釈緩衝液とした。
洗浄液として、100mM塩化ナトリウム、0.025%Tween20含有0.3mMりん酸緩衝液(pH7.5)を使用した。
酵素液として、6%β−グルファターゼ(株式会社日本バイオテスト研究所製)含有0.1M酢酸緩衝液(pH5.5)を使用した。
基質(基質液)として、0.05%過酸化水素水、2.2mg/mL OPD(o−フェニレンジアミン二塩酸塩)含有50mMくえん酸緩衝液(pH5.5)を使用した。
反応停止液として、3N硫酸を使用した。
各々のイソフラボン類等及び標識化されていないS−エクオールの濃度希釈系列を調製し、各イソフラボン類等及び標識化されていないS−エクオールについて、それぞれ濃度0から過剰量を加えたときの競合反応おける吸光度を測定した。ここで得られた各測定値を、標準抗原(S−エクオール)の希釈系列から得られる検量線と照らし合わせ、算出された各値に基づき反応阻害を比較して、標識化されたS−エクオールの抗エクオール抗体への結合を20%反応阻害する各イソフラボン類等の濃度及び標識化されていないS−エクオールの濃度(IC20)を決定した。
交差性(%)=(S−エクオールのIC20/各々のイソフラボン類等のIC20)×100
液体クロマトグラフ/タンデム質量分析装置(LC/MS/MS)との相関性
本試験例では、ELISA法における競合法を採用し、且つ、標準抗原および標識化抗原にS−エクオールを用いた場合の、LC/MS/MS法との相関性を調べた。具体的には以下のようにして相関性を調べた。
生体試料として、イソフラボン摂取前および摂取後の血清(男性10名)を使用した。
一次抗体として、実施例1と同様の、抗エクオールウサギ抗血清を使用した。該抗血清は、後述の抗血清希釈緩衝液で適宜希釈して試験に使用した。
二次抗体として、実施例1と同様の、ヤギ抗ウサギIgG抗体を使用した。該抗体は、実施例1と同様に固相化させて、ヤギ抗ウサギIgG抗体固相化プレートとした。
標識化抗原として、実施例1と同様の、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識S−エクオール及び標識化抗原液を使用した。
標準抗原として、実施例1と同様に、S−エクオールを用いた。なお、810ng/mL S−エクオールを標準抗原希釈液で適宜希釈して、標準エクオール溶液とした。
標準抗原の希釈液として、100%チャコール処理ヒト血清を用いた。
150mM塩化ナトリウム、0.5%ウシ血清アルブミン、0.01%Tween20含有0.1Mりん酸緩衝液(pH7.5)を抗血清希釈緩衝液とした。
洗浄液として、100mM塩化ナトリウム、0.025%Tween20含有0.3mMりん酸緩衝液(pH7.5)を使用した。
酵素液として、6%β−グルファターゼ(株式会社日本バイオテスト研究所製)含有0.1M酢酸緩衝液(pH5.5)を酵素液とした。
0.05%過酸化水素水、2.2mg/mL OPD(o−フェニレンジアミン二塩酸塩)含有50mMくえん酸緩衝液(pH5.5)を基質(基質液)とした。
3N硫酸を反応停止液とした。
ヤギ抗ウサギIgG抗体固相化プレートのウェルに、血清検体20μL、酵素及び標識化抗原の混合液50μL(標識化抗原液1に対して酵素液10)を加え、攪拌後に25℃で30分静置する。その後、抗エクオールウサギ抗血清溶液50μLを加え、攪拌後に25℃で1時間静置した。
S−エクオール産生者/非産生者の判定1(カットオフ値の設定)
本試験例では、以下のようにしてカットオフ値を設定した。
S−エクオール産生者/非産生者の判定2(カットオフ値の設定)
試験例4と同様にして、S−エクオール産生者か非産生者かの判定基準となるカットオフ値を設定した。
S−エクオール産生者/非産生者の判定3
試験例4と同様にして、S−エクオール産生者か非産生者かの判定基準となるカットオフ値を設定した。
Claims (12)
- 生体試料中のエクオールを免疫法により測定する方法であって、検量線の作成に使用する標準抗原および生体試料中のエクオールと競合する標識化抗原からなる群より選択される少なくとも一方の抗原として、S−エクオールを用いることを特徴とする方法。
- S−エクオールに対する交差性を100%とした場合、ダイゼインに対する交差性が10%以下、ゲニステインに対する交差性が10%以下、グリシテインに対する交差性が10%以下、ジヒドロダイゼインに対する交差性が20%以下、およびデヒドロエクオールに対する交差性が20%以下である抗エクオール抗体を一次抗体として使用する、請求項1に記載の方法。
- 前記標識化抗原の標識物が、酵素、放射性同位体、色素、蛍光物質、ラテックスおよび金属コロイドからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1に記載の方法。
- 前記免疫法が、ELISA法、ラジオイムノアッセイ法およびイムノクロマト法からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1に記載の方法。
- 前記生体試料が、尿および血液からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1に記載の方法。
- 前記生体試料中のエクオールの抱合体が脱抱合処理されることなく測定されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 生体試料中のエクオールを免疫法により測定するためのキットであって、検量線の作成に使用する標準抗原および試料中のエクオールと競合する標識化抗原からなる群より選択される少なくとも一方の抗原として、S−エクオールを含むことを特徴とする、キット。
- 更に、S−エクオールに対する交差性を100%とした場合、ダイゼインに対する交差性が10%以下、ゲニステインに対する交差性が10%以下、グリシテインに対する交差性が10%以下、ジヒドロダイゼインに対する交差性が20%以下、およびデヒドロエクオールに対する交差性が20%以下である抗エクオール抗体を一次抗体として含む、請求項7に記載のキット。
- 前記免疫法が、ELISA法、ラジオイムノアッセイ法およびイムノクロマト法からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項7に記載のキット。
- 前記生体試料が、尿および血液からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項7に記載のキット。
- 被験者のエクオール産生能を判定する方法であって、
(1)検量線の作成に使用する標準抗原および生体試料中のエクオールと競合する標識化抗原からなる群より選択される少なくとも一方の抗原としてS−エクオールを用いた免疫法により、大豆イソフラボンを摂食させた被験者由来の生体試料中のエクオールを測定する工程、および
(2)前記工程(1)で得られたエクオールの測定値に基づいて、被験者のエクオール産生能を判定する工程、
を含む判定方法。 - 前記工程(1)において、生体試料中のエクオールの抱合体が脱抱合処理されることなく測定されることを特徴とする、請求項11に記載の判定方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009114572 | 2009-05-11 | ||
JP2009114572 | 2009-05-11 | ||
PCT/JP2010/057974 WO2010131660A1 (ja) | 2009-05-11 | 2010-05-11 | 生体試料中のエクオールを免疫法により測定する方法、その測定のためのキット、および被験者のエクオール産生能を判定する方法 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014095421A Division JP2014160088A (ja) | 2009-05-11 | 2014-05-02 | 生体試料中のエクオールを免疫法により測定する方法、その測定のためのキット、および被験者のエクオール産生能を判定する方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2010131660A1 true JPWO2010131660A1 (ja) | 2012-11-01 |
Family
ID=43085033
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011513349A Pending JPWO2010131660A1 (ja) | 2009-05-11 | 2010-05-11 | 生体試料中のエクオールを免疫法により測定する方法、その測定のためのキット、および被験者のエクオール産生能を判定する方法 |
JP2014095421A Pending JP2014160088A (ja) | 2009-05-11 | 2014-05-02 | 生体試料中のエクオールを免疫法により測定する方法、その測定のためのキット、および被験者のエクオール産生能を判定する方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014095421A Pending JP2014160088A (ja) | 2009-05-11 | 2014-05-02 | 生体試料中のエクオールを免疫法により測定する方法、その測定のためのキット、および被験者のエクオール産生能を判定する方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9176124B2 (ja) |
EP (1) | EP2431740B1 (ja) |
JP (2) | JPWO2010131660A1 (ja) |
KR (1) | KR20120028324A (ja) |
CN (1) | CN102422160B (ja) |
AU (1) | AU2010248472B2 (ja) |
CA (1) | CA2761078C (ja) |
ES (1) | ES2563049T3 (ja) |
HK (1) | HK1165001A1 (ja) |
TW (1) | TWI542878B (ja) |
WO (1) | WO2010131660A1 (ja) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013054029A (ja) * | 2011-08-08 | 2013-03-21 | Arkray Inc | カルボキシメチルアルギニンの免疫測定方法 |
CN103076452B (zh) * | 2012-12-30 | 2015-02-25 | 上海市内分泌代谢病研究所 | 一种脂联素浓度的测定方法及其应用 |
CZ306733B6 (cs) * | 2014-08-27 | 2017-05-31 | Walmark, A.S. | Doplněk stravy na bázi klikvy velkoplodé pro použití k oddálení biochemického návratu karcinomu prostaty |
US20170189902A1 (en) * | 2014-09-12 | 2017-07-06 | Pinpoint Testing, Llc | Ready-to-constitute analytical platforms for chemical analyses and quantification |
CN104897652B (zh) * | 2015-03-19 | 2017-08-25 | 杭州金溪生物技术有限公司 | 一步均相化学发光法进行小分子检测的方法及所用微粒 |
KR20180073562A (ko) | 2015-10-29 | 2018-07-02 | 가부시키가이샤 야쿠르트 혼샤 | 에쿠올 산생능의 측정 방법 |
JP6586604B2 (ja) * | 2016-07-27 | 2019-10-09 | 株式会社ヘルスケアシステムズ | 骨折リスク評価方法 |
CN106290281A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-01-04 | 广州蓝勃生物科技有限公司 | 一种检测用试剂组件及其读取识别方法 |
JP6202652B1 (ja) * | 2016-12-19 | 2017-09-27 | 株式会社ヘルスケアシステムズ | 抗エクオール抗体組成物及びその利用 |
CN109444406A (zh) * | 2018-11-09 | 2019-03-08 | 深圳市众循精准医学研究院 | 定量检测标志物cyfra21-1的试纸条及其制备方法和检测方法 |
CN116577498B (zh) * | 2023-07-13 | 2023-09-12 | 济南玖方生物科技有限公司 | 用于检测尿液中hiv抗体的样品垫的应用、试纸条及样品垫处理液 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006504409A (ja) * | 2002-07-24 | 2006-02-09 | チルドレンズ ホスピタル メディカル センター | 鏡像異性のエクオールを含有する組成物および製品、およびその製造方法 |
JP2006242602A (ja) * | 2005-02-28 | 2006-09-14 | Gifu Prefecture | エクオールの検査方法及びエクオール産生菌の検査方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5314804A (en) * | 1992-03-24 | 1994-05-24 | Serim Research Corporation | Test for Helicobacter pylori |
US20030162955A1 (en) * | 1998-03-17 | 2003-08-28 | Lionel Chalus | Isolated mammalian membrane protein genes; related reagents |
JP4610525B2 (ja) | 2003-06-30 | 2011-01-12 | 大塚製薬株式会社 | エクオール産生乳酸菌含有組成物 |
-
2010
- 2010-05-11 TW TW099115202A patent/TWI542878B/zh active
- 2010-05-11 CA CA2761078A patent/CA2761078C/en active Active
- 2010-05-11 KR KR1020117029453A patent/KR20120028324A/ko active Search and Examination
- 2010-05-11 JP JP2011513349A patent/JPWO2010131660A1/ja active Pending
- 2010-05-11 US US13/318,735 patent/US9176124B2/en active Active
- 2010-05-11 EP EP10774917.8A patent/EP2431740B1/en active Active
- 2010-05-11 AU AU2010248472A patent/AU2010248472B2/en active Active
- 2010-05-11 WO PCT/JP2010/057974 patent/WO2010131660A1/ja active Application Filing
- 2010-05-11 CN CN201080021069.2A patent/CN102422160B/zh active Active
- 2010-05-11 ES ES10774917.8T patent/ES2563049T3/es active Active
-
2012
- 2012-06-01 HK HK12105379.6A patent/HK1165001A1/zh unknown
-
2014
- 2014-05-02 JP JP2014095421A patent/JP2014160088A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006504409A (ja) * | 2002-07-24 | 2006-02-09 | チルドレンズ ホスピタル メディカル センター | 鏡像異性のエクオールを含有する組成物および製品、およびその製造方法 |
JP2006242602A (ja) * | 2005-02-28 | 2006-09-14 | Gifu Prefecture | エクオールの検査方法及びエクオール産生菌の検査方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
DUNCAN C.S. TALBOT ET AL.: "Monoclonal Antibody-Based Time-Resolved Fluorescence Immunoassays for Daidzein, Genistein, and Equol", CLINICAL CHEMISTRY, vol. 53, JPN7013003087, 2007, pages 748 - 756, XP009162851, ISSN: 0002609772, DOI: 10.1373/clinchem.2006.075077 * |
ELKE BROUWERS ET AL.: "Time-resolved fluoroimmunoassay for equol in plasma and urine", THE JOURNAL OF STEROID BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, vol. Volume 84, Issue 5, JPN7013003086, 2003, pages 577 - 587, ISSN: 0002609771 * |
鈴木: "卵巣摘出ラットにおけるS体エクオールのエストロゲン様作用", 第61回日本栄養・食糧学会大会講演要旨集, JPN7013003088, 2007, pages 250, ISSN: 0002609773 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HK1165001A1 (zh) | 2012-09-28 |
US9176124B2 (en) | 2015-11-03 |
EP2431740A1 (en) | 2012-03-21 |
CA2761078C (en) | 2018-06-12 |
TW201043956A (en) | 2010-12-16 |
ES2563049T3 (es) | 2016-03-10 |
EP2431740B1 (en) | 2016-01-13 |
WO2010131660A1 (ja) | 2010-11-18 |
AU2010248472B2 (en) | 2015-05-14 |
CN102422160A (zh) | 2012-04-18 |
CN102422160B (zh) | 2014-09-10 |
CA2761078A1 (en) | 2010-11-18 |
TWI542878B (zh) | 2016-07-21 |
EP2431740A4 (en) | 2012-10-31 |
AU2010248472A1 (en) | 2011-11-10 |
US20120064550A1 (en) | 2012-03-15 |
KR20120028324A (ko) | 2012-03-22 |
JP2014160088A (ja) | 2014-09-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2010131660A1 (ja) | 生体試料中のエクオールを免疫法により測定する方法、その測定のためのキット、および被験者のエクオール産生能を判定する方法 | |
JP4990785B2 (ja) | トピラメートに関する免疫アッセイ | |
AU2015280288B2 (en) | Assays for vitamin D epimers | |
EP2090590A1 (en) | Antibody against aflatoxins, support using the antibody, method of immunologically detecting aflatoxins and method of concentrating and purifying aflatoxins | |
JP2007056030A (ja) | 三環系抗うつ薬誘導体およびイムノアッセイ | |
CN110713986B (zh) | 一株维生素b1单克隆抗体杂交瘤细胞株cbdd及其应用 | |
US20190016677A1 (en) | Compositions relating to vitamin d | |
JPH09506260A (ja) | メトトレキサートを検出するための試薬および方法 | |
JP5329994B2 (ja) | 試料中のエクオールの免疫測定法 | |
AU2015280292B2 (en) | Binding partners specific for vitamin D epimers | |
US8039226B2 (en) | Anti NC1 monoclonal antibody | |
JP4663831B2 (ja) | モノクローナル抗体、細胞株及びn1,n12−ジアセチルスペルミンの測定法 | |
JP2005247822A (ja) | コプラナーpcbハプテン、コプラナーpcbに対する抗体およびそれを用いる免疫学的測定方法 | |
Cernoch et al. | Production and analytical characterization of neopterin immunoreagents for biosensor developments | |
CN116023442B (zh) | 一种多粘菌素b半抗原、人工抗原、特异性抗体及其制备方法和应用 | |
JP2011026315A (ja) | アゾキシストロビン誘導体、アゾキシストロビンに対する抗体またはそのフラグメント、ならびにそれらの抗体またはフラグメントを用いた測定キットおよび測定方法 | |
JPH0821835A (ja) | D−カイロイノシトールの免疫測定方法 | |
CN116082258A (zh) | 一种用于检测扑草净的间接竞争elisa试剂盒及其检测方法与应用 | |
EP2124055A1 (en) | Kit for immunoassay of bsh, and method for measurement of bsh | |
KR20150133196A (ko) | 마우스 혈청 내의 래트 항체의 특이적인 검출 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130510 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130820 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131011 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20131112 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131226 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20131227 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20140204 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140502 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20140514 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20140704 |