JPWO2003066099A1 - ２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体 - Google Patents
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Abstract
本発明は，ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害剤を有効成分とする抗痴呆薬に関する。ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害剤は学習障害の改善作用を有し，ＢＥＣ１カリウムチャネルが関与していると考えられる疾患，好ましくは痴呆の予防又は治療剤として有用であることを実証した。具体的にはＢＥＣ１カリウムチャネル阻害剤が，ｉｎ ｖｉｖｏ試験において学習障害を改善する作用を示すことが確認された。また，２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジンを有する化合物がＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有することを見出した。
Description
技術分野
本発明は，医薬，特にＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有する物質を有効成分とする抗痴呆薬，好ましくはＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有する物質が２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩である痴呆薬，及び新規２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩に関する。
背景技術
カリウムチャネルは，細胞の形質膜に存在しカリウムイオンを選択的に通す蛋白質で，細胞の膜電位制御に重要な役割を担っていると考えられている。特に，神経・筋細胞においては活動電位の頻度や持続性などを調節することにより，中枢・末梢神経の伝達機構，心臓のペースメーキング，筋肉の収縮などに寄与している。
チャネルの開閉機構から分類すると，現在までに電位依存性カリウムチャネル，内向き整流性カリウムチャネル，カルシウム依存性カリウムチャネル，又は受容体共役型カリウムチャネルなどが同定されている。このうち，電位依存性カリウムチャネルは，膜電位が脱分極した際に開口する特性を有している。通常，カリウムイオンは細胞外が約５ｍＭ，細胞内が約１５０ｍＭと非平衡状態で存在する。このため，脱分極により電位依存性カリウムチャネルが開口すると，細胞内から細胞外へとカリウムイオンが流出し，結果として膜電位の回復（再分極）を引き起こす。そのため，電位依存性チャネルの開口に伴って，神経・筋細胞の興奮性の低下が誘導されることになる
【非特許文献１】。
電位依存性チャネルの開口を修飾する化合物は，神経・筋細胞などの興奮性を調整することにより，さまざまな生理現象を調整し，ひいては種々の疾患の治療薬となる可能性を有している。
例えば，神経細胞に認められるＡ型電位依存性カリウムチャネルの阻害剤である４−アミノピリジンは，神経の興奮性を高めることによりてんかんを引き起こすことが知られている
【非特許文献３】。また，電位依存性カリウムチャネルのうち心臓に発現するＨＥＲＧカリウムチャネルの阻害剤であるｄｏｆｅｔｉｌｉｄｅは，心筋細胞の興奮性を制御することに基づいた不整脈治療薬として利用されている
【非特許文献４】。
米国特許第６３２６１６８号（対応特許国際公開パンフレットＷＯ９９／３７６７７号）
【特許文献１】の実施例１中配列番号２に記載されているカリウムチャネル（以下ＢＥＣ１又はＢＥＣ１カリウムチャネルと表記する）は，脳に限局した発現分布を示す電位依存性カリウムチャネルである。その発現は，特に，海馬や大脳皮質において顕著である。海馬は，記憶・学習との関連性が強く示唆されている領域である
【非特許文献５】。
なかでも，当該カリウムチャネルの発現が確認された歯状回の顆粒細胞，ＣＡ１およびＣＡ３錐体細胞は神経回路を形成しており，各種記憶入力は歯状回の顆粒細胞からＣＡ１錐体細胞を経てＣＡ３錐体細胞へとグルタミン酸を神経伝達物質とする興奮性シナプスを介して伝達される。それぞれのシナプスで認められる長期増強，長期抑圧といったシナプス伝達効率の長期変化は，記憶・学習に深く関わっていると考えられている。これらの長期変化は神経細胞の興奮頻度や興奮強度によって調節されている。また電位依存性カリウムチャネルは一般的に神経細胞の興奮性をコントロールできる可能性を持っている。
従って，ＢＥＣ１は，神経細胞の興奮性制御を介して記憶・学習の形成に関与していると考えられるが，現在まで具体的に実証はなされていない。
現在２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体は多数知られているがその用途は，抗ＨＩＶ薬
【非特許文献６】，アデノシンＡ３アンタゴニスト
【特許文献２】，抗菌剤（
【非特許文献７】，
【非特許文献８】，
【非特許文献９】及び
【特許文献３】）として開示されている。現在までに，多くのカリウムチャネル阻害薬や２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体が報告されているが（
【特許文献３】，
【非特許文献１０】），ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有するという報告や示唆はない。
本発明の課題は，ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有する物質（以下ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害剤という）を有効成分とする抗痴呆薬，好ましくはＢＥＣ１カリウムチャネル阻害剤が２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩である抗痴呆薬、ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有する新規２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩及び当該新規誘導体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬を提供することである。
本発明者らは上記の課題を達成すべく研究を行ったところ，ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害剤が抗痴呆薬になりうることを見出した。更に２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン構造を有する化合物が，予想外にもＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有することを見出し本発明を完成させるに至った。
発明の開示
本発明はＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有する物質を有効成分とする抗痴呆薬に関する。
好ましくはＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有する物質が式（Ｉ）に示される２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩である抗痴呆薬である。
（式中の記号は次の通りである。
Ｒ１及びＲ２：同一又は異なって，Ｈ，ＯＨ，アルキル−Ｏ−，アリール−ＣＯ−，Ｈ２Ｎ，ＯＨで置換されていてもよいアルキル−ＮＨ，（アルキル）２Ｎ，置換されていてもよい炭化水素基，置換されていてもよいヘテロ環，又はＲ１，Ｒ２及び隣接するＮと一体となって含窒素ヘテロ環を形成することができ，当該環は置換されていてもよい。
Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６：同一又は異なって，（ｉ）Ｈ，（ｉｉ）ＣＮ，（ｉｉｉ）ＮＯ２，（ｉｖ）ハロゲン（ｖ）（１）ＣＮ，（２）ハロゲン若しくは（３）ＯＨで置換されていてもよい低級アルキル，（ｖｉ）シクロアルキル，（ｖｉｉ）低級アルキルで置換されていてもよいアリール，（ｉｘ）低級アルキルで置換されていてもよいヘテロ環，（ｘ）Ｒ７Ｒ８Ｎ−（Ｒ７及びＲ８：同一又は異なって，（１）Ｈ，（２）アリール若しくはＲ９−Ｏ−ＣＯ−で置換されていてもよい低級アルキル（Ｒ９：（１）Ｈ，若しくはアリールで置換されていてもよい低級アルキル），（ｘｉ）Ｒ１０−Ｔ１−（Ｒ１０：（１）Ｈ，（２）アリール，ＨＯ−Ｃ１−１０アルキレン−Ｏ−若しくはＨＯで置換されていてもよい低級アルキル，若しくは（３）アリール，Ｔ１：Ｏ若しくはＳ），又は（ｘｉｉ）Ｒ１１−Ｔ２−（Ｒ１１：（１）ＯＨ，（２）Ｒ７Ｒ８Ｎ−，（３）低級アルキル−Ｏ−，（４）低級アルキル，（５）アリール，若しくは（６）ヘテロ環（Ｔ２：ＣＯ若しくはＳＯ２）），
更にＲ３，Ｒ４及び隣接するＣ若しくはＲ５，Ｒ６及び隣接するＣと一体となってヘテロ環，環状炭化水素環を形成しベンゼン環と縮合することができる。）。
本発明の別の態様としては，上記式（Ｉ）に示される２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩を有効成分とする配列番号２に記載のＢＥＣ１カリウムチャネル阻害剤である。
また，本発明の別の態様としては式（ＩＩ）に示される２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩である。
（式中の記号は次の通りである。
Ｒ１及びＲ２：同一又は異なって，Ｈ，ＯＨ，アルキル−Ｏ−，アリール−ＣＯ−，Ｈ２Ｎ，ＯＨで置換されていてもよいアルキル−ＮＨ，（アルキル）２Ｎ，置換されていてもよい炭化水素基，置換されていてもよいヘテロ環，又はＲ１，Ｒ２及び隣接するＮと一体となって含窒素ヘテロ環を形成することができ，当該環は置換されていてもよい。
Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６：同一又は異なって，（ｉ）Ｈ，（ｉｉ）ＣＮ，（ｉｉｉ）ＮＯ２，（ｉｖ）ハロゲン，（ｖ）（１）ＣＮ，（２）ハロゲン若しくは（３）ＯＨで置換されていてもよい低級アルキル，（ｖｉ）シクロアルキル，（ｖｉｉ）低級アルキルで置換されていてもよいアリール，（ｉｘ）低級アルキルで置換されていてもよいヘテロ環，（ｘ）Ｒ７Ｒ８Ｎ−（Ｒ７及びＲ８：同一又は異なって，（１）Ｈ，（２）アリール若しくはＲ９−Ｏ−ＣＯ−で置換されていてもよい低級アルキル（Ｒ９：（１）Ｈ，若しくはアリールで置換されていてもよい低級アルキル），（ｘｉ）Ｒ１０−Ｔ１−（Ｒ１０：（１）Ｈ，（２）アリール，ＨＯ−Ｃ１−１０アルキレン−Ｏ−若しくはＨＯで置換されていてもよい低級アルキル，若しくは（３）アリール，Ｔ１：Ｏ若しくはＳ），又は（ｘｉｉ）Ｒ１１−Ｔ２−（Ｒ１１：（１）ＯＨ，（２）Ｒ７Ｒ８Ｎ−，（３）低級アルキル−Ｏ−，（４）低級アルキル，（５）アリール，若しくは（６）ヘテロ環（Ｔ２：ＣＯ若しくはＳＯ２）），
更にＲ３，Ｒ４及び隣接するＣ若しくはＲ５，Ｒ６及び隣接するＣと一体となってヘテロ環，環状炭化水素環を形成しベンゼン環と縮合することができる。）。
但し、上記式（ＩＩ）中Ｒ１及びＲ２が同一又は異なって，（ｉ）Ｈ，ＮＨ２，シクロヘキシル，置換されていてもよいフェニル，Ｒａ−（ＣＨ２）２−（Ｒａ：ＨＳ，ＨＯ，Ｒ７Ｒ８Ｎ，ＣＯＯＨ，エトキシ，ＣＮ，モルホリノ，クロロ），以下▲１▼乃至▲５▼の置換基で置換されていてもよいアルキル（▲１▼ＨＯＯＣ，▲２▼アルキル−Ｏ−ＣＯ−，▲３▼置換されていてもよいフェニル，▲４▼Ｒ７Ｒ８ＮＣＯＮＨＣＯ，又は▲５▼Ｒ７Ｒ８ＮＣＯＮＨＣＯ−），アルケニル、フェニル−Ｓ−，フェニル−ＳＯ２−，置換されていてもよいフェニルＮＨＣＳ−，置換されていてもよいフェニルＮＨＣＯ−，アルキル−Ｏ−ＣＯ−，Ｈ２ＮＣＳ，クロロ−ＣＯＣＨ２−，置換されていてもよい１，３，４−オキサジアゾール−２−イルメチル，或いはＲ１，Ｒ２及び隣接するＣと一体になってピラゾール−１−イル，インドール−１−イル，インダゾール−２−イル，ピペリジン−１−イル若しくはモルホリン−４−イルであり且つＲ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６が同一又は異なって，Ｈ，ハロゲン，ＮＯ２，アセチル，ＨＯ，低級アルキル−Ｏ−，ＨＯＯＣ−，低級アルキル−Ｏ−ＣＯ−，Ｈ２ＮＳＯ２−，又は低級アルキルである場合を除く。以下同様。）。
更に本発明の別の態様としては，上記式（ＩＩ）に記載の２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬である。
本発明の好ましい態様としては、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）中の置換基が以下のものである２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩である；
▲１▼Ｒ１及びＲ２が異なって，Ｈ，及び置換されていてもよい炭化水素基，より好ましくは炭化水素基がアルキルであり，更に好ましくは置換されていてもよいヘテロ環置換アルキルであり、
▲２▼Ｒ１及びＲ２が異なって，Ｈ，及び置換されていてもよいヘテロ環，更に好ましくは当該ヘテロ環がＳ及びＯから選択されるヘテロ原子を１乃至２個含有する４乃至６員単環であり，
▲３▼Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，及びＲ６がＨ，
▲４▼Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，及びＲ６が同一又は異なって，Ｈ及びハロゲン，
▲５▼Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，及びＲ６が同一又は異なって，Ｈ及び［（１）ハロゲン若しくは（２）ＯＨ］で置換されていてもよい低級アルキル，
▲６▼Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，及びＲ６が同一又は異なって，Ｈ，ハロゲン及び［（１）ハロゲン若しくは（２）ＯＨ］で置換されていてもよい低級アルキル，
▲７▼Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，及びＲ６が同一又は異なって，Ｈ及びＲ１０−Ｔ１−，又は
▲８▼Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，及びＲ６が同一又は異なって，Ｈ，ハロゲン及びＲ１０−Ｔ１−。
特に好ましくは，上記▲１▼乃至▲２▼の何れかと▲３▼乃至▲８▼の何れか一つとを組み合わせた２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩である。
好ましい化合物は、下表に示される何れか１つの２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩である。
【表１】
また、本発明の別の態様としては、上述ＢＥＣ１阻害剤を患者に投与することからなる痴呆の治療法である。
更に別の態様としては，ＢＥＣ１カリウムチャネルを発現させた細胞に被験化合物を接触させ当該チャネル活性を阻害することを同定するスクリーニング法で得られた化合物からなる医薬、殊に痴呆治療用医薬組成物の調製法である。
以下本明細書中における記号は同様の意味を示す。
一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示される化合物についてさらに説明すると，次の通りである。本明細書の一般式の定義において，特に断らない限り「低級」なる用語は炭素数１−６の直鎖又は分岐状の炭素鎖を意味する。
「ハロゲン」とはフッ素，塩素，臭素又はヨウ素原子が挙げられる。
「炭化水素基」とは炭素数１−１５，好ましくは炭素数１−１０の直鎖或いは分岐状炭化水素基又は炭素数３−１５の環状炭化水素基である。直鎖或いは分岐状炭化水素基として「アルキル」，「アルケニル」又は「アルキニル」である。具体的には「アルキル」としてはメチル，エチル，イソプロピル，ヘキシル，デシル，テトラデシル又はペンタデシル等である。「アルケニル」とは少なくとも１以上の二重結合を有する炭化水素基であり，ビニル，プロペニル，アリル，イソプロペニル，又はヘキセニル等である。「アルキニル」とは少なくとも１以上の三重結合を有する炭化水素基であり，エチニル，プロピニル，又はブチニル等である。環状炭化水素基として「シクロアルキル，「シクロアリール」又は「アリール」である。具体的には「シクロアルキル」は単環式飽和環であり，シクロプロピル，シクロペンチル，シクロヘキシル，シクロオクチル並びにシクロデシル等である。当該シクロアルキルは架橋していてもよくベンゼンと縮合していてもよい。例えば以下に示すＣ３−１０シクロアルキルが好ましい。「シクロアルケニル」は，１以上の二重結合を有する炭化水素環であり，当該シクロアルケニルはヘテロ環，アリール若しくはＣ３−１０シクロアルキルと縮合していてもよい。例えば以下に示すＣ３−８シクロアルケニルが好ましい。「アリール」とは芳香性の炭化水素基を意味し，例えば，Ｃ６−１４アリール，則ちフェニル，ナフチル，又はアンスリル等である。
当該アリールはヘテロ環，Ｃ３−１０シクロアルケニル，Ｃ３−１０シクロアルキル若しくはベンゼン縮合シクロアルキルと縮合していてもよい。例えば，以下に示す２乃至３環式が好ましい。
特にＲ３，Ｒ４及び隣接するＣ若しくはＲ５，Ｒ６及び隣接するＣと一体となってベンゼン環と縮合した２乃至３環式アリールは置換されていてもよい。
当該置換基としては、オキソ（＝Ｏ），低級アルキル，アリール，ＯＨ−アリール，低級アルキル−Ｏ−アリールが挙げられる。
「ヘテロ環」とはＮ，Ｓ及びＯから選択されるヘテロ原子を１乃至４個含有する４乃至７員単環式，２環式若しく３環式の脂肪族環又は芳香族環であり。当該環は架橋していてもよく、またＣ３−１０シクロアルキル若しくはアリールと縮合していてもよい。例えば以下に示すヘテロ環が好ましい具体例である。
上記ヘテロ環の内，芳香族含窒素ヘテロ環であるものは、当該環上の窒素原子は４級化されるか或いはＮ−オキシドを形成することができる。
「含窒素ヘテロ環」とは、少なくとも１個の窒素原子を有する上記ヘテロ環である。
「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基としては，好ましくは下記ａ群の置換基が挙げられる。
「置換されていてもよいヘテロ環」及び「Ｒ１，Ｒ２及び隣接するＮと一体となって形成することができる含窒素ヘテロ環」の置換基としては，好ましくは下記ｂ群の置換基が挙げられる。
ａ群：（ｉ）ＣＮ，（ｉｉ）ＮＯ２，（ｉｉｉ）ハロゲン，（ｉｖ）Ｒ７Ｒ８Ｎ−（Ｒ７及びＲ８：同一又は異なって，（１）Ｈ，（２）アリール若しくはＲ９−Ｏ−ＣＯ−で置換されていてもよい低級アルキル（Ｒ９：（１）Ｈ，若しくはアリールで置換されていてもよい低級アルキル），（３）ＣＮ若しくは低級アルキルで置換されていてもよいアリール，（４）ヘテロ環，（５）低級アルキル−ＣＯ−，（６）低級アルキル−Ｏ−ＣＯ−，（７）ＨＳ−若しくは低級アルキル−Ｓ−で置換されていてもよいシクロアルキル，（８）ＮＯ２で置換されていてもよいアリール−ＳＯ２−若しくは（９）ヘテロ環−ＳＯ２−），（ｖ）Ｒ１０−Ｔ１−（Ｒ１０：（１）Ｈ，（２）アリール，ＨＯ−Ｃ１−１０アルキレン−Ｏ−若しくはＨＯで置換されていてもよい低級アルキル，若しくは（３）アリール，Ｔ１：Ｏ若しくはＳ），（ｖｉ）Ｒ１１−Ｔ２−（Ｒ１１：（１）ＯＨ，（２）Ｒ７Ｒ８Ｎ−，（３）低級アルキル−Ｏ−，（４）低級アルキル，（５）アリール，若しくは（６）ヘテロ環（Ｔ２：ＣＯ若しくはＳＯ２）），（ｖｉｉ）下記（１）乃至（６）の置換基で置換されていてもよい低級アルキル（（１）ハロゲン，（２）ＣＮ，（３）ＯＨ，（４）Ｒ１０ＣＯ−，（５）Ｒ７Ｒ８Ｎ−若しくは（６）アリール），（ｖｉｉｉ）低級アルキルで置換されていてもよいシクロアルキル，（ｉｘ）シクロアルケニル，シクロアルキニル，（ｘｉ）下記（１）乃至（５）の置換基で置換されていてもよいアリール（（１）ハロゲン，（２）ＮＯ２，（３）Ｒ１２−Ｔ１−（Ｒ１２：Ｒ１０又はＯＨで置換されていてもよい低級アルキル−アリール），（４）Ｈ２ＮＯ２Ｓ−，若しくは（５）ハロゲン若しくはＯＨで置換されていてもよい低級アルキル），又は（ｘｉｉ）下記（１）乃至（９）の置換基で置換されていてもよいヘテロ環（（１）ハロゲン，（２）オキソ（＝Ｏ），（３）ＮＯ２，（４）［Ｒ７Ｒ８Ｎ−，Ｒ１０−Ｔ１−，（ＯＨ，ハロゲン若しくは低級アルキル−Ｏ−）で置換されていてもよいアリール］で置換されていてもよい低級アルキル，（５）ハロゲンで置換されてもよいアリール，（６）ＯＨ，（７）低級アルキル−Ｏ−（８）Ｒ７Ｒ８Ｎ−，又は（９）ヘテロ環），
「ＢＥＣ１」及び「ＢＥＣ１カリウムチャネル」とは，配列番号２に示された全長の蛋白質，又は当該蛋白質と同様の機能を有する当該蛋白質の断片，又は１以上のアミノ酸が置換欠失挿入されていてもよい当該蛋白質の断片或いは全長の蛋白質を意味する。
「ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有する物質」は，被験化合物を代表的なスクリーニング法、例えば米国特許第６，３２６，１６８号記載の方法に供することにより得られる。
ａ）Ｖｏｌｔａｇｅ−ｃｌｕｍｐ法を利用したスクリーニング方法
ＢＥＣ１カリウムチャネル蛋白質のチャネル活性はｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ ｖｏｌｔａｇｅ−ｃｌａｍｐ法により測定することが可能である。同チャネル蛋白質を発現させた細胞をｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ ｖｏｌｔａｇｅ−ｃｌａｍｐ法により膜電位固定し、全細胞電流を測定する。細胞外液には１４５ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む溶液、細胞内液（パッチ電極液）は１５５ｍＭ ＫＣｌを含む溶液などを用いる。脱分極刺激、すなわち、膜電位を保持電位（例えば−７０ｍＶ）から脱分極側（例えば−８０ｍＶ）にシフトさせることで生じる外向き電流を被検薬存在下と非存在下で比較することで、ＢＥＣ１カリウムチャネル蛋白質の活性を修飾する化合物およびペプチドをスクリーニングすることができる。
ｂ）Ｒｂ＋イオンの放出を利用したスクリーニング方法
一般的にカリウムチャネルはＫ＋イオンと同様にＲｂ＋イオンを通すことができるので、放射性同位元素８６Ｒｂ＋の放出を指標としてそのチャネル活性を測定することができる。新規カリウムチャネル蛋白質を発現させた細胞を８６ＲｂＣｌとインキュベート（例えば１８ｈｒ、３７℃）することにより、８６Ｒｂ＋を同細胞内に取り込ませることができる。細胞は、低濃度Ｋ＋生理食塩水（例えば４．５ｍＭ Ｋ＋）で洗浄した後同様液に懸濁する。細胞懸濁液に高濃度Ｋ＋溶液（例えば最終濃度１００ｍＭ）を添加すると、細胞の膜電位が脱分極しカリウムチャネルが活性化される。これに伴い、細胞内の８６Ｒｂ＋が細胞外へ放出されるので、細胞外液の放射活性をチャネル活性の指標とすることができる。被験薬存在下と非存在下で高濃度Ｋ＋溶液を添加した際の細胞外へ放出された放射活性を比較することで、ＢＥＣ１カリウムチャネル蛋白質の活性を修飾する化合物およびペプチドをスクリーニングすることが可能である。
ｃ）膜電位感受性色素や細胞内Ｋ＋検出色素を利用したスクリーニング方法
膜電位感受性色素や細胞内Ｋ＋検出色素は、カリウムチャネルの開口に伴う膜電位あるいは細胞内Ｋ＋濃度の変化を光学的に検出することが可能である。膜電位感受性色素として、ＲＨ１５５、ＷＷ７８１、Ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ、あるいはそれらの誘導体などを用いることができる。また、Ｓｈａｋｅｒ型の膜電位依存性カリウムチャネルのＣ末端細胞内領域にｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎのアミノ酸配列を挿入したキメラ蛋白質を膜電位の検出に用いることもできる（Ｓｉｅｇｅｌ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｉｓａｃｏｆｆ，Ｅ．Ｙ．（１９９７）Ｎｅｕｒｏｎ １９，７３５−７４１）。細胞内Ｋ＋検出色素としては、Ｋ＋−ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ ｉｓｏｐｈｔｈａｌａｔｅなどを用いることができる。これらの色素を用いることによりＢＥＣ１カリウムチャネルのチャネル活性を測定することができ、被験薬存在下と非存在下で変化量を比較することでＢＥＣ１カリウムチャネル蛋白質の活性を修飾する化合物およびペプチドをスクリーニングすることが可能である。
好ましいスクリーニング法としては，後述の８６Ｒｂイオン放出量を指標とした化合物のＢＥＣ１阻害活性測定法である。
更に、代表的な本発明化合物である実施例１３と被験化合物とを競合的にＢＥＣ１カリウムチャネル阻害させることにより当該作用を有する物質を得ることができる。
被験化合物は具体的には当該阻害活性があれば何れでもよいが市販品又はケミカルファイルに登録されている公知化合物、コンビナトリアル・ケミストリー技術によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、抗体やドミナントネガディブな蛋白質が挙げられる。更に当該物質を当業者には常法である化学変換による置換基等修飾したものも挙げられる。
本発明化合物は基の種類によっては，光学異性体（光学活性体，ジアステレオマー等）が存在する。また，本発明化合物はアミド結合や，二重結合を有する化合物もあり，アミド結合に基づく互変異性体や幾何異性体も存在する。本発明には，これらの異性体の分離されたもの，あるいは混合物を包含する。
本発明化合物は酸又は塩基と塩を形成する。酸との塩としては塩酸，臭化水素酸，ヨウ化水素酸，硫酸，硝酸，リン酸等の鉱酸等の無機酸や，ギ酸，酢酸，プロピオン酸，シュウ酸，マロン酸，コハク酸，フマール酸，マレイン酸，乳酸，リンゴ酸，クエン酸，酒石酸，炭酸，ピクリン酸，メタンスルホン酸，エタンスルホン酸，グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩を挙げることができる。
塩基との塩としてはナトリウム，カリウム，マグネシウム，カルシウム，アルミニウム等の無機塩基，メチルアミン，エチルアミン，メグルミン，エタノールアミン等の有機塩基又はリジン，アルギニン，オルニチン等の塩基性アミノ酸との塩やアンモニウム塩が挙げられる。さらに，本発明化合物は水和物，エタノール等との溶媒和物や結晶多形を形成することができる。
また，本発明有効成分又は本発明化合物には，生体内で代謝され変換される化合物，いわゆるプロドラッグも全て包含される。本発明のプロドラッグを形成する基としては，Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．，５，２１５７−２１６１（１９８５）や「医薬品の開発」第７巻（廣川書店，１９９０年）分子設計１６３−１９８頁に記載の基等が挙げられる。
（製造法）
本発明化合物及びその製薬学的に許容され得る塩は，その基本骨格あるいは置換基の種類に基づく特徴を利用し，種々の公知の合成法を適用して製造することができる。例えば酸化，還元，アミノ化，アルキル化，アミド化，スルホンアミド化，エステル化及びウレア化等の反応は，日本化学会編「実験化学講座」第４版（１９９１）（丸善）等の文献記載の条件を参考にして行うことができる。その際，官能基の種類によっては，当該官能基を原料乃至中間体の段階で適当な保護基（容易に当該官能基に転化可能な基）に置き換えておくことが製造技術上効果的な場合がある。このような官能基としては例えばアミノ基，ＯＨ（水酸基）及びＣＯＯＨ（カルボキシ）等であり，それらの保護基としては例えばグリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）及びウッツ（Ｗｕｔｓ）著，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第３版）」に記載の保護基等を挙げることができ，これらを反応条件に応じて適宜選択して用いればよい。このような方法では，当該保護基を導入して反応を行った後，必要に応じて保護基を除去することにより，所望の化合物を得ることができる。
以下，本発明化合物の原料及び本発明化合物の製造法を詳述する。本発明化合物は，自体公知の方法，例えばブリティン ド ラ ソシエテ ケミカ ド フランス，６巻，２１１２頁（１９７３年）（Ｂｕｌｌ．Ｓｏｃ．Ｃｈｉｍ．Ｆｒ．，６，２１１２（１９７３））等に記載の方法またはそれらに準じた方法などにより製造できるが，代表的な製造法を以下に示した。
（式中，Ｌ１，Ｌ２及びＬ３は脱離基を示す。）
脱離基としては，（ｉ）ハロゲン，（ｉｉ）メチルスルファニル，（ｉｉｉ）メチルスルフィニル，（ｉｖ）１乃至３のハロゲンで置換されていてもよいＣ１−６アルカンスルホニルオキシ基（例えばメタンスルホニルオキシ，トリフルオロメタンスルホニルオキシなど），又は（ｖ）１乃至４のＣ１−６アルキル若しくはハロゲンで置換されていてもよいＣ６−１０アレンスルホニルオキシ基（例えば，ｐ−トルエンスルホニルオキシ，ｐ−ブロモベンゼンスルホニルオキシなどが挙げられる。
Ａ製法
本発明化合物の原料化合物（ＩＶ）又は（ＶＩＩ）はアグリカルチャル アンド バイオロジカルケミストリー，５１巻，２５６３頁（１９８９年）（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，９，２５６３（１９８９）），ジャーナル オブ アメリカン ケミカル ソサイエティ，１１６巻，４３２６頁（１９９４年）（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６，４３２６（１９９４）），に記載の公知の方法またはそれらに準じた方法により合成することができる。
Ｂ製法
本発明化合物の原料化合物（Ｖ），（ＶＩ）或いは（ＶＩＩＩ）は，ジャーナル オブ アメリカン ケミカル ソサイエティ，１１６巻，２３８２頁（１９９４年）（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６，２３８２（１９９４）），米国特許第２４７６５４８号（ＵＳＰ−２４７６５４８），ジャーナル オブ ケミカル ソサイエティ，５６１頁（１９４８年）（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，５６１，（１９４８））有機合成化学協会誌，１８巻，３３２頁（１９６０年）に記載の公知の方法またはそれらに準じた方法により合成することができる。
Ｃ製法
本製法は化合物（ＩＶ），（Ｖ），（ＶＩ）或いは（ＶＩＩＩ）とアミン化合物（ＩＸ）或いはアニリン化合物（Ｘ）または（ＸＩ）を反応させ，本発明化合物（Ｉ−ａ）または（Ｉ−ｂ）を得る方法である。反応は無溶媒中もしくはベンゼン，トルエン或いはキシレン等の芳香族炭化水素類，ジエチルエーテル，テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）或いはジオキサン等のエーテル類，ジクロロメタン，１，２−ジクロロエタン或いはクロロホルム等のハロゲン化炭化水素類，Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ），Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ），Ｎ−メチルピロリドン，酢酸エチル，又はアセトニトリル等の反応に不活性な溶媒中，化合物（ＩＶ），（Ｖ），（ＶＩ）或いは（ＶＩＩＩ）と化合物（ＩＸ），（Ｘ）或いは（ＸＩ）を等モル乃至一方を過剰量用い，冷却下乃至加熱還流下にて行なわれる。反応温度は化合物に応じて適宜設定できる。化合物によっては，有機塩基（好ましくは，ジイソプロピルエチルアミン，Ｎ−メチルモルホリン，ピリジン，４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン）または金属塩塩基（好ましくは，水素化ナトリウム，炭酸カリウム，炭酸ナトリウム，炭酸水素ナトリウム，水酸化ナトリウム，水酸化カリウム）の存在下に行うのが好ましい場合がある。また、化合物によっては塩基の非存在下に反応させるのが，反応を円滑に進行させる上で有利な場合がある。
本発明化合物（Ｉ）は公知の手段，例えば溶媒抽出，液性変換，転溶，晶出，再結晶，クロマトグラフィーなどによって単離精製することができる。また，化合物（ＩＩＩ），（ＩＶ），（Ｖ），（ＶＩ），（ＶＩＩ）或いは（ＶＩＩＩ）の原料化合物またはその製薬学的に許容される塩は，前記と同様の公知の手段などによって単離精製することができるが，単離することなくそのまま反応混合物として次の工程の原料として供されてもよい。
なお，上記製造法は式中の置換基に限定されるものではなく本発明化合物が同様の置換基を有する場合に広く適用される。
このようにして製造された本発明化合物は，遊離のまま，あるいはその製薬学的に許容される塩として単離・精製される。
単離・精製は，抽出，濃縮，留去，結晶化，濾過，再結晶，各種クロマトグラフィー等の通常の化学操作を適用して行われる。
各種の異性体は，適当な原料化合物を選択することにより，あるいは異性体間の物理的性質の差を利用して分離することができる。例えば，光学異性体は，適当な原料を選択することにより，あるいはラセミ化合物のラセミ分割法（例えば，一般的な光学活性な塩基とのジアステレオマー塩に導き，光学分割する方法等）により立体科学的に純粋な異性体に導くことができる。
産業上の利用可能性
本発明は，ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害剤を有効成分とする抗痴呆薬に関する。
ＢＥＣ１カリウムチャネルが海馬，大脳皮質において高発現するトランスジェニック・マウスを作成しその行動を解析した結果から，当該マウスは，後述のモリス型水迷路学習試験，受動的回避学習試験，及び恐怖条件付け学習試験において，学習能力が低下していることが明らかとなった。また，ＢＥＣ１カリウムチャネルに対する抗体を用いてアルツハイマー病患者脳の免疫染色試験を行ったところ，海馬，大脳皮質の神経細胞においてその発現が増加していることが示唆された。以上のことは，アルツハイマー病患者の海馬，大脳皮質におけるＢＥＣ１カリウムチャネルの発現増加が，神経細胞の興奮性を低下させることにより記憶学習に関わる神経伝達を抑制している可能性を示唆している。
さらに鋭意研究を行った結果、ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害剤、代表的な化合物として実施例７４４に示す化合物が、マウス受動的回避学習試験において電撃痙攣（ＥＣＳ）で誘発される学習障害を改善する作用を示すことが確認された。
以上より，ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害剤は学習障害の改善作用を有し，ＢＥＣ１カリウムチャネルが関与していると考えられる疾患，好ましくは痴呆の予防又は治療剤として有用であることが実証された。
ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害剤又はその製薬学的に許容される塩の１種又は２種以上を有効成分として含有する製剤は，通常製剤化に用いられる担体や賦形剤，その他の添加剤を用いて調製される。
製剤用の担体や賦形剤としては，固体又は液体いずれでも良く，例えば乳糖，ステアリン酸マグネシウム，スターチ，タルク，ゼラチン，寒天，ペクチン，アラビアゴム，オリーブ油，ゴマ油，カカオバター，エチレングリコール等やその他常用のものが挙げられる。
投与は錠剤，丸剤，カプセル剤，顆粒剤，散剤，液剤等による経口投与，あるいは静注，筋注等の注射剤，坐剤，経皮等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。投与量は症状，投与対象の年齢，性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定されるが，通常成人１人当たり，１日につき１〜１，０００ｍｇ，好ましくは５０〜２００ｍｇの範囲で１日１回から数回に分け経口投与されるか又は成人１人当たり，１日につき１〜５００ｍｇの範囲で，１日１回から数回に分け静脈内投与されるか，又は，１日１時間〜２４時間の範囲で静脈内持続投与される。もちろん前記したように，投与量は種々の条件で変動するので，上記投与量範囲より少ない量で十分な場合もある。
本発明による経口投与のための固体組成物としては，錠剤，散剤，顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては，一つまたはそれ以上の活性物質が，少なくとも一つの不活性な希釈剤，例えば乳糖，マンニトール，ブドウ糖，ヒドロキシプロピルセルロース，微結晶セルロース，デンプン，ポリビニルピロリドン，メタケイ酸アルミン酸マグネシウムと混合される。組成物は，常法に従って，不活性な希釈剤以外の添加剤，例えばステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤や繊維素グルコール酸カルシウムのような崩壊剤，ラクトースのような安定化剤，グルタミン酸又はアスパラギン酸のような溶解補助剤を含有していてもよい。
錠剤又は丸剤は必要によりショ糖，ゼラチン，ヒドロキシプロピルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等の糖衣又は胃溶性あるいは腸溶性物質のフィルムで被膜してもよい。
経口投与のための液体組成物は，薬剤的に許容される乳濁剤，溶液剤，懸濁剤，シロップ剤，エリキシル剤等を含み，一般的に用いられる不活性な希釈剤，例えば精製水，エタノールを含む。この組成物は不活性な希釈剤以外に湿潤剤，懸濁剤のような補助剤，甘味剤，風味剤，芳香剤，防腐剤を含有していてもよい。
非経口投与のための注射剤としては，無菌の水性又は非水性の溶液剤，懸濁剤，乳濁剤を包含する。水性の溶液剤，懸濁剤としては，例えば注射用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水溶性の溶液剤，懸濁剤としては，例えばプロピレングリコール，ポリエチレングリコール，オリーブ油のような植物油，エタノールのようなアルコール類，ポリソルベート８０等がある。
このような組成物はさらに防腐剤，湿潤剤，乳化剤，分散剤，安定化剤（例えば，ラクトース），溶解補助剤（例えば，グルタミン酸，アスパラギン酸）のような補助剤を含んでいてもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過，殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。また，これらは無菌の固体組成物を製造し，使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。
発明を実施するための最良の形態
（実施例）
次に，実施例により本発明をさらに詳細に説明するが，本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚，実施例で用いられる原料化合物の製造方法を参考例として説明する。
以下に記載の％は特記しない限り重量パーセントを意味する。その他の本文中で用いている略号は下記の意味を示す。
表中の記号は以下の通りである。
Ｅｘ：実施例番号
Ｒｅｆ：参考例番号
Ｆ：フルオロ，Ｃｌ：クロロ，ＮＯ２：ニトロ，ＯＨ：ヒドロキシ，ＣＮ：シアノ，Ｍｅ：メチル，Ｅｔ：エチル，Ｐｈ：フェニル，Ｐｙ：ピリジン，Ｐｙ−２−ｙｌＣＨ２ＮＨ：ピリジン−２−イルメチルアミン，Ｐｙ−３−ｙｌＣＨ２ＮＨ：ピリジン−３−イルメチルアミノ，Ｐｙ−４−ｙｌＣＨ２ＮＨ：ピリジン−４−イルメチルアミノ，ＣＦ３：トリフルオロメチル，ｉＰｒ：イソプロピル，Ｐｅｎ：ペンチル，ｃＰｒ：シクロプロピル，ｃＨｅｘ：シクロヘキシル，Ｂｚｌ：ベンジル，Ｂｚ：ベンゾイル，ｄｉＭｅＰｈＮＨ：ジメチルフェニルアミノ，ｄｉＭｅＯＰｈＮＨ：ジメトキシフェニルアミノ，ｄｉＣｌＰｈＮＨ：ジクロロフェニルアミノ，ｄｉＣＦ３ＰｈＮＨ：ジトリフルオロメチルフェニルアミノ，Ａｃ：アセチル，ＡｃＯＥｔ：酢酸エチル，ｆｒｅｅ：フリー体，
ＮＭＲ：核磁気共鳴スペクトル（テトラメチルシラン（ＴＭＳ）内部標準で測定（ｐｐｍで表示））
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは，ＴＭＳを内部標準物質としたときのケミカルシフト値で表し，シグナルを以下の略号で表す。ｓ：ｓｉｎｇｌｅｔ，ｄ：ｄｏｕｂｌｅｔ，ｔ：ｔｒｉｐｌｅｔ，ｑ：ｑｕａｒｔｅｔ，ｂｒ：ｂｒｏａｄ，ｍ：ｍｕｌｔｉｐｌｅｔ
ｍ．ｐ．：融点［℃］（融点は，柳本製融点測定器ヤナコＭＰ−Ｓ３を用いて測定し，未補正値を示した。）
ＭＳ：ＦＡＢ−ＭＳ，ＭＡＳＳ：ＥＳＩ−ＭＳ，ＨＰＬＣ ｒｔ：ＨＰＬＣ保持時間
測定装置：ＨＰＬＣ ＷＡＴＥＲＳ製２７９０セパレーションモジュール
ＭＳ ｍｉｃｒｏｍａｓｓ製ＺＭＤ
ＰＤＡ検出器ＷＡＴＥＲＳ製９９６フォトダイオードアレイ検出器
測定条件：カラム和光純薬工業製ＷＡＫＯＳＩＬ−２ ５Ｃ１８ＡＲ
２．０ミリメートルＩ．Ｄ．ｘ３０ミリメートル
カラム温度 ３５℃
移動相 Ａ液＝５ｍＭトリフルオロ酢酸水溶液，Ｂ液＝メタノール
検出波長２５４ｎｍまたは２１０ｎｍ
試料導入量５μＬ
流速１．２ｍｌ／ｍｉｎ
なお，移動相の混合比は初期溶媒条件を１０％移動相Ｂとし，その後４分かけて１００％移動相Ｂまで直線勾配で増加させ，続けて０．５分を１００％移動相Ｂとした。
原料化合物を参考例に示す。
参考例１
２，４−ジクロロ−６−アニリノ−１，３，５−トリアジン２．４１ｇをアセトニトリル２０ｍｌに溶解し，これにジイソプロピルエチルアミン２．０９ｍｌ，ｐ−フルオロアニリン１．２３ｇを加え，室温にて終夜攪拌した。反応液に水を加えた後，酢酸エチルで抽出し，有機層を１Ｍ塩酸，飽和食塩水で洗浄後，無水硫酸マグネシウムで乾燥した。
溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し，酢酸エチル：ｎ−ヘキサン（１：９）にて溶出し，得られた粗製物をベンゼンから結晶化することにより，６−クロロ−Ｎ−（４−フルオロフェニル）−Ｎ’−フェニル−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミン２．２５ｇを白色固体として得た。
参考例１と同様にして，下表４に示す参考例２乃至５の化合物を合成した。
参考例６
４，６−ジクロロ−Ｎ−（４−フルオロフェニル）−１，３，５−トリアジン２．５９ｇをアセトニトリル２０ｍｌに溶解し，これにジイソプロピルエチルアミン２．０９ｍｌ，ｐ−トルイジン１．１８ｇを加え，室温にて終夜攪拌した。反応液に水を加えた後，酢酸エチルで抽出し，有機層を１Ｍ塩酸，飽和食塩水で洗浄後，無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し，酢酸エチル：ｎ−ヘキサン（１：９）にて溶出し，得られた粗製物をベンゼンから結晶化することにより，６−クロロ−Ｎ−（４−フルオロフェニル）−Ｎ’−（４−メチルフェニル）−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミン２．７４ｇを白色固体として得た。
参考例６と同様にして，下表４に示す参考例７乃至１２の化合物を合成した。
実施例１
６−クロロ−Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミン２００ｍｇをアセトニトリル１０．０ｍｌに溶解し，これに４−（アミノメチル）ピリジン１４５ｍｇ，ジイソプロピルエチルアミン０．５８５ｍｌを加え，８０℃にて終夜攪拌した。反応液を室温まで冷却した後，水を加え，クロロホルムで抽出した。有機層を５％クエン酸水溶液，飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し，酢酸エチル：ｎ−ヘキサン（２：１）で溶出し，得られた粗製物を酢酸エチル／ｎ−ヘキサンから結晶化することにより，Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−Ｎ’’−（４−ピリジルメチル）−１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン１０７ｍｇを淡赤色結晶として得た。
実施例１と同様にして，下表５乃至７及び下表２８乃至３５に示す実施例２乃至３８及び実施例７４０乃至８１５の化合物を合成した。
実施例３９
（４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル）イソプロピルアミン２０７ｍｇをアセトニトリル１０．０ｍｌに溶解し，これに４−メトキシアニリン３６９ｍｇを加え，８０℃にて３日間攪拌した。反応液を室温まで冷却した後，水を加え，酢酸エチルで抽出した。有機層を１Ｍ塩酸水溶液，飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し，酢酸エチル：ｎ−ヘキサン（２：１）で溶出し，粗製物を得た。この粗製物を酢酸エチルに溶解し，これに４Ｍ塩酸酢酸エチル溶液を加え，溶媒を減圧留去して得られた残渣を酢酸エチルから結晶化することにより，Ｎ−イソプロピル−Ｎ’，Ｎ’’−ビス（４−メトキシフェニル）−１，３，５−トリアジン−１，３，５−トリアミン塩酸塩３３２ｍｇを無色結晶として得た。実施例３９と同様にして，下表７に示す実施例４０乃至４４の化合物を合成した。
実施例４５
参考例１で合成した６−クロロ−Ｎ−（４−フルオロフェニル）−Ｎ’−フェニル−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミン３１６ｍｇをアセトニトリル１０．０ｍｌに溶解し，これにジイソプロピルエチルアミン０．５２３ｍｌ，イソプロピルアミン０．１７０ｍｌを加え，８０℃にて終夜攪拌した。反応液を室温まで冷却した後，水を加え，酢酸エチルで抽出した。有機層を５％クエン酸水溶液，飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し，酢酸エチル：ｎ−ヘキサン（２：１）で溶出し，粗製物を得た。この粗製物を酢酸エチルに溶解し，これに４Ｍ塩酸酢酸エチル溶液を加え，溶媒を減圧留去して得られた残渣を酢酸エチルから結晶化することにより，Ｎ−（４−フロオロフェニル）−Ｎ’−イソプロピル−Ｎ’’−フェニル−１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン塩酸塩３２７ｍｇを無色結晶として得た。実施例４５と同様にして，下表８に示す実施例４６乃至５０の化合物を合成した。
実施例５１（コンビナトリアル・ケミストリーによる合成例）
６−クロロ−Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミン８．９ｍｇ（３０μｍｏｌ）のアセトニトリル４００μｌとＮ−メチルピロリドン１２０μｌの混合溶液にｐ−フルオロベンジルアミンを７．５ｍｇ（６０μｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン５２μｌを加え，８０℃にて３時間攪拌した。反応液を濾過後，分取用ＬＣ−ＭＳ装置に注入し，望む分子量を含む分画を集めた。溶媒を留去し，Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−Ｎ’’−（４−フルオロベンジル）−１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン６．１ｍｇ（収率４５％）を得た。分析用ＬＣ−ＭＳにより，保持時間２．７７分，純度９３％を決定した。
実施例５１と同様にして，下表９乃至１８に示す実施例５２乃至４１８の化合物を合成した。
実施例４１９
６−クロロ−Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミン８．９ｍｇ（３０μｍｏｌ）のアセトニトリル４００μｌとＮ−メチルピロリドン１２０μｌの混合溶液に２−フルオロアニリンを６．７ｍｇ（６０μｍｏｌ）加え，８０℃にて３時間攪拌した。反応液を濾過後，分取用ＬＣ−ＭＳ装置に注入し，望む分子量を含む分画を集めた。
溶媒を留去し，Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−Ｎ’’−（２−フルオロフェニル）−１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン６．０ｍｇ（収率５４％）を得た。分析用ＬＣ−ＭＳにより，保持時間３．０１分，純度９４％を決定した。実施例４１９と同様にして，下表１９乃至２２に示す実施例４２０乃至５８３の化合物を合成した。
実施例５８４
２，６−ジクロロ−Ｎ−イソプロピル−１，３，５−トリアジン−４−アミン１０ｍｇをＮ−メチル−２−ピロリドン６００μｌに溶解し，これに２−フルオロアニリンの０．５ｍＭ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液４００μｌ，ジイソプロピルエチルアミン２６μｌを加え，１２０℃にて３日間攪拌した。反応液にアルゴノート社のＰＳ−トリスアミン（４．２７ｍｍｏｌ／ｇ）５０ｍｇを加え，更に１２０℃にて７時間攪拌した。反応液を５０℃まで冷却した後，アルゴノート社のＰＳ−ベンズアルデヒド（１．５３ｍｍｏｌ／ｇ）５０ｍｇを加え，更に５０℃にて１６時間攪拌した。反応液を室温まで冷却した後，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液とクロロホルムを加えて攪拌した。溶液を濾過した後に有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し，溶媒を減圧留去して，Ｎ，Ｎ’−ジ−（２−フルオロフェニル）−Ｎ’’−イソプロピル−１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン７ｍｇを褐色樹脂状物質として得た。
実施例５８４と同様にして，下表２３乃至２４に示す実施例５８５乃至６３６の化合物を合成した。
実施例６３７
６−クロロ−Ｎ−イソプロピル−Ｎ’−フェニル−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミン１４ｍｇをＮ−メチル−２−ピロリドン８００μｌに溶解し，これに２−フルオロアニリンの０．５ｍＭ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液２００μｌ，４Ｍ塩酸／ジオキサン５０μｌを加え，８０℃にて７時間攪拌した。反応液を６０℃まで冷却した後，反応液にアルゴノート社のＰＳ−トリスアミン（４．２７ｍｍｏｌ／ｇ）５０ｍｇ，ＰＳ−ベンズアルデヒド（１．５３ｍｍｏｌ／ｇ）５０ｍｇを加え，更に６０℃にて１６時間攪拌した。反応液を室温まで冷却した後，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液とクロロホルムを加えて攪拌した。溶液を濾過した後に有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し，溶媒を減圧留去してＮ−（２−フルオロフェニル）−Ｎ’−イソプロピル−Ｎ’’−フェニル−１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン１３ｍｇを褐色樹脂状物質として得た。実施例６３７と同様にして，下表２４乃至２７に示す実施例６３８乃至７３９に示す化合物を合成した。
実施例８１６
実施例７５３で合成したＮ−（４−フルオロフェニル）−Ｎ’−［（６−メトキシピリジン−３−イル）メチル］−Ｎ’’−フェニルｌ−１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン塩酸塩５６５ｍｇに２５％臭化水素酸酢酸溶液５ｍｌ及び４８％臭化水素酸水溶液１ｍｌを加え，８０℃にて６時間攪拌した。反応溶液を減圧留去したのち、，酢酸エチル及び炭酸水素ナトリウム水溶液を順次加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し，クロロホルム：メタノール（９９：１）で溶出し，粗製物を得た。この粗製物を酢酸エチルに溶解し，これに４Ｍ塩酸酢酸エチル溶液を加え，生じた結晶をろ別乾燥することにより，５−［（｛４−アニリノ−６−［（４−フルオロフェニル）アミノ］−１，３，５−トリアジン−２−イル｝アミノ）メチル］ピリジン−２（１Ｈ）−オン塩酸塩１９５ｍｇを無色結晶として得た。実施例８１６と同様にして，下表３５に示す実施例８１７及び８１８の化合物を合成した。
実施例８１９
実施例７５８で合成したｔｅｒｔ−ブチル｛６−［（｛４−アニリノ−６−［（４−フルオロフェニル）アミノ］−１，３，５−トリアジン−２−イル｝アミノ）メチル］ピリジン−２−イル｝カルバマート塩酸塩２５０ｍｇを酢酸エチル１０．０ｍｌに溶解し，これに４Ｍ塩酸酢酸エチル溶液１０．０ｍｌを加え，室温にて４時間攪拌した。生じた淡黄色結晶をろ別乾燥することにより、Ｎ−［（６−アミノピリジン−２−イル）メチル］−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）−Ｎ’’−フェニル−１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン塩酸塩１９０ｍｇを淡黄色結晶として得た。
実施例８２０
実施例７６７で合成したＮ−（４−フルオロフェニル）−Ｎ’−｛［１−（４−メトキシベンジル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−イル］メチル｝−Ｎ’’−フェニル−１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン塩酸塩３６０ｍｇをトリフルオロ酢酸５ｍｌに溶解し、７０℃にて終夜攪拌した。反応溶液を減圧留去したのち、，酢酸エチル及び炭酸水素ナトリウム水溶液を順次加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し，クロロホルム：メタノール（９２：８）で溶出し，粗製物を得た。この粗製物を酢酸エチルに溶解し，これに４Ｍ塩酸酢酸エチル溶液を加え，生じた結晶をろ別乾燥することにより，Ｎ−（４−フルオロフェニル）−Ｎ’−フェニル−Ｎ’’−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イルメチル）−１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン塩酸塩２６８ｍｇを無色結晶として得た。
実施例８２１
［（１−トリチル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチル］アミン６７８ｍｇをアセトニトリル１０．０ｍｌに溶解し，これにジイソプロピルエチルアミン０．５２ｍｌ及び参考例１で合成した６−クロロ−Ｎ−（４−フルオロフェニル）−Ｎ’−フェニル−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミン３１６ｍｇを加え，８０℃にて３日間攪拌した。反応液を室温まで冷却した後，水を加え，酢酸エチルで抽出した。有機層をクエン酸水溶液，飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し，クロロホルム：メタノール（９９：１）で溶出し，粗製物を得た。この粗製物を酢酸９ｍｌ及び水１ｍｌに溶解し、７０℃にて２時間攪拌した。反応溶液を減圧留去したのち，酢酸エチル及び炭酸水素ナトリウム水溶液を順次加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し，クロロホルム：メタノール（９０：１０）で溶出し，粗製物を得た。この粗製物を酢酸エチルに溶解し，これに４Ｍ塩酸酢酸エチル溶液を加え，生じた結晶をろ別乾燥することにより，Ｎ−（４−フルオロフェニル）−Ｎ’−（１Ｈ−イミダゾール−４−イルメチル）−Ｎ’’−フェニル−１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン塩酸塩３０６ｍｇを無色結晶として得た。
以下に参考例及び実施例化合物の構造及び物性値を表４乃至３５に示す。
また、前記実施例と同様にして下表３６乃至３９に示す化合物も合成できる。表中の記号Ｎｏは化合物番号を示す。
実施例８２２
（試験法）
８６Ｒｂイオン放出量を指標とした化合物のＢＥＣ１阻害活性測定法
ＢＥＣ１のチャネル活性は，ＷＯ９９／３７６７７記載の方法に準じ，ＢＥＣ１発現細胞からの放射性同位元素８６Ｒｂイオンの放出を指標として測定した。すなわち，８６Ｒｂイオンを取り込ませたＢＥＣ１発現細胞を１００ｍＭ ＫＣｌで刺激した際に同細胞から放出される放射活性をＢＥＣ１のチャネル活性とした。８６Ｒｂイオンは，ＢＥＣ１安定発現細胞を８６ＲｂＣｌ（０．５μＣｉ／ｍｌ）存在下で培養（３時間，３７℃）することにより細胞に取り込ませ，ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４，２．５ｍＭ ＫＣｌ）で３回洗浄することにより取り込まれなった８６Ｒｂイオンを取り除いた。同細胞は，被検化合物を含むＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水で１５分間室温下でインキュベートし，その後同化合物を含む１００ｍＭ ＫＣｌ含有ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）でさらに５分間室温下でインキュベートした。細胞外液を回収した後，残った細胞を０．１Ｎ ＮａＯＨで溶解し回収した。
細胞外液と細胞溶解液のチェレンコフ放射活性をそれぞれ測定し，その合計を総放射活性とした。８６Ｒｂイオン放出量は，総放射活性に対する細胞外液放射活性の百分率で表した。化合物存在下で得られた値を検査値，化合物非存在下で得られた値をコントロール値，１００ｍＭ ＫＣｌで刺激しなかった際に得られた値をブランク値とした。化合物の阻害作用は，阻害％すなわち（コントロール値−検査値）×１００／（コントロール値−ブランク値），あるいは，阻害％から求めたＩＣ５０値で表した。代表的な化合物の試験結果を下表２及び３に示した通り，当該化合物はＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有することが確認された。
なお，ＢＥＣ１発現細胞は，チャイニース・ハムスター卵巣細胞のジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）欠損株を用いてＷＯ９９／３７６７７記載の方法に準じて作成したＢＥＣ１安定発現細胞を用いた。
【表２】
【表３】
実施例８２３
電気生理的手法を用いた，化合物によるＢＥＣ１電流阻害活性の評価
ＢＥＣ１発現細胞をｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ ｖｏｌｔａｇｅ−ｃｌａｍｐ法により膜電位固定し，全細胞電流を測定した。細胞外液は１４０ｍＭ ＮａＣｌ，５．４ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＣａＣｌ２，０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２，１５ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨを添加しｐＨ＝７．４），細胞内液（パッチ電極液）は１２５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ２，２ｍＭ ＭｇＣｌ２，１１ｍＭ ＥＧＴＡ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＫＯＨを添加しｐＨ＝７．２）を用いた。
膜電位を−９０ｍＶから０ｍＶへ脱分極することにより，持続的な外向き電流が惹起される。この外向き電流の，薬剤非存在下での強度（コントロール値）と被検化合物投与時の電流強度（検査値）を比較することにより，阻害％［（検査値／コントロール値）×１００］を求めた。
試験結果
その結果，実施例１３の化合物では，１μＭの濃度で，５０％以上の阻害を示した。
実施例８２４
トランスジェニック・マウスの作成
〈ＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウス作成用導入遺伝子の構築〉
配列番号２記載のアミノ酸配列を有するＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウスを作成するための導入遺伝子は，α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩ遺伝子のプロモーター領域の下流に５’イントロンとポリＡ付加シグナルを持った，ＢＥＣ１ ｃＤＮＡ（配列番号１）をつないだ遺伝子からなっている。α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩのプロモーター領域は，Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって互いにオーバーラップする部分を持つ２断片として取得した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムＤＮＡは，同マウスの血液からゲノムＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。プライマーは遺伝子データベースＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＪ２２２７９６）をもとに設計した。フォワードプライマーとして配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し，リバースプライマーとして配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて４．６ｋｂの遺伝子断片を得た。前記フォワードプライマーの５’末端側にはＡａｔｌｌ認識配列が付加してある。また，フォワードプライマーとして配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し，リバースプライマーとして配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて３．７ｋｂの遺伝子断片を得た。前記リバースプライマーの５’末端側にはＳａｌｌ認識配列が付加してある。それぞれのＰＣＲは，ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて９９℃（１分）熱変性後，９９℃（１５秒），５８℃（１５秒），７５℃（１０分）を４５サイクル，あるいは９５℃（１分）熱変性後，９５℃（１５秒），６２℃（１５秒），７５℃（８分）を４０サイクル実施し，得られた遺伝子断片は，クローニングベクター（ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ ｐｌａｓｍｉｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。４．６−ｋｂ断片と３．７−ｋｂ断片のオーバーラップする部分には内在性のＸｍａｌ認識配列が存在する。４．６−ｋｂ断片を制限酵素ＡａｔｌｌおよびＸｍａｌで消化し，３．７−ｋｂ断片を制限酵素ＸｍａｌおよびＳａｌｌで消化した。得られた各断片をライゲーションし，ＡａｔｌｌおよびＳａｌｌ認識配列を利用してプラスミドｐＵＣ１８（東洋紡績社），にクローニングした。以上の操作により目的のα−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩプロモーター領域が得られた。一方，ＢＥＣ１ ｃＤＮＡ（配列番号１）は，５’イントロンとポリＡ付加シグナルを含んだ断片として，カリウムチャネル発現ベクターｐＭＥ−Ｅ１（ＷＯ ９９／３７６７７に記載）を鋳型としてＰＣＲにより取得した。フォワードプライマーとして配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを，リバースプライマーとして配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを，それぞれ５’イントロンの上流配列とポリＡ付加シグナルの下流配列から設計した。
前記フォワードプライマーにはＳａｌｌ認識配列を，リバースプライマーにはＫｐｎｌ，Ｎｏｔｌ認識配列を付加してある。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて９６℃（１分）熱変性後，９６℃（１５秒），６０℃（１５秒），７５℃（８分）を３０サイクル実施した。得られた３．７−ｋｂ断片は，クローニングベクター（ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ ｐｌａｓｍｉｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。同断片はＳｐｅｌ認識配列およびＫｐｎｌ認識配列を利用してプラスミドｐＵＣ１８（東洋紡績社）にサブクローニングし，さらにその上流にＡａｔｌｌ認識配列およびＳａｌｌ認識配列を利用して前記α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩのプロモーター領域をサブクローニングした。以上の操作により最終的なＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウス作成用導入遺伝子（１２ｋｂ）を持つプラスミド（ｐＣＭ−Ｅ１ ｐｌａｓｍｉｄと命名した）が得られた。
〈ＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウスの作製および同定〉
ＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウス作製用導入遺伝子（１２ｋｂ）は，ｐＣＭ−Ｅ１からＡａｔｌｌおよびＮｏｔｌ制限酵素を用いて切り出した後単離精製した。得られた同遺伝子をＣ５７ＢＬ／６とＤＢＡ２マウスのＦ１交雑マウスの受精卵２８３個にマイクロインジェクションした後，同受精卵を仮親ＩＣＲマウスの卵管に移植した（Ｈｏｇａｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）。妊娠マウスを自然分娩させ，得られた仔マウス８１匹についてトランスジェニックマウスの同定を行った。
トランスジェニックマウスを同定するため，仔マウスの尻尾より単離したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ゲノムＤＮＡはマウスの尻尾からゲノムＤＮＡ抽出キット（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ−，東洋紡績社）を用いて精製した。ＢＥＣ１ ｃＤＮＡ配列（配列番号１）よりフォワードプライマーとして配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド，リバースプライマーとして配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを設計し，これを用いてＰＣＲを行うと，導入遺伝子からは２４５−ｂｐ断片が，マウスゲノムＤＮＡからはマウスＢＥＣ１が９３−ｂｐイントロンを含んだ３３８−ｂｐ断片として増幅される。同プライマーを用いて，得られた仔マウス由来ゲノムＤＮＡについてＰＣＲを行った。
ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ，Ｒｏｃｈｅ社）を用いて，９４℃（１分）熱変性を行った後，９４℃（１５秒），６０℃（１５秒），７２℃（３０秒）を３５サイクル実施した。その結果，仔マウス８１匹中１６匹がトランスジェニックマウスであることが同定された。
〈ＢＥＣ１ ｍＲＮＡの定量〉
導入された遺伝子が実際に機能しＢＥＣ１ ｍＲＮＡが過剰発現していることを確認するため，トランスジェニックマウスの脳でのＢＥＣ１ ｍＲＮＡの発現を解析した。脳摘出用のＦ１マウスを得るため，トランスジェニックマウス１６匹のうち１１匹についてＣ５７ＢＬ／６マウスと交配させた。その結果，５匹のトランスジェニックマウスにおいてＦ１マウスへの導入遺伝子の伝播が確認された。得られたＦ１トランスジェニックマウス（４週齢）から前脳と小脳を摘出し，それぞれＲＮＡを単離した。
各ＲＮＡはゲノムＤＮＡの混入を防ぐするためＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で消化した。得られたＲＮＡ中のＢＥＣ１ ｍＲＮＡコピー数をＰＲＩＳＭ７７００（ＡＢＩ社）と蛍光試薬ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いたリアルタイムＰＣＲにより定量した。リアルタイムＰＣＲの鋳型として，各ＲＮＡから逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応キット（Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲ ｋｉｔ，クロンテック社）により合成した一本鎖ｃＤＮＡを用いた。フォワードプライマーとして配列番号１１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド，リバースプライマーとして配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを，導入遺伝子であるヒトＢＥＣ１とラットおよびマウスのＢＥＣ１に共通する配列から設計した。
リアルタイムＰＣＲの結果，５系統のトランスジェニックマウスのうち３系統（＃６−５，＃７−７，＃９−５）に野生型の約１０倍の前脳選択的なＢＥＣ１ ｍＲＮＡ過剰発現が認められた。系統＃９−５を選択し，さらに脳各部位（大脳皮質，海馬，線条体，視床下部，視床，中脳，脳幹，小脳）のＢＥＣ１ ｍＲＮＡ発現量を野生型マウスとトランスジェニックマウスで比較した。その結果，トランスジェニックマウスでのＢＥＣ１ ｍＲＮＡ過剰発現は，野生型でも発現の認められた大脳皮質，海馬，線条体において顕著であることが確認された。
実施例８２５
〈ＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウスのモリス式水迷路試験における学習行動解析〉
ＢＥＣ１過剰発現の学習行動に与える作用を解析するため，＃９−５系統のトランスジェニックマウスと野生型マウスのモリス式水迷路における学習行動を比較した。
生後１０週齢オスのトランスジェニックマウス（１２匹）と野生型マウス（１５匹）を用いた。直径１００ｃｍの円形のプールに絵の具を用いて白濁させた水をはり，水面下５ｍｍの位置に直径１０ｃｍの円形のプラットフォームを設置した。実験時の室温および水温は２３℃であった。プールに入れたマウスの水泳の軌跡を水迷路画像解析装置（ＮＩＨ ｉｍａｇｅ−小原医科産業）によって記録解析し，プラットフォームへの到達時間，プールを４分割したときの各領域への滞在時間を測定した。トレーニングの１試行は７０秒とし，１日３試行のトレーニングを５日間行った。トレーニング初日のプラットフォーム到達所要時間は両群ともほぼ同じ値であったが，トレーニング開始３日目以降はトランスジェニックマウスの所要時間は野生型よりも延長された。トレーニング最終日には，プラットフォーム到達所要時間（平均値±標準誤差）は野生型６．９±１．０秒に対しトランスジェニックマウス１８．１±６．４秒となり統計的に有意な差が認められた（ｐ〈０．０５：二元配置分散分析）。
トレーニング終了後，プラットフォームを除去したプールに４０秒間マウスを入れ，マウスのプラットフォーム存在領域に滞在する時間を測定した。その結果，トランスジェニックマウスの滞在時間は野生型よりも統計的に有意に短かった（ｐ〈０．０１：Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
以上の結果は，トランスジェニックマウスではプラットフォーム位置の記憶学習が低下していることを示す。
実施例８２６
〈ＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウスの受動的回避試験における学習行動解析〉
生後８週齢メスの＃９−５系統トランスジェニックマウス（６匹）と野生型マウス（８匹）を用いた。マウス用明暗実験装置（小原医科産業）の明箱部分にマウスを入れ，マウスが暗箱に進入した時点で６０Ｖ・２秒間の定電圧刺激を与えた。２４時間後に再びマウスを明箱に入れ，この時の暗箱進入潜時を測定した。
その結果，トランスジェニックマウスの暗箱進入潜時は１６７秒（中央値）であり野生型マウスの６００秒（中央値）に比べ有意に短かった（ｐ〈０．０５：Ｗｉｌｅｃｏｘｏｎ ｒａｎｋ ｓｕｍ ｔｅｓｔ）。
トランスジェニックマウスでは暗箱に関連づけられた電気刺激を学習する能力が低下していることが示された。
実施例８２７
電撃痙攣ショック（ＥＣＳ）誘発学習障害（マウス受動回避反応試験）
既報（Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３２１；２７３−２７８、１９９７）を参考に以下のように評価を行った。
動物；ｄｄＹ系雄性マウス（ＳＬＣ、訓練時５週齢）を用いた。１群３１−３２匹とした。
＜実験手順＞
薬剤調製
評価化合物は生理食塩水中に０．５％となるようメチルセルロースを溶解した溶液（以下、０．５％メチルセルロース溶液）に懸濁した。投与容量は体重１ｋｇ当たり１０ｍｌとした。評価化合物の偽薬として体重１ｋｇ当たり１０ｍｌの０．５％メチルセルロース溶液（以下、Ｖｅｈｉｃｌｅ）を投与した。
訓練
（１）実験１日目にマウスを実験室に１時間以上放置した。
（２）マウスを受動回避反応試験実験装置の明室に入れ、３０秒間放置した。その後、ギロチンドアをはずした。マウスが暗室に入ると電気ショック（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ６０Ｖ、ｄｅｌａｙ １ｓｅｃ、ｄｕｒａｔｉｏｎ ３ｓｅｃ）を受けて明室に戻ってきたらギロチンドアをしめ、明室に３０秒間放置した。
（３）マウスを取り出し、素早く（１分以内）角膜電極をつけ、電撃痙攣ショック（ＥＣＳ，５０Ｈｚ，ｉｎｔｅｒｖａｌ ２０ｍｓ，ｄｕｒａｔｉｏｎ １０ｍｓ，ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ２０ｍＡ，ｇａｔｅ １ｓｅｃ）を与えた。
（４）評価化合物を腹腔内投与した。
（５）ホームケージに戻した。
（６）訓練終了後、６０分間以上実験室に放置し、その後飼育室に戻した。
試験（訓練の２４時間後）
（１）実験室に１時間以上動物を放置した。
（２）マウスを明室に入れ、３０秒間放置した後、ギロチンドアをはずした。
（３）ギロチンドアを外してからマウスが暗室のセンサーを横切るまでの時間（ｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｌａｔｅｎｃｙ）を記録した。最長測定時間は６００秒とした。
（４）ｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｌａｔｅｎｃｙを学習形成の指標として採用した。評価化合物の学習障害改善作用は（ＥＣＳ負荷＋Ｖｅｈｉｃｌｅ投与）群と（ＥＣＳ負荷＋評価化合物投与）群との多群間で両側Ｓｔｅｅｌ検定による比較に基づいて判定した。ｐ〈０．０５で有意な差があると判定した。実施例７４４で示される化合物を腹腔内投与した場合の最小有効用量は３ｍｇ／ｋｇであった。
以上の結果，代表的な化合物として実施例７４４に示す化合物が、ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害活性を有し、かつマウス受動的回避学習試験において電撃痙攣（ＥＣＳ）で誘発される学習障害を改善する作用を示すことが確認された。
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
実施例４１の化合物
ＤＡＴＡ
１塩酸塩
ｍ．ｐ．：１８４−１８６
１Ｈ−ＮＭＲ：１．２０（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．８５−４．４０（１Ｈ，ｍ），６．０２（４Ｈ，ｓ），６．７７−７．０７（４Ｈ，ｍ），７．１０−７．５５（２Ｈ，ｍ），８．５５（１Ｈ，ｂｒｓ），９．８５−１０．８５（２Ｈ，ｍ）／ＤＭＳＯ−ｄ６
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【表２０】
【表２１】
【表２２】
【表２３】
【表２４】
【表２５】
【表２６】
【表２７】
【表２８】
【表２９】
【表３０】
【表３１】
【表３２】
【表３３】
【表３４】
【表３５】
【表３６】
【表３７】
【表３８】
【表３８】
【配列表】
本発明は，医薬，特にＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有する物質を有効成分とする抗痴呆薬，好ましくはＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有する物質が２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩である痴呆薬，及び新規２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩に関する。
背景技術
カリウムチャネルは，細胞の形質膜に存在しカリウムイオンを選択的に通す蛋白質で，細胞の膜電位制御に重要な役割を担っていると考えられている。特に，神経・筋細胞においては活動電位の頻度や持続性などを調節することにより，中枢・末梢神経の伝達機構，心臓のペースメーキング，筋肉の収縮などに寄与している。
チャネルの開閉機構から分類すると，現在までに電位依存性カリウムチャネル，内向き整流性カリウムチャネル，カルシウム依存性カリウムチャネル，又は受容体共役型カリウムチャネルなどが同定されている。このうち，電位依存性カリウムチャネルは，膜電位が脱分極した際に開口する特性を有している。通常，カリウムイオンは細胞外が約５ｍＭ，細胞内が約１５０ｍＭと非平衡状態で存在する。このため，脱分極により電位依存性カリウムチャネルが開口すると，細胞内から細胞外へとカリウムイオンが流出し，結果として膜電位の回復（再分極）を引き起こす。そのため，電位依存性チャネルの開口に伴って，神経・筋細胞の興奮性の低下が誘導されることになる
【非特許文献１】。
電位依存性チャネルの開口を修飾する化合物は，神経・筋細胞などの興奮性を調整することにより，さまざまな生理現象を調整し，ひいては種々の疾患の治療薬となる可能性を有している。
例えば，神経細胞に認められるＡ型電位依存性カリウムチャネルの阻害剤である４−アミノピリジンは，神経の興奮性を高めることによりてんかんを引き起こすことが知られている
【非特許文献３】。また，電位依存性カリウムチャネルのうち心臓に発現するＨＥＲＧカリウムチャネルの阻害剤であるｄｏｆｅｔｉｌｉｄｅは，心筋細胞の興奮性を制御することに基づいた不整脈治療薬として利用されている
【非特許文献４】。
米国特許第６３２６１６８号（対応特許国際公開パンフレットＷＯ９９／３７６７７号）
【特許文献１】の実施例１中配列番号２に記載されているカリウムチャネル（以下ＢＥＣ１又はＢＥＣ１カリウムチャネルと表記する）は，脳に限局した発現分布を示す電位依存性カリウムチャネルである。その発現は，特に，海馬や大脳皮質において顕著である。海馬は，記憶・学習との関連性が強く示唆されている領域である
【非特許文献５】。
なかでも，当該カリウムチャネルの発現が確認された歯状回の顆粒細胞，ＣＡ１およびＣＡ３錐体細胞は神経回路を形成しており，各種記憶入力は歯状回の顆粒細胞からＣＡ１錐体細胞を経てＣＡ３錐体細胞へとグルタミン酸を神経伝達物質とする興奮性シナプスを介して伝達される。それぞれのシナプスで認められる長期増強，長期抑圧といったシナプス伝達効率の長期変化は，記憶・学習に深く関わっていると考えられている。これらの長期変化は神経細胞の興奮頻度や興奮強度によって調節されている。また電位依存性カリウムチャネルは一般的に神経細胞の興奮性をコントロールできる可能性を持っている。
従って，ＢＥＣ１は，神経細胞の興奮性制御を介して記憶・学習の形成に関与していると考えられるが，現在まで具体的に実証はなされていない。
現在２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体は多数知られているがその用途は，抗ＨＩＶ薬
【非特許文献６】，アデノシンＡ３アンタゴニスト
【特許文献２】，抗菌剤（
【非特許文献７】，
【非特許文献８】，
【非特許文献９】及び
【特許文献３】）として開示されている。現在までに，多くのカリウムチャネル阻害薬や２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体が報告されているが（
【特許文献３】，
【非特許文献１０】），ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有するという報告や示唆はない。
本発明の課題は，ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有する物質（以下ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害剤という）を有効成分とする抗痴呆薬，好ましくはＢＥＣ１カリウムチャネル阻害剤が２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩である抗痴呆薬、ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有する新規２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩及び当該新規誘導体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬を提供することである。
本発明者らは上記の課題を達成すべく研究を行ったところ，ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害剤が抗痴呆薬になりうることを見出した。更に２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン構造を有する化合物が，予想外にもＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有することを見出し本発明を完成させるに至った。
本発明はＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有する物質を有効成分とする抗痴呆薬に関する。
好ましくはＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有する物質が式（Ｉ）に示される２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩である抗痴呆薬である。
Ｒ１及びＲ２：同一又は異なって，Ｈ，ＯＨ，アルキル−Ｏ−，アリール−ＣＯ−，Ｈ２Ｎ，ＯＨで置換されていてもよいアルキル−ＮＨ，（アルキル）２Ｎ，置換されていてもよい炭化水素基，置換されていてもよいヘテロ環，又はＲ１，Ｒ２及び隣接するＮと一体となって含窒素ヘテロ環を形成することができ，当該環は置換されていてもよい。
Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６：同一又は異なって，（ｉ）Ｈ，（ｉｉ）ＣＮ，（ｉｉｉ）ＮＯ２，（ｉｖ）ハロゲン（ｖ）（１）ＣＮ，（２）ハロゲン若しくは（３）ＯＨで置換されていてもよい低級アルキル，（ｖｉ）シクロアルキル，（ｖｉｉ）低級アルキルで置換されていてもよいアリール，（ｉｘ）低級アルキルで置換されていてもよいヘテロ環，（ｘ）Ｒ７Ｒ８Ｎ−（Ｒ７及びＲ８：同一又は異なって，（１）Ｈ，（２）アリール若しくはＲ９−Ｏ−ＣＯ−で置換されていてもよい低級アルキル（Ｒ９：（１）Ｈ，若しくはアリールで置換されていてもよい低級アルキル），（ｘｉ）Ｒ１０−Ｔ１−（Ｒ１０：（１）Ｈ，（２）アリール，ＨＯ−Ｃ１−１０アルキレン−Ｏ−若しくはＨＯで置換されていてもよい低級アルキル，若しくは（３）アリール，Ｔ１：Ｏ若しくはＳ），又は（ｘｉｉ）Ｒ１１−Ｔ２−（Ｒ１１：（１）ＯＨ，（２）Ｒ７Ｒ８Ｎ−，（３）低級アルキル−Ｏ−，（４）低級アルキル，（５）アリール，若しくは（６）ヘテロ環（Ｔ２：ＣＯ若しくはＳＯ２）），
更にＲ３，Ｒ４及び隣接するＣ若しくはＲ５，Ｒ６及び隣接するＣと一体となってヘテロ環，環状炭化水素環を形成しベンゼン環と縮合することができる。）。
本発明の別の態様としては，上記式（Ｉ）に示される２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩を有効成分とする配列番号２に記載のＢＥＣ１カリウムチャネル阻害剤である。
また，本発明の別の態様としては式（ＩＩ）に示される２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩である。
Ｒ１及びＲ２：同一又は異なって，Ｈ，ＯＨ，アルキル−Ｏ−，アリール−ＣＯ−，Ｈ２Ｎ，ＯＨで置換されていてもよいアルキル−ＮＨ，（アルキル）２Ｎ，置換されていてもよい炭化水素基，置換されていてもよいヘテロ環，又はＲ１，Ｒ２及び隣接するＮと一体となって含窒素ヘテロ環を形成することができ，当該環は置換されていてもよい。
Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６：同一又は異なって，（ｉ）Ｈ，（ｉｉ）ＣＮ，（ｉｉｉ）ＮＯ２，（ｉｖ）ハロゲン，（ｖ）（１）ＣＮ，（２）ハロゲン若しくは（３）ＯＨで置換されていてもよい低級アルキル，（ｖｉ）シクロアルキル，（ｖｉｉ）低級アルキルで置換されていてもよいアリール，（ｉｘ）低級アルキルで置換されていてもよいヘテロ環，（ｘ）Ｒ７Ｒ８Ｎ−（Ｒ７及びＲ８：同一又は異なって，（１）Ｈ，（２）アリール若しくはＲ９−Ｏ−ＣＯ−で置換されていてもよい低級アルキル（Ｒ９：（１）Ｈ，若しくはアリールで置換されていてもよい低級アルキル），（ｘｉ）Ｒ１０−Ｔ１−（Ｒ１０：（１）Ｈ，（２）アリール，ＨＯ−Ｃ１−１０アルキレン−Ｏ−若しくはＨＯで置換されていてもよい低級アルキル，若しくは（３）アリール，Ｔ１：Ｏ若しくはＳ），又は（ｘｉｉ）Ｒ１１−Ｔ２−（Ｒ１１：（１）ＯＨ，（２）Ｒ７Ｒ８Ｎ−，（３）低級アルキル−Ｏ−，（４）低級アルキル，（５）アリール，若しくは（６）ヘテロ環（Ｔ２：ＣＯ若しくはＳＯ２）），
更にＲ３，Ｒ４及び隣接するＣ若しくはＲ５，Ｒ６及び隣接するＣと一体となってヘテロ環，環状炭化水素環を形成しベンゼン環と縮合することができる。）。
但し、上記式（ＩＩ）中Ｒ１及びＲ２が同一又は異なって，（ｉ）Ｈ，ＮＨ２，シクロヘキシル，置換されていてもよいフェニル，Ｒａ−（ＣＨ２）２−（Ｒａ：ＨＳ，ＨＯ，Ｒ７Ｒ８Ｎ，ＣＯＯＨ，エトキシ，ＣＮ，モルホリノ，クロロ），以下▲１▼乃至▲５▼の置換基で置換されていてもよいアルキル（▲１▼ＨＯＯＣ，▲２▼アルキル−Ｏ−ＣＯ−，▲３▼置換されていてもよいフェニル，▲４▼Ｒ７Ｒ８ＮＣＯＮＨＣＯ，又は▲５▼Ｒ７Ｒ８ＮＣＯＮＨＣＯ−），アルケニル、フェニル−Ｓ−，フェニル−ＳＯ２−，置換されていてもよいフェニルＮＨＣＳ−，置換されていてもよいフェニルＮＨＣＯ−，アルキル−Ｏ−ＣＯ−，Ｈ２ＮＣＳ，クロロ−ＣＯＣＨ２−，置換されていてもよい１，３，４−オキサジアゾール−２−イルメチル，或いはＲ１，Ｒ２及び隣接するＣと一体になってピラゾール−１−イル，インドール−１−イル，インダゾール−２−イル，ピペリジン−１−イル若しくはモルホリン−４−イルであり且つＲ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６が同一又は異なって，Ｈ，ハロゲン，ＮＯ２，アセチル，ＨＯ，低級アルキル−Ｏ−，ＨＯＯＣ−，低級アルキル−Ｏ−ＣＯ−，Ｈ２ＮＳＯ２−，又は低級アルキルである場合を除く。以下同様。）。
更に本発明の別の態様としては，上記式（ＩＩ）に記載の２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬である。
本発明の好ましい態様としては、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）中の置換基が以下のものである２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩である；
▲１▼Ｒ１及びＲ２が異なって，Ｈ，及び置換されていてもよい炭化水素基，より好ましくは炭化水素基がアルキルであり，更に好ましくは置換されていてもよいヘテロ環置換アルキルであり、
▲２▼Ｒ１及びＲ２が異なって，Ｈ，及び置換されていてもよいヘテロ環，更に好ましくは当該ヘテロ環がＳ及びＯから選択されるヘテロ原子を１乃至２個含有する４乃至６員単環であり，
▲３▼Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，及びＲ６がＨ，
▲４▼Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，及びＲ６が同一又は異なって，Ｈ及びハロゲン，
▲５▼Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，及びＲ６が同一又は異なって，Ｈ及び［（１）ハロゲン若しくは（２）ＯＨ］で置換されていてもよい低級アルキル，
▲６▼Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，及びＲ６が同一又は異なって，Ｈ，ハロゲン及び［（１）ハロゲン若しくは（２）ＯＨ］で置換されていてもよい低級アルキル，
▲７▼Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，及びＲ６が同一又は異なって，Ｈ及びＲ１０−Ｔ１−，又は
▲８▼Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，及びＲ６が同一又は異なって，Ｈ，ハロゲン及びＲ１０−Ｔ１−。
特に好ましくは，上記▲１▼乃至▲２▼の何れかと▲３▼乃至▲８▼の何れか一つとを組み合わせた２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩である。
好ましい化合物は、下表に示される何れか１つの２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩である。
【表１】
更に別の態様としては，ＢＥＣ１カリウムチャネルを発現させた細胞に被験化合物を接触させ当該チャネル活性を阻害することを同定するスクリーニング法で得られた化合物からなる医薬、殊に痴呆治療用医薬組成物の調製法である。
以下本明細書中における記号は同様の意味を示す。
一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示される化合物についてさらに説明すると，次の通りである。本明細書の一般式の定義において，特に断らない限り「低級」なる用語は炭素数１−６の直鎖又は分岐状の炭素鎖を意味する。
「ハロゲン」とはフッ素，塩素，臭素又はヨウ素原子が挙げられる。
「炭化水素基」とは炭素数１−１５，好ましくは炭素数１−１０の直鎖或いは分岐状炭化水素基又は炭素数３−１５の環状炭化水素基である。直鎖或いは分岐状炭化水素基として「アルキル」，「アルケニル」又は「アルキニル」である。具体的には「アルキル」としてはメチル，エチル，イソプロピル，ヘキシル，デシル，テトラデシル又はペンタデシル等である。「アルケニル」とは少なくとも１以上の二重結合を有する炭化水素基であり，ビニル，プロペニル，アリル，イソプロペニル，又はヘキセニル等である。「アルキニル」とは少なくとも１以上の三重結合を有する炭化水素基であり，エチニル，プロピニル，又はブチニル等である。環状炭化水素基として「シクロアルキル，「シクロアリール」又は「アリール」である。具体的には「シクロアルキル」は単環式飽和環であり，シクロプロピル，シクロペンチル，シクロヘキシル，シクロオクチル並びにシクロデシル等である。当該シクロアルキルは架橋していてもよくベンゼンと縮合していてもよい。例えば以下に示すＣ３−１０シクロアルキルが好ましい。「シクロアルケニル」は，１以上の二重結合を有する炭化水素環であり，当該シクロアルケニルはヘテロ環，アリール若しくはＣ３−１０シクロアルキルと縮合していてもよい。例えば以下に示すＣ３−８シクロアルケニルが好ましい。「アリール」とは芳香性の炭化水素基を意味し，例えば，Ｃ６−１４アリール，則ちフェニル，ナフチル，又はアンスリル等である。
当該アリールはヘテロ環，Ｃ３−１０シクロアルケニル，Ｃ３−１０シクロアルキル若しくはベンゼン縮合シクロアルキルと縮合していてもよい。例えば，以下に示す２乃至３環式が好ましい。
特にＲ３，Ｒ４及び隣接するＣ若しくはＲ５，Ｒ６及び隣接するＣと一体となってベンゼン環と縮合した２乃至３環式アリールは置換されていてもよい。
当該置換基としては、オキソ（＝Ｏ），低級アルキル，アリール，ＯＨ−アリール，低級アルキル−Ｏ−アリールが挙げられる。
「含窒素ヘテロ環」とは、少なくとも１個の窒素原子を有する上記ヘテロ環である。
「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基としては，好ましくは下記ａ群の置換基が挙げられる。
「置換されていてもよいヘテロ環」及び「Ｒ１，Ｒ２及び隣接するＮと一体となって形成することができる含窒素ヘテロ環」の置換基としては，好ましくは下記ｂ群の置換基が挙げられる。
ａ群：（ｉ）ＣＮ，（ｉｉ）ＮＯ２，（ｉｉｉ）ハロゲン，（ｉｖ）Ｒ７Ｒ８Ｎ−（Ｒ７及びＲ８：同一又は異なって，（１）Ｈ，（２）アリール若しくはＲ９−Ｏ−ＣＯ−で置換されていてもよい低級アルキル（Ｒ９：（１）Ｈ，若しくはアリールで置換されていてもよい低級アルキル），（３）ＣＮ若しくは低級アルキルで置換されていてもよいアリール，（４）ヘテロ環，（５）低級アルキル−ＣＯ−，（６）低級アルキル−Ｏ−ＣＯ−，（７）ＨＳ−若しくは低級アルキル−Ｓ−で置換されていてもよいシクロアルキル，（８）ＮＯ２で置換されていてもよいアリール−ＳＯ２−若しくは（９）ヘテロ環−ＳＯ２−），（ｖ）Ｒ１０−Ｔ１−（Ｒ１０：（１）Ｈ，（２）アリール，ＨＯ−Ｃ１−１０アルキレン−Ｏ−若しくはＨＯで置換されていてもよい低級アルキル，若しくは（３）アリール，Ｔ１：Ｏ若しくはＳ），（ｖｉ）Ｒ１１−Ｔ２−（Ｒ１１：（１）ＯＨ，（２）Ｒ７Ｒ８Ｎ−，（３）低級アルキル−Ｏ−，（４）低級アルキル，（５）アリール，若しくは（６）ヘテロ環（Ｔ２：ＣＯ若しくはＳＯ２）），（ｖｉｉ）下記（１）乃至（６）の置換基で置換されていてもよい低級アルキル（（１）ハロゲン，（２）ＣＮ，（３）ＯＨ，（４）Ｒ１０ＣＯ−，（５）Ｒ７Ｒ８Ｎ−若しくは（６）アリール），（ｖｉｉｉ）低級アルキルで置換されていてもよいシクロアルキル，（ｉｘ）シクロアルケニル，シクロアルキニル，（ｘｉ）下記（１）乃至（５）の置換基で置換されていてもよいアリール（（１）ハロゲン，（２）ＮＯ２，（３）Ｒ１２−Ｔ１−（Ｒ１２：Ｒ１０又はＯＨで置換されていてもよい低級アルキル−アリール），（４）Ｈ２ＮＯ２Ｓ−，若しくは（５）ハロゲン若しくはＯＨで置換されていてもよい低級アルキル），又は（ｘｉｉ）下記（１）乃至（９）の置換基で置換されていてもよいヘテロ環（（１）ハロゲン，（２）オキソ（＝Ｏ），（３）ＮＯ２，（４）［Ｒ７Ｒ８Ｎ−，Ｒ１０−Ｔ１−，（ＯＨ，ハロゲン若しくは低級アルキル−Ｏ−）で置換されていてもよいアリール］で置換されていてもよい低級アルキル，（５）ハロゲンで置換されてもよいアリール，（６）ＯＨ，（７）低級アルキル−Ｏ−（８）Ｒ７Ｒ８Ｎ−，又は（９）ヘテロ環），
「ＢＥＣ１」及び「ＢＥＣ１カリウムチャネル」とは，配列番号２に示された全長の蛋白質，又は当該蛋白質と同様の機能を有する当該蛋白質の断片，又は１以上のアミノ酸が置換欠失挿入されていてもよい当該蛋白質の断片或いは全長の蛋白質を意味する。
「ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有する物質」は，被験化合物を代表的なスクリーニング法、例えば米国特許第６，３２６，１６８号記載の方法に供することにより得られる。
ａ）Ｖｏｌｔａｇｅ−ｃｌｕｍｐ法を利用したスクリーニング方法
ＢＥＣ１カリウムチャネル蛋白質のチャネル活性はｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ ｖｏｌｔａｇｅ−ｃｌａｍｐ法により測定することが可能である。同チャネル蛋白質を発現させた細胞をｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ ｖｏｌｔａｇｅ−ｃｌａｍｐ法により膜電位固定し、全細胞電流を測定する。細胞外液には１４５ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む溶液、細胞内液（パッチ電極液）は１５５ｍＭ ＫＣｌを含む溶液などを用いる。脱分極刺激、すなわち、膜電位を保持電位（例えば−７０ｍＶ）から脱分極側（例えば−８０ｍＶ）にシフトさせることで生じる外向き電流を被検薬存在下と非存在下で比較することで、ＢＥＣ１カリウムチャネル蛋白質の活性を修飾する化合物およびペプチドをスクリーニングすることができる。
ｂ）Ｒｂ＋イオンの放出を利用したスクリーニング方法
一般的にカリウムチャネルはＫ＋イオンと同様にＲｂ＋イオンを通すことができるので、放射性同位元素８６Ｒｂ＋の放出を指標としてそのチャネル活性を測定することができる。新規カリウムチャネル蛋白質を発現させた細胞を８６ＲｂＣｌとインキュベート（例えば１８ｈｒ、３７℃）することにより、８６Ｒｂ＋を同細胞内に取り込ませることができる。細胞は、低濃度Ｋ＋生理食塩水（例えば４．５ｍＭ Ｋ＋）で洗浄した後同様液に懸濁する。細胞懸濁液に高濃度Ｋ＋溶液（例えば最終濃度１００ｍＭ）を添加すると、細胞の膜電位が脱分極しカリウムチャネルが活性化される。これに伴い、細胞内の８６Ｒｂ＋が細胞外へ放出されるので、細胞外液の放射活性をチャネル活性の指標とすることができる。被験薬存在下と非存在下で高濃度Ｋ＋溶液を添加した際の細胞外へ放出された放射活性を比較することで、ＢＥＣ１カリウムチャネル蛋白質の活性を修飾する化合物およびペプチドをスクリーニングすることが可能である。
ｃ）膜電位感受性色素や細胞内Ｋ＋検出色素を利用したスクリーニング方法
膜電位感受性色素や細胞内Ｋ＋検出色素は、カリウムチャネルの開口に伴う膜電位あるいは細胞内Ｋ＋濃度の変化を光学的に検出することが可能である。膜電位感受性色素として、ＲＨ１５５、ＷＷ７８１、Ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ、あるいはそれらの誘導体などを用いることができる。また、Ｓｈａｋｅｒ型の膜電位依存性カリウムチャネルのＣ末端細胞内領域にｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎのアミノ酸配列を挿入したキメラ蛋白質を膜電位の検出に用いることもできる（Ｓｉｅｇｅｌ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｉｓａｃｏｆｆ，Ｅ．Ｙ．（１９９７）Ｎｅｕｒｏｎ １９，７３５−７４１）。細胞内Ｋ＋検出色素としては、Ｋ＋−ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ ｉｓｏｐｈｔｈａｌａｔｅなどを用いることができる。これらの色素を用いることによりＢＥＣ１カリウムチャネルのチャネル活性を測定することができ、被験薬存在下と非存在下で変化量を比較することでＢＥＣ１カリウムチャネル蛋白質の活性を修飾する化合物およびペプチドをスクリーニングすることが可能である。
好ましいスクリーニング法としては，後述の８６Ｒｂイオン放出量を指標とした化合物のＢＥＣ１阻害活性測定法である。
更に、代表的な本発明化合物である実施例１３と被験化合物とを競合的にＢＥＣ１カリウムチャネル阻害させることにより当該作用を有する物質を得ることができる。
被験化合物は具体的には当該阻害活性があれば何れでもよいが市販品又はケミカルファイルに登録されている公知化合物、コンビナトリアル・ケミストリー技術によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、抗体やドミナントネガディブな蛋白質が挙げられる。更に当該物質を当業者には常法である化学変換による置換基等修飾したものも挙げられる。
本発明化合物は基の種類によっては，光学異性体（光学活性体，ジアステレオマー等）が存在する。また，本発明化合物はアミド結合や，二重結合を有する化合物もあり，アミド結合に基づく互変異性体や幾何異性体も存在する。本発明には，これらの異性体の分離されたもの，あるいは混合物を包含する。
本発明化合物は酸又は塩基と塩を形成する。酸との塩としては塩酸，臭化水素酸，ヨウ化水素酸，硫酸，硝酸，リン酸等の鉱酸等の無機酸や，ギ酸，酢酸，プロピオン酸，シュウ酸，マロン酸，コハク酸，フマール酸，マレイン酸，乳酸，リンゴ酸，クエン酸，酒石酸，炭酸，ピクリン酸，メタンスルホン酸，エタンスルホン酸，グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩を挙げることができる。
塩基との塩としてはナトリウム，カリウム，マグネシウム，カルシウム，アルミニウム等の無機塩基，メチルアミン，エチルアミン，メグルミン，エタノールアミン等の有機塩基又はリジン，アルギニン，オルニチン等の塩基性アミノ酸との塩やアンモニウム塩が挙げられる。さらに，本発明化合物は水和物，エタノール等との溶媒和物や結晶多形を形成することができる。
また，本発明有効成分又は本発明化合物には，生体内で代謝され変換される化合物，いわゆるプロドラッグも全て包含される。本発明のプロドラッグを形成する基としては，Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．，５，２１５７−２１６１（１９８５）や「医薬品の開発」第７巻（廣川書店，１９９０年）分子設計１６３−１９８頁に記載の基等が挙げられる。
（製造法）
本発明化合物及びその製薬学的に許容され得る塩は，その基本骨格あるいは置換基の種類に基づく特徴を利用し，種々の公知の合成法を適用して製造することができる。例えば酸化，還元，アミノ化，アルキル化，アミド化，スルホンアミド化，エステル化及びウレア化等の反応は，日本化学会編「実験化学講座」第４版（１９９１）（丸善）等の文献記載の条件を参考にして行うことができる。その際，官能基の種類によっては，当該官能基を原料乃至中間体の段階で適当な保護基（容易に当該官能基に転化可能な基）に置き換えておくことが製造技術上効果的な場合がある。このような官能基としては例えばアミノ基，ＯＨ（水酸基）及びＣＯＯＨ（カルボキシ）等であり，それらの保護基としては例えばグリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）及びウッツ（Ｗｕｔｓ）著，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第３版）」に記載の保護基等を挙げることができ，これらを反応条件に応じて適宜選択して用いればよい。このような方法では，当該保護基を導入して反応を行った後，必要に応じて保護基を除去することにより，所望の化合物を得ることができる。
以下，本発明化合物の原料及び本発明化合物の製造法を詳述する。本発明化合物は，自体公知の方法，例えばブリティン ド ラ ソシエテ ケミカ ド フランス，６巻，２１１２頁（１９７３年）（Ｂｕｌｌ．Ｓｏｃ．Ｃｈｉｍ．Ｆｒ．，６，２１１２（１９７３））等に記載の方法またはそれらに準じた方法などにより製造できるが，代表的な製造法を以下に示した。
脱離基としては，（ｉ）ハロゲン，（ｉｉ）メチルスルファニル，（ｉｉｉ）メチルスルフィニル，（ｉｖ）１乃至３のハロゲンで置換されていてもよいＣ１−６アルカンスルホニルオキシ基（例えばメタンスルホニルオキシ，トリフルオロメタンスルホニルオキシなど），又は（ｖ）１乃至４のＣ１−６アルキル若しくはハロゲンで置換されていてもよいＣ６−１０アレンスルホニルオキシ基（例えば，ｐ−トルエンスルホニルオキシ，ｐ−ブロモベンゼンスルホニルオキシなどが挙げられる。
Ａ製法
本発明化合物の原料化合物（ＩＶ）又は（ＶＩＩ）はアグリカルチャル アンド バイオロジカルケミストリー，５１巻，２５６３頁（１９８９年）（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，９，２５６３（１９８９）），ジャーナル オブ アメリカン ケミカル ソサイエティ，１１６巻，４３２６頁（１９９４年）（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６，４３２６（１９９４）），に記載の公知の方法またはそれらに準じた方法により合成することができる。
Ｂ製法
本発明化合物の原料化合物（Ｖ），（ＶＩ）或いは（ＶＩＩＩ）は，ジャーナル オブ アメリカン ケミカル ソサイエティ，１１６巻，２３８２頁（１９９４年）（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６，２３８２（１９９４）），米国特許第２４７６５４８号（ＵＳＰ−２４７６５４８），ジャーナル オブ ケミカル ソサイエティ，５６１頁（１９４８年）（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，５６１，（１９４８））有機合成化学協会誌，１８巻，３３２頁（１９６０年）に記載の公知の方法またはそれらに準じた方法により合成することができる。
Ｃ製法
本製法は化合物（ＩＶ），（Ｖ），（ＶＩ）或いは（ＶＩＩＩ）とアミン化合物（ＩＸ）或いはアニリン化合物（Ｘ）または（ＸＩ）を反応させ，本発明化合物（Ｉ−ａ）または（Ｉ−ｂ）を得る方法である。反応は無溶媒中もしくはベンゼン，トルエン或いはキシレン等の芳香族炭化水素類，ジエチルエーテル，テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）或いはジオキサン等のエーテル類，ジクロロメタン，１，２−ジクロロエタン或いはクロロホルム等のハロゲン化炭化水素類，Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ），Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ），Ｎ−メチルピロリドン，酢酸エチル，又はアセトニトリル等の反応に不活性な溶媒中，化合物（ＩＶ），（Ｖ），（ＶＩ）或いは（ＶＩＩＩ）と化合物（ＩＸ），（Ｘ）或いは（ＸＩ）を等モル乃至一方を過剰量用い，冷却下乃至加熱還流下にて行なわれる。反応温度は化合物に応じて適宜設定できる。化合物によっては，有機塩基（好ましくは，ジイソプロピルエチルアミン，Ｎ−メチルモルホリン，ピリジン，４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン）または金属塩塩基（好ましくは，水素化ナトリウム，炭酸カリウム，炭酸ナトリウム，炭酸水素ナトリウム，水酸化ナトリウム，水酸化カリウム）の存在下に行うのが好ましい場合がある。また、化合物によっては塩基の非存在下に反応させるのが，反応を円滑に進行させる上で有利な場合がある。
本発明化合物（Ｉ）は公知の手段，例えば溶媒抽出，液性変換，転溶，晶出，再結晶，クロマトグラフィーなどによって単離精製することができる。また，化合物（ＩＩＩ），（ＩＶ），（Ｖ），（ＶＩ），（ＶＩＩ）或いは（ＶＩＩＩ）の原料化合物またはその製薬学的に許容される塩は，前記と同様の公知の手段などによって単離精製することができるが，単離することなくそのまま反応混合物として次の工程の原料として供されてもよい。
なお，上記製造法は式中の置換基に限定されるものではなく本発明化合物が同様の置換基を有する場合に広く適用される。
このようにして製造された本発明化合物は，遊離のまま，あるいはその製薬学的に許容される塩として単離・精製される。
単離・精製は，抽出，濃縮，留去，結晶化，濾過，再結晶，各種クロマトグラフィー等の通常の化学操作を適用して行われる。
各種の異性体は，適当な原料化合物を選択することにより，あるいは異性体間の物理的性質の差を利用して分離することができる。例えば，光学異性体は，適当な原料を選択することにより，あるいはラセミ化合物のラセミ分割法（例えば，一般的な光学活性な塩基とのジアステレオマー塩に導き，光学分割する方法等）により立体科学的に純粋な異性体に導くことができる。
産業上の利用可能性
本発明は，ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害剤を有効成分とする抗痴呆薬に関する。
ＢＥＣ１カリウムチャネルが海馬，大脳皮質において高発現するトランスジェニック・マウスを作成しその行動を解析した結果から，当該マウスは，後述のモリス型水迷路学習試験，受動的回避学習試験，及び恐怖条件付け学習試験において，学習能力が低下していることが明らかとなった。また，ＢＥＣ１カリウムチャネルに対する抗体を用いてアルツハイマー病患者脳の免疫染色試験を行ったところ，海馬，大脳皮質の神経細胞においてその発現が増加していることが示唆された。以上のことは，アルツハイマー病患者の海馬，大脳皮質におけるＢＥＣ１カリウムチャネルの発現増加が，神経細胞の興奮性を低下させることにより記憶学習に関わる神経伝達を抑制している可能性を示唆している。
さらに鋭意研究を行った結果、ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害剤、代表的な化合物として実施例７４４に示す化合物が、マウス受動的回避学習試験において電撃痙攣（ＥＣＳ）で誘発される学習障害を改善する作用を示すことが確認された。
以上より，ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害剤は学習障害の改善作用を有し，ＢＥＣ１カリウムチャネルが関与していると考えられる疾患，好ましくは痴呆の予防又は治療剤として有用であることが実証された。
ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害剤又はその製薬学的に許容される塩の１種又は２種以上を有効成分として含有する製剤は，通常製剤化に用いられる担体や賦形剤，その他の添加剤を用いて調製される。
製剤用の担体や賦形剤としては，固体又は液体いずれでも良く，例えば乳糖，ステアリン酸マグネシウム，スターチ，タルク，ゼラチン，寒天，ペクチン，アラビアゴム，オリーブ油，ゴマ油，カカオバター，エチレングリコール等やその他常用のものが挙げられる。
投与は錠剤，丸剤，カプセル剤，顆粒剤，散剤，液剤等による経口投与，あるいは静注，筋注等の注射剤，坐剤，経皮等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。投与量は症状，投与対象の年齢，性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定されるが，通常成人１人当たり，１日につき１〜１，０００ｍｇ，好ましくは５０〜２００ｍｇの範囲で１日１回から数回に分け経口投与されるか又は成人１人当たり，１日につき１〜５００ｍｇの範囲で，１日１回から数回に分け静脈内投与されるか，又は，１日１時間〜２４時間の範囲で静脈内持続投与される。もちろん前記したように，投与量は種々の条件で変動するので，上記投与量範囲より少ない量で十分な場合もある。
本発明による経口投与のための固体組成物としては，錠剤，散剤，顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては，一つまたはそれ以上の活性物質が，少なくとも一つの不活性な希釈剤，例えば乳糖，マンニトール，ブドウ糖，ヒドロキシプロピルセルロース，微結晶セルロース，デンプン，ポリビニルピロリドン，メタケイ酸アルミン酸マグネシウムと混合される。組成物は，常法に従って，不活性な希釈剤以外の添加剤，例えばステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤や繊維素グルコール酸カルシウムのような崩壊剤，ラクトースのような安定化剤，グルタミン酸又はアスパラギン酸のような溶解補助剤を含有していてもよい。
錠剤又は丸剤は必要によりショ糖，ゼラチン，ヒドロキシプロピルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等の糖衣又は胃溶性あるいは腸溶性物質のフィルムで被膜してもよい。
経口投与のための液体組成物は，薬剤的に許容される乳濁剤，溶液剤，懸濁剤，シロップ剤，エリキシル剤等を含み，一般的に用いられる不活性な希釈剤，例えば精製水，エタノールを含む。この組成物は不活性な希釈剤以外に湿潤剤，懸濁剤のような補助剤，甘味剤，風味剤，芳香剤，防腐剤を含有していてもよい。
非経口投与のための注射剤としては，無菌の水性又は非水性の溶液剤，懸濁剤，乳濁剤を包含する。水性の溶液剤，懸濁剤としては，例えば注射用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水溶性の溶液剤，懸濁剤としては，例えばプロピレングリコール，ポリエチレングリコール，オリーブ油のような植物油，エタノールのようなアルコール類，ポリソルベート８０等がある。
このような組成物はさらに防腐剤，湿潤剤，乳化剤，分散剤，安定化剤（例えば，ラクトース），溶解補助剤（例えば，グルタミン酸，アスパラギン酸）のような補助剤を含んでいてもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過，殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。また，これらは無菌の固体組成物を製造し，使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。
発明を実施するための最良の形態
（実施例）
次に，実施例により本発明をさらに詳細に説明するが，本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚，実施例で用いられる原料化合物の製造方法を参考例として説明する。
以下に記載の％は特記しない限り重量パーセントを意味する。その他の本文中で用いている略号は下記の意味を示す。
表中の記号は以下の通りである。
Ｅｘ：実施例番号
Ｒｅｆ：参考例番号
Ｆ：フルオロ，Ｃｌ：クロロ，ＮＯ２：ニトロ，ＯＨ：ヒドロキシ，ＣＮ：シアノ，Ｍｅ：メチル，Ｅｔ：エチル，Ｐｈ：フェニル，Ｐｙ：ピリジン，Ｐｙ−２−ｙｌＣＨ２ＮＨ：ピリジン−２−イルメチルアミン，Ｐｙ−３−ｙｌＣＨ２ＮＨ：ピリジン−３−イルメチルアミノ，Ｐｙ−４−ｙｌＣＨ２ＮＨ：ピリジン−４−イルメチルアミノ，ＣＦ３：トリフルオロメチル，ｉＰｒ：イソプロピル，Ｐｅｎ：ペンチル，ｃＰｒ：シクロプロピル，ｃＨｅｘ：シクロヘキシル，Ｂｚｌ：ベンジル，Ｂｚ：ベンゾイル，ｄｉＭｅＰｈＮＨ：ジメチルフェニルアミノ，ｄｉＭｅＯＰｈＮＨ：ジメトキシフェニルアミノ，ｄｉＣｌＰｈＮＨ：ジクロロフェニルアミノ，ｄｉＣＦ３ＰｈＮＨ：ジトリフルオロメチルフェニルアミノ，Ａｃ：アセチル，ＡｃＯＥｔ：酢酸エチル，ｆｒｅｅ：フリー体，
ＮＭＲ：核磁気共鳴スペクトル（テトラメチルシラン（ＴＭＳ）内部標準で測定（ｐｐｍで表示））
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは，ＴＭＳを内部標準物質としたときのケミカルシフト値で表し，シグナルを以下の略号で表す。ｓ：ｓｉｎｇｌｅｔ，ｄ：ｄｏｕｂｌｅｔ，ｔ：ｔｒｉｐｌｅｔ，ｑ：ｑｕａｒｔｅｔ，ｂｒ：ｂｒｏａｄ，ｍ：ｍｕｌｔｉｐｌｅｔ
ｍ．ｐ．：融点［℃］（融点は，柳本製融点測定器ヤナコＭＰ−Ｓ３を用いて測定し，未補正値を示した。）
ＭＳ：ＦＡＢ−ＭＳ，ＭＡＳＳ：ＥＳＩ−ＭＳ，ＨＰＬＣ ｒｔ：ＨＰＬＣ保持時間
測定装置：ＨＰＬＣ ＷＡＴＥＲＳ製２７９０セパレーションモジュール
ＭＳ ｍｉｃｒｏｍａｓｓ製ＺＭＤ
ＰＤＡ検出器ＷＡＴＥＲＳ製９９６フォトダイオードアレイ検出器
測定条件：カラム和光純薬工業製ＷＡＫＯＳＩＬ−２ ５Ｃ１８ＡＲ
２．０ミリメートルＩ．Ｄ．ｘ３０ミリメートル
カラム温度 ３５℃
移動相 Ａ液＝５ｍＭトリフルオロ酢酸水溶液，Ｂ液＝メタノール
検出波長２５４ｎｍまたは２１０ｎｍ
試料導入量５μＬ
流速１．２ｍｌ／ｍｉｎ
なお，移動相の混合比は初期溶媒条件を１０％移動相Ｂとし，その後４分かけて１００％移動相Ｂまで直線勾配で増加させ，続けて０．５分を１００％移動相Ｂとした。
原料化合物を参考例に示す。
参考例１
２，４−ジクロロ−６−アニリノ−１，３，５−トリアジン２．４１ｇをアセトニトリル２０ｍｌに溶解し，これにジイソプロピルエチルアミン２．０９ｍｌ，ｐ−フルオロアニリン１．２３ｇを加え，室温にて終夜攪拌した。反応液に水を加えた後，酢酸エチルで抽出し，有機層を１Ｍ塩酸，飽和食塩水で洗浄後，無水硫酸マグネシウムで乾燥した。
溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し，酢酸エチル：ｎ−ヘキサン（１：９）にて溶出し，得られた粗製物をベンゼンから結晶化することにより，６−クロロ−Ｎ−（４−フルオロフェニル）−Ｎ’−フェニル−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミン２．２５ｇを白色固体として得た。
参考例１と同様にして，下表４に示す参考例２乃至５の化合物を合成した。
参考例６
４，６−ジクロロ−Ｎ−（４−フルオロフェニル）−１，３，５−トリアジン２．５９ｇをアセトニトリル２０ｍｌに溶解し，これにジイソプロピルエチルアミン２．０９ｍｌ，ｐ−トルイジン１．１８ｇを加え，室温にて終夜攪拌した。反応液に水を加えた後，酢酸エチルで抽出し，有機層を１Ｍ塩酸，飽和食塩水で洗浄後，無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し，酢酸エチル：ｎ−ヘキサン（１：９）にて溶出し，得られた粗製物をベンゼンから結晶化することにより，６−クロロ−Ｎ−（４−フルオロフェニル）−Ｎ’−（４−メチルフェニル）−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミン２．７４ｇを白色固体として得た。
参考例６と同様にして，下表４に示す参考例７乃至１２の化合物を合成した。
実施例１
６−クロロ−Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミン２００ｍｇをアセトニトリル１０．０ｍｌに溶解し，これに４−（アミノメチル）ピリジン１４５ｍｇ，ジイソプロピルエチルアミン０．５８５ｍｌを加え，８０℃にて終夜攪拌した。反応液を室温まで冷却した後，水を加え，クロロホルムで抽出した。有機層を５％クエン酸水溶液，飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し，酢酸エチル：ｎ−ヘキサン（２：１）で溶出し，得られた粗製物を酢酸エチル／ｎ−ヘキサンから結晶化することにより，Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−Ｎ’’−（４−ピリジルメチル）−１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン１０７ｍｇを淡赤色結晶として得た。
実施例１と同様にして，下表５乃至７及び下表２８乃至３５に示す実施例２乃至３８及び実施例７４０乃至８１５の化合物を合成した。
実施例３９
（４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル）イソプロピルアミン２０７ｍｇをアセトニトリル１０．０ｍｌに溶解し，これに４−メトキシアニリン３６９ｍｇを加え，８０℃にて３日間攪拌した。反応液を室温まで冷却した後，水を加え，酢酸エチルで抽出した。有機層を１Ｍ塩酸水溶液，飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し，酢酸エチル：ｎ−ヘキサン（２：１）で溶出し，粗製物を得た。この粗製物を酢酸エチルに溶解し，これに４Ｍ塩酸酢酸エチル溶液を加え，溶媒を減圧留去して得られた残渣を酢酸エチルから結晶化することにより，Ｎ−イソプロピル−Ｎ’，Ｎ’’−ビス（４−メトキシフェニル）−１，３，５−トリアジン−１，３，５−トリアミン塩酸塩３３２ｍｇを無色結晶として得た。実施例３９と同様にして，下表７に示す実施例４０乃至４４の化合物を合成した。
実施例４５
参考例１で合成した６−クロロ−Ｎ−（４−フルオロフェニル）−Ｎ’−フェニル−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミン３１６ｍｇをアセトニトリル１０．０ｍｌに溶解し，これにジイソプロピルエチルアミン０．５２３ｍｌ，イソプロピルアミン０．１７０ｍｌを加え，８０℃にて終夜攪拌した。反応液を室温まで冷却した後，水を加え，酢酸エチルで抽出した。有機層を５％クエン酸水溶液，飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し，酢酸エチル：ｎ−ヘキサン（２：１）で溶出し，粗製物を得た。この粗製物を酢酸エチルに溶解し，これに４Ｍ塩酸酢酸エチル溶液を加え，溶媒を減圧留去して得られた残渣を酢酸エチルから結晶化することにより，Ｎ−（４−フロオロフェニル）−Ｎ’−イソプロピル−Ｎ’’−フェニル−１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン塩酸塩３２７ｍｇを無色結晶として得た。実施例４５と同様にして，下表８に示す実施例４６乃至５０の化合物を合成した。
実施例５１（コンビナトリアル・ケミストリーによる合成例）
６−クロロ−Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミン８．９ｍｇ（３０μｍｏｌ）のアセトニトリル４００μｌとＮ−メチルピロリドン１２０μｌの混合溶液にｐ−フルオロベンジルアミンを７．５ｍｇ（６０μｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン５２μｌを加え，８０℃にて３時間攪拌した。反応液を濾過後，分取用ＬＣ−ＭＳ装置に注入し，望む分子量を含む分画を集めた。溶媒を留去し，Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−Ｎ’’−（４−フルオロベンジル）−１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン６．１ｍｇ（収率４５％）を得た。分析用ＬＣ−ＭＳにより，保持時間２．７７分，純度９３％を決定した。
実施例５１と同様にして，下表９乃至１８に示す実施例５２乃至４１８の化合物を合成した。
実施例４１９
６−クロロ−Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミン８．９ｍｇ（３０μｍｏｌ）のアセトニトリル４００μｌとＮ−メチルピロリドン１２０μｌの混合溶液に２−フルオロアニリンを６．７ｍｇ（６０μｍｏｌ）加え，８０℃にて３時間攪拌した。反応液を濾過後，分取用ＬＣ−ＭＳ装置に注入し，望む分子量を含む分画を集めた。
溶媒を留去し，Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−Ｎ’’−（２−フルオロフェニル）−１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン６．０ｍｇ（収率５４％）を得た。分析用ＬＣ−ＭＳにより，保持時間３．０１分，純度９４％を決定した。実施例４１９と同様にして，下表１９乃至２２に示す実施例４２０乃至５８３の化合物を合成した。
実施例５８４
２，６−ジクロロ−Ｎ−イソプロピル−１，３，５−トリアジン−４−アミン１０ｍｇをＮ−メチル−２−ピロリドン６００μｌに溶解し，これに２−フルオロアニリンの０．５ｍＭ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液４００μｌ，ジイソプロピルエチルアミン２６μｌを加え，１２０℃にて３日間攪拌した。反応液にアルゴノート社のＰＳ−トリスアミン（４．２７ｍｍｏｌ／ｇ）５０ｍｇを加え，更に１２０℃にて７時間攪拌した。反応液を５０℃まで冷却した後，アルゴノート社のＰＳ−ベンズアルデヒド（１．５３ｍｍｏｌ／ｇ）５０ｍｇを加え，更に５０℃にて１６時間攪拌した。反応液を室温まで冷却した後，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液とクロロホルムを加えて攪拌した。溶液を濾過した後に有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し，溶媒を減圧留去して，Ｎ，Ｎ’−ジ−（２−フルオロフェニル）−Ｎ’’−イソプロピル−１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン７ｍｇを褐色樹脂状物質として得た。
実施例５８４と同様にして，下表２３乃至２４に示す実施例５８５乃至６３６の化合物を合成した。
実施例６３７
６−クロロ−Ｎ−イソプロピル−Ｎ’−フェニル−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミン１４ｍｇをＮ−メチル−２−ピロリドン８００μｌに溶解し，これに２−フルオロアニリンの０．５ｍＭ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液２００μｌ，４Ｍ塩酸／ジオキサン５０μｌを加え，８０℃にて７時間攪拌した。反応液を６０℃まで冷却した後，反応液にアルゴノート社のＰＳ−トリスアミン（４．２７ｍｍｏｌ／ｇ）５０ｍｇ，ＰＳ−ベンズアルデヒド（１．５３ｍｍｏｌ／ｇ）５０ｍｇを加え，更に６０℃にて１６時間攪拌した。反応液を室温まで冷却した後，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液とクロロホルムを加えて攪拌した。溶液を濾過した後に有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し，溶媒を減圧留去してＮ−（２−フルオロフェニル）−Ｎ’−イソプロピル−Ｎ’’−フェニル−１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン１３ｍｇを褐色樹脂状物質として得た。実施例６３７と同様にして，下表２４乃至２７に示す実施例６３８乃至７３９に示す化合物を合成した。
実施例８１６
実施例７５３で合成したＮ−（４−フルオロフェニル）−Ｎ’−［（６−メトキシピリジン−３−イル）メチル］−Ｎ’’−フェニルｌ−１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン塩酸塩５６５ｍｇに２５％臭化水素酸酢酸溶液５ｍｌ及び４８％臭化水素酸水溶液１ｍｌを加え，８０℃にて６時間攪拌した。反応溶液を減圧留去したのち、，酢酸エチル及び炭酸水素ナトリウム水溶液を順次加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し，クロロホルム：メタノール（９９：１）で溶出し，粗製物を得た。この粗製物を酢酸エチルに溶解し，これに４Ｍ塩酸酢酸エチル溶液を加え，生じた結晶をろ別乾燥することにより，５−［（｛４−アニリノ−６−［（４−フルオロフェニル）アミノ］−１，３，５−トリアジン−２−イル｝アミノ）メチル］ピリジン−２（１Ｈ）−オン塩酸塩１９５ｍｇを無色結晶として得た。実施例８１６と同様にして，下表３５に示す実施例８１７及び８１８の化合物を合成した。
実施例８１９
実施例７５８で合成したｔｅｒｔ−ブチル｛６−［（｛４−アニリノ−６−［（４−フルオロフェニル）アミノ］−１，３，５−トリアジン−２−イル｝アミノ）メチル］ピリジン−２−イル｝カルバマート塩酸塩２５０ｍｇを酢酸エチル１０．０ｍｌに溶解し，これに４Ｍ塩酸酢酸エチル溶液１０．０ｍｌを加え，室温にて４時間攪拌した。生じた淡黄色結晶をろ別乾燥することにより、Ｎ−［（６−アミノピリジン−２−イル）メチル］−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）−Ｎ’’−フェニル−１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン塩酸塩１９０ｍｇを淡黄色結晶として得た。
実施例８２０
実施例７６７で合成したＮ−（４−フルオロフェニル）−Ｎ’−｛［１−（４−メトキシベンジル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−イル］メチル｝−Ｎ’’−フェニル−１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン塩酸塩３６０ｍｇをトリフルオロ酢酸５ｍｌに溶解し、７０℃にて終夜攪拌した。反応溶液を減圧留去したのち、，酢酸エチル及び炭酸水素ナトリウム水溶液を順次加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し，クロロホルム：メタノール（９２：８）で溶出し，粗製物を得た。この粗製物を酢酸エチルに溶解し，これに４Ｍ塩酸酢酸エチル溶液を加え，生じた結晶をろ別乾燥することにより，Ｎ−（４−フルオロフェニル）−Ｎ’−フェニル−Ｎ’’−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イルメチル）−１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン塩酸塩２６８ｍｇを無色結晶として得た。
実施例８２１
［（１−トリチル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチル］アミン６７８ｍｇをアセトニトリル１０．０ｍｌに溶解し，これにジイソプロピルエチルアミン０．５２ｍｌ及び参考例１で合成した６−クロロ−Ｎ−（４−フルオロフェニル）−Ｎ’−フェニル−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミン３１６ｍｇを加え，８０℃にて３日間攪拌した。反応液を室温まで冷却した後，水を加え，酢酸エチルで抽出した。有機層をクエン酸水溶液，飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し，クロロホルム：メタノール（９９：１）で溶出し，粗製物を得た。この粗製物を酢酸９ｍｌ及び水１ｍｌに溶解し、７０℃にて２時間攪拌した。反応溶液を減圧留去したのち，酢酸エチル及び炭酸水素ナトリウム水溶液を順次加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し，クロロホルム：メタノール（９０：１０）で溶出し，粗製物を得た。この粗製物を酢酸エチルに溶解し，これに４Ｍ塩酸酢酸エチル溶液を加え，生じた結晶をろ別乾燥することにより，Ｎ−（４−フルオロフェニル）−Ｎ’−（１Ｈ−イミダゾール−４−イルメチル）−Ｎ’’−フェニル−１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリアミン塩酸塩３０６ｍｇを無色結晶として得た。
以下に参考例及び実施例化合物の構造及び物性値を表４乃至３５に示す。
また、前記実施例と同様にして下表３６乃至３９に示す化合物も合成できる。表中の記号Ｎｏは化合物番号を示す。
実施例８２２
（試験法）
８６Ｒｂイオン放出量を指標とした化合物のＢＥＣ１阻害活性測定法
ＢＥＣ１のチャネル活性は，ＷＯ９９／３７６７７記載の方法に準じ，ＢＥＣ１発現細胞からの放射性同位元素８６Ｒｂイオンの放出を指標として測定した。すなわち，８６Ｒｂイオンを取り込ませたＢＥＣ１発現細胞を１００ｍＭ ＫＣｌで刺激した際に同細胞から放出される放射活性をＢＥＣ１のチャネル活性とした。８６Ｒｂイオンは，ＢＥＣ１安定発現細胞を８６ＲｂＣｌ（０．５μＣｉ／ｍｌ）存在下で培養（３時間，３７℃）することにより細胞に取り込ませ，ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４，２．５ｍＭ ＫＣｌ）で３回洗浄することにより取り込まれなった８６Ｒｂイオンを取り除いた。同細胞は，被検化合物を含むＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水で１５分間室温下でインキュベートし，その後同化合物を含む１００ｍＭ ＫＣｌ含有ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）でさらに５分間室温下でインキュベートした。細胞外液を回収した後，残った細胞を０．１Ｎ ＮａＯＨで溶解し回収した。
細胞外液と細胞溶解液のチェレンコフ放射活性をそれぞれ測定し，その合計を総放射活性とした。８６Ｒｂイオン放出量は，総放射活性に対する細胞外液放射活性の百分率で表した。化合物存在下で得られた値を検査値，化合物非存在下で得られた値をコントロール値，１００ｍＭ ＫＣｌで刺激しなかった際に得られた値をブランク値とした。化合物の阻害作用は，阻害％すなわち（コントロール値−検査値）×１００／（コントロール値−ブランク値），あるいは，阻害％から求めたＩＣ５０値で表した。代表的な化合物の試験結果を下表２及び３に示した通り，当該化合物はＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有することが確認された。
なお，ＢＥＣ１発現細胞は，チャイニース・ハムスター卵巣細胞のジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）欠損株を用いてＷＯ９９／３７６７７記載の方法に準じて作成したＢＥＣ１安定発現細胞を用いた。
【表２】
電気生理的手法を用いた，化合物によるＢＥＣ１電流阻害活性の評価
ＢＥＣ１発現細胞をｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ ｖｏｌｔａｇｅ−ｃｌａｍｐ法により膜電位固定し，全細胞電流を測定した。細胞外液は１４０ｍＭ ＮａＣｌ，５．４ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＣａＣｌ２，０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２，１５ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨを添加しｐＨ＝７．４），細胞内液（パッチ電極液）は１２５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ２，２ｍＭ ＭｇＣｌ２，１１ｍＭ ＥＧＴＡ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＫＯＨを添加しｐＨ＝７．２）を用いた。
膜電位を−９０ｍＶから０ｍＶへ脱分極することにより，持続的な外向き電流が惹起される。この外向き電流の，薬剤非存在下での強度（コントロール値）と被検化合物投与時の電流強度（検査値）を比較することにより，阻害％［（検査値／コントロール値）×１００］を求めた。
試験結果
その結果，実施例１３の化合物では，１μＭの濃度で，５０％以上の阻害を示した。
実施例８２４
トランスジェニック・マウスの作成
〈ＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウス作成用導入遺伝子の構築〉
配列番号２記載のアミノ酸配列を有するＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウスを作成するための導入遺伝子は，α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩ遺伝子のプロモーター領域の下流に５’イントロンとポリＡ付加シグナルを持った，ＢＥＣ１ ｃＤＮＡ（配列番号１）をつないだ遺伝子からなっている。α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩのプロモーター領域は，Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって互いにオーバーラップする部分を持つ２断片として取得した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムＤＮＡは，同マウスの血液からゲノムＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。プライマーは遺伝子データベースＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＪ２２２７９６）をもとに設計した。フォワードプライマーとして配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し，リバースプライマーとして配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて４．６ｋｂの遺伝子断片を得た。前記フォワードプライマーの５’末端側にはＡａｔｌｌ認識配列が付加してある。また，フォワードプライマーとして配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し，リバースプライマーとして配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて３．７ｋｂの遺伝子断片を得た。前記リバースプライマーの５’末端側にはＳａｌｌ認識配列が付加してある。それぞれのＰＣＲは，ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて９９℃（１分）熱変性後，９９℃（１５秒），５８℃（１５秒），７５℃（１０分）を４５サイクル，あるいは９５℃（１分）熱変性後，９５℃（１５秒），６２℃（１５秒），７５℃（８分）を４０サイクル実施し，得られた遺伝子断片は，クローニングベクター（ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ ｐｌａｓｍｉｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。４．６−ｋｂ断片と３．７−ｋｂ断片のオーバーラップする部分には内在性のＸｍａｌ認識配列が存在する。４．６−ｋｂ断片を制限酵素ＡａｔｌｌおよびＸｍａｌで消化し，３．７−ｋｂ断片を制限酵素ＸｍａｌおよびＳａｌｌで消化した。得られた各断片をライゲーションし，ＡａｔｌｌおよびＳａｌｌ認識配列を利用してプラスミドｐＵＣ１８（東洋紡績社），にクローニングした。以上の操作により目的のα−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩプロモーター領域が得られた。一方，ＢＥＣ１ ｃＤＮＡ（配列番号１）は，５’イントロンとポリＡ付加シグナルを含んだ断片として，カリウムチャネル発現ベクターｐＭＥ−Ｅ１（ＷＯ ９９／３７６７７に記載）を鋳型としてＰＣＲにより取得した。フォワードプライマーとして配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを，リバースプライマーとして配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを，それぞれ５’イントロンの上流配列とポリＡ付加シグナルの下流配列から設計した。
前記フォワードプライマーにはＳａｌｌ認識配列を，リバースプライマーにはＫｐｎｌ，Ｎｏｔｌ認識配列を付加してある。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて９６℃（１分）熱変性後，９６℃（１５秒），６０℃（１５秒），７５℃（８分）を３０サイクル実施した。得られた３．７−ｋｂ断片は，クローニングベクター（ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ ｐｌａｓｍｉｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。同断片はＳｐｅｌ認識配列およびＫｐｎｌ認識配列を利用してプラスミドｐＵＣ１８（東洋紡績社）にサブクローニングし，さらにその上流にＡａｔｌｌ認識配列およびＳａｌｌ認識配列を利用して前記α−カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩのプロモーター領域をサブクローニングした。以上の操作により最終的なＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウス作成用導入遺伝子（１２ｋｂ）を持つプラスミド（ｐＣＭ−Ｅ１ ｐｌａｓｍｉｄと命名した）が得られた。
〈ＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウスの作製および同定〉
ＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウス作製用導入遺伝子（１２ｋｂ）は，ｐＣＭ−Ｅ１からＡａｔｌｌおよびＮｏｔｌ制限酵素を用いて切り出した後単離精製した。得られた同遺伝子をＣ５７ＢＬ／６とＤＢＡ２マウスのＦ１交雑マウスの受精卵２８３個にマイクロインジェクションした後，同受精卵を仮親ＩＣＲマウスの卵管に移植した（Ｈｏｇａｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）。妊娠マウスを自然分娩させ，得られた仔マウス８１匹についてトランスジェニックマウスの同定を行った。
トランスジェニックマウスを同定するため，仔マウスの尻尾より単離したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ゲノムＤＮＡはマウスの尻尾からゲノムＤＮＡ抽出キット（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ−，東洋紡績社）を用いて精製した。ＢＥＣ１ ｃＤＮＡ配列（配列番号１）よりフォワードプライマーとして配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド，リバースプライマーとして配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを設計し，これを用いてＰＣＲを行うと，導入遺伝子からは２４５−ｂｐ断片が，マウスゲノムＤＮＡからはマウスＢＥＣ１が９３−ｂｐイントロンを含んだ３３８−ｂｐ断片として増幅される。同プライマーを用いて，得られた仔マウス由来ゲノムＤＮＡについてＰＣＲを行った。
ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ，Ｒｏｃｈｅ社）を用いて，９４℃（１分）熱変性を行った後，９４℃（１５秒），６０℃（１５秒），７２℃（３０秒）を３５サイクル実施した。その結果，仔マウス８１匹中１６匹がトランスジェニックマウスであることが同定された。
〈ＢＥＣ１ ｍＲＮＡの定量〉
導入された遺伝子が実際に機能しＢＥＣ１ ｍＲＮＡが過剰発現していることを確認するため，トランスジェニックマウスの脳でのＢＥＣ１ ｍＲＮＡの発現を解析した。脳摘出用のＦ１マウスを得るため，トランスジェニックマウス１６匹のうち１１匹についてＣ５７ＢＬ／６マウスと交配させた。その結果，５匹のトランスジェニックマウスにおいてＦ１マウスへの導入遺伝子の伝播が確認された。得られたＦ１トランスジェニックマウス（４週齢）から前脳と小脳を摘出し，それぞれＲＮＡを単離した。
各ＲＮＡはゲノムＤＮＡの混入を防ぐするためＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で消化した。得られたＲＮＡ中のＢＥＣ１ ｍＲＮＡコピー数をＰＲＩＳＭ７７００（ＡＢＩ社）と蛍光試薬ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いたリアルタイムＰＣＲにより定量した。リアルタイムＰＣＲの鋳型として，各ＲＮＡから逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応キット（Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲ ｋｉｔ，クロンテック社）により合成した一本鎖ｃＤＮＡを用いた。フォワードプライマーとして配列番号１１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド，リバースプライマーとして配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを，導入遺伝子であるヒトＢＥＣ１とラットおよびマウスのＢＥＣ１に共通する配列から設計した。
リアルタイムＰＣＲの結果，５系統のトランスジェニックマウスのうち３系統（＃６−５，＃７−７，＃９−５）に野生型の約１０倍の前脳選択的なＢＥＣ１ ｍＲＮＡ過剰発現が認められた。系統＃９−５を選択し，さらに脳各部位（大脳皮質，海馬，線条体，視床下部，視床，中脳，脳幹，小脳）のＢＥＣ１ ｍＲＮＡ発現量を野生型マウスとトランスジェニックマウスで比較した。その結果，トランスジェニックマウスでのＢＥＣ１ ｍＲＮＡ過剰発現は，野生型でも発現の認められた大脳皮質，海馬，線条体において顕著であることが確認された。
実施例８２５
〈ＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウスのモリス式水迷路試験における学習行動解析〉
ＢＥＣ１過剰発現の学習行動に与える作用を解析するため，＃９−５系統のトランスジェニックマウスと野生型マウスのモリス式水迷路における学習行動を比較した。
生後１０週齢オスのトランスジェニックマウス（１２匹）と野生型マウス（１５匹）を用いた。直径１００ｃｍの円形のプールに絵の具を用いて白濁させた水をはり，水面下５ｍｍの位置に直径１０ｃｍの円形のプラットフォームを設置した。実験時の室温および水温は２３℃であった。プールに入れたマウスの水泳の軌跡を水迷路画像解析装置（ＮＩＨ ｉｍａｇｅ−小原医科産業）によって記録解析し，プラットフォームへの到達時間，プールを４分割したときの各領域への滞在時間を測定した。トレーニングの１試行は７０秒とし，１日３試行のトレーニングを５日間行った。トレーニング初日のプラットフォーム到達所要時間は両群ともほぼ同じ値であったが，トレーニング開始３日目以降はトランスジェニックマウスの所要時間は野生型よりも延長された。トレーニング最終日には，プラットフォーム到達所要時間（平均値±標準誤差）は野生型６．９±１．０秒に対しトランスジェニックマウス１８．１±６．４秒となり統計的に有意な差が認められた（ｐ〈０．０５：二元配置分散分析）。
トレーニング終了後，プラットフォームを除去したプールに４０秒間マウスを入れ，マウスのプラットフォーム存在領域に滞在する時間を測定した。その結果，トランスジェニックマウスの滞在時間は野生型よりも統計的に有意に短かった（ｐ〈０．０１：Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
以上の結果は，トランスジェニックマウスではプラットフォーム位置の記憶学習が低下していることを示す。
実施例８２６
〈ＢＥＣ１過剰発現トランスジェニックマウスの受動的回避試験における学習行動解析〉
生後８週齢メスの＃９−５系統トランスジェニックマウス（６匹）と野生型マウス（８匹）を用いた。マウス用明暗実験装置（小原医科産業）の明箱部分にマウスを入れ，マウスが暗箱に進入した時点で６０Ｖ・２秒間の定電圧刺激を与えた。２４時間後に再びマウスを明箱に入れ，この時の暗箱進入潜時を測定した。
その結果，トランスジェニックマウスの暗箱進入潜時は１６７秒（中央値）であり野生型マウスの６００秒（中央値）に比べ有意に短かった（ｐ〈０．０５：Ｗｉｌｅｃｏｘｏｎ ｒａｎｋ ｓｕｍ ｔｅｓｔ）。
トランスジェニックマウスでは暗箱に関連づけられた電気刺激を学習する能力が低下していることが示された。
実施例８２７
電撃痙攣ショック（ＥＣＳ）誘発学習障害（マウス受動回避反応試験）
既報（Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３２１；２７３−２７８、１９９７）を参考に以下のように評価を行った。
動物；ｄｄＹ系雄性マウス（ＳＬＣ、訓練時５週齢）を用いた。１群３１−３２匹とした。
＜実験手順＞
薬剤調製
評価化合物は生理食塩水中に０．５％となるようメチルセルロースを溶解した溶液（以下、０．５％メチルセルロース溶液）に懸濁した。投与容量は体重１ｋｇ当たり１０ｍｌとした。評価化合物の偽薬として体重１ｋｇ当たり１０ｍｌの０．５％メチルセルロース溶液（以下、Ｖｅｈｉｃｌｅ）を投与した。
訓練
（１）実験１日目にマウスを実験室に１時間以上放置した。
（２）マウスを受動回避反応試験実験装置の明室に入れ、３０秒間放置した。その後、ギロチンドアをはずした。マウスが暗室に入ると電気ショック（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ６０Ｖ、ｄｅｌａｙ １ｓｅｃ、ｄｕｒａｔｉｏｎ ３ｓｅｃ）を受けて明室に戻ってきたらギロチンドアをしめ、明室に３０秒間放置した。
（３）マウスを取り出し、素早く（１分以内）角膜電極をつけ、電撃痙攣ショック（ＥＣＳ，５０Ｈｚ，ｉｎｔｅｒｖａｌ ２０ｍｓ，ｄｕｒａｔｉｏｎ １０ｍｓ，ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ２０ｍＡ，ｇａｔｅ １ｓｅｃ）を与えた。
（４）評価化合物を腹腔内投与した。
（５）ホームケージに戻した。
（６）訓練終了後、６０分間以上実験室に放置し、その後飼育室に戻した。
試験（訓練の２４時間後）
（１）実験室に１時間以上動物を放置した。
（２）マウスを明室に入れ、３０秒間放置した後、ギロチンドアをはずした。
（３）ギロチンドアを外してからマウスが暗室のセンサーを横切るまでの時間（ｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｌａｔｅｎｃｙ）を記録した。最長測定時間は６００秒とした。
（４）ｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｌａｔｅｎｃｙを学習形成の指標として採用した。評価化合物の学習障害改善作用は（ＥＣＳ負荷＋Ｖｅｈｉｃｌｅ投与）群と（ＥＣＳ負荷＋評価化合物投与）群との多群間で両側Ｓｔｅｅｌ検定による比較に基づいて判定した。ｐ〈０．０５で有意な差があると判定した。実施例７４４で示される化合物を腹腔内投与した場合の最小有効用量は３ｍｇ／ｋｇであった。
以上の結果，代表的な化合物として実施例７４４に示す化合物が、ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害活性を有し、かつマウス受動的回避学習試験において電撃痙攣（ＥＣＳ）で誘発される学習障害を改善する作用を示すことが確認された。
【表４】
１塩酸塩
ｍ．ｐ．：１８４−１８６
１Ｈ−ＮＭＲ：１．２０（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．８５−４．４０（１Ｈ，ｍ），６．０２（４Ｈ，ｓ），６．７７−７．０７（４Ｈ，ｍ），７．１０−７．５５（２Ｈ，ｍ），８．５５（１Ｈ，ｂｒｓ），９．８５−１０．８５（２Ｈ，ｍ）／ＤＭＳＯ−ｄ６
【表９】
Claims (5)
- ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有する物質を有効成分とする抗痴呆薬。
- ＢＥＣ１カリウムチャネル阻害作用を有する物質が式（Ｉ）に示される２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩である抗痴呆薬。
（式中の記号は次の通りである。
Ｒ１及びＲ２：同一又は異なって，Ｈ，ＯＨ，アルキル−Ｏ−，アリール−ＣＯ−，Ｈ２Ｎ，ＯＨで置換されていてもよいアルキル−ＮＨ，（アルキル）２Ｎ，置換されていてもよい炭化水素基，置換されていてもよいヘテロ環，又はＲ１，Ｒ２及び隣接するＮと一体となって含窒素ヘテロ環を形成することができ，当該環は置換されていてもよい。
Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６：同一又は異なって，（ｉ）Ｈ，（ｉｉ）ＣＮ，（ｉｉｉ）ＮＯ２，（ｉｖ）ハロゲン，（ｖ）（１）ＣＮ，（２）ハロゲン若しくは（３）ＯＨで置換されていてもよい低級アルキル，（ｖｉ）シクロアルキル，（ｖｉｉ）低級アルキルで置換されていてもよいアリール，（ｉｘ）低級アルキルで置換されていてもよいヘテロ環，（ｘ）Ｒ７Ｒ８Ｎ−（Ｒ７及びＲ８：同一又は異なって，（１）Ｈ，（２）アリール若しくはＲ９−Ｏ−ＣＯ−で置換されていてもよい低級アルキル（Ｒ９：（１）Ｈ，若しくはアリールで置換されていてもよい低級アルキル），（ｘｉ）Ｒ１０−Ｔ１−（Ｒ１０：（１）Ｈ，（２）アリール，ＨＯ−Ｃ１−１０アルキレン−Ｏ−若しくはＨＯで置換されていてもよい低級アルキル，若しくは（３）アリール，Ｔ１：Ｏ若しくはＳ），又は（ｘｉｉ）Ｒ１１−Ｔ２−（Ｒ１１：（１）ＯＨ，（２）Ｒ７Ｒ８Ｎ−，（３）低級アルキル−Ｏ−，（４）低級アルキル，（５）アリール，若しくは（６）ヘテロ環（Ｔ２：ＣＯ若しくはＳＯ２）），
更にＲ３，Ｒ４及び隣接するＣ若しくはＲ５，Ｒ６及び隣接するＣと一体となってヘテロ環，環状炭化水素環を形成しベンゼン環と縮合することができる。）。 - 式（Ｉ）に示される２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩を有効成分とする配列番号２に記載のＢＥＣ１カリウムチャネル阻害剤。
- 式（ＩＩ）に示される２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩
（式中の記号は次の通りである。
Ｒ１及びＲ２：同一又は異なって，Ｈ，ＯＨ，アルキル−Ｏ−，アリール−ＣＯ−，Ｈ２Ｎ，ＯＨで置換されていてもよいアルキル−ＮＨ，（アルキル）２Ｎ，置換されていてもよい炭化水素基，置換されていてもよいヘテロ環，又はＲ１，Ｒ２及び隣接するＮと一体となって含窒素ヘテロ環を形成することができ，当該環は置換されていてもよい。
Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６：同一又は異なって，（ｉ）Ｈ，（ｉｉ）ＣＮ，（ｉｉｉ）ＮＯ２，（ｉｖ）ハロゲン，（ｖ）（１）ＣＮ，（２）ハロゲン若しくは（３）ＯＨで置換されていてもよい低級アルキル，（ｖｉ）シクロアルキル，（ｖｉｉ）低級アルキルで置換されていてもよいアリール，（ｉｘ）低級アルキルで置換されていてもよいヘテロ環，（ｘ）Ｒ７Ｒ８Ｎ−（Ｒ７及びＲ８：同一又は異なって，（１）Ｈ，（２）アリール若しくはＲ９−Ｏ−ＣＯ−で置換されていてもよい低級アルキル（Ｒ９：（１）Ｈ，若しくはアリールで置換されていてもよい低級アルキル），（ｘｉ）Ｒ１０−Ｔ１−（Ｒ１０：（１）Ｈ，（２）アリール，ＨＯ−Ｃ１−１０アルキレン−Ｏ−若しくはＨＯで置換されていてもよい低級アルキル，若しくは（３）アリール，Ｔ１：Ｏ若しくはＳ），又は（ｘｉｉ）Ｒ１１−Ｔ２−（Ｒ１１：（１）ＯＨ，（２）Ｒ７Ｒ８Ｎ−，（３）低級アルキル−Ｏ−，（４）低級アルキル，（５）アリール，若しくは（６）ヘテロ環（Ｔ２：ＣＯ若しくはＳＯ２）），
更にＲ３，Ｒ４及び隣接するＣ若しくはＲ５，Ｒ６及び隣接するＣと一体となってヘテロ環，環状炭化水素環を形成しベンゼン環と縮合することができる。
但し、上記式（ＩＩ）中Ｒ１及びＲ２が同一又は異なって，（ｉ）Ｈ，ＮＨ２，シクロヘキシル，置換されていてもよいフェニル，Ｒａ−（ＣＨ２）２−（Ｒａ：ＨＳ，ＨＯ，Ｒ７Ｒ８Ｎ，ＣＯＯＨ，エトキシ，ＣＮ，モルホリノ，クロロ），以下▲１▼乃至▲５▼の置換基で置換されていてもよいアルキル（▲１▼ＨＯＯＣ，▲２▼アルキル−Ｏ−ＣＯ−，▲３▼置換されていてもよいフェニル，▲４▼Ｒ７Ｒ８ＮＣＯＮＨＣＯ，又は▲５▼Ｒ７Ｒ８ＮＣＯＮＨＣＯ−），アルケニル、フェニル−Ｓ−，フェニル−ＳＯ２−，置換されていてもよいフェニルＮＨＣＳ−，置換されていてもよいフェニルＮＨＣＯ−，アルキル−Ｏ−ＣＯ−，Ｈ２ＮＣＳ，クロロ−ＣＯＣＨ２−，置換されていてもよい１，３，４−オキサジアゾール−２−イルメチル，或いはＲ１，Ｒ２及び隣接するＣと一体になってピラゾール−１−イル，インドール−１−イル，インダゾール−２−イル，ピペリジン−１−イル若しくはモルホリル−４−イルであり且つＲ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６が同一又は異なって，Ｈ，ハロゲン，ＮＯ２，アセチル，ＨＯ，低級アルキル−Ｏ−，ＨＯＯＣ−，低級アルキル−Ｏ−ＣＯ−，Ｈ２ＮＳＯ２−，又は低級アルキルである場合を除く。 - 請求の範囲４に記載の２，４，６−トリアミノ−１，３，５−トリアジン誘導体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬組成物。
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