JPS63160596A - Novel physiologically active polypeptide - Google Patents

Novel physiologically active polypeptide

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Publication number
JPS63160596A
JPS63160596A JP61307887A JP30788786A JPS63160596A JP S63160596 A JPS63160596 A JP S63160596A JP 61307887 A JP61307887 A JP 61307887A JP 30788786 A JP30788786 A JP 30788786A JP S63160596 A JPS63160596 A JP S63160596A
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JP
Japan
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plasmid
polypeptide
amino acid
acid sequence
active polypeptide
Prior art date
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Pending
Application number
JP61307887A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
Kazuo Kitai
北井 一男
Tsukio Sakugi
柵木 津希夫
Satoshi Nakamura
聡 中村
Yataro Ichikawa
市川 弥太郎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Teijin Ltd
Original Assignee
Teijin Ltd
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Filing date
Publication date
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Publication of JPS63160596A publication Critical patent/JPS63160596A/en
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525Tumour necrosis factor [TNF]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

NEW MATERIAL:A physiologically active polypeptide expressed by the formula. USE:A carcinostatic agent. PREPARATION:For example, a novel human tumor necrotic factor (TNF) gene capable of coding a polypeptide expressed by the formula using a base sequence of a structural gene part of a human TNF precursor cDNA as a base plate is designed and synthesized to respectively link a translation starting codon with the 5'-side and two translation completing codons with the 3'-side. Furthermore, cleavage parts by restriction enzymes are provided on the upstream part on the 5'-side ad downstream part on the 3'-side to readily link to a vector plasmid. The resultant plasmid is then linked to a suitable vector to prepare a recombinant plasmid, which is then inserted to transform a host microorganism. The transformed microorganism is then cultivated in a culture medium to separate the formed product from the culture and afford the polypeptide expressed by the formula.

Description

【発明の詳細な説明】 (1)産業上の利用分野 本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするDNA領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポ
リペプチド(以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略す
こともある)、該ポリペプチドをコードするDNA領域
を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質転
換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた新
規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。
Detailed Description of the Invention (1) Industrial Application Field The present invention relates to a novel physiologically active polypeptide, a recombinant plasmid containing a DNA region encoding the polypeptide, a recombinant microbial cell transformed with the plasmid, and a recombinant microbial cell transformed with the plasmid. The present invention relates to a method for producing a novel physiologically active polypeptide using the microbial cells. More specifically, novel polypeptides having antitumor activity (hereinafter sometimes abbreviated as novel antitumor activity polypeptides), recombinant plasmids containing a DNA region encoding the polypeptides, and constructs transformed with the plasmids. The present invention relates to a modified microbial cell and a method for producing a novel antitumor active polypeptide using the microbial cell.

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはIUPA
C−ILJB生化学委員会(CBN>で採用された方法
により略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる
In this specification, amino acids and polypeptides are referred to as IUPA
It shall be abbreviated according to the method adopted by the C-ILJB Biochemistry Committee (CBN>), for example, the following abbreviations are used.

Alal−−アラニン Ar(IIL−アルギニン ASn L−アスパラギン AspL−アスパラギン酸 Cys  L−システィン Gln  L−グルタミン Glu  L−グルタミン酸 Gly  グリシン His  L−ヒスチジン 11el−イソロイシン しeu  し−oイシン LyS  L−リジン Met L−メチオニン phe  L−フェニルアラニン ProL−プロリン 3er  L−セリン Thrl−スレオニン l”rp  L−t−リプトファン Tyr  L−チロシン Val  l−バリン また、DNAの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。
Alal--Alanine Ar (IIL-Arginine ASn L-Asparagine AspL-Aspartic acid Cys L-Cystine Gln L-Glutamine Glu L-Glutamate Gly Glycine His L-Histidine 11el-Isoleucine Eu Shi-o Isine LyS L-Lysine Met L -Methionine phe L-Phenylalanine ProL-Proline 3er L-Serine Thrl-Threonine l”rp L-t-Lyptophan Tyr L-Tyrosine Val l-Valine Also, the sequence of DNA is the base contained in each deoxyribonucleotide that makes it up. shall be abbreviated by type,
For example, use the following abbreviations.

A アデニン(デオキシアデニル酸を示す。)Cシトシ
ン(デオキシシチジル酸を示す。)G グアニン(デオ
キシグアニル酸を示す。)T チミン (デオキシチミ
ジル酸を示す。)さらに、(HzN)−及び−(COO
H)はそれぞれアミノ酸配列のアミン末端側及びカルボ
キシ末端側を示すものであり、(5′)−及び(3′ 
)はそれぞれDNA配列の5′末端側及び3′末端側を
示すものである。
A Adenine (represents deoxyadenylic acid) C Cytosine (represents deoxycytidylic acid) G Guanine (represents deoxyguanylic acid) T Thymine (represents deoxythymidylic acid) Furthermore, (HzN) - and -( COO
H) indicates the amine terminal side and carboxy terminal side of the amino acid sequence, respectively, (5')- and (3'
) indicate the 5' end and 3' end of the DNA sequence, respectively.

(2発明の背景 Carswal Iらは、3acillus  Ca1
lllette−Guerin  (BCG)などで前
もって刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した
後に採取した血清中に、移植したMethA肉腫による
癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、
この物質を腫瘍壊死因子(T ua+or  N ec
rosisl”actor 、以下TNFと略記するこ
ともある)と名づけだ[E、 A、 Carswall
 ら、 Pr0c、Na口。
(2 Background of the Invention Carswal I et al.
We discovered that the serum collected after administering endotoxin to mice that had been stimulated with llette-Guerin (BCG), etc., contained a substance that caused hemorrhagic necrosis of the transplanted MethA sarcoma cancer.
This substance is treated as tumor necrosis factor (Tua+or Nec).
[E, A, Carswall]
et al., Pr0c, Na mouth.

Acad、Sci、、USA、 72.3666 (1
975) ] 、このTNFはマウス、ウサギ、ヒト等
多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、しかも種
を越えて働くことから、制癌剤としての利用が期待され
てきた。
Acad, Sci,, USA, 72.3666 (1
975)], this TNF is found in many animals such as mice, rabbits, and humans, and since it acts specifically on tumor cells and across species, it has been expected to be used as an anticancer agent.

最近になッテ、Penn1caらは、ヒトTNFのCD
 N Aクローニングを行ない、ヒトTNF蛋白質の一
次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトTN
FI伝子の発現について報告した[ [) 、  P 
cnnicaら、  Nature 、 ≦312. 
724(1984) ] 。その後、自弁ら[T、Bh
trat ら。
Recently, Penn1ca et al.
We carried out NA cloning to clarify the primary structure of human TNF protein and
reported on the expression of the FI gene [[), P
cnnica et al., Nature, ≦312.
724 (1984)]. After that, Jiben et al. [T, Bh
Trat et al.

Nature 、  313. 803(1985) 
] 、宗村ら[家相う、 Kl:(t、学11Nt1.
12. 160(1985) ] 、Wan(1ら[A
、 M、 Wanc+ら、 5cience、ユ28.
 149(1985) ]及びM armenoutら
[A 0M arllenotltら。
Nature, 313. 803 (1985)
], Munemura et al.
12. 160 (1985)], Wan (1 et al. [A
, M., Wanc+ et al., 5science, Yu28.
149 (1985)] and Marmenout et al.

Eur、 J、 Biochem、、 152. 51
5(1985) ]が、ヒトTNFm伝子の大腸菌にお
ける発現について相ついで報告している。
Eur, J. Biochem, 152. 51
5 (1985)] have successively reported on the expression of the human TNFm gene in Escherichia coli.

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトTNF蛋白質が多填に入手できるようになるに及
び、1”NFの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明ら
かになりつつある。たとえば、癌末期や車症感染症患者
に見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケク
チンがTNFに非常に類似シテおり[B、 Beult
erら、 Nature 。
Through the use of genetic engineering technology, pure human TNF protein has become available in large quantities, and the physiological activities of 1"NF other than its antitumor activity are becoming clear. For example, in cancer Cachectin, which is one of the causes of cachexia seen in terminally ill patients and patients with infectious diseases, is very similar to TNF [B, Beult
et al., Nature.

31B、  552(1985) ] 、カケクチンが
リボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、
TNFの投与により血中のトリグリセリトロが増大し、
その結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可
能性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血
管内皮細胞への影響LJ、R。
31B, 552 (1985)], since cachectin has riboprotein lipase inhibitory activity,
Administration of TNF increases triglyceride levels in the blood,
It was suggested that this may result in side effects such as hyperlipidemia. In addition, there are also effects on vascular endothelial cells LJ, R.

Q ambleら、J、 Exp、 Med、 、ユ6
2.2163(1985) ] 、骨吸収作用[D、 
R,Be1toliniら、Nature 、ユ19.
 516(198G) ]等が報告されている。
Q amble et al., J. Exp. Med, Yu6
2.2163 (1985)], bone resorption effect [D,
R. Beltolini et al., Nature, Yu 19.
516 (198G) ] etc. have been reported.

一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。
On the other hand, recent advances in genetic engineering technology have enabled the substitution or addition of arbitrary amino acids in proteins with other amino acids,
or allowed to be deleted.

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。
In this way, many studies have been carried out to create new proteins that serve specific purposes by modifying naturally occurring proteins.

ヒトTNF蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第1図記載のヒトTNF蛋白質のアミノ酸
配列において、Cy s j/及びcyS/I/のいず
れか又は両方の他のアミノ酸残基への置換(PCT出願
公開WO36/ 0460G号、特願昭6l−1067
72) 、G I’/’“の他のアミノ酸残基への置換
(特願昭61−106772号、特願昭61−2380
48@ ) 。
Several studies have also been conducted on the modification of human TNF protein, and in the amino acid sequence of human TNF protein shown in Figure 1, other amino acid residues of either or both of Cy s j/ and cyS/I/ (PCT Application Publication No. WO36/0460G, Patent Application Sho 6l-1067
72), substitution of G I'/''' with other amino acid residues (Japanese Patent Application No. 106772/1982, Patent Application No. 2380/1983)
48@).

Ala”の他のアミノ酸残基への置換(特願昭6l−2
333371q )が報告されている。また、アミノ末
端側のアミノ酸残塁の欠失についても、6アミノ酸欠失
TNFが細胞障害活性を有していること(特開昭61−
50923号)、7アミノ酸欠失TNFがIIl胞障害
活性を有していること(特願昭61−90087号)、
1〜10アミノ酸欠失TNFが細胞障害活性を有してお
り、その比活性は6〜8アミノ酸欠失TNFにおいて糧
大になること(PCT出願公開WO36/ 02381
号)、10アミノ酸欠失TNFが細胞障害活性を有して
いること(特願昭61−114754M ’)、及び1
1アミノ酸欠失TNFffi細胞陣害活性を有している
こと(特願昭61−173822号)が報告されている
Substitution of “Ala” with other amino acid residues (Patent application 1986-1-2)
333371q) has been reported. Furthermore, it has been shown that 6-amino acid-deleted TNF has cytotoxic activity even with deletion of amino acid residues on the amino terminal side (JP-A-61-1999).
50923), that 7 amino acid deleted TNF has IIl cytotoxic activity (Japanese Patent Application No. 61-90087);
1 to 10 amino acid deleted TNF has cytotoxic activity, and the specific activity is significant in 6 to 8 amino acid deleted TNF (PCT application publication WO 36/02381
No. 1), 10 amino acid deletion TNF has cytotoxic activity (Japanese Patent Application No. 114754M' 1986), and 1.
It has been reported that TNFffi with one amino acid deletion has cell-killing activity (Japanese Patent Application No. 173822/1982).

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上1反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトTNF蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。
Therefore, the present inventors have conducted intensive research on modification of human TNF protein with the aim of improving specific activity, improving stability, broadening the reaction spectrum, and reducing side effects.
The present invention has now been completed.

(3)  発明の目的 本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。
(3) Object of the invention The object of the present invention is to provide a novel polypeptide with antitumor activity.

本発明の伯の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするDNA領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。
An object of the present invention is to provide a recombinant plasmid containing a DNA region encoding a novel antitumor active polypeptide.

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。
Still another object of the present invention is to provide a recombinant microorganism transformed with the above recombinant plasmid and a method for producing a novel antitumor active polypeptide using the recombinant microorganism cells.

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。
Still other objects of the present invention will become clearer from the following description.

(4)  発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列 (HzN)  rhr−pro−8er−AStl  
LyS−P ro −Val−A Ia −His −
Val−Val−A Ia −Asn−1−1is−G
ln−Ala−Gln−Gly−Gin −L 13L
I−G In−T rfl−L Ou−A Sn−A 
r(1−A r(1−A Ia −A Sn −A I
a −L cu −L eu −A Ia−Asn −
Gly−Val−Glu −Leu−Ara−Asp−
Asn −Gln −Lcu−Val−Val−Pro
−8er−Glu −Q ly−L eu −7yr−
1au −11e −T yr −S er −Gln
−Val−Leu−Phe−Lys−Gly−Gln−
G  Iy −Cys−P  ro −S  er −
T  hr−ト1is−Val−L  eu−L  e
u−T  hr−ト1  iS −T  hr −11
e −S  Or −Ar(1−11e−Ala −V
 al −S cr −Tyr −Q In −Thr
−L ys −Vat −A sn −L eu −L
 eu −Ser −A la−I Ie −1ys−
Ser −pro −CVS −G In −A ro
−G lu−T hr−P ro−G lu−G Iy
−A Ia−G lu−A Ia−L l/S−P r
o −T rl) −T Vr−G 1u−P ro 
−11e−Tyr −Leu −G ly −G ly
 −Vat −P he −G In −L eu −
G lu −L ys −G ly −A sp −A
ro−Leu−8er−A 1a−Glu−I Ie−
Asn−A ro−P ro−A3p−Tyr−Leu
−Asp−Phe−A la−G lu−5er−G 
Iy−G In−Val−Tyr−Phe−Gly −
I Ie −11e−Ala−Leu −(CO01−
1) で表わされる新規抗腫瘍活性ポリペプチドまたはそのア
ミノ末端にMetが結合したポリペプチドを提供するこ
とによって達成され、また上記新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドをコードするDNA領域を含む組換えプラスミドを
提供することによって達成され、更にかくして得られた
組換えプラスミドによって形質転換された組換え微生物
細胞、その微生物細胞を用いて目的とする新規抗腫瘍活
性ポリペプチドを産生ずる方法及びこの新規抗腫瘍活性
ポリペプチドを含有する医薬組成物を提供することによ
って達成されることがわかった。
(4) Structure of the Invention According to the research conducted by the present inventors, the object of the present invention is to obtain the following amino acid sequence (HzN) rhr-pro-8er-AStl
LyS-Pro-Val-A Ia-His-
Val-Val-A Ia-Asn-1-1is-G
ln-Ala-Gln-Gly-Gin-L 13L
I-G In-T rfl-L Ou-A Sn-A
r(1-A r(1-A Ia -A Sn -A I
a -L cu -L eu -A Ia-Asn -
Gly-Val-Glu-Leu-Ara-Asp-
Asn-Gln-Lcu-Val-Val-Pro
-8er-Glu -Q ly-L eu -7yr-
1au -11e -Tyr -Ser -Gln
-Val-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-
GIy-Cys-Pro-Ser-
T hr-t1is-Val-L eu-L e
u-T hr-1 iS -T hr -11
e -S Or -Ar(1-11e-Ala-V
al -S cr -Tyr -Q In -Thr
-L ys -Vat -A sn -L eu -L
eu -Ser -A la-I Ie -1ys-
Ser-pro-CVS-G In-A ro
-G lu-T hr-Pro-G lu-G Iy
-A Ia-G lu-A Ia-L l/S-P r
o -T rl) -T Vr-G 1u-P ro
-11e-Tyr -Leu -G ly -G ly
-Vat -P he -G In -L eu -
G lu -L ys -G ly -A sp -A
ro-Leu-8er-A 1a-Glu-I Ie-
Asn-A ro-Pro ro-A3p-Tyr-Leu
-Asp-Phe-A la-G lu-5er-G
Iy-G In-Val-Tyr-Phe-Gly-
I Ie -11e-Ala-Leu -(CO01-
1) This is achieved by providing a novel anti-tumor active polypeptide represented by the above or a polypeptide having Met bound to its amino terminus, and also provides a recombinant plasmid containing a DNA region encoding the above-mentioned novel anti-tumor active polypeptide. and a recombinant microbial cell transformed with the recombinant plasmid thus obtained, a method for producing the target novel antitumor active polypeptide using the microbial cell, and this novel antitumor active polypeptide. It has been found that this can be achieved by providing a pharmaceutical composition containing the peptide.

以下本発明について更に詳細に説明する。The present invention will be explained in more detail below.

(A)ヒトTNF遺伝子のりO−ン化;ヒトTNF3n
伝子は、ヒトTNF蛋白質を構成するアミノ酸[D 、
 P ennicaら、前出]を指定するいくつかのコ
ドンの中から適当なものを選び、それを化学合成するこ
とによって取得できる。ヒトTNFm転子の設計に際し
ては、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択するこ
とが望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に
行なえるように適当な位置に適当な制限酵素による切断
部位を設けることが望ましい。
(A) Human TNF gene conversion; human TNF3n
The gene consists of amino acids [D,
It can be obtained by selecting an appropriate codon from among several codons specifying [Pennica et al., supra] and chemically synthesizing it. When designing the human TNFm trochanter, it is desirable to select codons that are most suitable for the host cell used, and provide cleavage sites with appropriate restriction enzymes at appropriate positions to facilitate subsequent cloning and genetic modification. This is desirable.

また、ヒトTNF蛋白質をコードするDNA領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致さぜた形での翻訳開始
コドン(ATG)を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン(TGA。
Furthermore, the DNA region encoding the human TNF protein preferably has a translation initiation codon (ATG) with matching reading frames upstream thereof, and a translation initiation codon (ATG) with matching reading frames downstream thereof. Translation stop codon (TGA).

TAGまたはTAA)を有することが好ましい。TAG or TAA).

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
2つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。
The above translation stop codon is used to improve expression efficiency.
It is particularly preferred to connect two or more in tandem.

さらに、このヒトTNFm転子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トTN Fffl伝子m転子配列の例を、第1図に示し
た。
Furthermore, this human TNFm trochanter can be cloned into an appropriate vector by using cleavage sites for restriction enzymes that act upstream and downstream thereof. An example of such a human TN Fffl gene m-trochanter sequence is shown in FIG.

上記のように設計したヒトTNF遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第2図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法[H,G、 Khorana
To obtain the human TNF gene designed as described above, each of the upper and lower strands is divided into several oligonucleotides as shown in Figure 2, and these are chemically synthesized. It is desirable to use a method of linking each oligonucleotide. The synthesis method for each oligonucleotide is the diester method [H, G, Khorana
.

” 3 ome  Recent  [) evelo
pments  inChemistry  of  
p hosphate  E 5ters   of3
 iological   l nterest  ”
 、  J ohn   W 1leyand   3
ons  、  [nc、、New  York  (
1961)  ]。
” 3 home Recent [) evelo
pments in Chemistry of
Phosphate E 5ters of3
iological interest”
, John W 1leyand 3
ons, [nc,, New York (
1961) ].

]1−リエステル法 R、L 、 L etsinae
rら、J。
]1-Reester method R, L, L etsinae
r et al., J.

And、  Che+++、  Soc、、89.48
01(1967) ]及びボスファイト法[M、 D、
 Matteucciら。
And, Che+++, Soc,, 89.48
01 (1967)] and the Bosphite method [M, D,
Matteucci et al.

Tctrahedron  Lett、、 21. 7
19(1980) ]があるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全白IJIDNA合成機を用いた
ホスファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴ
ヌクレオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマト
グラフィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体
クロマトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用
いることができる。
Tctrahedron Lett, 21. 7
19 (1980)], but synthesis by the phosphite method using a Zenshiro IJI DNA synthesizer is preferred from the viewpoint of synthesis time, yield, simplicity of operation, etc. To purify the synthesized oligonucleotide, gel filtration, ion-exchange chromatography, gel electrophoresis, high-performance liquid chromatography using a reversed phase column, etc. can be used individually or in combination as appropriate.

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの5′末端側
の水酸基を、たとえばT4−ボリヌ、クレオチドキナー
ゼを用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえ
ばT4−DNAリガーゼを用いて連結する。合成オリゴ
ヌクレオチドを連結してヒトTN F311伝子を作成
する方法としでは、合成オリゴヌクレオチドをいくつか
のブロックに分けて連結し、たとえばpBR322[F
 、  B olivarら、  Gene 、  2
. 95(1977) ]のようなベクターに一度クロ
ーン化した後、それらの各ブロックのDNA断片を連結
する方法が好ましい。このようなヒトTNF遺伝子を構
成するブロックのDNA断片を含むプラスミドとして、
好ましくはpTNFlBR。
The hydroxyl group at the 5' end of the synthetic oligonucleotide thus obtained is phosphorylated using, for example, T4-vorinucleotide kinase, and then annealed and ligated using, for example, T4-DNA ligase. A method for constructing the human TNF311 gene by linking synthetic oligonucleotides involves dividing the synthetic oligonucleotides into several blocks and linking them, for example, pBR322[F311].
, B olivar et al., Gene, 2
.. 95 (1977)], and then the DNA fragments of each block are ligated together. As a plasmid containing a DNA fragment of a block constituting such a human TNF gene,
Preferably pTNF1BR.

pTNF2NまたはpTNF3が用いられる。pTNF2N or pTNF3 is used.

上記のようにしてクローン化したヒトTNF遺伝子を構
成する各ブロックのDNA断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、 SD (シャイン・ダルガーノ)配列の
下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることがで
きる。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン
・オペロン・プロモーター(trpプロ゛モーター)。
After ligating the DNA fragments of each block constituting the human TNF gene cloned as described above, an expressed gene can be obtained by ligating downstream of an appropriate promoter and SD (Shine-Dalgarno) sequence. . A usable promoter is the tryptophan operon promoter (trp promoter).

ラクトース・オペロン・プロモーター(lacプロモー
ター) 、 tacプロモーター、PLプロモーター、
 Ippプロモーター等があげられるが、とりわけtr
pプロモーターが好適である。trpプロモーターを有
するプラスミドとして、好ましくはpYs31N、又は
pA A 41が用いられる。
Lactose operon promoter (lac promoter), tac promoter, PL promoter,
Examples include the Ipp promoter, but especially the tr
The p promoter is preferred. As a plasmid having a trp promoter, pYs31N or pA A41 is preferably used.

さらに、発現効率向上を目的として、ヒトTNF遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このようなターミネータ−として、
1ppターミネータ−1trpターミネータ−等があげ
られるが、とりわけtrp Aターミネータ−が好適で
あり、trp△ターミネータ−を有するプラスミドとし
て、好ましくはpA A 41が用いられる。この発現
型ヒトTNF遺伝子を、たとえばpBR322由来のベ
クターにクローン化することにより、発現型プラスミド
が作成できる。ヒトTNF遺伝子発現型プラスミドとし
て、好ましくはpTNF401NN又はpTNF 40
1Aが用いられる。
Furthermore, for the purpose of improving expression efficiency, a terminator that functions efficiently in E. coli can be added downstream of the human TNF gene. As such a terminator,
Examples include 1pp terminator, 1trp terminator, etc., of which trp A terminator is particularly preferred, and pA A 41 is preferably used as the plasmid having trpΔ terminator. By cloning this expressed human TNF gene into a pBR322-derived vector, for example, an expression plasmid can be created. The human TNF gene expression plasmid is preferably pTNF401NN or pTNF40.
1A is used.

(B)新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
; こうして得られたヒトTNF遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトTNF遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトTNF蛋白質中の任意のア
ミノ酸を池のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗I4瘍活性ポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能にな
る。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現
型プラスミドとして、好ましくはtlTNF463が用
いられる。
(B) Cloning of a novel antitumor active polypeptide gene; The human TNF gene expression plasmid thus obtained is cut with an appropriate restriction enzyme to remove a specific region within the human TNF gene, and then an appropriate base sequence is extracted. We perform gene repair using synthetic oligonucleotides with By using such a method, an expression type containing a gene encoding a novel anti-I4 tumor active polypeptide in which any amino acid in the human TNF protein is substituted with, added to, or deleted with an Ike amino acid can be obtained. It becomes possible to create plasmids. As such a novel antitumor active polypeptide gene expression plasmid, tlTNF463 is preferably used.

(C)発現確認及び活性評価; ヒトTNF遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌[エシェ
リヒア・コリ(Escherichia  coli)
 ]が好ましい。前記ヒトTNF遺伝子発現型プラスミ
ド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドは、たとえば公知の方法CM、 V、 Noraa
rdら。
(C) Expression confirmation and activity evaluation; Examples of microbial hosts for expressing the human TNF gene and the novel antitumor active polypeptide gene include Escherichia coli, Bacillus subtilis, and yeast, but especially Escherichia coli [Escherichia coli] coli)
] is preferred. The human TNF gene expression plasmid and the novel antitumor active polypeptide gene expression plasmid can be obtained by, for example, known methods CM, V, Noraa.
rd et al.

Gene 、 3. 279(1978) ]を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリCGOOr
−m−株(ATCC33525)に導入することができ
る。
Gene, 3. 279 (1978)] using a microbial host such as Escherichia coli CGOOr
-m- strain (ATCC33525).

このようにして得られた組換え微生物warnを、それ
自体は公知の方法で培養する。培地としては、たとえば
グルコースとカザミノ酸を含むM9培地[T、 van
+attsら編、  ” M olecularCl0
ninQ”、 P 440. Co1d  Sprin
gHarbor  Laboratory 、 New
  York  (1982)参照]があげられ、必要
に応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが望ま
しい。培養は目的の組換え微生物に適した条件、たとえ
ば撮とうによる通気、撹拌を加えながら、37℃で2〜
36時間行なう。また、培養開始時または培養中に、プ
ロモーターを効率良く機能させる目的で、3−β−イン
ドールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。
The recombinant microorganism war thus obtained is cultured by a method known per se. As a medium, for example, M9 medium containing glucose and casamino acids [T, van
+atts et al., eds., “MolecularCl0
ninQ", P 440. Co1d Sprin
gHarbor Laboratory, New
York (1982)], and it is desirable to add, for example, ampicillin, if necessary. Cultivation is performed at 37°C for 2 to 2 hours under conditions suitable for the target recombinant microorganism, such as aeration by photographing and stirring.
Do it for 36 hours. Furthermore, a drug such as 3-β-indole acrylic acid can be added at the start of culture or during culture in order to make the promoter function efficiently.

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物III胞を破砕し、遠心分
離により組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られ
たライゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム(
以下、SDSと略すこともある)を含むポリアクリルア
ミドゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋
白質を適当な方法を用いて染色する。
After culturing, the recombinant microbial cells are collected by, for example, centrifugation, suspended in, for example, a phosphate buffer, the recombinant microbial III cells are disrupted by, for example, sonication, and the lysate of the recombinant microbial cells is obtained by centrifugation. The protein in the obtained lysate was treated with sodium lauryl sulfate (
The proteins in the gel are separated by electrophoresis using a polyacrylamide gel containing (hereinafter sometimes abbreviated as SDS), and the proteins in the gel are stained using an appropriate method.

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトT
NF31伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
の発現を確認する。
Human T
Confirm the expression of the NF31 gene or the novel antitumor active polypeptide gene.

このようにして得られたヒトTNF蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植した
MethA肉腫を壊死させる効果を見るin  viv
o活性測定法(CarSWellら。
The activity of the human TNF protein and the novel anti-tumor active polypeptide thus obtained was evaluated by in vivo observation of the effect of necrosis on MethA sarcoma transplanted into mice.
o activity assay (CarSWell et al.

前出)、マウスLlll胞に対する[l胞障害性を見る
in  VitrO活性測定法[Ruff 、 J。
(ibid.), In VitrO activity measurement method for mouse Lllll cytotoxicity [Ruff, J.

Imn+uno1.、126. 235(1981) 
]等により行なえるが、測定時間、定量性、測定゛の簡
便さ等の点から、in  VitrO活性測定法による
i¥価が好ましい。
Imn+uno1. , 126. 235 (1981)
] etc., but in terms of measurement time, quantitative properties, and ease of measurement, it is preferable to use an in VitrO activity measurement method.

かくして本発明によれば、従来公知のヒトTNF蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。
Thus, according to the present invention, it is possible to obtain a novel physiologically active polypeptide different from the conventionally known human TNF protein, and by using this novel antitumor active polypeptide, an excellent antitumor pharmaceutical composition can be obtained. It is now possible to provide

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.

実施例1(ヒトTNF遺伝子の設計) 第1図に示した塩基配列のヒトTNFi伝子を設計した
、設計に際しては、Penn1caら[D。
Example 1 (Design of human TNF gene) A human TNFi gene having the base sequence shown in FIG. 1 was designed.

P cnnicaら、  Nature 、  312
. 724(1984)  ] の報告したヒトTNF
前駆体cD N Aの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤
として、適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に
設け、5′側に翻訳開始コドン(ATG)を、そして3
′側に2個の翻訳終止コドン(TGA及びTAA)を°
それぞれ付与した。また、5′側翻訳開始コドン上流に
は制限酵素C1aIによる切断部位を設け、SD配列と
翻訳開始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモー
ターとの連結を可能にした。更に、3′側翻訳終止コド
ン下流には制限酵素Hindllによる切断部位を設け
、ベクター・プラスミドと容易に連結できるようにした
P cnnica et al., Nature, 312
.. 724 (1984)] reported human TNF.
Based on the base sequence of the structural gene portion of the precursor cDNA, cleavage sites with appropriate restriction enzymes are set at appropriate positions, a translation initiation codon (ATG) is placed on the 5' side, and 3
Two translation stop codons (TGA and TAA) on the ' side
granted to each. In addition, a cleavage site using the restriction enzyme C1aI was provided upstream of the 5' translation initiation codon, making it possible to link the SD sequence and the translation initiation codon to the promoter while maintaining an appropriate state. Furthermore, a cleavage site with the restriction enzyme Hindll was provided downstream of the 3' translation stop codon to facilitate ligation with a vector/plasmid.

実施例2(オリゴヌクレオチドの化学合成)実施例1で
設計したヒトTNF遺伝子は、第2図に示したように1
7本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は仝自IJJ D N A合成機(ア
プライド・バイオシステムズ。
Example 2 (Chemical synthesis of oligonucleotide) The human TNF gene designed in Example 1 was
Synthesize it in seven oligonucleotides. Oligonucleotides were synthesized using an in-house IJJ DNA synthesizer (Applied Biosystems).

モデル38OA )を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。
The test was carried out by the phosphite method using Model 38OA). Purification of the synthetic oligonucleotide was performed according to the manual of Applied Biosystems.

すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を55℃で一晩保つことにより、DNA塩基の保護
基をはずし、セファデックスG−50フアイン・ゲル(
ファルマシア)を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、7M
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度
20%)の復、紫外線シャドウィング法により泳動パタ
ーンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分を
切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく破
砕した後、2〜5Idの溶出用バッフp−[5001M
  N1140AC−1mMEDTA−0,1%SO8
(pH7,5) ]を加え、37℃で一晩振とうした。
That is, by keeping an ammonia aqueous solution containing synthetic oligonucleotides at 55°C overnight, the protecting groups of the DNA bases are removed, and the DNA bases are removed from the ammonia solution containing Sephadex G-50 Fine Gel (
A high-molecular-weight synthetic oligonucleotide fraction is collected by gel filtration using a high-molecular-weight synthetic oligonucleotide (Pharmacia). Next, 7M
After electrophoresis on a polyacrylamide gel containing urea (gel concentration 20%), the migration pattern is observed using an ultraviolet shadowing method. After cutting out a band of the desired size and finely crushing the polyacrylamide gel fragments, the elution buffer p-[5001M
N1140AC-1mMEDTA-0,1% SO8
(pH 7,5)] and shaken overnight at 37°C.

遠心分離により、目的のDNAを含む水相の回収を行な
った。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液をゲル
濾過カラム(セファデックスG −50)にかけること
により、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。なお
、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を繰
り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはかっ
た。
The aqueous phase containing the target DNA was recovered by centrifugation. Finally, a purified product of the synthetic oligonucleotide was obtained by applying the solution containing the synthetic oligonucleotide to a gel filtration column (Sephadex G-50). Note that, if necessary, polyacrylamide gel electrophoresis was repeated to improve the purity of the synthetic oligonucleotide.

実施例3(化学合成ヒトTNFm伝子のクローン化) 実施例2で作成した17本の合成オリゴヌクレオチド(
TNF−1〜TNF−17)を用いて、ヒトTNF31
伝子を3つのブロックに分けてクローン化した。
Example 3 (Cloning of chemically synthesized human TNFm gene) The 17 synthetic oligonucleotides prepared in Example 2 (
human TNF31 using TNF-1 to TNF-17)
The gene was cloned in three blocks.

0.1〜1.0μりの合成オリゴヌクレオチドTNF−
2〜TNF−6の5′末端側を、5〜15ユニツトのT
4−ポリヌクレオチドキナーゼ(E。
0.1-1.0μ synthetic oligonucleotide TNF-
2 to 5' to 15 units of T on the 5' end of TNF-6.
4-polynucleotide kinase (E.

coli3タイプ、宝酒造)を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は10〜20μpの50m
MTris−HCj  (pH9,5)   、   
10 1M    M  g C1z   。
E. coli type 3, Takara Shuzo) to phosphorylate each separately. Phosphorylation reaction is 10-20μp 50m
MTris-HCj (pH 9,5),
10 1M M g C1z.

5 iMジチオスレイトール、10mM  ATP水溶
液中で、37℃で、30分間行なった。反応終了後、す
べての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合し、
フェノール抽出、エーテル抽出によりT4−ポリヌクレ
オチドキナーゼを失活、除去する。
The test was carried out in an aqueous solution of 5 iM dithiothreitol and 10 mM ATP at 37° C. for 30 minutes. After the reaction is complete, mix all the synthetic oligonucleotide aqueous solutions,
T4-polynucleotide kinase is inactivated and removed by phenol extraction and ether extraction.

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに0.1〜
1.0μ9の合成オリゴヌクレオチドTNF−1及びT
NF−7を加え、90℃で5分間加熱した後室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。
To this synthetic oligonucleotide mixture, add 0.1~
1.0μ9 synthetic oligonucleotides TNF-1 and T
NF-7 is added, heated at 90° C. for 5 minutes, and then slowly cooled to room temperature for annealing.

次に、これを減圧乾固した後に、30μ文の66 mM
Tris−1−ICf (DH7,6) 、  6.6
1M  MOCjz 。
Next, after drying this under reduced pressure, 30μ of 66mM
Tris-1-ICf (DH7,6), 6.6
1M MOCjz.

10 mMジチオスレイトール、111MATP水溶液
に溶解させ、300ユニツトのT4−DNAリガーゼ(
宝酒造)を加えて、11℃で15時間連結反応を行なっ
た。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲ
ル濃度5%)を行ない、エチジウムブロマイド染色法に
より泳動パターンのl152察を行なう。目的とする大
きさく約220bp )のバンド部分を切出して、実施
例2の方法に従ってポリアクリルアミドゲルよりDNA
を回収する。
Dissolve in 10 mM dithiothreitol and 111 MATP aqueous solution, and add 300 units of T4-DNA ligase (
Takara Shuzo) was added thereto, and the ligation reaction was carried out at 11°C for 15 hours. After the reaction is completed, polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration: 5%) is performed, and the migration pattern is observed by ethidium bromide staining. Cut out a band with the desired size (approximately 220 bp) and gel it with DNA from a polyacrylamide gel according to the method of Example 2.
Collect.

一方、3μ9の大腸菌用プラスミドpBR322(約4
.4K t+p)を30μ文の10 mM  T ri
s−l−1(J(pH7,5) 、 60111M  
Na Cf、 7 IMMOCfz水溶液に溶解させ、
10ユニツトの制限酵素C1a’I<ニューイングラン
ド・バイオラブズ)を添加して、37℃で1時間切断反
応を行なった。
On the other hand, 3 μ9 E. coli plasmid pBR322 (approximately 4
.. 4K t+p) with 30μ of 10mM Tri
s-l-1(J(pH7,5), 60111M
NaCf, dissolved in 7 IMMOCfz aqueous solution,
10 units of restriction enzyme C1a'I (New England Biolabs) was added, and the cleavage reaction was carried out at 37°C for 1 hour.

制限酵素CIaIによる切断の後、フェノール抽出。Phenol extraction after cleavage with restriction enzyme CIaI.

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりDNAを
回収する。このDNAを30μ文の50 mMT ri
s−HCf(pH7,4) 、  100 mM  N
a C1,10IM  M<1sO4水溶液に溶解させ
、10ユニツ1への制限酵素5alI(宝酒造)を添加
して、37℃で1時間切断反応を行なった。反応終了後
、アガロースゲル電気泳動(ゲル濃度0.8%)を行な
い、エチジウムブロマイド染色法により切断パターンの
観察を行なう。プラスミドflBR322の大部分を含
む約3.7KbpのDNAの部分に相当するバンドを切
出し、そのアガロースゲル断片を3倍量(vol 7w
t)の8M  NaC10<水溶液に溶解させた。Ch
enらのグラスフィルター法[C,W。
Ether extraction is performed and DNA is recovered by ethanol precipitation. This DNA was incubated with 30 μg of 50 mMTri.
s-HCf (pH 7,4), 100 mM N
a C1,10IM M<1sO4 aqueous solution was dissolved, 10 unit 1 restriction enzyme 5alI (Takara Shuzo) was added, and a cleavage reaction was performed at 37°C for 1 hour. After the reaction is completed, agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%) is performed, and the cutting pattern is observed by ethidium bromide staining. A band corresponding to the approximately 3.7 Kbp DNA portion containing most of the plasmid flBR322 was cut out, and the agarose gel fragment was divided into 3 times the amount (vol 7w).
t) in an 8M NaCl0<aqueous solution. Ch
The glass filter method of en et al. [C, W.

C:、 henら、 Anal 、 3 iocham
、ユ01. 339(1980) ]により、約3.7
K bpのDNA断片(Cfa I”5alI )をア
ガロースゲルより回収した。
C:, hen et al., Anal, 3 iocham
, Yu01. 339 (1980)], approximately 3.7
A DNA fragment of Kbp (Cfa I''5alI) was recovered from the agarose gel.

先に得られたヒトTNF遺伝子の一部を含む約22(H
lpのDNA断片について、前記の方法に準じて末端の
リン酸化反応を行なった後、プラスミドpBR322の
大部分を含む約3.7K bpのDNA水溶液と混合す
る。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両DNA
断片の連結反応を行なった。
Approximately 22 (H
The lp DNA fragment is subjected to a terminal phosphorylation reaction according to the method described above, and then mixed with an approximately 3.7 Kbp DNA aqueous solution containing most of plasmid pBR322. After ethanol precipitation, both DNAs were separated according to the method described above.
A ligation reaction of the fragments was performed.

エシェリヒア・コリC600r−m−株の形質転換は、
通常のCaCJz法(M、 V、 Norgardらの
方法)の改良法で行なった。すなわち、5dのL培地(
1%トリプトン、0.5%酵母エキス Qj9(。
Transformation of Escherichia coli C600r-m- strain
A modification of the usual CaCJz method (method of M, V, Norgard et al.) was used. That is, 5d L medium (
1% tryptone, 0.5% yeast extract Qj9 (.

Na C1,pH7,2)にエシェリヒア・コリC60
0「1−株の18時間培1基を接種し、菌体を含む培養
液の600nmにおける濁度(ODz、)が0.3に達
するまで生育させる。菌体を冷たいマグネシウム・/<
”/77’  [0,IM  Na CL 5  mM
  MgCl2゜5 mM  Tris−Hcj (D
I−17,6,0℃)]中で2回洗い、2Idの冷した
カルシウム・バッファー[1001Mca C12,2
50mM  KCj、 5 mMMgClz 、 5 
mM  Tris−H(J (1)H7,6゜0℃)]
中に再懸濁させ、0℃で25分間rli装する。
Escherichia coli C60 to Na C1, pH7,2)
Inoculate one 18-hour culture of the 0"1- strain and grow until the turbidity (ODz, ) at 600 nm of the culture solution containing the bacterial cells reaches 0.3. Incubate the bacterial cells in cold magnesium...
”/77' [0, IM Na CL 5 mM
MgCl2゜5mM Tris-Hcj (D
I-17,6,0°C)] and washed twice in 2Id cold calcium buffer [1001Mca C12,2
50mM KCj, 5mM MgClz, 5
mM Tris-H (J(1)H7,6°0°C)]
resuspend in 100°C and RLI for 25 minutes at 0°C.

次に菌体をこの容量の1/10にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のDNA水溶液と2:1 (v
ol、: vol、) ’fU合する。この混合物を0
0分間。
Next, the bacterial cells were concentrated to 1/10 of this volume in a calcium buffer, and the ligated DNA aqueous solution was 2:1 (v
ol,: vol,) 'fU together. This mixture is 0
0 minutes.

0℃で保った後、1dのLBG培地(1%トリプトン、
0.5%酵母エキス、1%NaC1,0,08%グルコ
ース、  IIH7,2)を添加し、37℃で1時間振
どう培養する。培養液を、選択培地[アンピシリン(シ
グマ) 30μg/dを含むし培地プレート]に100
t、t(1/プレートの割合で接種する。プレートを3
7℃で1晩培養して、形質転換株を生育させる。得られ
たアンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用い
てDNAを調製し、アガロースゲル電気泳動により、目
的のプラスミドI)TNF18R(約4.OK bp>
の取得を確認した。第3図に、プラスミドpTNF1B
Hの作成方法を示す。
After keeping at 0°C, 1 d of LBG medium (1% tryptone,
Add 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 0.08% glucose, IIH7,2), and culture with shaking at 37°C for 1 hour. Transfer the culture solution to a selective medium [medium plate containing 30 μg/d of ampicillin (Sigma)] at 100%
Inoculate at a ratio of t, t (1/plate.
The transformed strain is grown by culturing at 7°C overnight. From the obtained ampicillin-resistant colonies, DNA was prepared using a known method, and by agarose gel electrophoresis, the target plasmid I) TNF18R (approximately 4.OK bp>
confirmed the acquisition. In Figure 3, plasmid pTNF1B
We will show how to create H.

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドT 
N F −8〜TNF−13を用いてプラスミドpTN
F2N(約3.IKbll)を、合成オリゴヌクレオチ
ドTNF−14〜TNF−17を用いてプラスミドpT
NF3(約2.4K bp)を、それぞれ作成した。第
4図及び第5図に、プラスミドpTNF2N及びpTN
F3の作成方法を、それぞれ示す。
By the same method as above, synthetic oligonucleotide T
Plasmid pTN using NF-8 to TNF-13
F2N (approximately 3.IKbll) was transformed into plasmid pT using synthetic oligonucleotides TNF-14 to TNF-17.
NF3 (approximately 2.4K bp) was created. Figures 4 and 5 show plasmids pTNF2N and pTN.
The methods for creating F3 are shown below.

こうして得られたヒトTNF遺伝子の一部を含むプラス
ミドDTNFIBR,11RNF2N及びpTNF3の
、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通
りであることは、マキサム・ギルバート法[A、M、M
axamら、 MethodsEnzymol、、65
. 499(1980) ]によって確認した。
It was confirmed that the base sequences of the parts using synthetic oligonucleotides of the thus obtained plasmids DTNFIBR, 11RNF2N and pTNF3 containing a part of the human TNF gene were as designed using the Maxam-Gilbert method [A, M, M
axam et al., MethodsEnzymol, 65
.. 499 (1980)].

実施例4(ヒトTNFm伝子発現型プラスミドの作成) 実施例3で得られたプラスミドpTNF1BR10μ9
を、実施例3と同様にして制限酵素CfaI及び5al
Iで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ゲル温
度5%)の後、実施例2の方法に準じて、ヒトTNF遺
伝子の一部を含む約220bpのDNA断片<C1a 
l−8alI)をポリアクリルアミドゲルより回収した
Example 4 (Creation of human TNFm gene expression plasmid) Plasmid pTNF1BR10μ9 obtained in Example 3
was added to the restriction enzymes CfaI and 5al in the same manner as in Example 3.
After cutting with I and polyacrylamide gel electrophoresis (gel temperature 5%), an approximately 220 bp DNA fragment containing part of the human TNF gene <C1a was obtained according to the method of Example 2.
l-8alI) was recovered from polyacrylamide gel.

次に、実施例3で得られたプラスミドpTNF2 10
μyを100μuの10 mM  T ris−1−1
(J(pH7,5)  、  60m  M   Na
  Cオ、  7  mMM(1(J2水溶液に溶解さ
せ、40ユニツトの制限酵素PVLIII(宝酒造)を
添加し、37℃で1時間切断反応を行なった。そして、
実施例3の方法に準じて制限酵素5alIによる切断、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度5%)の模
、実施例2の方法に準じて、ヒトTNF遺伝子の一部を
含む約170bl)のDNA断片(SalI+PvuI
I)をポリアクリルアミドゲルより回収した。
Next, 10 plasmids pTNF2 obtained in Example 3
μy of 100 μu of 10 mM Tris-1-1
(J (pH 7,5), 60mM Na
CO, 7 mM (1 (J2) was dissolved in aqueous solution, 40 units of restriction enzyme PVLIII (Takara Shuzo) was added, and the cleavage reaction was carried out at 37°C for 1 hour.
Cleavage with restriction enzyme 5alI according to the method of Example 3,
A model of polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 5%), according to the method of Example 2, a DNA fragment (SalI + Pvul
I) was recovered from polyacrylamide gel.

また、実施例3で得られたプラスミドI)TNF3 1
0μpも100μUの10 mM  Tris−トIC
j(1it−17,5)   、   60  mM 
    Na  C1,71+MM(JC1z水溶液に
溶解させ、40ユニツトの制限酵素pvu■及び40ユ
ニツトの制限酵素Hindl[[(宝酒造)を添加し、
37℃で1時間切断反応を行なった。そして、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度5%)の後、実施例
2の方法に準じて、ヒトTNF遺伝子の一部を含む約1
10bDのDNA断片(Pvull”l−1ind l
 )をポリアクリルアミドゲルより回収した。
In addition, plasmid I) TNF3 1 obtained in Example 3
0μp and 100μU of 10mM Tris-IC
j(1it-17,5), 60 mM
Na C1,71+MM (dissolved in JC1z aqueous solution, 40 units of restriction enzyme pvu■ and 40 units of restriction enzyme Hindl [[(Takara Shuzo) were added,
The cleavage reaction was carried out at 37°C for 1 hour. After polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 5%), approximately
10bD DNA fragment (Pbull”l-1indl
) was recovered from polyacrylamide gel.

一方、大IMtrpプロモーターを有するプラスミドp
Ys31N(約4.7Kbl)) 5μグを、上記と同
様に制限酵素C1aI及びHindnlで切断し、アガ
ロースゲル電気vX動くゲルm度0.8%)の後、実施
例3の方法に準じて、プラスミドpYs31NCD大部
分ヲ含ム約4.7Kbl)(7)DNAIFi片(Cオ
aI= I−1ind ■)をアガロースゲルより回収
した。
On the other hand, plasmid p with large IMtrp promoter
5 μg of Ys31N (approximately 4.7 Kbl) was digested with the restriction enzymes C1aI and Hindnl in the same manner as above, and after agarose gel electrophoresis (m 0.8%), according to the method of Example 3, (7) A DNA IFi piece (CaI=I-1ind) was recovered from the agarose gel.

こうして得られた、ヒトTNFl転子の一部を含む約2
20bp、約17Qbp及び約110bpの3つのDN
A断片とプラスミドI)YS31Nの大部分を含む約4
,7K bpのDNA断片とを混合し、エタノール沈澱
の後、実施例3の方法に準じて、T4−DNAリガーゼ
による連結反応を行なった。反応終了後、実施例3の方
法に準じてエシェリヒア・コリCGOOr−a+−株に
導入し、形質転換株の中より目的のヒトTNF遺伝子発
現型プラスミドpTNF401NN(約5.2K bp
)を有するりO−ンを選択した。第6図に、そのプラス
ミドpTNF 401NNの作成方法を示した。
The thus obtained approximately 2
Three DNs of 20bp, about 17Qbp and about 110bp
A fragment and plasmid I) Approx. 4 containing most of YS31N
, 7K bp DNA fragments, and after ethanol precipitation, a ligation reaction using T4-DNA ligase was performed according to the method of Example 3. After the reaction was completed, it was introduced into Escherichia coli CGOOr-a+- strain according to the method of Example 3, and the desired human TNF gene expression plasmid pTNF401NN (approximately 5.2K bp) was selected from among the transformed strains.
) was selected. FIG. 6 shows the method for constructing the plasmid pTNF401NN.

また、上記プラスミドI)YS31N5μりな、上記の
方法に準じて制限酵素pvu[で部分分解した後、さら
に制限酵素Hindu[で切断し、アガロースゲル電気
泳動くゲル濃度0.8%)の後、実施例3の方法に準じ
て、trpプロモーターを含む約2.7K bpのDN
A断片[Pvuff(2)←→ト1 ind l[[]
をアガロースゲルより回収した。
In addition, the above plasmid I) YS31N5μ Rina was partially digested with the restriction enzyme pvu according to the above method, further digested with the restriction enzyme Hindu, and subjected to agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%). According to the method of Example 3, approximately 2.7K bp of DNA containing the trp promoter was prepared.
A fragment [Pvuff(2) ← → t1 ind l[[]
was recovered from the agarose gel.

次に第7図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例2の方法に準じて、合成・精製した。1qら
れた2木の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ0.5μび
について、実施例3の方法に準じて、末端のリン酸化を
行ない、アニーリングの後、先に得られた約2.7Kb
pのDNA断片[pvuII f2)=11−1 in
d m ]と混合し、工’) / −/L/ 沈12 
(7)1m、実施例3の方法に準じて、T4−DNAリ
ガーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例
3の方法に準じてエシェリヒア・コリC6C600r−
株に導入し、形質転換株の中より目的のプラスミドrl
AA41(約2.7K bp)を有するクローンを選択
した。このようなプラスミドは、プラスミドpY S 
3INからコピー数制御領域除去し、trpプロモータ
ー下流に存在するクローニング・サイトの下流に大腸菌
tri) Aクーミネーターを付与した形の、多コピー
・高効率発現ベクターであり、第7図にその作成方法を
示した。
Next, an oligonucleotide having the base sequence shown in FIG. 7 was synthesized and purified according to the method of Example 2. The terminals of each of the two synthetic oligonucleotides of 0.5μ length obtained with 1q were phosphorylated according to the method of Example 3, and after annealing, the previously obtained approximately 2.7Kb
DNA fragment of p [pvuII f2) = 11-1 in
d m ], mixed with d m ) / -/L/ 12
(7) 1m, according to the method of Example 3, a ligation reaction using T4-DNA ligase was performed. After the reaction, Escherichia coli C6C600r-
Introduce the desired plasmid rl into the transformed strain.
A clone with AA41 (approximately 2.7K bp) was selected. Such a plasmid is called plasmid pYS
It is a multi-copy, high-efficiency expression vector in which the copy number control region has been removed from 3IN and an E. coli (tri) A couminator has been added downstream of the cloning site that exists downstream of the trp promoter. Figure 7 shows how to create it. showed that.

このプラスミドpAA41 2μグを、上記と同様に制
限酵素(JaI及びl−1indI[Iで切断し、アガ
ロースゲル電気泳動(ゲル濃度0.8%)の侵、実施例
3の方法に準じて、プラスミドpA A 41の大部分
を含む約2.7KbpのDNA断片(CfaI。
2 μg of this plasmid pAA41 was cut with restriction enzymes (JaI and l-1indI [I) in the same manner as above, and subjected to agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%). An approximately 2.7 Kbp DNA fragment containing most of pA A41 (CfaI).

1−1indll)をアガロースゲルより回収した。1-1indll) was recovered from the agarose gel.

また、先に得られたヒトT N F ’sM f云了光
現型プラスミドI)TNF 401NN5μりを、」1
記と同様に制限酵素CfaI及びl−1indllで切
断し、ポリアクリルアミドゲル電気法8(ゲル、11度
5%)の後、実施例2の方法に準じて、ヒトT N F
 )”ii伝吊子全域含む約490bpのDNA断片(
CFa T−”Hind I[[)をポリアクリルアミ
ドゲルより回収した。
In addition, 5 μl of the previously obtained human TNF'sM fyunryophotogenic plasmid I) TNF 401NN was added to ``1''.
Human TNF
)”ii DNA fragment of approximately 490 bp that includes the entire length of the chain (
CFa T-''Hind I [[) was recovered from the polyacrylamide gel.

こうして得られた、プラスミドpΔA41の大部分を含
む約2.7K bpのDNA断片とヒトTNF遺伝子全
域を含む約4QObpのDNAtfi片とを混合し、エ
タノール沈澱の後、実施例3の方法に準じて、T4−D
NAリガーゼによる連結反応を行なった。
The approximately 2.7K bp DNA fragment containing most of the plasmid pΔA41 obtained in this way and the approximately 4QObp DNAtfi fragment containing the entire human TNF gene were mixed, and after ethanol precipitation, the mixture was prepared according to the method of Example 3. , T4-D
A ligation reaction using NA ligase was performed.

反応終了後、実施例3の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ600r−m−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドpTN F 401A (約3.2Kb
p)を有するクローンを選択した。このプラスミドは、
ヒトTN F3il伝子をより効率良く発現させる能力
を有しており、第8図にイの作成方法を示した。
After completion of the reaction, according to the method of Example 3, Escherichia
The target plasmid pTN F 401A (approximately 3.2 Kb
Clones with p) were selected. This plasmid is
It has the ability to express the human TNF3il gene more efficiently, and the method for producing it is shown in Figure 8.

実施例5(Ii規規程腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現
型プラスミド作成) 実I′iI例4で得られたヒトTNF遺伝子発現型プラ
スミドpT N F 401A 20μ9を、実施例4
の方法に準じて制限酵素CfaI及びl−1indll
で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気ン永動(ゲルQ
度5%)及びアガロースゲル電気泳動くゲル濃度0.8
%)の後、それぞれ実施例2及び3の方法に準じて、生
成する2つのDNA断片(約490bp及び約2.7K
bp、両方共(Ja I HI−1ind m >をゲ
ルより回収した。
Example 5 (Creation of a plasmid expressing the tumor active polypeptide gene according to the Ii regulations) The human TNF gene expression plasmid pT NF 401A 20μ9 obtained in Example 4 of Example 4 was used in Example 4.
restriction enzymes CfaI and l-1indll according to the method of
Cut with polyacrylamide gel electrolyte (Gel Q
5%) and agarose gel electrophoresis running gel concentration 0.8
%), two DNA fragments (approximately 490 bp and approximately 2.7K
bp, both (JaIHI-1indm>) were recovered from the gel.

ここで得られたヒトTNF遺伝子全域を含む約490b
pのDNA断片を50μQのto mM  Tris−
l−]Cf (1)l−17,4) 、 10mM  
M(] SO+ 、 1 1Mジチオスレイトール水溶
液に溶解させ、10ユニツ1−の制限酵素HapII(
宝酒造)を添加して、37℃で1時間切断反応を行なっ
た。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ゲ
ル濃度5%)を行ない、実施例2の方法に準じて、ヒト
TNF遺伝子U)大R’5分ヲ含ムF) 390bpの
DNAFJi片(l−1ap■−ト1indI[)をポ
リアクリルアミドゲルより回収した。
Approximately 490b including the entire human TNF gene obtained here
The DNA fragment of
l-]Cf (1)l-17,4), 10mM
M(]SO+, 1 Dissolved in 1M dithiothreitol aqueous solution, 10 units 1- restriction enzyme HapII (
Takara Shuzo) was added thereto, and the cleavage reaction was carried out at 37°C for 1 hour. After completion of the reaction, polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 5%) was performed according to the method of Example 2, and a 390 bp DNAFJi fragment (L-1ap) containing human TNF gene U) large R' 5 min. (1) IndI [) was recovered from the polyacrylamide gel.

また、第9図記載の塩基配列をイIするオリゴヌクレオ
チドを、実施例2の方法に準じて、合成。
Furthermore, an oligonucleotide having the base sequence shown in FIG. 9 was synthesized according to the method of Example 2.

精製した。得られた4本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ0.5μ3について、実施例3の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、T4−DN
Aリガーゼによる連結反応を行なった。
Purified. The terminals of 0.5μ3 of each of the four synthetic oligonucleotides obtained were phosphorylated according to the method of Example 3, and after annealing, T4-DN
A ligation reaction using A ligase was performed.

反応終了後、得られた2本鎖詞すゴヌクレオチドを、先
に得られた約2.7KbpのDNA断片(Cfa I 
+I−1ind m )及びヒトT N F 遺伝子の
大部分を含む約390bpのDNA断片(ト1al)I
IH)−1ind I[I )と混合し、エタノール沈
澱の後、実施例3の方法に準じて、T4−DNAリガー
ゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例3の
方法に準じてエシェリヒア・コリC600r−m−株に
導入し、形質転換株の中より゛目的のプラスミド1)T
NF4f33(約3.2K bp)を有するクローンを
選択した。このプラスミドは、次のアミノ酸配列(H2
N)−Thr−prO−8er−ASI)   Lys
−P  ro −V  al  −A  la−ト1 
 is −V  al  −V  al−A  la 
−△5n−1−1is−Gln−Ala−Qln−Gl
y−Qln−1cu−Qln−工rp−L eu−A 
sn−Arg −A、 rg −Ala−△Sn−A 
la−L eu−L eu−A la−A 5n−Gl
y−Val−Qlu−Lell−Ar(]−]Asp−
Asn−GIn−1eu−Vat−Vat−pro−5
ar−Q lu −Gly−Lcu−Tyr−Leu−
11e−Tyr−8er−Qln−Val −L eu
−P he −L ys −G Iy −Q In−G
 ly−CVs−P ro −S er −T hr−
His −V at −L eu −L eu−Thr
−1−1is−Thr −11e −Ser −A r
g−1le−A la−Val−5er−Tyr−G 
In−Thr−Lys−Val−Asn−L eu−L
 cu−5er−A la−11e−Lys−5er−
Pro−Cys−G In−Arg−Glu−−11+
r−Pro−Glu−Gly −Aha −Glu−A
la −Lys−Pro−Trp−’TVr−Glu 
−P ro−1le−Tyr−Leu−G ly−G 
ly−Val−P he−G ln−L eu−G l
u−L VS−G ly−A Sl)−Arg−1−e
t+−8er−Ala−Glu−T Ie−Asn−A
 ro −P ro −A SD −T Vr −L 
elf −A Sp −P he −A Ia−G l
u−S er−G Iy−G In−V al−T y
r−Phe−G IV−11e−I  Ie−△1a−
Lcu−(CO○ ト1 ) で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ン末端にMetが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗!!!1瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラ
スミドであり、第9図にその作成方法を示した。
After the reaction, the obtained double-stranded oligonucleotide was combined with the previously obtained approximately 2.7 Kbp DNA fragment (Cfa I
+I-1indm) and a DNA fragment of about 390 bp containing most of the human TNF gene (T1al)I
After mixing with IH)-1ind I[I] and ethanol precipitation, a ligation reaction using T4-DNA ligase was performed according to the method of Example 3. After the reaction was completed, it was introduced into Escherichia coli C600r-m- strain according to the method of Example 3, and the desired plasmid 1)T was selected from among the transformed strains.
A clone with NF4f33 (approximately 3.2K bp) was selected. This plasmid has the following amino acid sequence (H2
N)-Thr-prO-8er-ASI) Lys
-Pro -V al -A la-to1
is -V al -V al-A la
-△5n-1-1is-Gln-Ala-Qln-Gl
y-Qln-1cu-Qln-engrp-L eu-A
sn-Arg-A, rg-Ala-△Sn-A
la-L eu-L eu-A la-A 5n-Gl
y-Val-Qlu-Lell-Ar(]-]Asp-
Asn-GIn-1eu-Vat-Vat-pro-5
ar-Q lu -Gly-Lcu-Tyr-Leu-
11e-Tyr-8er-Qln-Val-L eu
-P he -L ys -G Iy -Q In-G
ly-CVs-Pro-Ser-Thr-
His −V at −L eu −L eu−Thr
-1-1is-Thr -11e -Ser -A r
g-1le-A la-Val-5er-Tyr-G
In-Thr-Lys-Val-Asn-L eu-L
cu-5er-A la-11e-Lys-5er-
Pro-Cys-G In-Arg-Glu--11+
r-Pro-Glu-Gly-Aha-Glu-A
la -Lys-Pro-Trp-'TVr-Glu
-Pro-1le-Tyr-Leu-G ly-G
ly-Val-P he-G ln-L eu-G l
u-L VS-G ly-A Sl)-Arg-1-e
t+-8er-Ala-Glu-T Ie-Asn-A
ro -P ro -A SD -T Vr -L
elf -A Sp -P he -A Ia-G l
u-S er-G Iy-G In-V al-T y
r-Phe-G IV-11e-I Ie-△1a-
A novel anti-! ! ! This is a plasmid expressing the tumor active polypeptide gene, and the method for its construction is shown in FIG.

実施例6く発現の確認) 前記実施例4で得られた発現ベクター1)A A 4L
ヒトTNF遺伝子発現型プラスミドI)TNF401N
N又はpTNF 401A、又は実施例5で11tられ
た、新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミ
ド1)TNF4f33を有するエシェリヒア・コリC6
00r−m−株を、30〜50μg/Idのアンピシリ
ン、0.2%のグルコース及び4η/dのカザミノ酸を
含むM9培地[0,6%Na2トlPO4−0,3%に
2 HPOJ −0,05%Na(J−0,1%NH4
Cl水溶液(+)H7,4)をオートクレーブ滅菌した
後に、別途にオートクレーブ滅菌したMgSO4水溶液
及びCaCj2水溶液をそれぞれRn濃度2mM及び0
.1 mMになるように加える。]  250In1に
接種し、001.、tfi 0.7に達するまで、37
℃で振どう18養を行なった。次いで、最終a度50μ
!?/meの3−β−インドールアクリル酸を培養液中
に添加し、さらに37℃で12時間撮とう培養を続けた
Example 6 Confirmation of expression) Expression vector obtained in Example 4 1) A A 4L
Human TNF gene expression plasmid I) TNF401N
1) Escherichia coli C6 carrying TNF4f33
The 00r-m- strain was grown in M9 medium [0,6% Na2PO4-0,3% HPOJ-0 containing 30-50 μg/Id ampicillin, 0.2% glucose and 4η/d casamino acids. ,05%Na(J-0,1%NH4
After sterilizing the Cl aqueous solution (+)H7,4) in an autoclave, separately sterilized an MgSO4 aqueous solution and a CaCj2 aqueous solution at Rn concentrations of 2mM and 0.
.. Add to 1 mM. ] 250In1, 001. , 37 until reaching tfi 0.7
Shaking was carried out at 18°C. Then, final a degree 50μ
! ? /me of 3-β-indoleacrylic acid was added to the culture solution, and the culture was further continued at 37° C. for 12 hours.

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、PBSバッファ
 −(150mM  Na ciを含む201IIMリ
ン酸バッファー、  pH7,4)を用いて菌体の洗浄
を行なった。洗浄後の菌体を10dのPBSバッファー
に懸濁さけ、超音波発生装置(久保田、  200M型
)を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残漬
の除去を行なった。
After collecting E. coli cells by centrifugation, the cells were washed using PBS buffer (201IIM phosphate buffer containing 150 mM NaCl, pH 7.4). The washed cells were suspended in 10 d of PBS buffer, the cells were destroyed using an ultrasonic generator (Kubota, Model 200M), and the remaining cells were removed by centrifugation.

IJられた大腸菌ライゼートの一部に対して、Tris
−l−l Cjバッファー (pH6,8> 、 SD
S、 2−メルカブトエクノール、グリセ0−Jしを、
それぞれ最終温度60mM、2%、4%、10%になる
ように加え、5O8−ポリアクリルアミドゲル電気法#
J[銘木、遺伝、旦、 43(1977) ]を行なっ
た。
A portion of the IJ-treated E. coli lysate was
-l-l Cj buffer (pH 6,8>, SD
S, 2-mercabutoecnol, glycerol 0-J,
5O8-polyacrylamide gel electromethod #
J [Precious Wood, Genetics, Dan, 43 (1977)].

分離用ゲルは12.5%とし、泳動バッファーはSD3
、Tris−グリシン系[jl、 K、l−aemml
i。
The separation gel was 12.5%, and the running buffer was SD3.
, Tris-glycine system [jl, K, l-aemml
i.

Nature 、  227. 680(1970) 
]を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマ
シープルーR−250(バイオ・ラッド)で染色し、ヒ
トTNFm信子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
の発現の確認を行なった。
Nature, 227. 680 (1970)
] was used. After the electrophoresis was completed, the proteins in the gel were stained with Coomassie Blue R-250 (Bio-Rad) to confirm the expression of human TNFm and novel antitumor active polypeptide genes.

実施例7(活性の評価) 新規抗腫瘍性ポリペプチドの活性測定は、前記Rurf
の方法に準じて行なった。すなわち、実施例6で得られ
た新規抗1IVt、活性ポリペブヂドを含む大腸菌ライ
ゼートを順次培地で希釈した試料100μ文と、4 X
 105周/dの濃度のマウスL−9291411ft
芽細胞(ATCCCCL−929)懸濁液100μρを
、96穴の組織培養用マイクロプレート(コースタ−)
内で混合した。なおこの際に、最終温度1μg/iのア
クチノマイシンD(コスメゲン、m有製薬)を添加して
おく。培地どしては、5%(vol /vol )の1
クシ胎児血清を含むイ−グルのミニマム・エツセンシャ
ル培地(日本製薬)を用いた。上記マイクロプレートを
、5%炭酸ガスを含む空気中、37℃で18〜20時間
培養した後、クリスタル・バイオレット溶液[5%(v
01/vol )メタノール水溶液に、0.5%(wt
/vol )のクリスタル・バイオレットを溶解させた
ちの]を用いて生細胞を染色した。余分なりリスタル・
バイオレットを洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル
・バイオレットを100μ文の0.5%SO8水溶液で
抽出し、その595μm 1.:おける吸光度をE11
sAアナライザー(東洋測置、ETY−96型)で測定
する。この吸光度は、生き残った細胞数に比例する。そ
こで、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼ
ートの希釈溶液を加えない対照の吸光度の50%の値に
相当する大腸菌ライゼートの希釈倍率をグラフ(たとえ
ば第10図)によって求め、その希釈倍率をユニットと
定義する。第10図より、発現型プラスミド1)TNF
463にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含
む大腸菌ライゼート 100μ文は6.Ox 10’ユ
ニット程度の活性を、それぞれ有していることが明らか
になった。
Example 7 (Evaluation of activity) The activity of the novel antitumor polypeptide was measured using the Rurf
It was carried out according to the method of That is, 100 μl of the E. coli lysate containing the novel anti-1IVt and active polypeptide obtained in Example 6 was diluted in a medium, and 4×
Mouse L-9291411ft with a concentration of 105 laps/d
Transfer 100μρ of blast cell (ATCCCCCL-929) suspension to a 96-well tissue culture microplate (Coaster).
mixed inside. At this time, actinomycin D (Cosmegen, M Yu Pharmaceutical Co., Ltd.) at a final temperature of 1 μg/i is added. For the medium, 5% (vol/vol) 1
Eagle's Minimum Essential Medium (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) containing fetal comb serum was used. After culturing the above microplate at 37°C for 18 to 20 hours in air containing 5% carbon dioxide, a crystal violet solution [5% (v
01/vol) 0.5% (wt
/vol) of crystal violet] was used to stain living cells. Excess Listal・
After rinsing and drying the violet, the remaining crystal violet was extracted with 100 μm of 0.5% SO8 aqueous solution, and the 595 μm of crystal violet was extracted with 100 μm of 0.5% SO8 aqueous solution. : Absorbance at E11
Measurement is performed using an sA analyzer (Toyo Station, Model ETY-96). This absorbance is proportional to the number of surviving cells. Therefore, the dilution factor of E. coli lysate that corresponds to 50% of the absorbance of the control to which no diluted solution of E. coli lysate containing the novel antitumor active polypeptide is added is determined using a graph (for example, Fig. 10), and the dilution factor is determined by the unit. It is defined as From Figure 10, expression plasmid 1) TNF
E. coli lysate containing the novel anti-tumor active polypeptide encoded by 463. It was revealed that each of them had an activity of about 10' units of Ox.

実施例6で19られた発現型プラスミドpTNF401
△にコードされるヒトTNF蛋白質又は発現型プラスミ
ドρTNF463にコードされる1iノ児抗腫瘍活性ポ
リペプチドを含む大腸菌ライゼート中に含まれ総蛋白質
量は、プロティン・アラレイ・キット(バイオ・ラッド
)を用いて定?し、ウシ血清アルブミンを用いた検凶線
より計口した。上記で得られた活性の値及び蛋白質定Φ
結果よりヒトTN Fillli白質及び新規抗腫瘍活
性ポリペプチドの比活性を計算したところ、新規抗腫瘍
性ポリペプチドはヒトTNF蛋白質とほぼ同様の比活性
を有していることがわかる。
Expression type plasmid pTNF401 obtained in Example 6
The total amount of protein contained in the E. coli lysate containing the human TNF protein encoded by △ or the 1st child antitumor active polypeptide encoded by the expression plasmid ρTNF463 was determined using the Protein Array Kit (Bio-Rad). Is it fixed? The sample was then counted from the autopsy line using bovine serum albumin. Activity value and protein constant Φ obtained above
When the specific activities of the human TN Filli white matter and the novel anti-tumor active polypeptide were calculated from the results, it was found that the new anti-tumor polypeptide has almost the same specific activity as the human TNF protein.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

第1図は設計したヒトTNFl伝子の塩基配列を、第2
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第3図、第4図及び第5
図は、ヒトTNFm伝子の一部を有するプラスミドpT
NF1BR,IITNF2N及びpTNF3の作成方法
を、それぞれ示したものである。第6図はヒトTNFm
伝子発現型プラスミドpTNF 401NNの作成方法
を、第7図は発現ベクター1)A A 41の作成方法
を、そして第8図はヒトTNF遺伝子発現型プラスミド
1)TNF401Aの作成方法を、それぞれ示したもの
である。第9図は各種新規抗腫瘍活性エリペブヂド遺伝
子発現型プラスミドの作成方法を示したものである。第
10図は新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定結果を
示したものである。 特許出願人  帝  人  株  式  会  社11
+2!! m 拓 4関 vuIL 括ジ■ 第9因のB F’vμI(1) 括 8 匹 )(ihcJ TL 乳q凱の8 集to聰 4駅倍阜
Figure 1 shows the designed base sequence of human TNFl gene, and
The figures show the base sequences of chemically synthesized synthetic oligonucleotides. Figures 3, 4 and 5
The figure shows plasmid pT containing part of the human TNFm gene.
The methods for producing NF1BR, IITNF2N, and pTNF3 are shown. Figure 6 shows human TNFm
Figure 7 shows the method for constructing the gene expression type plasmid pTNF401NN, Figure 7 shows the method for constructing the expression vector 1)A A41, and Figure 8 shows the method for constructing the human TNF gene expression type plasmid 1) TNF401A. It is something. FIG. 9 shows a method for constructing various novel antitumor active elipebudide gene expression plasmids. FIG. 10 shows the results of measuring the activity of the novel antitumor active polypeptide. Patent applicant Teijin Ltd. Company 11
+2! ! M Taku 4 Seki vuIL Kutsuji ■ The 9th cause B F'vμI (1) Kutsu 8 animals) (ihcJ TL Milk Gai's 8 collection to 聰4 station double)

Claims (10)

【特許請求の範囲】[Claims] (1)次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 (COOH)で表わされる、新規生理活性ポリペプチド
(1) A novel physiologically active polypeptide represented by the following amino acid sequence [amino acid sequence available] (COOH).
(2)アミノ末端にMetが結合していることを特徴と
する第1項記載のポリペプチド。
(2) The polypeptide according to item 1, characterized in that Met is bound to the amino terminus.
(3)次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 (COOH) で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にMetが結合しているポリペプチドをコードす
るDNA領域を含む組換えプラスミド。
(3) A recombinant plasmid containing a DNA region encoding a novel physiologically active polypeptide represented by the following amino acid sequence [amino acid sequence available] (COOH) or a polypeptide having Met bound to its amino terminus.
(4)該DNA領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖DNAとそれに相補的な一本鎖DN
Aとから成る二本鎖DNAを含むことを特徴とする第3
項記載のプラスミド。
(4) Single-stranded DNA whose DNA region is represented by the following base sequence [there is a gene sequence] and its complementary single-stranded DNA
A third characterized in that it contains a double-stranded DNA consisting of A.
Plasmids described in section.
(5)該DNA領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖DNAとそれに相補的な一本鎖DN
Aとから成る二本鎖DNAを含むことを特徴とする第3
項記載のプラスミド。
(5) Single-stranded DNA whose DNA region is represented by the following base sequence [there is a gene sequence] and its complementary single-stranded DNA
A third characterized in that it contains a double-stranded DNA consisting of A.
Plasmids described in section.
(6)該プラスミドがプラスミドpTNF463である
第3項記載のプラスミド。
(6) The plasmid according to item 3, wherein the plasmid is plasmid pTNF463.
(7)次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 (COOH) で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にMetが結合しているポリペプチドをコードす
るDNA領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた組換え微生物細胞。
(7) Transformation with a recombinant plasmid containing a DNA region encoding a novel physiologically active polypeptide represented by the following amino acid sequence (COOH) or a polypeptide with Met attached to its amino terminus. recombinant microbial cells.
(8)該微生物細胞がエシェリヒア・コリ (Escherichia coli)であることを特
徴とする第7項記載微生物細胞。
(8) The microbial cell according to item 7, wherein the microbial cell is Escherichia coli.
(9)次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 (COOH) で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にMetが結合しているポリペプトチドをコード
するDNA領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
(9) Transformed with a recombinant plasmid containing a DNA region encoding a novel physiologically active polypeptide represented by the following amino acid sequence [amino acid sequence is available] (COOH) or a polypeptide with Met attached to its amino terminus. Production of a novel bioactive polypeptide, which comprises culturing recombinant microbial cells, producing and accumulating a novel bioactive polypeptide in the culture, and isolating the novel bioactive polypeptide from the resulting culture. Method.
(10)抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【アミノ
酸配列があります】 (COOH) で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にMetが結合しているポリペプチドを含有する
医薬組成物。
(10) A pharmaceutical composition containing an antitumor-effective amount of a novel physiologically active polypeptide represented by the following amino acid sequence (COOH) or a polypeptide having Met bound to its amino terminus. .
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