JPS62503146A - 動物細胞培養 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 動物細胞培養 発明の分野 本発明は動物細胞培養に関し特にポリペプチドおよびタンパク質産住物を産生ず るための動物細胞の培養方法に関する。 発明の背景 近年有用な産生物を提供するために動物細胞の培養にかなりの関心が持たれかつ 、この関心は増大しつ＼ある・この関心は、最近の分子生物学の発展により、遺 伝学的に修飾した動物細胞を調製しこの細胞を培養して所望のポリペプチドやタ ンパク質産生物を産生ずることが可能となったことにより一層高まっている。Ｋ ｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ　（Ｎａｔｕｒｅ第２５６巻、４９５〜５９ ７頁）の業績に本とず〈細胞融合技術は雑種細胞系すなわちハイブリドーマの調 製を可能とし、こｆ′Ｌはモノクローナル抗体を産生ずるために培養することが できる。また異種構造の遺伝子で形質転換した細胞系を提供するために組替えＤ ＮＡ技術が動物細胞に適用され、これを培養して対応する遺伝子産物を産生ずる ことができる。多くの場合、組替え産生物の産生のために、特に産生物が充分な 活性を発揮するために、グリコシレージョンおよび他の転写後の修飾を必要とす る場合には、微生物宿主細胞たとえば細菌や酵母よりも動物宿主細胞の方が望ま しいことが判った。 動物宿主細胞はこのような産生物が産生される自然の細胞環境に近い環境を提供 するのである。 所望の産生物の工業的生産に動物細胞培養を適用するには、産生物を充分な量で かつ商業的に生残れるコストで産生ずる培養方法を開発することが必要である。 しかしたいていの工業的な培養方法は微生物培養の発酵にもとずくものであって 、動物細胞の培養において収率に影響する要因については比較的に知られていな い。たとえば抗生物質等の二次代謝物の微生物パッチ培養において、二次代謝産 物の生産に必須であることが判っている栄養物を培地に添加することが知られて いるＣ公開国際特許出１１ｋＷ　０８４１００７７７　Ｕｎｉｓｅａｒｃｈ）。 しかし明らかに二次代謝産物の長期率における改善には限界があったウモノクロ ーナル抗体を産生ずるため、ダルベツコ修正イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　）（ＤＭＢＭ）中でハ イブリドーマ細胞が培養された（　ａａｃｋｓ　＆　Ｌｅｎｎｏｘ、Ｖｏｘ　Ｓ ａｎｇ、　４０−９９−１０４　（１９８１年））。 より最近では哺乳類由来のタンパク質または抗体の産生を促進する方法が記載さ れており（ＧＢ　２１５３８３０Ａ−Ｄａｍｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　）　％この 方法は約３４０　ｍｉ　１１　ｉｏａｍｏｌｅｓ以上の浸透度を有する高張培地 の中で細胞を培養する工程を含む。特にＧＢ　２１５３８３０Ａは、カプセル化 したハイツリドーマ細胞の培地および過剰アミノ酸の添加は培地を高張にする旨 記載している。しかしわれわれの動物細胞培養、特にハイブリドーマ細胞培養の 研究は、浸透度以外の要因が培養された動物細胞から産生じたタンパク質のレベ ルを決定する上で重要であることを示している。 われわれはダルベツコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含み子ウシ血清（Ｆｅ２ ）を補足した培地の中でのハイツリドーマ細胞の単純ノ々ツチ培養における細胞 増殖および抗体産生の動力学を研究した。指数増殖期の後、細胞数密度的２　Ｘ 　１０’細胞数、／−でＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ中のグルタミンが欠乏し、細胞増殖が止 まり、培養中の生存細胞数は急速に減少し、抗体の合成は終了する。 生存細胞の減少は培地中の必須栄養物の欠除、特にグルタミンの欠除によるもの と思われた。グルタミンは培地中で不安定であり、その劣化産生物中のあるもの は細胞毒性を有する（特にアンモニアおよびピロリドンカルぎン酸）ことが知ら れている。そこでわれわれは、培養の後期指数期中および、その後でグルタミン を添加した単純な形の栄養物添加（ｆｅｄ　）パッチ培養を検査した。 後期指数期において培養に加えられた一発（ｏｎｅ　５ｈｏｔ　）のグルタミン 添加は最大細胞数密度には実質的には影響を及ぼさなかつ次が、培養はより長時 間生存しその結果合計抗体力価は増大した。 投与によって添加することについて研究した。４０時間にわたるグルタミンの反 復投与（その前の一発添加と同一の全体添加濃度までの）は、−発添加を受け次 培養と比べて細胞または抗体の収率になんら改善をもたらさなかった。 これらの結果は予想外のものであった。培地から消尽されてはい穴が、グルタミ ンは最大細胞数密度を制限する唯一の要因ではないように思われる。なぜならば 、グルタミンの培養への添加は最大生存細胞数密度の増加につながら々いからで ある。むしろ、グルタミンの添加は培養の生存期間を延長しその結果全体の抗体 収率を若干増加させるように思われる。 われわれはさらに動物細胞培養からのタンパク質産生レベルに影響を及ぼす要因 を研究した。われわれは、予想外のことであったが、グルタミンその他の栄養物 を与えると、特に低い率で長期間にわたり与えた場合、培養ハイブリドーマ細胞 系の抗体産生に有意の増加をもたらし、これは特にパッチ培養の減衰期において 着るしいことを発見した。ｉ友われわれは、形質転換しｆｃｉｐ物細胞の培養か らの異種構造遺伝子産生物の産生について同様の結果を発見したう 発明の要約 よって、本発明は、培養中培地を−または複数のエネルギー源および−または複 数のアミノ酸の組合せ供給（ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｆｅｅｄ　）により補充し、か つ細胞の産生物を提供するために培養を減衰期中まで継続することを特徴工程を 含む動物細胞のバッチ培養方法を提供するものである。 本発明は動物細胞培養に対し、継続的に栄養物を供給すると、特に時間を延ばし て供給したとき、培養が減衰期中にまで継続し穴場合には収率は有意に増加する という前例のない発見から生まれｔものである。予想に反して、栄養物を継続し て供給すると最大生存細胞数密度は増加しないが、そのかわシに、栄養物を与え ない培養中で起ることが予想される減衰期の開始点を超えて培養の生存期間が延 長され、その結果産生物生産レベルが増加するように思わｎる。特に、わｎわｎ はエネルギー源とアミノ酸の組合せ供給は全体の収率を著るしく増大させること を発見した。驚くべきことに、このエネルギー源とアミノ酸の組合せ供給は最大 生存細胞数密度を増加させなかった。 この現象が起る理由は完全には理解できなり０培養の指数増殖期から減衰期への 変化を形成する細胞増殖の減衰についてＦｉ２つの説明が可能であるうその一つ はタンパク質合成には必要ではないが細胞増殖には必要とされる−または複数の 栄養物が欠乏し、細胞増殖が止まるという説であり、他の一つはラクテートま７ ’ＣＦｉアンモニア等−または複数の細胞毒性を有する代謝産物が培養中に蓄積 し、それ以上の細胞増殖を抑止するという説である。 こｎら２つの説明の中わｎわｔ′Ｌ、ハ後者を支持する。し九がって、公平に見 て、細胞増殖は、細胞毒性を有する代謝産物の蓄積によって抑止さｎ１本発明方 法におけるような継続供給は培養の生存性を延長させる結果全体の産生物収率を 増大させるものと考えら詐る。そして補充栄養物は減衰期中細胞増殖よシもむし ろ主としてタンパク質合成とエネルギー源に使わｎるものと考えられる。しかし 、上記はわれわｎが観測しｆｃ現象の可能な説明として述べたものであって、本 発明の範囲を限定するものではないことけ理解さ′ｎよう。 本発明の方法は、Ｎａｍａｌｖａ細胞およびＲｏｖｅｓメラノーマ細胞等所望の 産生物を構成的に産生する細胞を含む友とえは咄乳類細胞等一般の動物細胞の培 養に適用することができる。しかし本方法は遺伝学的に修飾さｎた細胞系の培養 に適用することが望ましい。したがって、細胞はトランスフェクトさ′ｎｆｃ動 物細胞すなわち異種構造遺伝子でトランスフェクトさｆ′Ｌｆｃ動物細胞であっ てもよいし、その場合核細胞は対応する異種構造遺伝子産生物を産生ずるために 培養することができる。このようなトランスフェクトさｎた動物細胞はトランス フェクトさａＸチャイニーズハムスター卵巣細胞系（ＣＨＯ）等０ト７ンスフエ クトさｎ、ｆｃｑ乳類宿主細胞を含むことができ、特に異種構造遺伝子でトラン スフェクトさｆＬ７ｔハイブリドーマおよびミエローマ細胞系を含むことができ る。特に本方法は、Ｂｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒウィルス（ＥＢＶ）形質転換抗体 産生細胞を含むモノクローナル抗体産生細胞系および特に細胞融合技術によって 調製さｎたハイブリドーマ細胞系の培養に適用することが望ましい。 本方法はパッチ培養が可能ないかなる細胞にも適用することができ、たとえば微 粒子担体培養等における足場依存性細胞およびカプセル入り細胞を含む。しかし 、こｎらの細胞は懸濁液中で培養されることが好ましい。 培養動物細胞によって産生しうるいかなる産生物も本発明の方法を使用して産生 ずることができる。このような産生物は典型的にはポリペプチドとタンパク質産 生物を含み、たとえばｈＧ）（等の底長ホルモン、インタフエロン等のリンフ才 力イン、ＩＬ２等のインタロイキン、組替え抗体分子およびそのフラグメント、 産業上かつ薬学的に有用なｔＰＡ等の＃素およびメタロプロティナーゼ組織阻害 剤（ＴＩＭＰ）等の＃素阻害物質を含む、特に好ましい産生物はモノクローナル 抗体である。 培地には前記組合せ供給を培養中適当な時にいつでも補充することができる。補 充供給は培養の指数増殖期の後で開始してもよいが、指数増殖期中特に指数増殖 期の後半中に開始することが好ましい。培養に対し前記供給を延長さｎた期間に わたって補充することが有利である。 補充供給は培養の指数増殖期中に完了してもよいが、定常期中まて継続すること が好ましく、培養の減衰期中まで継続してもよい。 本明細嘗の記載において「指数増殖期」という用語は最大生存細胞数密度に達す る点までの増殖期を意味する。 たとえば、ハイブリドーマ細胞の典型的な懸濁液培養において、補充供給は培養 開始稜２５時間ないし１５０時間後好ましくＦｉ４０時間ないし６０時間後、特 に約５０時間後に開始した。補充供給はたとえば細胞が生存細胞密度的Ｉ　Ｘ　 １０’　ａ胞数／′献に増殖し九時点で開始することができる。また補充供給は 培養中の生存細胞がピークに達した後少くとも５時間ないし２０時間、好ましく け１０時間ないし１５時間培養に与えられる。また補光供給は合計３０時間ない し１００時間、４つとも好ましくｔｉ４０時間ないし６０時間、特に約４０時間 にわたって与えらｎる。ハイブリドーマ細胞一般について、またトランスフェク トさｎたハイブリドーマ細胞およびミエローマ細胞について同様な補充供給法を 使用することができる。しかし、供給の時期と期間に問題の細胞の増殖特性を考 慮して変更することができる。 同様に、補充供給の構成要素は培養さ１しる特定の細胞にしたがって可変である 。シタがってエネルギー源としては、当該細胞に対して適当ないかなるエネルギ ー源をも含むことができるが、通ｔは少くとも−の炭水化物エネルギー源、たと えば糖質（ｓｕｇａｒ　）特にグルコースを含むっ他の適当な炭水化物エネルギ ー源はマルトース、ラクトースおよびスクロース等の二糖、ガラクトース、フル クトース等の単糖を含む。他の可能なエネルギー源はグリセリン醗、グリセルア ルデヒド等である。グルタミンは、タンパク質合成のアミノ酸前駆体としての役 割の外に、培養中の動物細胞にとって主要なエネルギー基質である。したがって 供給、物のエネルギー源構成要素は、通常グルコース等の炭水化物と組合せた形 で、グルタミンを含むことができる。 補充供給は典型的には、グルタミンま７’Ｃけその前駆体たとえばグルタミン酸 を含む−または複数のアミノ酸を含む。しかし通常は補充供給は複数のアミノ酸 の組合せを含む。補充供給はアルギニン、システィン、グルタミン、クリシン、 ヒスチジン、インロイシン、ロイシン、リシン１メチオニン、フェニルアラニン 、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン等の必須アミノ酸の 中の一筏まｆｃはこｎらの中の数種または全部の組合せを含むことができる。ま た補充供給は、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、ソロ リン等の非必須アミノ酸の中の−ａｔたはとｎらの中の数種ま′ｆｃは全部の組 合せを含むことができる。（補充供給はヒドロキシプロリン、ｒ−カル２キング ルタメート、ホスホセリン等の特殊アミノ酸を含むこともできる７）。 補充供給はコリン等信の栄養物質を含むことができる。 また補充供給はホルモン等の増殖刺激要素または増殖調節要素を含むことができ る。ただしこのような要素は通常は培養開始時に培地に与えらｎるつ 補充供給中のアミノ酸構成要素は典型的にＦｉＬアミノ酸であシ、塩ま７’Ｃけ その前駆体の形態をとることができる。補充供給のアミノ酸構成要素を提供する ため、単一のアミノ酸のかわりにジペプチドその他の短いペプチドを使用しても よい。 補充供給に使用さｎるエネルギー源およびアミノ酸各構成要素の量は、培養の生 存可能性を延長し産生物合成に必要な基質を提供するために所望によシ変更する ことができる。しかし補充供給の構成要素と七のｔは培地の分析によって選択す ることが好ましい。したがって、補充供給は増殖によって欠乏する培地構成要素 を含みうるし、培地に供給さｎるこｎら構成要素の量は培養開始時にこれらの構 成要素が存在していたレベルの濃度まで回復しかつ維持さｎることが好オしい。 通常補充供給は培養中エネルギー基質まｆｃｔｉ生合成前駆体として過剰に使用 される培地構成要素を維持しうるような量である。 培養開始時においてはいか々る適当な培地でも使用することができろう特に好ま しい培地はダルベツコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ　）であり、通常こｎにたと えばＦｅ２等の血清を補充して使用する。また培養の基礎としてＤＭＥＭを修正 したものまたは他の類似の培地を用いることもできる。また低血清培地、焦血清 培地および低タンノぞり質培地も適当なものとして使用可能である。 したがって、好ましい実施例において、本発明は、培養中細胞の増殖により欠乏 したエネルギー源、アミノ酸およびその他の栄養物質の組合せ供給により培地を 補充し、細胞の産生物を提供するため培養をその減衰期中まで継続することを特 徴とする、細胞を栄養培地中で培養する工程を含む動物細胞のパンチ培養方法を 提供するものである。 補充供給はいかなる適当な方法によっても培地に供給することができる。補充供 給は一発のショット添加（５ｈｏｔ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　）　ｔ　′Ｉｔ−ｕ好 ましくは複数発のショット添加として延長した期間にわ几って供給することがで きる。このよう表複数のショット添加はそｔｔｔ’ｒｔ別個の構成要素すなわち エネルギー源とアミノｅＲまたは他の適当な構成要素の組合せを含むことができ る。しかしこｎらの構成要素の数種オｆｃは全部は延長さｎた期間にわた抄地に 添加してもよいし、スラリまｆｃは好ましくけ懸濁液として添加してもよい。特 にシスティン、チロシン、トリプトファンのように中性ｐＨで僅かに溶けるいわ ゆる「不溶性」アミノＷＬハスラリ状で好ましくはショット添加により添加する ことができる。他のいわゆる「可溶性」アミノ酸は溶液として添加することが好 ましい、もつとも好ましいのはたとえばグルコース等のエネルギー源と「可溶性 」アミノ酸および選択的にコリンを含む溶液を延長さｒｔｆＣ期間にわたって培 地に対しポンプ供給することであろうこのようなポンプ供給は、グルタミンおよ び「不溶性」アミノ酸をショット添加により供給し友後に行ってもよい。 補充供給の正確な組成、その各構成要素およびその量はパンチ培養さｎる特定の 細胞に依存する。しかしたとえば典型的なハイブリドーマ細胞培養においては、 補充供給の構成要Ｘはグルタミンおよびグルコース等の炭水化物エネルギー源で ある。全グルタミン供給量は通常培養１リットル当シ０．５〜３ｔ、好ましく　 Ｆｉｏ、８〜１．６２特に１〜１．５ｆである。グルコースをエネルギー源とし て使用する場合、全グルコース供給量は通常培養１リットル当り１〜１０Ｆ、好 ましくＩ／ｉ３〜６２、特に４〜５２である。同量の他の炭水化物エネルギー源 を同様の量のグルタミンとともに使用してもよい。 典型的なハイブリドーマ培養に対するアミノ酸供給は、グルタミンに加えて、シ スティン、チロシン、ドリフトファン、リシン、ヒスチジン、アルギニン、グリ シン、バリン、メチオニン、トレオニン、セリン、インロイシン、ロイシン、フ エニアルアラニン（塩および前駆体を含む）の中の数種または全部を含むことが できる。一般にアミノ酸構成要素は培養開始時に培地に存在していたアミノ酸の 量の５０〜９０％を含む。補充供給中の各アミノ酸の全量Ｃグルタミンを除＜＞ ｔｒｘ通常培養１リットル当り０〜３００”ｆｓ特に普通には２０〜２００■で ある。補充供給はりシン、アルギニン、バリン、イソロイシン、ロイシンについ ては比較的に高い量（＊とえは培養１リットル当り７０〜１３０ｙ）、チロシン 、トレオニン、フエニアルアラニンについては中間程度の量Ｃたとえば培養１リ ットル当り４０〜７０■）、システィン、トリシトファン、ヒスチジン、グリシ ン、メチオニン、セリンについては比較的に低い量（培養１リットル当り１０〜 ４０■）を含有することが好ましいつｔｆｃ補充供給はたとえば塩化コリンとし て比較的に低い量（たとえば培養１リットル当り５〜２０■）のコリンを含むこ とができる。 われわｆ′Ｌは本発明の方法を使用してハイブリドーマ細胞の懸濁液培養からの 抗体収率を有意に増加させることができることを発見した。典型的にハイブリド ーマ細胞の補充供給をしないパッチ培養と比べて全体の産生物収率は少くとも２ ．５倍、しばしば少くとも３〜４倍、時には７倍にも達した。わｎわｆ′Ｌは、 Ｉ；ＢＹで形質転換した抗体産生ヒト細胞の培養から、補充供給をしない場合に 比べて少くとも５０５Ａの産生物収率増加を得た。またわｎわｎけトランスフェ クトさ′ｎた動物細胞特にｔＰＡを産生ずるトランスフェクトさｎたバイブリド −ｗＪｉｌ胞およびミエローマ細胞の培養から同様の産生物収率の増加を得た。 好ましい実施例において、本発明の方法は、培養の指数増殖終了後における実質 的な産生物形式を特徴とする。全産生物収率０５０％以上時には８０ｘ以上が指 数増殖終了後に産生さｎる。 図面の簡単な説明 本発明を以下の実施例について図示によりさらに説明する。 第１図はハイブリドーマ細胞培養時間に対する生存細胞密度および抗体力価のグ ラフである 単純パッチ培養 すおよびＣ単純栄養供給ノ々ツチ培養 ｄおよびＣ本発明による栄養供給パッチ培養第２図は第１図（ｅ）と同様の培養 時間に対する全細胞数密度、生存細胞密度および抗体濃度のグラフである。 第３図はプラスミドｐｓＶ２Ｉｌグロビン、ＰＳＶ３　Ｂｎｅ。 Ｐ３．１６．ｐＦＬｓＶ３およびｐＰＲＩの部分的な制限地図である。　（ｔＰ ＡおよびＲＰＶ遺伝子の転写方向は矢印で示す）、ＥｃｏＲｌ、ＲａｍＨＩおよ び５ａｔｌの制限酵素部位けｇ、　ｌ（、８でそｎぞＩＬ示す。種々の配列の起 源を以下応シＮ坏Ｚ同ルｏｕｓ　Ｓａｒｃｏｍａ　ウイテνスからのＬＴＦＬプ ロモーター ２　ｔＰＡ　ｃＤＮＡ遺伝子　［＝二二］　８Ｖ４０ボＩＪＡ部位［二＝＝］選 択遺伝子　ＥＭ＼＼］　ＳＶ４０初期プロモー第４図はエアリフト発ｖＰ器中の ｐ）ＬＩＩ／１０細胞による増殖とｔＰＡ合成の各曲線を示すグラフである。（ 生存細胞Δ、ＢＬＩＳＡによって決定したｔＰＡψ、フィブリン寒天アッセイに よって決定したｔＰＡ○）。 この実施例はハイブリドーマ細胞のａ濁液培養に関す本諸実験を記載する。最初 の２つの実験であるパッチ培養と単純栄養供給パッチ培養は比較実験として含ま ｎている。各実験はマウス−マウスハイブリドーマ細胞系であるＮＢＩを使って 行われたうＮＲＩＦｉＢ型血球の抗原決定基に対して特異性を有するモノクロー ナル抗体を分泌する。ＮＢＩ／］９．１１２．２８として知られるＮＢＩの起源 と特性については英国特許ＧＢ２０９４２５Ｂ明細書に記載さｎている。 第１の比較実験−パッチ培養 ３！Ａ熱不活性化子ウシ血ｆｆｆ（Ｆｅ２　）を補充したダルベツコ修正イーグ ル培地（ＤＭＥＭ）懸濁液中でＮＢＩハイブリドーマ細胞をエアリフト発酵器で パッチ式に増殖させたう約５０時間紐いた指数増殖期の後、生存細胞数密度は約 ２Ｘ１０’細胞数７’Ｗｊｔのピーク値に達し、その後増殖は突然停止し細胞生 存数は急速に減衰した。この実験の結果を第１図（ａ）に示す。黒丸は生存細胞 数密度の変化を示し白丸は時間の経過に伴う抗体力価の変化を示す。生存細胞は ６．４　（ｔＯｇ＋ｏ生存細胞数／１Ｒｔｌでピークに達し、その後急速に減衰 した。抗体力価は低く、細胞数密度のピーク後実質的に増加しなかった。 培養の減衰期は培地からのグルタミンの欠乏と一致し第１の比較実験と同様ＦＣ ８補充ＤＭＥＭ中の懸濁液中でＮＢＩハイブリドーマ細胞を増殖させＬ０後期指 数増殖期において培養に対し１発のグルタミンのショット添加を行う′ｆｃ（最 終添加濃度４ｍＭ）。その結果を第１図（ｂ）に示す。グルタミンの添加は最大 細胞数密度Ｃ黒丸）を冥質的な影響を及ぼさなかったが、培養は延長さｆした期 間生存し、その結果合計抗体力価（白丸）ｔｉ増加した。 −ｔｘわｎわｆＬＦｉ、１発のショット添加のかわりにグルタミンを反りして添 加することについて調査した。その結果を第１図（Ｃ）に示す。１回当り］ｍＭ ＩＪットルの添加濃度で４０時間にわたり反復添加（４回）した結果は、４ｍＭ グルタミンを１回添加した場合と比べて細胞数においても抗体収率においてもな んらの改善をも示さなかった。（第１図（Ｃ）を第１図（ｂ）と比較せよ。各図 において矢印はグルタミン添加時を示す）。 そこでわ扛わｎは、第１図（ｂ）におけるようなグルタミン供給培養中間隔をお いて培養上澄みを分析し、他の重要な栄養物質が欠けていることを発見した。 グルコースはエネルギー源であるとともに他の生体分子の前駆体であるが、新鮮 な培地のグルコース濃度の約ＩＸＫまで欠乏していることが示さｎた。同様に、 すべてのＤＭＥＭ構成要素アミノ酸がその初期濃度のＩＯＮないし５０％に欠乏 していることが判った。培養中各栄譬物質を過剰に維持するようにショット供給 およびポンプ供給による添加方法を使用してこれらの培地構成要素を培養に供給 する方法が考案さｎた。ま几、細胞膜前駆体であるコリンも補充供給中に加えら ｎ７ｅ。 実験−補充供給パッチ培養 ＮＢＩ細胞を３　Ｘ　ｖ／ｙ子ウシ血清で補充したＤＭｉ！ｉＭからなる培地中 で５リツトル工アリフト発酵器中で増殖させることにより、補充供給処方をテス トした。出発細胞数密度は約０．２　Ｘ　１０’生存細胞数、／−であった。細 胞が細胞数密度的Ｉ　Ｘ　１０’生存細胞数、ｌ−まで増殖した時、補充供給物 のショット添加を行い、かつポンプ供給を開始した。補充物の量的組成は、第１ 図（ｂ）におけるようなグルタミン補充培養の分析によって判明し皮栄養物質利 用パターンにもとすいて決定し友。補充供給の組成および培養への添加方法を表 １に示す。また得らｎた結果を第１図（ｅ）に示す。 表　１ 補光吻ＡＬ−グルタミン　２５０〜３５０　甲贅が］　Ｘ　）　０６細胞数／絋 の時２００ｍＭ溶液として ショット添刀０ 惰光すＢＬ、−システィン　１０〜４０　粗食がｌＸｌ０６細胞ｔＬ／Ｌ−チロ シン　４０〜７Ｑ　ｄの８１ｊｄｉＱ水としてショツＬ−トリプトファン　１０ ，２０　）添加Ｌ−リシンＨＣ／Ｉ　１０ト１４０　リンｅｉｉ塩ｉＲ側賞塩水 中の濃し−ヒスチジン　３０−４０　縮溶液としてポンプ供帖。 Ｌ−”’ｒルギ＝ｙＨｃｌ　６（ｈ’）０　隼餐がｌＸ１０６Ａ６胞ａ／’Ｌ− グリシン　１０〜３０　−の＠供給を開始し約５ＯＬ−バリン　６ｏＳ−ＲＯ時 間継続した。 Ｌ−メチオニン　２０〜３０ Ｌ−４レオニン　４か４０ Ｌ−セリン　２ト４０ Ｌ−イソロイシン　８０〜１００ Ｌ−ロイシン　７ト９０ Ｌ−フェニルアラニン　４０−６０ Ｌ−グルタミン　］　００ト］　２５０Ｄ−グにコース　４００ｏＳ−５０００ 塩化コリン　５〜】５ 補充供給なしの培養およびグルタミン供給培養の場合に観測されたものと同様に 、細胞は最大生存細胞数密度２．２　Ｘ　１０’細胞／ｄまで増殖した。しかし 増殖期の後に延長さｎた定常期が生じ、この定常期中生存細胞数密度には比較的 僅少な変化しかなかった。その後で長引いた減衰期が続いたｌ第１図（ｅ）参照 ）。その後の培地の分析は、培養期間を通じて主要な消費栄養物質は過剰に存在 していたことを示した。細胞生存の究極的な減衰は乳酸やアンモニア等の有毒代 謝産物の蓄積に帰因するものであった。なぜならば、こｔＬらの代謝産物は、初 期の指数増殖期において細胞に人工的に添加すると細胞毒性を示すことをわｎわ ｎが実、証した濃度において存在していることが判ったからである。また培養の この減衰はグルタミンが欠乏した培養におけるほど急速ではなかった。 抗体の検定をＩｇＭ特異的酵素にリンクしたイムノソルベントアッセイまたは赤 血球凝集アッセイのいすｎかでイに使用した抗体標準けＮＢＩ細胞の補充供給な しの培養からの培養上澄みであった。 第２図に関し抗体は培養期間を通じて培養上澄みに蓄積したが抗体合成率は増殖 中の０．３μＦ／１０’ａ胞数／時間から培養の後期中は０．５μＦ、’１０’ 細胞数、／時間および１．５μｆ／１０’ｍ胞数／時間に上昇することが判った 。最終抗体濃度は約１１６岬／リツトルで赤血球凝集力価は標準実施例２ 栄養物質供給物中にアミノ酸構成要素を設ける必要性を確定するためさらに実験 を行った。ＪＮＢＩ細胞を子ウシ血清で補充したＤＭＥＭ中で５リツトル工アリ フト発酵器で増殖させた。初期細胞数密度は約０．２　Ｘ　１０’生存細胞／ｗ ｔであった。細胞が約Ｉ　Ｘ　１０’生存細胞数／−に増殖した時グルタミンを 添加濃度２ｍＭまでショット添加により培養に添加しグルタミン、グルコースと コ１Ｊ７（７）ポンプ供給を開始した。したがって、培養はグルタミンを除く不 溶性または可溶性アミノ酸の補給を受けなかったことを除けば、供給さｎた構成 要素の量的添加は実施例１の培養と均等であった。補充供給時間は約５０時間で あった。得らｎた結果を第１図（ｄ）に示す。培養の増殖期はアミノ酸を含む完 全供給を受けた培地において観測さｎた曲線に類似する曲線に従った。最大細胞 数密度２．５　Ｘ　１０’生存細胞数／−が達成さＩした。しかし延長さｎた定 常期を確立するかわりに、ポンプ供給が完了する面に生存細胞の急速な減衰が続 いて起った。培養の減衰期中抗体合成率にＦｉはつきりした上昇は見らｎなかっ た。 最終抗体力価は補充的アミノ酸を含む完全供給を受けた培地において得らｎた力 価の約半分であった。 実施例３ 表２ｔｊ従来の補充供給のない培養から得た抗体収率と補充供給を受けたパッチ 培養（実施例１の補充供給金堂をいくつかの告歯類動物のハイブリドーマ細胞系 およびと）ＥＢＶ形質転換細胞系について比較している。量歯類動物細胞系につ いてけ、ノ９ツチ補充供給方法は抗体収率において３倍〜７倍の増加を得たうヒ ト細胞系については、パッチ補充供給方法は抗体収率において１．７倍の増加を 得た。 表　２ パッチ培養中で増殖しｆｃ昔歯傾動物ノ・イブリｒ−マ細胞系およびヒｋＥＢＶ 形質転３１１＃ｆｌ胞系からの抗体収率に対する栄養物質供給の効果細胞系　抗 体種別　抗体収率　ＭＧ／］　率供給パッチ　非供給バッチ併合パッチ対非供給 パッチ１　告菌類　Ｉ９Ｇ　８６　１７　５．１２　＃　Ｉ９Ｍ　２９５　９９ 　３．０３＃Ｉ９Ｇ　７３　１０　７．３ ４　＃　Ｉ９Ｇ　１００　２９　３．５５　１　ＩｇＧ　２ｆｉ０　６８　３． ８６　＃　Ｉ９Ｍ　１１２　２３　４９ ７　１　Ｉ、Ｇ　２００　．３４　５．９８　ｚ　ＩｇＧ　３５０　１１０　３ ．２９　（ヒト）　ＩすＧ　５３　３２　１７実施例４ この実施例は、ＳＰＡをコードする遺伝子で安定にトランスフェクトさｎたミエ ローマ細胞系の調製とこの細胞系を本発明の方法に従って補充供給パッチ培養す ることについて記載している。 （１９８２年）に詳細に記載さｎている。ｔＰＡ％異的ＤＮＡ配列ｆｉＢｏｗｅ ｓメラノーマライブラリから単離しｆｃ２つのｃＤＮＡクローンから得ｆｃ−（ Ｈａｒｒｉｓ　ｅｔ　ａＬ　１９　Ｂ　６年）。プラスミドｐｔＰＡ　Ａ　３　 ＦｉＨｉｎｄ　ＩＩＩリンカ−をｔＰＡ　ｃＤＮＡ（７）１２００塩基対（ｂｐ ）フラグメント（ヌクレオチド９〜１１９７　、　ｐｅｎｎｉｃａ　ｅｔ　ｍｌ 　１９８３年）に付加することにより構成しｆｃ、このＤＮＡｔ次いで単一のＨ ｉｎｄ　ＩＩＩ部位においてｐＡＴ１５３中にクローンし次。プラスミドｐｔＰ Ａ２１　ｕ　Ｒｇｔ　ＩＩ　ｃＤＮＡフラグメント（ヌクレオチド１８７〜２１ ６６）ｔ−単−ＢｇＡ　１１部位を有するシラスミド中にクローンすることによ り構成した。完全な長さのｔＰＡｃＤＮＡ遺伝子はｐｔＰＡ２１からのＢｇｔ　 １１フラグメントをｐｔＰＡＡ３のＢｇｔ　１１部位にクローンすることによっ て作らｆＬ７’ｃ、その結果生じたシラスミドｐｔＰＡ３／２１は７６ｂｐの５ ′非コ一ド配列、完全なｔＰＡコード領域、３９３ｈ、０３′非コ一ド配列お工 びｔＰＡコード領域の反復セグメント（ヌクレオチド１８７〜１１９７）をすべ て単一のＨｉｎｄ　ＩＩＩフラグメント上に含んでいる。第２のプラスミドＩ） ８１／’１１も構成され、この中ではＨｉｎｄ　ＩＩＩ　フラグメントＦｉｐＡ Ｔ１５３配列に対して反転さｎている。 プラスミドｐ８１／１１けＢａｔｌで消化し、３′非コ一ド配列の１１６ヌクレ オチドを含むＢａｔＩフラグメント、ＩＰＡコード領域の反復セグメントおよび 若干のｐＡＴ１５３配列はプラスミドｐＢｓ　Ｉを残して取除かｎた。単一のＢ ａｍ１（Ｉおよび８ａＬ　Ｉ制限酵素部位は、付着端がＤＮＡポリメラーゼで光 たさｆＬｆｃ　ｐＡＴ　１５３からの２７５　ｂｐのＲａｍ　Ｈ１／Ｓａｔ　１ フラグメン）　ｆ　ＢａｔＩ　９位に連結することによりｐＢｓＩ中に再導入さ れた。フラグメントが挿入さｆ′Ｌｆｃ方向に依存して、５ａｔＩ部位（ｐＢｓ １７）　またはＲａｍＨＩ部位（ｐＢｓ］　８）がｔＰＡ遺伝子３′末端で再形 成さｎた。プラスミドＰＦ３５１８ａ　ｔＰＡ　ｃＤＮＡ発現構造の前駆体であ った。 クローン２８　（Ｄｒ、ＩＩＨａｍｅｒ、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ ｅ　ｏｆＨｅａｌ　ｔｈ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ、　Ｕ、　 Ｓ、　Ａ、　）はＢａｍＨ１部位にクローンした全８Ｖ４０ゲノムおよびＥｃｏ 　ＲＩ部位にクローンしたマウスメタロチオネインＩ　（ＭＭＴ−Ｉ）遺伝子（ ＨａｍｅｒおよびＷａｌｌｉｎｇ、　１９８２　）　ｋ含む３．８　ＫｂのＥｃ ｏ’ｆＬ１　フラグメントを有している。このプラスミドは電ＰＡ発現構造にお いてＭＭＴ−１プロモーター（λ４ＭＴ　）を提供した。翻訳開始点から４ｂｐ 上流の単一のＢｉｔ　Ｉ部位（Ｇｌａｍｖｉｌｌｅ、　ｅｔ　ａｔ、１９８１年 ）はオリゴヌクレオチドＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧを使用してＨｉｎｄ　Ｉ１１部位 に変換さｎた。　・ Ｍ　Ｍ　Ｔプロモーターを含有するクローン２８から得た２、０ＫｂｐのＨｉｎ ｄ　ＩＩＩフラグメントをｐＢｓ　１８の単一のＨｉｎｄ　Ｉ１１部位にクロー ンすることによって、ＭＭＴプロモーターとｔＰ、Ａコード配列の転写上の融合 が形成さｎた。このシラスミドはｐＢｓ１８Ｍ３と呼ばｎた。クローン２８から 得られ、かつＳＶ　４０ポリアゾニレ−ジョン部位を含む２４３　ｂｐのＨａｍ 　Ｈ１／Ｂｃｔｌ　７ラグメ７トを２８８１８Ｍ３のＢａｍ８１部位に挿入した 。このポリアゾニレ−ジョン部位は初期から後期への方向に配向しており、した がってｔＰＡ遺伝子から遠いＢ１ｍＨＩ部位を再生した。このシラスミドはＰ３ ．１６と呼称された。 Ｒｏｕｓ　Ｓａｒｃｏｍａウィルス（ＲＰＶ）のロングターミナルリピー）（Ｌ ＴＲ）をｐＲ８ＶｃａｔからのＣＩ　ａ　Ｉ７’Ｈｉｎｄ年）。Ｍｂｏ１１部位 はオリゴヌクレオチドＧＧＡＴＣＧＡＴＣＣを使用してＣ１ａ　１部位に変換し た。このフラグメントを個々にクローンして、あらかじめＣＬａＩとＨｉｎｄ　 ＩＩＩで切断しておいたｐ３ｅｉ６にクローンすることによりＭＭＴ　７’ロモ ーターをレトロウィルスＬＴＦＬ７’ロモーターで置換した。その結果化じたプ ラスミドｔ′１ｐＲ８Ｖ３（ｆＬｓＶＬＴＦＬ含有）と呼ばｎた（第３図参照） っ優勢な選択を与える遺伝子がｐｓＶ　２　ｎｅｏから得られた（　８ｏｕｔｈ ｅｒｎおよびＢｅｒｇ、　１９８２年）口ｐｓＶ　２　ｎｅｏ　ｆｒｎｅｏＪ） 中の転写ユニットによって付与さｎる抗生物質Ｇ４１８　に対する耐性を使用し たつｎｅ。 転写ユニットを使用するためにそＴＬがＲａｍ　Ｈｌお工び）ｆｉｎｄ　ＩＩＩ フラグメントの双方に含まｊＬるよつリフローンした。 こｆＬらのベクター構造の開始点は、ｐ　Ｓ　Ｖ　２　Ｂｇｔｏｂｉｎ（第３図 ）であった（　５ｏｕｔｈｅｒｎお工びＲｅｒｇ、　１９８２年）。 ベクターの出ｎｄ　Ｉ１１部位をＢｇＡ　１１部位に変換した後生放したＢｇｔ ｏｂｉｎ含有ＢｇｔＩＩフラグメントを除去した。 その結果化じたプラスミドｐ８Ｖ　２　ＢｇＡ　ＩＩはＰｖｕ　１１部位をプラ スミドｐｓｖ　３　Ｍ　ｔ−発生するＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位に変換する次段階の 変換の基礎を形成した。 ｎｅｏ遺伝子の９８Ｖ３Ｍへの導入ｉｊ　Ｂｇｔｌｌ　−Ｂａｍ　Ｈｌポリ人− スプライン遺伝子フラグメントをｐ８Ｖ２ｎｅ。 から単離したＢｇＡ　ＩＩ　−Ｂａｍ　ＨＩフラグメン）−によって置換するこ とによって行わＩした。その結果化じたシラスミドｐｓＶＭｎｅは、Ｈｉｎｄ　 １１１−Ｒａｍ　ＨＩフラグメント中に含まｎるポリＡ配列なしでｎｅｏ遺伝子 の発現を駆動する５Ｖ４Ｇ初期プロモーターを含んでいた。ｐ８Ｖ３Ｍｎｅｃ） Ｈｉｎｄ　ＩＩおよびＢａｍＨＩ各部位は別部位Ｒａｍ　ＨＩおよびＨｉｎｄ　 ＩＩＩ各部位にそｎぞｎ変換さｎｌその結果プラスミドｐｓＶ　３　Ｔ３ｎｅお よびｐｓＶ　３　ＭＭｎｅ　（第３図）がそｎぞ再生じた。 ｐＲ８Ｖ３を安定的細胞系の生成に使用するため、選択を与えるＲＰＶベクター が存在していないので、ＲａｍＨ１部位に選択マーカーを導入した。使用した選 択カセットＦｉｐｓＶ３Ｂｎ６からのＢａｍＨＩフラグメントであり、ＢａｍＨ Ｉフラグメントを両方向に含むシラスミドｐＰＩ’ＬＩおよびｐＰＦＬＩＩが生 成さｎｆｃ。 ２、トランスフェクション トランスフェクションのために使用したａ胞系はＹＢ２／’３．ＯＡｇ　２０　 （英国特許ＧＢ２０７９３１３）であった。細ト 胞系ケヘニシリン（５０Ｕ７’ｓ＋＋ｊ３、スプレシトマイシン（５０μｆ／ｄ 　）、ｌ　ｍＭピルビン陵、２　ｍＭ　Ｌ−グルタミンおよび熱不活性化子ウシ 血清（１０％）を添加したダルベツコ修正イーグル培地（ＤＭＢＭ、　Ｇｉｂｃ ｏ　Ｌｉｄ、　Ｕ、　Ｋ、）中で維持さｎ７ｉ（０ ＤＮＡ’ｉｉミエローマ細胞中に導入するために、わｎわれけＤＥＡＥ−デキス トラン、ＣａＰＯ４およびニレクロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉ ｏｎ　）を使用する標準方法を使用クションの大半はトランスフェクションを改 良するため年）およびりｏｏキニーネ（ＬａｔｈｍａｎおよびＭａｇｎｕｓｓｏ ｎ。 １９８３’ｆ、）を使用するＤＥＡＲ−デキストラン法の修正方法を使用して行 われた。 トランスフェクション後細胞は典型的には選択を導入する前２４時間靜叙したう 抗生物質（１４１８（ＧｅｎｅｔｉｃｉｎＧｉｂｃｏ　Ｌｔｄ、　Ｕ、　Ｋ、　 （Ｓｃｈｅｒｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、米国特許第３９５９２５４号、第３９９７４０ ３号明細曹〕１を濃度１．４■／−で使用して、ｐｓＶ３Ｂｎｅからのｎｅｏ遺 伝子力セツＩｔ含むプラスミド構造を有するトランスフェクションがａ択さｎた 。 選択の導入後、細胞をクローン選択のためにマイクロタイター皿に分配する２４ 〜４８時間前に細胞を再びインキュベートさせたうとｎらのマイクロタイター皿 Ｆｉ典型的には最初のクローンが現わｎる以前に２〜３週間インｄヤーし、シえ 。上澄みヶ検葺するヮまえゆ２４ウ工ル組織培養皿に展開する前に飽和点に達す るまで（培地のフェノールレッドを黄色に変える）増殖させた。ｔＰＡ産生の有 用なレベル（１００μ７／−以上）″を示すトランスフェクションからの細胞系 は培養にＩＯＸＤＭＳＯを補充した後液体窒素中で凍結体として貯蔵した。こｎ らの細胞系もリフローンし、選択さｎた高産生株も上記のように貯蔵した。 ３、ｔＰＡタンノぐり質の定量 各細胞系からのＳＰＡをフィブリノーゲンｔｙｃは醇累起合イムノソルベントア ッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって検定したう 培地中の活性ｔＰＡタンパク質ｆ、　Ｃｅｄｅｒｈｏｌｍ−Ｗｔｌｌｉａｍｓに よって修正したフィブリンアガロースプレートアッセイを使用して検定した。　 ０．１　Ｍ　）リス（ｐＨ７，４１、０，１５Ｍ　ＮａＣ１および２　ｍＭ　Ｃ ａＣＬｘ中のＩ、ＧＴアガロース２０■／−を融かし５５℃壕で冷却した。０． ９％（ｖ／ｖ）ＮａＣＬ中の等量のフィブリノーゲン２１１Ｆ、／−とヒトプラ スミノーゲン（最終濃度１０μｔ７ｍｌ　）を添加した。ウシトロンビン’ｅ０ ．１２単位／へＩで添加することによりフィブリン重合が開始した。該混合物を ポリエステルシート上に注ぎ静置したつ試料の希釈液と既知濃度（５μを容積） のウロキナーゼ標準溶液の希釈液とをゲル中に穿ったウェルに加え各プレートを 加湿室中で１７時間ないし２０時間３７℃でインキュベートした。分解が生じた 領域の直径を測定した、その直径の２乗の対数を製置の対数に対してプロットす ることによってウロキナーゼデータから標準曲線を描いた。試料中の活性の童を 標準曲線から決定しｆｃ０１０〜１００単位／ｌＲ１の範囲内においてウロキナ ーゼｆｉｔＰＡ　活性を測定するために適当な標準であることが判った。 トランスフェクトし’ｆｃｍ胞系か６の培地中の合計ｔＰＡタンノぞり質ｔをＥ ＬｌＢｋを用いて検定した。０．０５　Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ９，６）中のヤ ギポリクローナル抗ｔＰＡ（Ｂｉｏｐｏｏｌ　、スエーデン）　２　ｔｔｆ／１ ｎｔｆ　３７℃１時間塗布したＮｕｎｃ免疫検定プレー）（Ｎｕｎｃ、デンマー ク）によりＥＬＩＳＡを実施した。こｎらのプレー）　ｋ　０．０５　Ｍ炭酸ナ トリウム（ｐＨ９−６）中の０．５％カセインＨａｍｍ２ｒｓｔｃｍで３７℃１ 時間ブロックした。こｎらの塗布しブロックしたマイクロタイタープレートおよ びその他の洗い工程でのプレートけ０．０２　Ｘ　Ｔｗｅｅｎ　２０とともにリ ン酸塩緩衝食塩水で洗った。検定用の試料は希釈して試料緩衝液（０，Ｉ　Ｍ　 ）リス−ＨＣｔｐＨ７，０，１５０ｍＭ　ＮａＣム０．５Ｘカセインおよび０． ０２８　Ｔｗｅｅｎ　２０　）とした。この検定で使用した標準は２本の鎖状ｔ 　ＰＡ　（Ｂｉｏｐｏｏｌ、スエーデン）であった。試料はウェル当り１００μ を導入し、振とりしつ＼呈瀉で１時間インキュベートした。次いでプレートを洗 い、試料緩衝液中にＳＰＡに対するマウスモノクローナル抗体であるＭＡＣＯ１ ０（１μＦ／’ａＩｔ）　’ｉ各ワウエル１００μＬ）に添加した。該モノクロ ーナル抗体とともにインキュヘ−）　ｔ、ｙｃ後プレートを洗い、ヤギ抗マウス ＩｇＧＦｃ特異的ペンオキシダーゼ抱合体を各ウェルに添加し、振とりしつ＼室 温で１時間インキュベートした。抱合体とともにインキュベートした後プレート を洗い、文献記載のとおｔ）　（Ｂｏｓμμ、１９８１年）展開した。 ４　フィブリン寒天プレートアッセイ ｔＰＡ　検定のために、トランスフェクトした細胞をプレート（約５　Ｘ　１０ Ｓ）か、らかき卦とし、細胞の中１０％をとり無血清ＤＭｇＭ　（（）ｉｂｃｏ 　）、１　ｍＭピルビン酸、５０ＩＵ／−ペニシリン、５０μ２／−ストレフト マイシン（Ｐ／Ｓ）、２ｍＭＬ−グルタミン（Ｇ／ｎ）で２度洗った。 次にこｎらの細胞ｔ”ｌ　ＯＸ　（ｖ／ｖ）９処理子ウシ血清（Ｆｅ２）ｔ−補 光した７０％ＤＭＥＭ　７−および２．５％低ゲル化温度アガロース（Ｓｉｇｍ ａ　Ｌｉｄ、　）で補充した３０％（ｖ７ｖ　）　Ｈａｎｋｓ平衝食塩水（Ｇｉ ｂｃｏ　）中で４２℃で懸濁した。この懸濁液にトロンビン（ウシプラズマ５０ ０　Ｕ／ｄ。 Ｓｉｇｍａ　Ｌｉｄ、　）　０．５単位を補充した。最後にＤＭｇＭ　１．５ミ リリツトル、ｌ　ｍＭピルビン酸、Ｐ／　Ｓ、　Ｇ／　ｎ、　１０　Ｘ（ｖ　／ マ）酸処理ＦＣ８，３０ｗｑ／−プイブリノゲン（ウシ血由来、タイプＩ　−Ｓ 　％Ｓｉｇｍａ　Ｌｔｄ−）　ｆ添加し、混合物を直ちに９０瓢皿に注いだ。 とｎらのトランスフェクションから産生さｌｒしたｔＰＡのレベルを決定するた め、こｎらの皿を最長４８時間インキュベートした。その結果はフィブリン分解 活性の相対レベルとして記録さＩした。 ５、ｔＰＡ産生細胞系 ＹＢ　２／３．０−’Ａｇ　２０　ｋ　ｐＰＲＩで生産可能にトランスフェクト することによってラットハイブリドーマ　ＹＢ２／３．０−　Ａｇ　２０細胞系 からｔＰＡ　産生細胞系ｐＰＲ１１／ｌＯを得た。 Ｙ　Ｂ　２／３．０−　Ａｇ　２０　（最大レベル）ｐＰＲＩ　Ｒ８Ｖ　ＬＴＦ Ｌ　９００ この実験の目的は産生型細胞培養リアクター中での細胞系ｐＰＲ１１／１０の増 殖およびｔＰＡ合成を測定することであった。 使用した細胞リアクターは作業容積５リツトルのエアリフト発酵器で溶存酸素張 力（ＤＯＴ）、ｐＨおよび温度を自動的に調節しうるものである。ＤＯＴは窒素 または空気の分散したパラストガス中に空気ま７′Ｃけ酸素を調節して注射する ことによって調節した。ｐＨはこの気体混合物中に二酸化炭素を調節して注射す るかアルカリを培養中にポンプ供給することによって調節した。温には温度調節 した水をリアクターのジャケットに流すことによって調節した。 １〇九ｖ　７　ｖ　の熱不活性化子つシ血ｆｉ（Ｆｅ２）を補充したダルベツコ 修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）からなる増殖培地中で細胞系ｐＰＲ１１／１０の 細胞株を回転瓶培養により通常の方法で増殖した。 ＡＬＰ　培養用培地はアルジミン、インシュリン、トランスフェリン、エタノー ルアミン、コリン、ビタミン、痕跡量の金楓および切断保睦ポリマーで補充し一 ７ｔＤＭＥＭからなる無血清組成のものであったっ ＡＬＦ　培養に対する細胞接穐物は血清を補充した培地中で増殖させた。ＡＬＰ 　培養中補充栄養物質を添加した。 これらの栄養物質は次のものからなる。 ａ、培養中の最終態度を２ｍＭ増加するためのグルタミンのショット添加 す、「不溶性」アミノ酸であるトリプトファン、チロシンおよびシスティンショ ット添加 Ｃ，グルコース、コリンおよび「可溶性」アミノ酸からなる供給物のポンプ供給 試料を１日ごとに培養からとり去った。修正フックス・ローゼルタール計数チャ ンバを使用して細胞数を計数し、トリパンブルースティン（Ｔｒｙｐａｎ　Ｂｌ ｕｅ　５ｔｅｉｎ　）の排除によシ細胞生存を測定した。培養上澄みの裡数のア リコツトを液体窒素で即時凍結した後、その後のｔ　ＰＡ　ｇＬＩｓＡおよびフ ィブリン寒天プレート、アッセイによるｔＰＡ定量のために一７０℃で貯蔵した 。 第４図はエアリフト培養中のｐＰＦＬ１１／１０細胞による増殖とｔＰＡ　合成 の各曲線を示す。細胞は最大生存細胞数密度２．２　Ｘ　１０６／ｌｎｔおよび 最大合計細胞数密度４×１０’／／Ｒ１を達成した。ｔＰＡ　は培養期間を通じ て合成さｎフィブリン寒天プレートアッセイによる測定によｒしば４２　ｐｆ／ ｌｔ　、ｔ　ＰＡ　ＢＬＩＳＡによる測定に工ｎば３８μｆ／１ｎｔの最高濃度 を達成したうＥＬＩＳＡ　（活性化ｔＰＡお工び非活性化ｔＰＡ　の双方全検知 する）とフィブリン寒天プレートアッセイとが良く合致していることは合成さｎ たｔＰＡ　Ｆｉ完全に活性化さｎていたことを示す。 上記実施例は本発明を単に例示的に説明するものであって本発明の範囲内におい て細部の変更が可能である。 １・７トＩン工　１１　乃δｒ′　りＭ　卯　、ｂ′ツ　冴で二ＦＩＧ、　３ 手続補正自動式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＧＢ　８６１００３８３ ２、発明の名称 動物細胞培養 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 セルチック、リミテッド ４、代　理　人　（郵便番号１０５） −計和 ６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．培養中培地をーまたは複数のエネルギー源およびーまたは複数のアミノ酸の 組合せ供給により補充し、かつ細胞の産生物を提供するために培養を減長期中ま で継続することを特徴とする、栄養培地（ｎｕｔｒｉｅｎｔｍｅｄｉｕｍ）中で 細胞を培養する工程を含む動物細胞のバツチ培養方法。
2. ２．細胞は遺伝学的に修飾した動物細胞である請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．細胞はトランスフエクトした動物細胞である請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．細胞は抗体産生細胞である請求の範囲第２項記載の方法。
5. ５．細胞はハイブリドーマ細胞である請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．該産生物はトランスフエクトされた遺伝子産生物を含む請求の範囲第１項記 載の方法。
7. ７．該産生物はｔＰＡを含む請求の範囲第６項記載の方法。
8. ８．該産生物はモノクローナル抗体を含む請求の範囲第４項記載の方法。
9. ９．該補充供給は該培養の指数増殖期中に開始する前記各請求範囲のいずれかに 記載の方法。
10. １０．該補充供給は該培養の指数増殖期後も継続する請求の範囲第８項記載の方 法。
11. １１．該補充供給は合計３０時間ないし１００時間にわたり行われる請求の範囲 第９項または第１０項記載の方法。
12. １２．該補充供給の該エネルギー源構成要素は糖質を含む前記各請求範囲のいず れかに記載の方法。
13. １３．該糖質はグルコースである請求の範囲第１２項記載の方法。
14. １４．該補充供給の該エネルギー源構成要素は付加的にグルタミンを含む請求の 範囲第１２項または第１３項記載の方法。
15. １５．該補充供給の該アミノ酸構成要素はグルタミンを含む前記各請求の範囲の いずれかに記載の方法。
16. １６．該補充供給の該アミノ酸構成要素は付加的に一または複数の必須アミノ酸 を含む請求の範囲第１５項記載の方法。
17. １７．該補充供給の該アミノ酸構成要素は付加的に一または複数の非必須アミノ 酸を含む請求の範囲第１５項または第１６項記載の方法。
18. １８．該補充供給はコリンを含む前記各請求の範囲のいずれかに記載の方法。
19. １９．該補充供給はエネルギー源、アミノ酸およびその他細胞の増殖によつて欠 乏する栄養物賃の組合せを含む前記各請求の範囲のいずれかに記載の方法。
20. ２０．該補充供給の少くとも一部は延長きれた期間にわたり継続的に添加される 前記各請求の範囲のいずれかに記載の方法。
21. ２１．該培養の継続的供給前にグルタミンをシヨツト添加として添加する請求の 範囲第２０項記載の方法。
22. ２２．「可溶性」アミノ酸をシヨツト添加として添加する請求の範囲第２０項ま たは第２１項記載の方法。
23. ２３．該補充供給の合計グルタミン構成要素は培養１リツトル当り０．５〜３ｇ である前記各請求の範囲のいずれかに記載の方法。
24. ２４．該補充供給の合計糖質構成要素は１リツトル当り１〜１０ｇ、好ましくは ３〜６ｇである前記各請求の範囲のいずれかに記載の方法。
25. ２５．該補充供給の各アミノ酸（グルタミンを除く）の合計は培養］リツトル当 り０〜３００ｍｇ、好ましくは２０〜１５０ｍｇである前記各請求の範囲のいず れかに記載の方法。