JPS60500652A

JPS60500652A - 植物根の発育

Info

Publication number: JPS60500652A
Application number: JP59501277A
Authority: JP
Inventors: ストロベル，ゲアリ　アラン
Original assignee: リサ−チ　アンド　デベロプメント　インステイテユ−ト，インコ−ポレイテツド
Priority date: 1983-02-28
Filing date: 1984-02-24
Publication date: 1985-05-09
Also published as: IT1178864B; EP0137035A1; ZA841380B; WO1984003298A1; GR79827B; PL246433A1; CA1226542A; FR2541686B1; ES8504428A1; IT8467189A0; IT8467189A1; OA07847A; BR8406167A; IL71071A0; IL71071A; US4588693A; KR840007605A; FR2541686A1; ES530079A0; EP0137035A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】植　物　根　の　発　育関連出願に対する近縁関係本出願は、１９８５年２月２８日付は出願の米国特許出願第４７０，３９２号の部分継続出願である。

発明の背景アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎａｓ　）は、多数の種類の高等植物における、いわゆる「毛根病」と呼ばれる原因微生物である。Ａ・リゾゲネスは土壌から分離することができ、次の特性を有する１種のアグロバクテリウムである：好気性、桿菌（０８Ｘｔ５〜３０μｍ）、１〜４個の鞭毛、グラム陰性、かつ胞子形成なし。一般的種類は、腫瘍の原因となるＡ・ツメファシェンス（Ａ−ｔｕｍｅｆａｃｉ＠ｎｓ　）−毛楼病を引き起こすＡ・リゾゲネス及び非病原性であるＡ・ラジオバクター（Ａ　−ｒａｄｆｏｂａｅｔ拳ｒ　）である。

人間の利益となるようＡ・リゾゲノスを使用する可能性が、「温床リンゴ樹の感染性毛根に関する研究」と題する論文〔ジャーナル・オプ・アグリカルチュラル・リサーチ、第４１巻、第７号、第５０７−５４０頁、ニー・ジエー・リカー等〕に記載されている。この著者はその５５７頁に次のように述べている：　［予備実験において、毛根微生物で処理した成る種の植物の切り枝又は取り木の枝は、未処理のものより早くかつ旺勢に発根した。

これらの結果は、この微生物を使用して成る種の植物の繁殖における根の発生を刺激しうる可能性を示唆している。結論を引き出しうるには、また多くの研究が必要である。」この示唆にもかかわらず、Ａ・リゾゲネスは人間の利益のために活発に追求されておらず、まだ望ましくない病原体であると見なされている。

発明の要点今回、根誘発性人・リゾゲネス、好ましくはアブロバクリラム・リゾゲネスＡＴＣＣ３９２０７と命名された新規菌株を用いる遺伝形質転換により、双子葉植物における根の有利な成長を効果的に制御しうろことが見出された。この制御は機能的Ａ・リゾゲネス・が土壌を汚染するという望ましくない可能性を有し或いは示し、いずれにしてもＡ・リゾゲネスでの植物の遺伝形質転換と同時又はその後にアブロバクリラム・ラジオバクター、好ましくはＡ・ラジオバクターに−８４を用いて効果的に制御することができる。どの人・リゾゲネスを使用したかとは無関係に、植物は好ましくは１−当り少なくとも約１０ｓ個の菌体という有効濃度における水性懸濁物又はその他の媒体（たとえばビート）において形質転換を達成しうる時間にわたり植物の露出内鞘とＡ・リゾゲネスとの接触により形質転換される。少なくとも約２０時間の露出により均一な結果が得られる。上記濃度における現在好適な露出時間は少なくとも約２４時間である。可逆的形質転換が生ずる。植物の表面上に残留する全てのＡリゾゲネスは根の発育に対し不必要である。したかつて、これをＡ・ラジオバクターに対し露出することにより、非感染性レベルまで減少させることができる。必要なことは、Ａ・ラジオバクターの濃度が約１０７　×ｆＪＪ　１０８個／ゴであるような水性懸濁物に簡単に浸漬することである。便利には、Ａ・リゾゲネスとＡ・ラジオバクターとを同じ処理溶液中で少なくとも約４；１、好ましくは４：１〜約８＝１０Ａ・リゾゲネス対人・ラジオバクターの菌体比にて組み合せることにより形質転換を達成しうろことが見出された。現在好適な溶液は約１０９個のＡ・リゾゲネス菌体と約２５Ｘ１０’個のＡ・ラジオバクター菌体とを１−当りに含有する。この場合も、接触は少なくとも約２０時間である。この処理により、Ａ・ラジオバクターは過剰のＡ・リゾゲネスを無害にする。

いずれの場合にも、Ａ・リゾゲネスとＡ・ラジオバクターとの両者は単独でも或いは組み合せても、乾燥した生存菌体を得るための遠心分離および凍結乾燥によるペレット化に耐えうる。さらに、これら菌体は、たとえば中性乃至アルカリ性ビートのような他の媒体に支持して植物の受容帯域に対し所定時間にわたって元こし、或いはそこから微生物を抽出して水溶液として使用することができ、或いはそれが好ましい。

Ａ°リゾゲネスＡＴＣＣ３９２０７は、同じ時間内に根の発育を２倍にする能力を示す点で根の発育に刈し、その親菌株よりも有効であることが捧詔された。

第１図は葉の発育程度を示す移植後４５日目に撮影した比較ノース・スター・チェリー・トリーの写真であり、第２図は葉の発育増大を示す移植後４５日目に撮影した形質転換ノース・スター・チェリー・トリーの写真であり、第６図は同じ毛根から切除した毛根円詣を示し、この場合、円盤１０は形質転換してない比較であり、円盤１２及び１４はＡ・リゾゲネスＴＲ１０５で形質転換したものであり、また円盤１６はＡ・リゾゲネスＡＴＣＣ３９２０７で形質転換したものである。

詳細な説明本発明によればＡ・リゾゲネスの新規な菌株、すなわちＡ・リゾゲネスＡＴＣＣ５９２０７が提供され、この菌株はＡ・リゾゲネスＴＲ１０５から分離され、単独で又は他の根誘発性Ａ・リゾゲネスと組み合せて使用し根の発育を増進させるために双子葉植物の遺伝形質転換を行なうことができ、Ａ・リゾゲネスの制御はＡ・ラジオバクター、好ましくはＡ・ラジオバクターに−８４を用いて用なうことができる。

Ａ・リゾゲネスにより遺伝形質転換された植物は、次いでＡ・ラジオバクターで処理して或いは両者を組み合せて形質転換を完成することができる。この方法において、Ａ・ラジオバクターは過剰のＡ・リゾゲネスを無′ざにする。両者を組み合せる場合、これらは４；１若しくはそれ以上のＡ・リゾゲネス対人・ラジオバクター、好ましくは約４：１〜約８：１の菌体比で組み合せることができ、この場合Ａ・ラジオバクタ・−はＡ・リゾゲネスが土壌を汚染するのを実質的に防止すると共に他物形質転換を阻害しないよう作用する。全ての場合にＡ　−ＩＪゾゲネスによる植物の形質転換は、この微生物が非浸透性であるため、内鞘に対し露出することを必要とする。露出は、遺伝形質転換が生ずるのに充分な時間である。Ａ・リゾゲネスを形質転換するのに有効な露出は少なくとも約２０時間、好ましくは少なくとも約２４時間であることが現在好適である。形質転換は一般に、Ａ・１ノゾゲネスを植物の傷に露出することを必要とし、この傷暑ま切除（新しくても、新しくなくてもよい）により或い＆ま単に根の切断により生ずる。

処理媒地における１ノゾゲネス菌俸濃度は、一般に少なくとも約１０３１固／− １好ましくは少なくとも約１０９個／−である。それより低濃度も有用であるが、形質転換を生ザしめるにはより長い露出を要する。植物の受容露出表面と接触させ、そこ力）ら細胞拡散により形質転換を生ぜしめるには、水浴液として、或いはたとえばビートのようなキャリヤを介して行なうことができる。代案として、含有される微生物をビートから植物の形質転換に使用する水溶液中へ抽出することもできる。

本発明によるＡ・リゾゲネスの使用の利点は多し）。先ず第１に、練機原料の早期発根を促進し寸法及び数の両者において葉の発育をより大にするため使用することができ、葉身及び茎の枯れが少なく、＃栢第１１１Ｏ，ｌにおける果実発育の機会が増大し、移植前の木の刈込みが減少し、かつ重要なことには植物の干魅に耐える能力を増大させる。同じ利点を植物の切除物についても誘起させることができ、この場合切茎を充分な根の発育が生ずるまでミストベンチ（ｍ１ｓｔ　ｂ＠ｎｃｈ　）に入れる。この場合、本発明の実施によって単位時間当りより多い根の発育を期待することができる。さらに本発明を、移植過程でショックを受けることが周知されているたとえば樹木のような大型植物の移植にも使用することができる。切板を介するＡ・リゾゲネスでの形質転換を使用して根の開裂位置における新たな根の急速発育を促進させ、樹木による充分な水分吸収を可能にし、落葉及び樹木の死滅を防止するのに使用することができる。要するに、この処理を使用して植物の活力を増進させることができる。

最後に、根の損傷若しくは病気を受けた植物もＡ・リゾゲネスでの処理により利益を受け、新たな根の急速発育を促進して、退化を防ぐことができる。

本発明の潜在的利点にもかかわらず、Ａ・リゾゲネスは土壌の病原体と見なされている。この場合、その作用は、Ａ・ラジオバクターの使用により除去し或いは非怒染性レベルまで減少させることができる。現在、Ａ・ラジオバクターに−８４が好適である。Ａ・ラジオバクターに−８４は、アグビオケム・インコーポレーション社（カリホルニャ州９４５６３、オリンダ、３７リートウツドコート在）により培養されかつ威光されている。星に形質転換植物を、好ましくは約１０７ｉｍ＋　／　ｍｅより高い菌体濃度で存在するＡ・ラジオバクターの水溶液中に数秒間のみ浸漬して、活性人・リゾゲネスを効果的に消滅させることができる。

より便利には、これら２柿を共通の形質転換植物で組み合せることができる。少なくとも約４：１、好ましくは約４：１〜約８：１のＡ・リゾゲネス対Ａ・ラジオバクターの菌体比で存在させると、形質転換は活性Ａ・リゾゲネスの残留菌を植物中に残すことなく生せしめることができる。この場合、Ａ・リゾゲネスのみを使用する場合と同様に、形質転換は受容植物領域を形質転換微生物に対し露出することを必要とする。しかしながら、Ａ・ラジオバクターは、形質転侠過棉會阻否するとは思われない。

これら微生物に対し、ビートが侵透な宿主となることが判明した。微生物は、便利なキャリヤかつ有効な処理培地として作用するほぼ中性乃至アルカリ性（ｐＨ）のビートにおいて増殖することが判明した。凍結乾燥も使用することができる。ビートを使用する場合、Ａ・リゾゲネスを人・ラジオバクターから分Ｐｊｔシておき、かつこれらを担持するビートを使用の時点で混合する。

以下、実施例により本発明を説明する。地中への移植に関連し、特記し゛ない限り、移植はアメリカ合用国、モンタナ州における通常の移植季節に４５並列として行な８高さ平均４〜５フイートの探検プラムトリーの根に句をつけ、次いでＡ・リゾゲネスＴＲ１０５（ワシントン州９８１９５、シアトル在、ワシントン大学、デパートメント・オブ・マイクロルバイオロジー・アンド、イミュ／Ｃｌジー、ネスター博士により提供）で処理し、コノ場合植物の傷ついた偽域を１−当つ約９Ｘ１０Ｇ（１，５の菌体懸濁濃度にてＡ・リゾゲネスを含有する溶液中へ２４時間浸漬した。比較根は水中のみに浸漬した。処理槽物及び比較植物を移植時点まで４０下で貯蔵し、次いで野外における土壌／バーミニキュライト１：１の混合物に移植した。これら樹木に対し３日置きに９日間潅水し、次いで根の光宵に笈し天然降雨に頼った。約３０日間の後、これら植物を静かに土壌から取り除き水でゆすいだ。新たな根をビンセットで古い根から抜き取り、次いで乾燥しかつ秤量した。それらの結果を第１’Ｐ＜に示す。

第１表新たな根の重凰実施例　形質転換植物（２）　比較例　（２）１　．０２５　Ａ　’　、００４２　．０１８　Ｂ　、００９５　．０１９　Ｃ，０１４ｘ　、０１９　’　ｘ　、００８有意差はＱ、１のレベルである。

９１情［Ｉ肛０７５００Ｇ５２　（４）実施側５〜８及び比￥ｉヤリｇ〜Ｈ実実施へ〜４及び比較１２ＩｉＡ　−Ｄに使用したものと同じ原料からの他のプラムトリーを同様に処理したが、葉の発育につき測定した。測定は、それぞれ夏の終り及び約２週間後に行なった。それらの結果を第１表に示す。

第１表処理と比較との間の全ての差は、ａ０ルベルにて有意である。

実施例６〜１１及び比較ガニ〜に株根原料から採取した平均高さ約４フイートのアーススタ一種のチェリートリーを根に傷つけて、処理用及び比較用とした。実施例１〜４０手順にしたがい、溺つけた根を１−当り約ｔ　６’Ｘ　１０１１１個のＡ・リゾゲネスＴＲ１０５の菌体を含有する溶液で形質転換させ、１晩浸Ｕ′ｌし、かつ暗所で１８日間冷貯蔵した。移植精通の早期に０移植を行なった。形ｆＩｔ転換′Ｎｉ物は、発芽の５日後に開花した。比較は開花までさらに１０日間を果した。移植後約４５〜５０日で形質転換植物についてはチェリーが観察され、かつ葉、茎及びチェリーの計数を真夏に行なった。有意差０．０５レベルにて形質転換植物対比較植物の比較、葉の枚数、チェリーの個数、枝の数、枯れ及び集の長さを観察し、これら結果を第■表に示す。第１図は移植後約４５日目の比較植物の写真である。第２図は第１図に示した植物と同じ成育条件に露出したが、ただしＡ・リゾゲネスを用いて根の成長を促進した形質転換植物の写真である。明らかな相違点の外に、さらに根の突起部形成も見られ、これは翌年の成長において高度の花及び根の発育を示すものである。

第■表実施例１０　７０７　９　５／１４　６実施例１１　５９３　０　１１０７　６実施例　Ｉ　０　０　１ｓ／１ｓ　− 実施＠Ｊ　３５１　０　１０／１６　４．５実施例　Ｋ　５７４　０　６／１０　２．５翌年の成長季節において、処理植物は未処理若しくは比較植物よりも数倍多瀘のチュリーを生産した。

アグロバクテリウム・リゾゲネスＴＲ１０５の分法した単一コロニーを根の発育程度における変化が観察されるまで毛根円盤でスクリーニングすることにより、Ａ・リゾゲネスＡＴＣＣ５９２Ｑ７をアグロバクテリウム・リゾゲネスＴＲ１０５から誘導した。処理溶液はアグロバクテリウム・リゾゲネスＴＲ１０５につき１ｍｇ当り２．１Ｘ１０”（固の菌体濃度で作成し、比較溶成はＡ・リゾゲネスＡ’ＴＣＣ５９２０’７につき１ｍｌ当り４　Ｘ　１０’個の菌体濃度にて作成した。これら毛根円盤を、毛根円盤１個当り０．１ｍｌの濃度で処理し、かつ室温で３週間培養した。根の形成程度の結果を第■表に示し、かつ第３図に図示し、それらの説明は前記した通りである。

第Ｎ表毛根＃１　毛根＃２　毛根＃６　毛根＃４Ａ、リゾゲネＸＴＲ１０５，００２５，００５４，００００，０００６，００１０，００１５，００６０、 σ００３．００１１　．０００９　．００３７　．００１６．００３０　．００２７　．００２０　．００ｊ６．００４３　．００１５　．０００３　．０００９．００７６　．００２７　．００１７　．０００９．００３０　．０００１　．００５４　．０００１．００５３　．００４４　．００４２　．００１２．００Ｂ０　．００４６　．００１３　．００１６．００９６　．００２１　．００４７　．０００５ｘ　、００４０　．００２６　．００２７　．０００９Ａ、リゾゲネスＡＴＣＣ，９２０７，００２４，００００，０００１、，０ＧＯ１ｌ＋、０１０１　．０００３　．００１５　．００１３．００３６　．００　１０　．００２２　．０００３．０１１３　．００１２　．０００７　．０００６．０１１８　．００６３　．００１２　．０００５．００９３　．００１８　．００３５　．００２７．００７８　．０００４　．００５８　．０００２．０１２３’、００３４　．００１９　．００３１．０１２７　．００３５　．００１１　．００１０．０ＱＯ６，００５？　、００５１　．０００２毛根扁１に対するデータＸは、０．０５レベルにてＴＲ１０５とＡＴＣＣ３９２０７とで相違している。

上記の試験において、―体密度は毛根円盤表面１ｆｔ２当り約１６０個とした。

植物が優れた発根体となる可能性を有する場合、Ａ・リゾゲネスＡＴＣＣ３９２０７は根の乾燥重量を少なくとも２倍にし、その他の相違は見られない。Ａ・リゾゲネスＡＴＣＣ３９２０７は、メリーランド州２０８５２、ｐツクビル、１２３０１パークローン、ブイストリフト在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されており、最初に同定番号アグロバクテリウム・リゾゲネスＭＴ２５２が付与された。

アボカド基の長さ１０〜１２ｃＩｎ切除物を比較（８０個の試験植物）及び形質転換用（１００個の試験値物）として使用した。これら植物を形質転換させるため、切除物を１０９個／耐の菌体濃度にてＡ・リゾゲネスＴ　Ｒ１０５を含有する懸濁液に１５分間浸漬した。これにより、形質転換を達成するのに充分な菌体の接槙を確保した。切除物を４０重型頭パーライトと６０重Ｎ％ビートとの光種混合物に移植した。（７］除物をクラウド９７オンギング系（ｃｌｏｕｄ　９　ｆｏｇｇｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ　）ミストベンチに載置し、日中のみ（１６時間）にわたり１０分間毎にミストを施こした。移植してから２ケ月後、８０個の比較植物のうち５個が生存して葉及び根を形成したのに対し、１００個の形質転換植物のうち６１個が生存して葉と根を彫或したことが確認された。

実施例１４及び比較例Ｎ下記により、Ａ・リゾゲネスが植物性繁殖する植物における根の発育を促進するのに有効であることを確認する。バイオレットの葉を有する茎の切除物を１　ｍｌ当り約１０９個の菌体濃度におけるＡ・リゾゲネスの懸濁液に浸漬し、そして根が生ずるまでミストベンチに載置した。

この場合、比較種物は１植物当り根の発育が平均α００２りの乾燥型ｉであったのに対し、形質転換切除物は乾燥重量基準で１植物当り平均ｏ、　ａ　ｏ　ｓ　ｔの根を与えた。これは有意差α１のレベルである。これらの観察を、ミストベンチに載置してから２週間後に行ない、それらの結果を第Ｖ表に示す。

第Ｖ表：バイオレット茎の切除物で生成した根の乾燥重量、００１５　．００４５．００４２　．００３　Ｂ、００１　ｆ　、００４０．００５４　．００６５．０００２　．００３０．００２０　．００２８．００１０　．００５６．００２２　．００５４．０　０　１　４　．０　１　０　３．００１２−　．００２６．００１２　．００５４、ＯＤ　０４　．００６４．００２５　．００５６．０　０　２　５　．００８６ｘ＝　、００２０　ｘ：　、００５０長さ約１０謂のマンゴ切除物を、その下部７ｃＩｎを１−当りＡ・リゾゲネスの菌体７Ｘ１０５＠を含有する菌体魅濁液に浸漬して形質転換させた。各試験につき４０個のマンゴ切除物を使用した。これら形質転換切除物と比較とをミストベンチに載置し、かつ７０〜８０下に保った。

比較例の場合、切除物の４１０′ｌＩニア　５％が植物を発現したのに対し、Ａ・リゾゲネスで処理した切除物は７９士７％を植物に発育させた。

実施例１６ノーススターチエリ−に対する実施例６〜１１及び比較例の手順を、翌年の成育季節に反復した。これにより同様な結晶が得られた。実施例１６の処理樹木は、第■表に示すように未処理比較よりも数倍多血のチェリーを与えた。

第■表０　１６１２０−における直径約ｔｏ−の寸法の採機植物とした。

茎長さは約４０ａｍであった。処理植物及び未処理植物（比較）を５月１３日〜１７日に移植し、１０日間毎に４時間にわたり２１／ｂｒ、の割合で全１ｋ２ｏｔ／ｉＴＡｍ１本として潅水した。毎月、潅水を１０％増量した。使用した肥料は６％Ｎ、６％Ｐ、６％に十微量要索であり、各潅水の際に５０〜１００　ｐｐｍの濃度で施こした。殺虫剤は使用しなかった。

移植してから２〜３ケ月後、次の測定を行なった：地上２０ｃｒ＋＋における幹の直径、葉／松物の数、及び新たな枝（５群の平均値）の長さ。１測定につき２０〜２５本の樹木を使用し、それら結果を第■表に示す。

第■表葉の数　幹の直径　新たな茎の長さ処理　１０４９±１３４　１８±α１９　６４±８４比較　６２２±１３４　１４土α１７　４１±ａ１処理と比較との間の全ての差は、１００ルベルにて有意である。

実施例１８実施例１〜８に記載したと同様にプラムトリーを移植してから１年４ケ月後、移植時点でＡ・リゾゲネスを接種したプラムトリーのりシス７アア（ｒｈｉｚｏｓｈｈｅｒｅ　）及びリゾプレイン（ｒｈｉｚｏｐ）ａｎｅ　）からＡ・リゾゲネスを集めるよう試みた。土壌の試料を各樹木の根領域から採取し、これをアゲ四バクテリウム選択培地に接種した。

２７℃にて２日間後、菌体増殖を示す各プレートからの８個の異なる領域を毛根円盤に施こした。かくして、各樹木からの土壌は１６個の試料（８個のりシス７エア及び８個のりシブレイン）を有した。２週間後、これらの円盤を発根につき検査した。

４個の未処理樹木（比較）からの土壌は、選択培地に入れると、毛根円盤に対し発根傾向を生じうる微生物をシスフェアからの３６回の試験と、リゾプレインからの３６回の試験である。接種樹木において、５本のうち３本がＡ・リゾゲネスを示した。１例において、１本の樹木のりシスフェアから得た８個の円盤のうち３１１ｉ′１が陽性であったのに対し、リゾプレインの土壌は陰性であった。

他の樹木において、リゾスフェアからの８個の毛根円盤のうち６個が陽性であり、かつリゾプレンからの８個のうち３個が陽性であった。他の例においては、８個のりシブレイン試料のうち１個が陽性であった。

域から回収しうるが、これはりシス７エア土壌に比較的制限されると思われる（これは根の表面に付着した部分である）。実施困難であるため、土壌１２当りの感染性菌体の個数は測定しなかった。

性質の発根宿主植物（毛根）にＡ・リゾゲネスを感染させるのに充分なＡ・リゾゲネスが根の領域に存在するかどうかを測定する手順を行なった。５月の終りに人参種子を、処理及び比較樹木の主茎から１０〜１０Ｃ１ｃｒｎに蒔いた。９月の始めに、人参を土壌から注意しながら抜き取りかつ水でゆすいだ。それらの結果を第１表に示す。

第１表５５　０これらの結果は、１季節にプラムトリーの根に接極されたＡ・リゾゲネスが次の季節における幾本かの樹木の根に存在するが、正常に感受性であり性質の発根植物、すなわち人参の根に感染するには充分な蛍でないことを示唆している。

実施例１９及び比較例Ｐ水１〇−当り混合物１ｆの水性スラリーにて４：１の重量混合物としてＡ・ラジオバクターと混合したＡ・リゾゲネスＡＴＣＣ３９２０７を使用し、コシヨー植物（ヨモワンダ一種）を発根させた。植物の根糸を洗浄し、形質転換用スラリーに１時間入れた後、野外に移植した。

第■表は、移植してから４６日後に５本の植物につき行なった観察を示している。

長さ５のにわたるコシヨーの初期高収重に、早ｍしの経済的利点を与える。

第■表比較１　３五００　４０．０　５　０　２９．０４　５２．００　５＆０　５　４　１２５．０５　４２．００　４９．０　７　２　９１０８　３９．３０　４９．０　５　１　１８．５処理２　５α０　５五０　１９　８　２６６．０３　５２．０　５／ｌｏ　１２　９　３７９．０６　４２．０　４＋Ｓ、０　３　２　１２ｔ０７　６２．０　６五〇　５　２　８７．０１プロット当り全部で１０本の植物を用い、移植してから第Ｘ表に示した日数の後に第Ｘ表に示したような観察を行なった。最終の収穫により、比較植物は重量収率において形質転換植物に匹敵した。

（１）洗浄根糸を水で置換して得られる。

（２）根糸のすぐ上の第１成育リングで得た測定値。

（３）全フシミーは、根の発育検査を犠牲にした植物から集めた。

第Ｘ表（１ブｐット当り植物１０本）１　’２．ｏ６　１Ｂ　２．４４　１６　２．ｏ’　１４４　１３７　９　五０　２１　１１５　２２５　ｔ６７　１０　５．０　２０　ｔｏ　１０８　ｔ　’ −６９１【処理２　２．５１　１９　五〇　１７　１．５（Ｓ　２０３　ｔ５０　１４　４．１５　１８　ｔ５６１６６　ｔ６９　１１２．３１　、ｊ２．　ｔ２５　１４７　Ｂ　８　五９４’　１９　２．５０　４５１　４５　４Ｂ　２　６．８７　５６４　７．５　５２　６Ｚ１９　４８５　７３７　４０　６　５．２５　３７８　４９５　５５　７　７．２４　７２大合計　２！Ｌ３２　１９５　大合計　２６．５５　２１３（１）　収穫した市販しうる寸法のみのコシヨー（２，５インチ若しくはそれ以上）。

（２）　全てのコシヨーは１０／１　！１〜１４／８！ｌにおける死滅霜を予期して収穫した。

実施例２０ツウシンバラ、キャベツ、香味タバコ及び菊を含む実験は、確定的でない結果を与えた。しかしながら、ライラックはよく反応し、その結果を第ＸＩ表に示す（有意差α１４）。

第Ｘ１表３９　１　５１１　２Ａ　１　０９ビートで作成しかつ２６±３℃で貯蔵した場合のＡ・リゾゲネスＡＴＣＣ３９２０７の持合を測定した。ビート１２当りの経時的な生存菌体数を第別表に示す。

第Ｘ■表作成時　１５ケ月後　３ケ月後　１０．５ケ月後３、ｌＸ１０ａ２．７Ｘ１０’ 　１１Ｘ１０’　２．０Ｘ１０７実施例２２土壌レベルより５．０側上方にて茎高さ５０！かつ直径α６０ｃｍの線板のオリーブ植物を、Ａ・リゾゲネスＡＴＣＣ３９２０７を用いて形質転換させた。他のものは比較として使用した。これら全てを砂漠へ６月に移植し、そして実施例１７にしたがって潅水しかつ施肥を行なった。

移植してから６ケ月後、第Ｘｌ１表に示す測定を行なった。

第Ｘｌ１Ｉ表茎直径（Ｃｒｎ） α９１　ｔ６４　ＺＯ５ｔ２７　ｔ１７　２．００１２５　１８８　２、００ｔ４０　ｔ５９　ｔ６５１３５　２．００　１５０ｔ　３０　ｔ　５５　２．２０ｔ４２１７０ｔ５５６０．５０．７０．４０７０．７５．６８．７２９５．７８．８６．１００６０．４８．６７．６８６５．５８．７８．７２８５．９５．７８．８゜６２．５０．４２．４５　１１０．８０．７８．９４１３０，１１０，１２０，１００６５．５５．７５．８１１００．１１０．９０，８８　１１０．１００．９０．８０４０．２５．５０１３５７５．８０．８２．９０９０．８０．７０．７０７０．６０．５５．４５１００．９０．１００．９５　１００，１１０．９０．８０６５．６０．４０．４５７０．８０．７２．８５　１００．１００．９０．８０（ニー１（、ＨＦＩＧ、　２国際調査報告第１頁の続き

Claims

【特許請求の範囲】ｔ　アゲ四バクテリウム・リゾゲネスＡ　Ｔ　ＣＣ３９２０７゜２、（ａ）　双子葉植物を遺伝形質転換させて根の成長を増進させるのに充分な濃度で菌体の水性懸濁物を生成するのに充分な濃度にて供給される桜島発性Ａ・リゾゲネスと、Ｃｂ）　Ａ・リゾゲネスを実質的に非感染性にするのに充分な量のＡ・ラジオバクターとからなることを特徴とする消和に根を成長させるための双子葉植物の遺伝形質転換用組成物。 ′５．Ａ・リゾゲネスとＡ・ラジオバクターとを別々の単位として含ませ、その少なくとも１方をビート中に存在させる請求の範囲第２項記載の組成物。４、　桜島発性Ａ・リゾゲネスをその菌体の水性懸濁物を生成するのに充分な少なくとも約１０７個／ｄの菌体濃度で存在させ、かつＡ・ラジオバクターをＡ・リゾゲネス対人・ラジオバクターの菌体比が少なくとも約４：１となるような１ −当りの菌体濃度で存在させる請求の範囲第２項又は第３項記載の組成物。５、Ａ・リゾゲネス対人・ラジオバクターの菌体比が約４：１〜約８：１である請求の範囲第２項乃至第４項のいずれかに記載の組成物。６、Ａ・リゾゲネスがＡ・リゾゲネスＴＲ１０５からなり、かつＡ・ラジオバクターがＡ・ラジオバクターに−８４からなる請求の範囲第２項乃至第５項のいずれかに記載の組成物。ＺＡ・リゾゲネスがＡ・リゾゲネスＡＴＣＣ３９ｇ、０７からなる請求の範囲第２項乃至第５項のいずれかに記載の組成物。８、Ａ・ラジオバクターがＡ・ラジオバクターに−８４からなる請求の範囲第７項記載の組成物。９　内鞘を露出させた双子葉植物の根を桜島発性Ａ・リゾゲネスの形質転換作用に、根の成長を増進させるべく双子葉植物を形質転換するのに充分な時間接触させ、かつこの植物を前記Ａ・リゾゲネスを実質的に非感染性にするのに充分な時間にわたりＡ・ラジオバクターと接触させることを特徴とする双子葉植物の遺伝形質転換法。１［ｌＬ　内鞘を露出させた双子葉植物の根を、少なくとも１０１〜の水性懸濁物と均等な濃度で桜島発性Ａ・リゾゲネスを存在させた培地中でＡ・リゾゲネスの作用に少なくとも約２０時間接触させて充分に双子葉植物全遺伝形質転換させると共に根成長を増進させ、次いでこの植物を約１０７個／ｗｔの懸濁物に等しい菌体濃度でＡ・ラジオバクターを存在させた培地中のＡ・ラジオバクターと、前記入・リゾゲネスを実質的に非感染性にするのに充分な時間にわたり接触させることを特徴とする双子葉植物の遺伝形質転換法。１ｔ　Ａ・リゾゲネスとの接触が少なくとも約２４時間である請求の範囲第１０項記載の方法。１２、Ａ・リゾ、ゲネスがＡ・リゾゲネスＴＲ１０５又はＡ・リゾゲネスＡＴＣＣ３９２０７からなる請求の範囲第９項乃至第１１項のいずれかに記載の方法。１３、Ａ・ラジオバクターがＡ・ラジオバクターに−８４からなる請求の範囲第９項乃至第１２項のいずれかに記載の方法。１４、培地が水性でありかつＡ・リゾゲネスとＡ・ラジオバクターとを水性懸濁物として含有させ、Ａ・リゾゲネス対人・ラジオバクターの菌体比が約４：１〜約８：１である請求の範囲第９項乃至第１３項のいずれかに記載の方法。１５、Ａ・リゾゲネスとＡ・ラジオバクターとを別々の単位として”供給し、そ、の少なくとも一方をビート中に存在させる請求の範囲第９項乃至第１４項のいずれかに記載の方法。