JPS59500747A - 新規な氷晶核形成微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝的進化は自然界における生物学上の莫大な可能性を与えてきている。種々の 生物または細胞は広範な種かの蛋白質を生産することによりこれらの種種の機能 を果たしているが、これら蛋白の多くがまた広範な種類の非蛋白質分子を生産す ることができる。これらの天然化合物類がそれらの環境と相互に作用して良かれ 悪しかれ環境を部分的に１変更してゆくことができる。

ある種の微生物が氷の形成の核となり得ることが発見された。氷晶核の形成は植 物の霜害の誘発、大気の降水過程および商業的人工雪の製造における１因子とし て商業的にかなシ興味のあることである。

それ故、微生物の氷晶核形成能力を制御したシ、またはそのような核形成能力を 有する生成物を生産することができるならば、それを農業、商業、リクリエーシ ョンあるいは環境などの広範な分野に活用することが可能である。氷晶を形成す る微生物を水の過冷却を防ぐために使うことができる、即ち人工雪製造機械に、 アイスリンクに、あるいはその他の過冷却がむだなエネルギー消費となる場所に 使用する氷晶核形成におけるバクテリアの効果に関して種種の論文が発表されて いる。例えば、Ｌｉｎｄｏｗ等、Ｐｒｏｃ、Ａｍ、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ、Ｓ ｏｃ、（１９７７）　４．１９７６　：　１６９；Ａｒｍｙ等、Ｎａｔｕｒｅ（ １９７６）２６２　：２８２−２８３：Ｌｉｎｄｏｗ等、Ｐｈｙｔｏｐｈａｔｈ ｏｌｏｇｙ（１９７８）６８：５２３−５２８；Ｌｉｎｄｏｗ等ＸＡｐｐ１．Ｅ ｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　（１９７８）　３６　：８３１−８３ ８　：　Ｌｉｎｄｏｗ等、Ｐｒｏｃ、　Ａｍ、　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ、　Ｓ ｏｃ。

（１９７７）　３．１９７６　：２２４を参照のこと。まだ米国特許第４，０４ ５，９１０．４，１６１．’０８４　オｊび４．２００，２２８も参照のこと。

さらに捷た、１９８１年８月２０日付同時係属出願第２９４，６０４号およびそ の引例も参照されたい。

発明の要約 氷晶核形成活性を持つ物質をコード化しているＤＮＡ配列が提供される。その配 列はＤＮＡ配列供給源と異なる宿主の中でクローン化されかつそのような宿主に 氷晶核形成活性を与えることができる。ＤＮＡ配列、プラスミドおよび形質転換 体が述べられている。

本発明は氷晶核形成活性（ＩＮＡ　）のためにコード化しているＤＮＡセグメン トの分離を提供する。そのＤＮＡセグメントは適当なベクターに導入され得るも のである。ベクターはプラスミド、ウィルス、またはＩＮＡ活性を単細胞微生物 宿主へ導入するだめの接合、形質転換、形質導入またはトランスフェクンヨンに 使用される他の自己複製染色体外因子であってもよい。次に、宿主が増殖し、ク ローン化し、そしてＩＮＡ＋クローンが分離されるであろう。ＩＮＡ陽性のクロ ーン、亜細胞部分またはそれらからの抽出物は人工雪製造に氷晶核形成において （米国特許第４．２００，２２８参照）、ＩＮＡコード遺伝子によってコード化 された蛋白の供給源として、前記遺伝子の発現から生じる他の細胞物質の供給源 として、あるいは水の過冷却が望ましくない他の場所において使用することがで きるであろう。

ＩＮＡをコード化しているＤＮＡ配列を得るために氷晶核形成のできることが知 られているある微生物をる微生物をケ８ツムライブラリーの調製のだめの供給源 として使用することができる。完全またはイ、完全消化によって２５ｋｂｔでの セグメントを供給する種種の制限酵素を使用できる。次に、これらの断片はクロ ーン化することができよう。

相異なる特異性を有する種々のベクターを使用できる。機能的自己複製染色体外 因子を提供するために、ケ゛ツムライブラリーからの断片の挿入を許すシラスミ ド、ウィルス丑たはコスミドが使用できる。

それ故、ベクターはケ゛ツムライブラリーからの１新片を都合よく挿入させる好 都合の’＋ｆｉｌｌ限部位を１１つべきであり、あるいはそういう部位を導入で きる必要かある。望捷しくは、ベクターは抗生物質的ユバ択、・ぐッケージング 要件、遺伝子の不活化などによる選択および／−！、たはふるいわけの手段、あ るいは他の手段を備えるべきである。

％　Ｋ　興味あるのはコスミドベクター、とりわけｐＬＡＦＲ］で、これは唯一 のＥｃｏＲＴ部位を有している。このベクターはベクターｐＲＩ（２９０（ＴＣ ｒ）の誘４体であリコゞコピーベクターで、そこては唯一のＥｃｏＲＴ部位がそ のＴｃ遺伝子の外側にある。ｐＲｒ＜　２９０には挿入失活のだめの選択まだは ふるいわけはない。しかし、ｐＬＡＦＲ１誘導体は、パッケージングか挿入物を 自動的に選択するので、非常に役に立つか、そこで（１挿入物の長さは約２０　 ｋｂ±］、　Ｏｋｂである。

ベクターの選択に依存して、ＩＮＡをコードするＤＮＡ配列を、バクテリア、真 菌、酵け、藻プ、原虫類なとを含む広範ＵＩ％の単細胞のでψ生物宿主中に導入 することができよう。宿主の選択（４、ベクターの入手可能性、宿主の中へＩＮ Ａを導入する目的、２よび宿主を使用する方法によってき丑るであろう。

ベクターの性質によって、種々な技術がベクターおよびＤＮＡ挿入物を宿主の中 −＼導入するために使用できよう。形質転換は適当々（８媒中でカル／ラムによ り沈澱させたＤＮＡを使用する従来の方法で達成することができる。トランスフ ェクションは、栄養培地で、細胞を修飾ウィルス捷たはそのＤＮＡと接触させ、 ＩＮＡコードの配列の一体化に応じて細胞のトランスフェクンヨン丑たはトラン スダク７ヨン（形質導入）を起させることによって達成されよう。接合も使用す ることができ、その場合フ０ラスミドを１つの生物ＶＣ導入し、それが次にその シラスミドを自ら移動可能か剤たは移動するプラスミドと一緒に々つて移動可能 な他の微生物へ伝達することができよう。

ゲノムライブラリーからの外来中ＤＮＡを受け入れる生物の分前ＶＣおいてはＴ ＮＡ−の微生物を使うことが望ましい。それによって生じるＩＮＡ＋であるクロ ーンは、その微生物に導入されたＩＮＡをコードするＤＮＡ配列を既に持ってい ることになる。多くの微生物は自然にはＩＮＡ能力を持っていないので、ｒＮＡ 能力を示すクローンがあれば既にＩＮＡのためにコード化され、でいるＤＮＡを 受けているにちがいない。

さて今やＩＮＡをコードする遺伝子を以前ＶＣ氷晶核形成能力を示さなかった微 生物に移植できることが示された。これらの微生物は今やＩＮＡ活件のためのＤ ＮＡセグメントをスクリーニングするために使用することかできる。クローンは 簡単な技術でスクリーニングできる。即ち、適当な固体普通培地上で平板培養し たコロニーをビロードの当て布に移し、それヲｉｔいパラフィン層で予備被覆を したアルミ箔ノートの上にレフ０リカ転写する。そのノートを零度以下の温度に 予め冷却した循環アルコール浴の表面に置き、その／−トの上から水を噴霧する と、微小水滴が細胞に接触すると正によって、ＩＮＡ’−細胞に、その微小水滴 を凍らせてＩＮＡ集落に霜におおわれた外観を与える。この方法で、ＩＮＡ集落 を同定することかできる。

ＩＮＡ活性をコードしている遺伝子にＬ約１　（ｌ　ｋ＋）以下の一中一断片十 に位ｔ６“できることか見出たされ／（。かくして、ＩＮＡと関係ある遺伝子は 染色体の多くの異なった部位に分布しているのてｄ］ないし、苔だそのような遺 伝子によってコードされている生産物は、氷晶核形成活性を有する天然の微生物 に関連する特有の性質の膜をＩＮＡ活件のために必要としないことが見出された 。さらに、氷晶形成能力はマルチコヒ０−（多重複写）ベクターを使用すること によって高められ、氷晶核形成活性（・寸ＩＮＡをコードしている遺伝子の高め られた発現と関係つけられると腎、われる。

不発【’Ｊｊを説明するだめに次の実験か行われた。

ＩＮＡをコードしているＤＮＡの供給源として３踵の（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｈｃｒ ｂｉｃｏｌａ　）　（］　ｉ；ｉ、２６５Ｒ６−２）である。

それらの１゛１゛、１１朱からＴ）ＮＡを拓１ｉ１ｉ　Ｌ、Ｊ１雇化セシウム− 臭化エチノウ−！、の雷電勾配遠心を２サイクルすることによって楯刺し、臭化 エチジウムを除き、適当フシ緩衝剤（ｃ　ｉＪ　して透＋Ｒシ、一部ｐ”、　ｃ 　ｏ　ＲＴ、で消ｆ１ｍ　Ｌ、５−２５■１−１１で１−蔗糖の勾配遠心（ごよ って分画した。部分積（Ｌは供給者（ＢｃＬｈｃｓｄａ　＋　Ｒｃｓｃａｒｃｈ 　１．ａｂｏｒａｔｏｒｉｃｓ　＋　Ｍｄ）の指木にｉｔ’ｆｉし）１１ｔ（ｌ のＩ）ＮＡ当−ｊｌ　ｆｌ、　’、：中６′・のＥ　ｃ　ｏＲｌ　５１＝ｉ：　 Ｉｔｌ　Ｌ、ぞの反応省−０５時間Ｆ’；２１（＝６５’Ｃて２分間加熱す；、 ）こ８ と（（よって止めた。蔗糖密度勾配遠心法によって得られたフラクションをアガ ロ〜スケ゛ル電気泳動によって分析し、１８−２５ｋｂ範囲の断片を多く含むフ ラクションをプールし、前もってＥｃｏＲｌによって線型化したコスミドベクタ ーｐＬＡＦＲ］に連結した。

（ｐＬＡＦＲはＳ、Ｌｏｎｇによって供給された）。

フ０ラスミドｐＬＡＦＲ１はベクターｐＲＫ２９０（Ｔｃ”）の読導体で生体外 パッケージングのだめのファージλのＣＯＳ部位を含んでいる。ｐＬＡＦＲ］は ｐＨＣ７９からのＢｇｌ、ＴＩ断片（Ｈｏｈｎ　ａｎｄ　Ｃｏ１１ｉｎｓ　、　 Ｇｅｎｅ　（］　９８０　）　］　］　：２９４−２９８）をｐＲＫ２９０のＢ ｇｌＩＩ部位に挿入することによって得られた。このフ０ラスミドはＴｃ遺伝子 の外側に単一のＥｃｏＲ１部位をもつ広い宿主範囲のオリコゝコピーベクターで ある。ｐＲＫ　２９０中には挿入失活のだめの選択呼たはスクリーニングはない 。しかし’、ｐＬＡＦＲ］誘導体はパッケージングのために最小の大きさの挿入 物を要求し、それ故長さ約１８−３０ｋｂの挿入物を自動的に選択するので非常 に役に立つ。

ｐＬＡＰ”Ｒ１中のＤＮＡ断片の連結は供給者の指示（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ　、　）に従ってＴ４　リガーゼを使用して達成される 。ベクターの２量化を最小にするため外部からのＤＮＡ断片の線型化ベクターに 対する比較的高い比率、約３−４：ＩＩ、が使用される。

約３−４μＩのＤＮＡ断片が１重ｇの線型化ｐＬＡＦＲ］につき使用される。そ れらのＤＮＡ断片は水で］ＯμｔＫした緩衝液中で連結され、６５℃で５分間、 ４２℃で３０分間加熱して後、室温に２時間放置した。アニーリングをした混合 物に］、　ｍＭのＡＴＰおよび１重位のＴ４リガーゼを加え、１２℃で夜通しイ ンキュベートした。

ＤＮＡ、〜Ｖｕ　ｃｄ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　、　 ｖｏｗ、　６８．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ　、Ｎ、Ｙ、　、ｐ、２９９−３ ０９　、　］、　９．７９に記載されている操作手順に従って行われる。おおよ そ３０　Ｉｌｌのλ−＼ッドと２０７ｔｔのλテイルを２０μｔのＩ　Ｍ　ＡＴ Ｐおよび５μＬの連結反応混合物に混合し５、それから生じる混合物を室温で１ 時間インギーベートした。その混合物に次に緩衝液］　ＯｍＭ　トリス、ＰＩ− （７，（３、］ＯｍＭＭｇＣｔ２を加えて、形質導入に使用されるファージスト ックを召ノだ。

形質導入は、０４係マルトースのルリア肉汁中で０、１　ｍｌのファージストッ クと０．５　ｍｌのＥ５コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＨＢ　１０１　（１０７−１０８ 細胞／　ｍｅ、中間対数増’ｔｌ　期）　全混合し、そして３７℃で１時間イン キ−ベートすることによって達成された。その混合物を２　ｒｎｌ’のルリ・ア 肉汁で稀釈し−こい　］、５７２時間インキ−ベートした。

それらの細胞はテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を補足した寒天培地（ルリ ア寒天）上にノ０レートして１−２日間平板培養した。

ｉ個の平板上のコロリーを、ビロードの当て布に移し、それを薄いパラフィンの 塗層で予め４％　ｍしたアルミ箔の上へレプリカ転写することによって氷晶核形 成活性（ＩＮＡ　）のためυてスクリーニングした。

それらの箔の端を上方に曲げ、−５°と一９°に９．ｊｌ“１節された循環アル コール浴の」二に置き、・Ｑラフイン晟ｔｌした箔の」二の細胞に微小水滴を噴 霧した。ＪＮＡ’πＩｌ＋胞と接触している微小水滴は凍って、、ＩＮＡ＋集落 ＆’ｔｃ　＠４のような外観を与えた。数ｆ固のＩＮＡ十年落を夫々のライブラ リーにおいて同定し、そして精製した。

温度に対する氷晶核のス波りトルまたはプロフィルが、パラフィン被覆を施した 盃１、族１．１節されているアルミニウムブロック上に多数のバクテリア含有水 滴（１０μＬ）を置くことによって測定された。そこでは温度を徐々に下げ（〜 ０２℃／分）、凍結する水滴の累積数を数える。水滴１個当りの細胞の数は系列 希釈によって変えることができる。各温度における凍結水滴の数から氷晶核の数 が計算され、種々の細胞濃度において温度に対してプロットされる。

氷晶核／細胞の対数を温度に対してプロットすると、通常−４°−ｍ−７℃の範 囲に１つと一９℃以下に１っ０２個のグラト−を示す。

プラスミドを含有しており、各プラスミド！ｉ　１４．Ｍの異なるＥｃｏＲ１断 片を持つかそのン０ラスミドの形成に使用されたベクターに相当する１１固の共 通の断片を有していた。ａ換えプラスミドのあるもの（ま、形質転換および／址 たけ移動（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　）によってＥ、ｃｏｌ：　（Ｓ　Ｋ　］ 、　５９２　）およびＨＢ　］、　０　］の甲−＼、てたそれらの形成Ｖて使用 されたｒ　ＤＮＡ供給源株」のＩＮＡ−変異２６ＳＲ６２）へ古人された。全て の場合にＩＮＡ＋の後代が得られた。上記の結果は、クローン化したＤＮＡ断片 が原株において■ＮＡ−ｆ−現型の発現をコードしており、そして異、１重のＩ ＮＡ−不田月復環境、し１１えばＥ、　ｃｏｌｉ、においてその表現型を発現で きることを説明している。

ある請゛殊々シラスミドｐＣ−１が分店さ、？１て、多くの実４験に使用された 。１）Ｃ−１はＰ、ンリンン°ヤーｃｉｔ　７株からの２３．２　ｋｂの部分消 化ＥｃｏＲ１断片を陰有しており、そしてｐＬＡＰ’］の唯一のＥｃｏＲ１部位 （Ｃ挿入さ：ｔ−ｂｃｉｔ−７のそれと比較したが、両スペクトルは本ｌ′↓的 に同一であることが判った。ｐＣ−１挿入物中の１０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片１つ がマルチコピベクターｐＢＲ３２５の唯一のＥｃｏＲ１部位においてサブクロー ン化された。

この部位はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子中にある。

その結果生じるプラスミドは、Ｅｃ　ｏＲＩ制限からｐｃｌＢＲｌと名づけられ 、ｐｃ−１に存在したそしてＩＮＡ＋表現型をＥ、ｃｏｌｉに与える単一のＥＣ ０ＲＩ挿入物（約１−０　ｋｂ　）を担持しているｐＢＲ３２５の期待される制 限断片を示した。２３℃（野生型菌株におけるＩＮＡの形質発現に最適の温度） およびンノヤーは３７℃では増殖しないけれども、２４℃以上の増殖温度は氷晶 核形成頻度を強く減少することが知られている。）細胞炉は２４時間および４９ 時間の増殖の後氷晶核形成頻度の測定をした（野生型ｌＮＡ４−菌株のＩＮＡ発 現は増殖サイクルの後期に大いに増加する）。下肥の表はその結果を示す。

第　１　表 Ｅ、ヘルビコフ　２６ＳＲ６−２５，２４７Ｅ５　７．２７Ｅ２Ｅ、コリＨＢＩ ＯＩ　−−Ｏ０ ＫＢＴｃ（１５μＥ／／ｍｅ）−４たはＫＢ”上４８時間培養菌（Ｋ　Ｂ　＝キ ンゲスＢ培地） おけるＩＮＡ活性の発現は野生型菌株におけると同様な温度と時間の支配下にあ る。（２）マルチコピーベクター中のクローン化は結果としてかなり大きな氷晶 核形成頻度を生じさせる（即ち比較的かなり多くの割合の細胞が活性な氷晶核を 含有するという結果になる）。これらの実験に基づいて、この効果をクローライ し遺伝子のより効果的な発現を結果として生じる「コピー数効果」Ｃでもつはら 帰することはできなイＬ　（ＥｃｏＲ１断片（！：　ｐｃｌＢＲｌ　ｔｒｉ、ク ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードしているｐＢＲ３２５ の配列の中に挿入されている）、またはｐｃ−ｔからの活性断片をサブクローン 化する間のりプレッザー型調節因子の除去に帰することもできない。

Ｅ、コリ）（Ｂ　１０１　（ｐｃｌＢＲｌ）におけるＩ’ＮＡの発現水準は２細 胞数／核数であるが、これは測定法の限界！／Ｃあるかそれに近い。

上記の結果から、氷晶核形成活性を以前はこの能力を所有していなかった広い範 囲の宿主に移すことができるということが明らかである。このことは、例エバマ ルチコピーベクターを使用して増大したＩＮＡの発現を得るために前記ＤＮＡ断 片をＩＮＡ宿主に導入することを排除するものではない。広い範囲の微生物およ び細胞の中に、単−形でもマルチコピー形でも、１だ染色体外に留まるとも組込 １れるとも、容易に導入されて、■ＮＡ＋表現型を与えることのできる比較酌小 さなりＮＡ断片が要求される。このようにして、広く種々の生態的地位を持つ微 生物類を、氷晶核形成を新しい環境および／−またけ高い効率をもってなすこと ができるよう変性することができる。

工ＮＡ発現に関して比較的効率の高い微生物はまた気象修正の用途に魅力ある候 補者である。

前述の発明は理解を明確にするために説明と例示によっである程度詳細に述べら れたが、付記する請求の範囲内においである程度の変更および修飾を施してもよ いことは自明てあろう。

国際調査報告 第１頁の続き ０発　明　者　リンドウ・ステイーブン・イーアメリカ合衆国カリフォルニア９ ４７０９バークレイ・バージニア２０１８ ０発　明　者　バノポウロス・ニコラス・ジエイアメリカ合衆国カリフォルニア ９４６１９オークランド・ベルファースト・ストリー）−４７９２ ０発　明　者　スタスカウイツツ・ブライアン・ジョンアメリカ合衆国カリフォ ルニア９４５４６カストロ・バリイ・アーモンド・ロート１９１２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　氷晶核形成活性物質をコードしているＤＮＡ配列を細胞または細胞の親に導 入する結果として高い氷晶核形成活性を有する該細胞。 ２　該細胞が原核細胞であシ、かつ該ＤＮＡ配列が該細胞に関して異種の供給源 からのものである請求の範囲第１項記載の細胞。 ３、該細胞が真核細胞てあり、かつ該ＤＮＡ配列が該細胞に関して異種の供給源 からのものである請求の範囲第１項記載の細胞。 ４　該ＤＮＡ配列が染色体外遺伝因子に基づくものである請求の範囲第１項記載 のＩｉｌ′ｌｌ胞。 ５　該ＤＮＡ配列が該染色体中に組込−ｉ　ｔ−ｔでいる。請求の範囲第３項記 載の細胞。 ６　氷晶核形成活性を翁するＥ、コ！Ｊ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）。 ７、　該氷晶核形成活性が染色体外遺伝因子に担持された遺伝子から生じるもの である請求の範囲第６項記載のＥ、コリ。 ８、氷晶核形成゛活性をコードしている約］Ｏｋｂ以下のＤＮＡ配列。 ９、　該配列がシュードモナス（、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）のオΦまたはニ ルクイニア（Ｅｒｗｉｎｉａ　）の種またはギザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏ ｎａｓ　）の種から由来するものである請求の範囲第８項のＤＮＡ配列。 １０　完全なレゾリコン見・よひ、請求の範囲第８項記載の発現用能なりＮＡ配 列を有する機能性自己複製ゑ包体外遺伝因子。 １１　該レゾリコンか原核細胞宿主によって認識される請求の範囲第１０項記載 の遺伝因子。 １２　該ＤＮＡ配列がンーードモナスでたけエルウィニアに由来する請求の範囲 第１０項または第１１項のいずれかに記載の遺伝因子。 １３　細胞の氷晶核形成活性を高める方法に２いて、該細胞中に氷晶核形成活性 のためにコードしているＤＮＡ配列を、該ＤＮＡ配列を発現くしめる条件の下（ で・［ｊ・−人し、該ＤＮＡ配列を含有する細胞を増殖せしのることを特徴とす る上記の方法。 １７１　該ＤＮＡ配列がシラスミド睡入物であり、かつ該）０ラスミドの１部と して形質転換によって導入される請求の範囲第１３項記載の方法。 １５　該ＤＮＡ配列がコスミド挿入物であり、かつ該コスミドの１部として形質 導入によって導入される請求の範囲第１３項記載の方法。 １６　該細胞が氷晶核形成活性を欠いている原核細胞である請求の範囲第１３項 、第１　＝４項または第１５項のいずれかに記載の方法。 １７　該細胞が野生型菌株で氷晶核形成活性を欠く菌株に由来するものである請 求の範囲第１（３項記載の方法。 載の方法。 １９　水性媒体の過冷却を防止する方法において、該水性媒体中に請求の範囲第 １項、第２項丑たは第６項のいずれかに記載の細胞を導入し、その時またはその 以前において該媒体を凍結温度まだはそれ以下に冷却することを特徴とする上記 の方法。 ２０　おおよそ凍結温度またはそれ以下の温度において該水性媒体を容れている 槽に空気を吹き込み雪を形成する工程をつけ加えた請求の範囲第１９項記載の方 法。