JPH11514843A

JPH11514843A - 喘息の治療方法

Info

Publication number: JPH11514843A
Application number: JP9500962A
Authority: JP
Inventors: ジョナサンダブリュー．ナイス
Original assignee: イーストキャロライナユニバーシティー
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 1999-12-21
Also published as: EP0831924A4; WO1996040266A1; AU6029596A; US6040296A; MX9709865A; EP0831924A1; AU699330B2; CA2223769A1; CN1192158A; CA2223769C

Abstract

(57)【要約】治療が必要な患者において気管支収縮を低減させる方法について開示する。該方法には、気管支収縮を低減させるのに有効な量のA₁またはA₃アデノシン受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を患者に投与することを含む。本方法は、喘息を患う患者を治療するのに有用である。薬学的処方についても開示する。

Description

【発明の詳細な説明】喘息の治療方法本発明は、国立癌研究所（National Cancer Institute）からの助成（番号R01 CA47217-06）の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に対して特定の権利を有する。発明の分野本出願は、喘息を治療するための、A₁及びA₃アデノシン受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する方法に関する。発明の背景喘息は、産業国において最もよく見られる疾患の一つであり、合衆国においては、総健康管理費の約１％を占める（K.Weissら，New Engl．J．Med.，326，862 -866(1992)）。過去十年以上にわたる喘息の流行およびそれによる死亡率の双方の増加を警告する報告がなされている（Asthma-United States，1980-1990，MMW R，41，733-735(1992)）。また、職業上の喘息は、次の十年における職業上の肺疾患として傑出するものと予測されている（M．Chan-Yeung及びJ．Malo，Europe an Resp．J.，346-371(1994)）。工業国における喘息による死亡率の増加が、この疾患の治療におけるベータアゴニストへの依存の増加であり得る一方で、喘息の根幹的原因は未だよく理解されていない（J．Gern及びR．Lemanske，Immunolo gy and Allergy Clinics of North America，13，Bush，R.K．ed．W.B．Saunder s Company，London，pp.839-860(1993)）。アデノシンは、気管支喘息の重要な天然のメディエーターを構成する（R．Rau welsら，Clinical & Exp．Allergy，21，Suppl.1，48-55(1991)；及びS．Holgat eら，Annals of the New York Acad．Sci.，629，227-236(1991)）。ヒトの喘息におけるアデノシンの潜在的な役割は、正常人とは対照的に、喘息患者がエアゾール化されたアデノシンに反応して顕著な気管支収縮を起こすという実験的な知見により裏付けられている（M．Church及びS．Holgate，Trends Pharmacol．Sci .，7，49-50(1986)；及びM．Cushleyら，Br．J．Clin．Pharmacol.，15，161-16 5(1983)）。同様に、喘息に罹患していないウサギは無反応であるのに対し、ヒトにおける喘息のモデルである塵ダニアレルギーウサギを用いて作成した喘息罹患ウサギもまた、エアゾール化されたアデノシンに反応して顕著な気管支収縮を起こすことが示されている（S．Aliら，Agents Actions，37，165-176(1992) ）。このモデル系を用いた最近の研究において、喘息における、アデノシン媒介性の気管支収縮及び気管支過敏性は、まずアデノシン受容体の刺激を通じて媒介されることが示唆されている（S．Aliら，J．Pharmacol．Exp．Ther.，268，132 8-1334(1994)；及びS．Aliら，Am．J．Physiol.，266，L271-277(1994)）。喘息の治療において重要な薬物であるテオフィリンは、アデノシン受容体拮抗剤として知られており（M．Cushleyら，Am．Rev．Resp．Dis.，129，380-384(19 84)）、喘息罹患ウサギにおけるアデノシン媒介性気管支収縮を消失させることも知られている（Aliら，同上）。アレルギー罹患ウサギを、別のA₁特異的受容体拮抗剤である8-シクロフェニル-1,3-ジプロピルキサンチン（DPCPX）で前処置すると、該アレルギー罹患ウサギにおけるアデノシン媒介性気管支収縮及び気管支過敏性が強く阻害される（同上）。しかしながら、現在使用されているアデノシンA₁受容体特異的拮抗剤の治療上の潜在能力は、それらの毒性により制限されている（H．Klitgaardら，European J．Pharmacol.，242，221-228(1993)）。テオフィリンは、喘息の治療において広く使用されているが、しばしば重大な毒性を伴うため、結果としてその治療用量域が狭められている（E．Powellら，Pedia tric Emergency Care，9，129-133(1993)；S．Nasser及びP．Rees，Drug Safety ，8，12-18(1993)；及びP．Epstein，Annals of Internal Med.，119，1216-121 7(1993)）。アデノシン媒介性気管支収縮を抑制的制御する代替法を利用可能にすることが、治療上関心が持たれることは明らかである。発明の概要本発明の第一の側面は、治療を必要とする患者におけるアデノシン媒介性気管支収縮を低減させる方法である。本方法は、気管支収縮を低減させるのに有効な量のアデノシン受容体アンチセンスオリゴヌクレオチドを患者の肺に投与することを含む。ここで、該アデノシン受容体は、A₁アデノシン受容体及びA₃アデノシン受容体からなる群より選択される。本発明の第二の側面は、治療が必要な患者における喘息を治療する方法である。本方法は、喘息を治療するのに有効な量のアデノシン受容体アンチセンスオリゴヌクレオチドを患者の肺に投与することを含む。ここで、該アデノシン受容体は、A₁アデノシン受容体及びA₃アデノシン受容体からなる群より選択される。本発明の第三の側面は、アデノシン媒介性気管支収縮を低減させるのに有効な量のアデノシン受容体アンチセンスオリゴヌクレオチドと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物である。ここで、該アデノシン受容体は、A₁アデノシン受容体及びA₃アデノシン受容体からなる群より選択される。本発明の第四の側面は、（ａ）治療が必要な患者におけるアデノシン媒介性気管支収縮を低減させるか、または（ｂ）治療が必要な患者における喘息を治療するための医薬品を調製するための前記のようなアデノシン受容体アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用である。アンチセンスオリゴヌクレオチドについては、ヒトの疾患において潜在的に有用な薬理学的試薬として、かなりの理論的な考察がなされてきた（R．Wagner，N ature，372，333-335(1994)）。しかしながら、ヒトの疾患の現実のモデルに対するこれらの分子の実際的な適用は、判然としない。これらの分子の薬理学的適用において考察すべき一つの重要な点は、投与経路についてである。生体内（インビボ）でアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた実験のほとんどは、脳の限られた領域への直接的な適用（C．Wahlestedt，Trends in Pharmacological Sci ences，15，42-46(1994)；J．Laiら，Neuroreport，5，1049-1052(1994)；K．St andiferら，Neuron，12，805-810(1994)；及びA．Akabayashiら，Brain Researc h，21，55-61 (1994)）、または脊髄液中への直接的な適用に包含される（L．Ts engら，European J．Pharmacol.，258，R1-3(1994)；R．Raffaら，European J． Pharmacol.，258，R5-7(1994)；及びF．Gillardonら，European J．Neurosci.， 6，880-884(1994)）。このような適用は、それらの侵襲的な性質のために、限られた臨床上の有用性しか有していない。アンチセンスオリゴヌクレオチドの全身投与であっても、それらの疾患部位組織の標的化の困難性をはじめとした、薬理学的適用方法に関する重大な問題が提起される。対照的に、肺は、非侵襲的且つ組織特異的にアプローチできるため、アンチセンスオリゴヌクレオチドを適用するのに非常に可能性の高い標的である。図面の簡単な説明図１は、A₁アデノシン受容体アンチセンスオリゴヌクレオチド並びにミスマッチ対照アンチセンスオリゴヌクレオチドの、ウサギモデルにおける気管支気道の動的コンプライアンスに対する効果を示す。２つの星印は、ｐ＜0.01（スチューデントＴ検定）での有意差を表す。図２は、A₁アデノシン受容体アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した気道組織に存在するA₁及びA₂アデノシン受容体の数で示すことによるA₁アデノシン受容体アンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性を示す。発明の詳細な説明本明細書においては、ヌクレオチド配列は、５’から３’方向で左から右への一本鎖によってのみ提示する。本明細書においては、ヌクレオチド及びアミノ酸は、IUPAC-IUB生化学慣用名委員会推薦の方法により、もしくは（アミノ酸については）37CFR §1.822に従い確立された使用方法の３文字コードにより表される(PatentIn User Manual，99-102（Nov．1990）(米国特許商標庁の特許副長官、ワシントン，D.C.，20231)；及びHudsonらの米国特許第4,871,670号公報のカラム３の20-43行目)。（本出願人は、当該特許並びに本願において引用した他の特許文献を参照文献として取り込むよう特に意図するものである。）本発明の方法は、いかなる理由であれ、喘息（なお、これに限定されることはない）を含む、患者の肺におけるアデノシン媒介性気管支収縮を低減させるために使用され得る。A₁及びA₃受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞におけるA₁またはA₃の抑制的制御に有効であることが示される。アデノシン媒介性気管支収縮の伝統的な治療方法と比べた場合の本治療の１つの新規な側面は、肺への直接投与という点である。加えて、単に薬剤と相互作用するというというよりはむしろ、受容体蛋白自体が量的に減じ、また毒性も低減させるという点である。本明細書で用いられる喘息の「治療」なる用語は、そのような治療を受けた患者に気管支収縮または喘息の症状が現れる可能性を減じる処置を指す。「抑制的制御」なる用語は、細胞内のA₁またはA₃アデノシン受容体の産生、分泌または機能性（アベイラビリティー）の減少（ひいては、濃度の減少）の誘導を指す。本発明は、第一にヒト患者の治療に関するが、罹患した犬や猫のような他の哺乳動物の治療といった獣医学の目的のためにも利用可能である。一般的に、「アンチセンス」とは、標的メッセンジャーRNA（mRNA）の機能を阻害することにより遺伝子の発現を阻害する一本鎖DNAに似せた小さな合成オリゴヌクレオチドの使用を指す（Milligan，J.F.ら，J．Med．Chem.，36(14)，192 3-1937(1993)）。本発明においては、A₁またはA₃アデノシン受容体の遺伝子の発現の阻害が望ましい。遺伝子の発現は、ワトソン−クリックの塩基対形成の規則に従って、標的である特異的メッセンジャーRNA（mRNA）のコーディング（センス）配列への水素結合によるハイブリダイゼーションを通じて阻害される。アンチセンスによる阻害のメカニズムは、外来的に投与されたオリゴヌクレオチドが標的遺伝子のmRNA及び蛋白のレベルを減少させるか、または細胞の増殖特性もしくは形態の変化を引き起こすことである。（同上；または、Helene，C.及びToul me，J．，Biochem．Biophys．Acta，1049，99-125(1990)；及びCohen，J.S.，Ed .,アンチセンス遺伝子発現阻害剤としてのオリゴデオキシヌクレオチド，CRCPre ss:BocaRaton，FL(1987)）。本明細書において用いられる「アデノシン受容体アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、（１）後述するハイブリダイゼーション条件に従って、A₁アデノシン受容体またはA₃アデノシン受容体をコードするmRNAのいずれかのコーディング配列にハイブリダイズし、且つ（２）ハイブリダーゼーションの結果、A₁または A₃アデノシン受容体の遺伝子発現の減少を引き起こす合成ヌクレオチドの短い配列として定義される。 A₁またはA₃アデノシン受容体のmRNA配列は、A₁またはA₃アデノシン受容体のいずれかを発現する遺伝子のDNA塩基配列に由来するヒトのA₁アデノシン受容体のゲノミック配列は、スタイレス（Stiles）らの米国特許第5,320,963号公報に開示され公知である。A₃アデノシン受容体については、ラット（F．Zhouら，Proc ．Nat'l Acad．Sci．USA，89: 7432(1992)）及びヒト（M.A．Jacobsonら，英国特許出願第9304582.1号明細書(1993)）で、そのクローニング、配列解析及び発現が開示されている。従って、A₁またはA₃アデノシン受容体の産生を抑制的に制御するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標準的な技術に従って製造することができる。本発明の１つの側面は、mRNA分子の翻訳を阻止するように、ヒトA₁アデノシン受容体またはA₃アデノシン受容体をコードするmRNA分子のいずれかの配列に特異的に結合することができる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書に開示された配列番号:１、配列番号:３及び配列番号:５に記載の配列を有することができる。オリゴヌクレオチドの化学的アナログ（例えば、生体内でより安定にするために、フォスフォジエステル結合を、例えば、メチルフォスフォネート、フォスフォトリエステル、フォスフォロチオエート、フォスフォロジチオエートもしくはフォスフォラミデートに修飾したオリゴヌクレオチド）も本願発明の１つの側面である。オリゴヌクレオチド中に天然に見られるフォスフォジエステル結合は、内在的に存在する細胞内ヌクレアーゼによる分解に対して感受性であるが、多くのアナログ結合は、ヌクレアーゼによる分解に対して高い耐性を有する（前記の Milliganら、並びにCohen，J.S.の文献参照）。分解からの保護は、オリゴヌクレオチドの３’末端のフォスフォジエステル結合をヌクレアーゼ耐性結合で置換するという「３’末端キャップ」戦略により達成される（Tidd，D.M.及びWareni us，H.M.，Br．J．Cancer，60，343-350(1989)；及びShaw，J.P.ら，Nucleic Ac idsRes.，19，747-750(1991)）。フォスフォラミデート結合、フォスフォロチオネー結合及びメチルフォスフォネート結合は、全て十分にそのように機能する。フォスフォジエステルのバックボーンの修飾を広げることによってさらに安定となり、またオリゴヌクレオチドの細胞内への親和性を高め、細胞内への浸透性を増加させることができる（Milliganら，同上）。全てのフォスフォジエステルのバックボーンを新規な結合で置換するために、多くの異なる化学的戦略が実施されてきた（同上）。該バックボーンアナログには、フォスフォロチオエート結合、フォスフォロジチオネエート結合、メチルフォスフォネート結合、フォスフォラミデート結合、ボラノフォスフェート結合、フォスフォトリエステル結合、フォルムアセタール結合、3'-チオフォルムアセタール結合、5'-チオフォルムアセタール結合、5'-チオエーテル結合、カーボネート結合、5'-N-カルバメート結合、サルフェート結合、スルフォネート結合、サルファメート結合、スルフォンアミド結合、スルフォン結合、サルファイト結合、スルフォキシド結合、スルフィド結合、ヒドロキシルアミン結合、メチレン（メチルイミノ）（MMI）結合、またはメチレンオキシ（メチルイミノ）（MOMI）結合が含まれる。自動オリゴヌクレオチド合成による調製の観点からは、フォスフォロチオエート結合及びメチルフォスフォネート結合で修飾されたオリゴヌクレオチドが特に好ましい。適切ならば、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容される塩の形態で投与することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それが結合すべき特定の標的並びにそれの運搬の形態に依存して、どのような適切な長さであってもよい（例えば、約１０〜６０ヌクレオチドの長さ）。好ましくは、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、イントロンとエクソンの間の接合部位を含むmRNA領域に向けられる。該アンチセンスオリゴヌクレオチドがイントロン／エクソン接合部位に向けられる場合には、該接合部位の全体を含むものであっても良いし、また前駆mRNAから成熟 mRNAへのプロセシングされる間に起こる介在エクソンのスプライシングアウトを阻害することができる該接合部位に十分に近傍の部位であっても良い（例えば、該アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端は、イントロン／エクソン接合部位の、例えば約１０個、５個、３個または２個のヌクレオチドを伴う。）。開始コドンと重複したアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた好ましい。本発明を実施する場合には、投与されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それが投与される動物種の起源に関連していてもよい。ヒトを治療する場合には、必要に応じてヒトのアンチセンスを用いることができる。細胞膜を通過し、さらにその翻訳を阻止するように細胞ないのA₁またはA₃アデノシン受容体をコードするmRNAに特異的に結合することによって、A₁またはA₃アデノシン受容体の発現を低減させるために有効な上述のようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物も、本発明の他の側面の１つである。これらの組成物は、適当な薬学的に許容される担体（例えば、発熱性物質を含有しない無菌の生理食塩水）の中に存在する形態で提供される。該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞膜を通過することができる疎水性の担体とともに製剤化することができる（例えば、薬学的に許容される水性担体中に担持されたリポソームを用いた該リポソーム中）。該オリゴヌクレオチドは、例えばライボザイムのようなmRNAを不活性化する物質と共役させてもよい。このようなオリゴヌクレオチドは、A₁またはA₃アデノシン受容体の活性化を阻害するために、本明細書中に記載されるいずれかの理由により治療を必要とする患者に投与することができる。さらに、該薬学的製剤は、細胞に内在化していることが知られている分子に接合させたアンチセンスオリゴヌクレオチドを有するキメラ分子を含んでいてもよい。これらのオリゴヌクレオチド抱合体は、オリゴヌクレオチドの細胞内への取込み経路を生み出すために利用でき、それにより該オリゴヌクレオチドの細胞内での濃度を増加させることができる。このような方法で用いられる巨大分子の例としては、トランスフェリン、アシアログリコプロテイン（ポリリジンを介してオリゴヌクレオチドと結合する）及びストレプトアビジンを挙げることができる。前記薬学的製剤においては、該アンチセンス化合物は、リポソームまたは微結晶のような脂質粒子または小胞中に含有させることができる。該粒子は、該アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有させることができる限り、単層または複数層のようないかなる適当な構造であってもよい。そのような粒子及び小胞としては、N-[1-(2,3-ジオールオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチル-アンモニウムメチルサルフェートまたは「DOTAP」のような正に荷電した脂質が特に好ましい。このような脂質粒子の調製方法は良く知られている（Janoffらの米国特許第4, 880,635号公報；Kuronoらの米国特許第4,906,477号公報；Wallachらの米国特許第4,911,928号公報；Wallachらの米国特許第4,917,951号公報；Allenらの米国特許第4,920,016号公報；及びWheatleyらの米国特許第4,921,757号公報）。該活性組成物の患者への投与は、該アンチセンスヌクレオチド組成物を患者の肺へ到達させるあらゆる手段によって行うことができる。本願に開示されるアンチセンス化合物は、どのような適切な手段を用いても患者の肺に投与することができるが、呼吸に適した粒子を含むエアゾールを生成させることにより投与するのが好ましい。該呼吸に適した粒子とは、該アンチセンス化合物を含み、患者はそのような粒子を吸入する。また、該呼吸に適した粒子は、液体または固形のいずれであってもよい。また、必要に応じて、該粒子中に、他の治療学的成分を含有させてもよい。本発明を実施するためのアンチセンスを含む粒子には、呼吸に適したサイズ、即ち、吸入によって口及び喉頭を通過して気管及び肺の肺胞に入り込むように十分に小さなサイズの粒子が包含されるべきである。一般的には、約0.5〜約10ミクロンのサイズの粒子が呼吸に適している。エアゾール中に呼吸に適さないサイズの粒子が含有されている場合には、喉に沈着し、飲み込まれてしまう傾向があるため、エアゾール中に含まれる呼吸に適さない粒子の量を最小限にすることが好ましい。鼻からの投与の場合には、鼻腔での貯留を確実なものとするために、粒子のサイズを１０〜５００μｍにするのが好ましい。エアゾールを調製するための活性化合物の液体薬学的組成物は、該アンチセンス化合物を、発熱性物質を含まない無菌の水のような適切な媒体と組み合わせることによって調製することができる。また、必要に応じて、他の治療学的化合物を含有させてもよい。微粉化したアンチセンス化合物を含む呼吸に的した乾燥粒子を含む固形微粒子組成物は、乾燥させたアンチセンス化合物を、乳鉢及び乳棒を用いて粉砕した後、該微粉化した組成物を４００目ふるいにかけて大きな球塊を砕くかもしくは分離することによって調製できる。アンチセンス化合物を含む固形微粒子組成物は、所望により、エアゾール化を容易にすることができる分散剤を含んでいてもよい。好ましい分散剤としては、ラクトースが挙げられ、該アンチセンス化合物とどのような適当な割合でも混ぜ合わせることができる（例えば、重量比で１対１）。また、必要に応じて、他の治療学的化合物を含有させてもよい。該アンチセンス化合物の投与用量は、治療すべき疾患、患者の状態、製剤の特有の形態、投与経路、及び患者への投与のタイミングなどに依存する。一般的には、該オリゴヌクレオチドの細胞内での濃度は、0.05〜５０μＭが好ましく、さらに好ましくは0.2〜５μＭである。ヒトのような患者への投与の場合には、典型的には、0.01、0.1もしくは１mg/Kg〜50、100もしくは150mg/Kg、またはそれ以上で実施され得る。投与される活性化合物の特有製剤の溶解性に依存して、一日の投薬量を、１回または複数回の投薬単位に分けることができる。該アンチセンス化合物の投与は、治療学的（即ち、救命治療として）または予防学的に実施することができる。該アンチセンス化合物を含む液体粒子のエアゾールは、噴霧器（ネブライザー）のような適当な手段を用いて生成させることができる（米国特許第4,501,729 号公報）。ネブライザーは、細いヴェンツーリ口を通過させることにより圧縮ガス（典型的には空気もしくは酸素）を加速させる方法、または超音波振動による方法のいずれかにより、活性成分の溶液または懸濁液を治療用エアゾール霧に変態させる市販の器具である。ネブライザーでの使用に適した製剤は、溶液担体中に溶解した該活性成分を含み、該活性成分は、該製剤に対して好ましくは２０％ w/wで、最大４０％w/wである。該担体は、典型的には水もしくは希釈した液性アルコール溶液であり、例えば、塩化ナトリウムを加えることにより体液と等張にしたものが好ましい。他の添加物としては、該製剤が無菌でない場合には防腐剤が挙げられ、またメチルヒドロキシベンゾエート、抗酸化剤、矯味剤、揮発油、緩衝剤及び界面活性剤を挙げることができる。該活性化合物を含む固形粒子のエアゾールは、いずれの固形微粒子医薬エアゾール生成器によっても同様に調製することができる。患者へ投与するための固形微粒子医薬のエアゾール生成器は、上述したように呼吸に適した粒子を製造すし、また、予め決定された大きさの医薬用量をヒトへの投与に適した率で含有するエアゾールの量を生成する。固形微粒子エアゾール生成器の一つの例示的種類としては、注入器（インサフレーター）が挙げられる。注入による投与に適した製剤としては、注入器により輸送されるか、または鼻からの吸引法において鼻腔に取り込まれるような極めて微小に粉砕された粉末が挙げられる。注入器の場合には、該粉末（例えば、本明細書中に記載される治療を実施するために有効である測定された医薬用量）は、目的に位置で穴が開くか、もしくは開くような、特にはゼラチン製もしくはプラスチック製のカプセルもしくはカートリッジ中に含有させることができる。該粉末は、吸入により該器具中を通った空気により輸送されるか、手動操作のポンプにより輸送される。注入器で使用される粉末は、活性成分単体から構成されてもよいし、または、ラクトースや所望の界面活性剤などの適当な粉末希釈剤と該活性成分との混合粉末から構成されてもよい。該活性成分は、典型的には、製剤に対して0.1〜100w/wである。エアゾール生成器の第二の例示的種類としては、用量調整吸引器（メータード・ドース・インヘラー）である。メータード・ドース・インヘラーは、加圧エアゾールディスペンサーであり、典型的には、活性成分が液状噴射剤中に溶解している懸濁製剤または溶液製剤を含んでいる。これらの器具を使用する間、調整した量（典型的には10〜150 μｌを供給するように調整した弁を通じて該製剤が放出され、活性成分を含む微少な粒子スプレーが産生される。適切な噴射剤としては、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン及びそれらの混合物のような特定のクロロフルオロカーボン化合物が挙げられる。該製剤は、所望に応じ、さらに１以上の共溶媒を含むことができる。例えば、エタノール、オレイン酸もしくはソルビタントリオレエートなどの界面活性剤、抗酸化剤、及び適当な矯味剤が挙げられる。前記エアゾールは、固形または液体のいずれの形態であってもよく、これらのエアゾールは、エアゾール生成器を用いて、10〜150リットル／分、好ましくは3 0〜150リットル／分、特に好ましくは約60リットル／分の率で生成させることができる。大量の医薬を含むエアゾールをさらに急速に投与することもできる。下記実施例を以て本発明を例示するが、本発明はそれらに限定されるものではない。該実施例においては、μＭはマイクロモルを、ｍＬはミリリットルを、μ ｍはマイクロメーターを、ｍｍはミリメートルを、ｃｍはセンチメーターを、℃ は摂氏を、μｇはマイクログラムを、ｍｇはミリグラムを、ｇはグラムを、ｋｇはキログラムを、Ｍはモルを、またｈは時間を意味する。実施例１アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計及び合成 A₁及びA₃アデノシン受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計には、標的となるA₁受容体のmRNA及びA₃受容体のmRNAの複雑な二次構造を解明する必要があるであろう。この構造を生成させた後、該mRNAに機能的活性及び安定性を与える理解されているmRNAの標的領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが設計される。該領域は、開始コドンと重複しているのが最適であろう。他の標的部位については、既に利用可能である。アンチセンス効果の特異性を実証するために、本アンチセンス実験においては、標的mRNAに完全には相補的ではないが、w/wベースで同一のヌクレオチド組成を有する他のオリゴヌクレオチドも対照として含まれる。アデノシンA₁受容体のmRNAの二次構造を分析し、上述したように、フォスフォロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計に用いた。合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、HAdA1ASと命名した。このオリゴヌクレオチドは、下記配列を有している。 5' - GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG - 3'（配列番号:１）対照として、下記配列を有するHAdA1MMと命名した不適正（ミスマッチ）フォスフォロチオエートアンチセンスヌクレオチドを合成した。 5' - GTA GCA GGC GGG GAT GGG GGC - 3'（配列番号:２）いずれのオリゴヌクレオチドも同一の塩基組成並びに一般的な配列構造を有していた。GENBANK（解放度85.0）及びEMBL（解放度40.0）を用いたホモロジー検索により、該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒト及びウサギのアデノシン A₁受容体の遺伝子に特異的であり、また該不適正対照がいずれの既知遺伝子配列ともハイブリダイゼーションさせるための候補ではないことが判明した。アデノシンA₃受容体のmRNAの二次構造を同様にして分析し、上述したように、２つのフォスフォロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計に用いた。合成した第１のアンチセンスオリゴヌクレオチド（HAdA₃AS1）は下記配列を有していた。 5' - GTT GTT GGG CAT CTT GCC - 3'（配列番号:３）対照として、下記配列を有する不適正（ミスマッチ）フォスフォロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（HAdA₃MM1）を合成した。 5' - GTA CTT GCG GAT CTA GGC - 3'（配列番号:４）第２のフォスフォロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（HAdA₃AS2）を設計し、合成した。該オリゴヌクレオチドは下記配列を有していた。 5' - GTG GGC CTA GCT CTC GCC - 3'（配列番号:５）その対照であるオリゴヌクレオチド（HAdA₃MM2）は下記配列を有していた。 5' - GTC GGG GTA CCT GTC GGC - 3'（配列番号:６）フォスフォロチオエートオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド合成機（ Applied Biosystems製，モデル３９６）を用いて合成し、NENSORBロマトグラフィー（DuPont製，MD）を用いて精製した。実施例２ A₁ アデノシン受容体アンチセンスオリゴヌクレオチドの生体外（インビトロ）試験前記のヒトのA₁受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号: １）の効果を、肺の腺癌細胞HTB-54を用いたインビトロモデルにより試験した。 HTB-54肺腺癌細胞がA₁アデノシン受容体を発現していることを、標準的なノーザンブロッティング並びに本研究室で設計し合成した受容体プローブを用いて実証した。インキュベーションの１２時間後に新鮮な培地及びオリゴヌクレオチドに交換することにより、HTB-54ヒト肺腺癌細胞（106/100mm組織培養皿）を、5.0μMのH AdA1ASまたはHAdA1MMに２４時間曝した。該オリゴヌクレオチドに２４時間曝した後、細胞を回収し、標準的手法に従ってmRNAを抽出した。該アンチセンスが標的としているmRNAの領域に対応する２１merのプローブ（従って、フォスフォロチオエート化されてはいないが、該アンチセンスと同一の配列を有する）を合成し、HAdA1AS処理、HAdA1MMまたは未処理のHTB-54細胞から調製したRNAのノーザンブロットにおけるプローブとして用いた。該ブロッティングにより、HAdA1AS が、ヒトアデノシン受容体のmRNAを５０％以上有効に減少させることが示された。HAdA1MMは、減少させなかった。この結果は、HAdA1ASが抗喘息薬としての良い候補であることを示すものであった。なぜならば、HAdA1ASが、喘息において関与するアデノシンA₁受容体の細胞内mRNAを減少させるからである。実施例３ A₁ アデノシン受容体アンチセンスオリゴヌクレオチドの生体内（インビボ）における効果アデノシンA₁遺伝子については、ヒト及びウサギのDNA配列が偶然的にホモロジーを有し、また開始コドンが重複していたことから、ヒトのアデノシンA₁受容体に対して使用するために当初設計された前記フォスフォロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ウサギモデルで使用することができた。パスツレラに感染していないニュージーランド白色ウサギの新生児に、生後２４時間以内に、１０％カオリンと混合したハウスダスト（家塵）ダニ（housedus t mite、D．farinae）の抽出物（３１２抗原単位／ｍＬ、Berkeley Biologicals 製、バークレー、カリフォルニア）を腹腔に投与して免疫した。該免疫は、最初の１カ月は１週間毎に、また続く２カ月間は２週間毎に行った。３〜４月齢の感作させたウサギ（８匹）を麻酔し、ケタミンヒドロクロライド（44mg/kg）及びマレイン酸アセプロマジン（0.4mg/kg）を筋肉内注射して弛緩させた。該ウサギを、小さく型どられ、パッドを敷き詰めた動物用ボードの上に楽な姿勢で仰向けに横たえ、4.0mmの気管内挿管用チューブ（Mallinkrodt，Inc製、グレンスフォールズ、ニューヨーク）を挿管した。ラテックスバルーンを配備した外径2.4mmのポリエチレンカテーテルを食道に挿入し、本実験の間中、口から等距離（約１６ｃｍ）で維持させた。該気管内挿管用チューブを、加熱したフライシュ呼吸気流計（サイズ：００、DOM Medcal製、リッチモンド、バージニア）に連結し、気流を、ゴウルドキャリアー増幅器（Gould carrier amplifier、モデル：11-4113、Gould Electronic製、クリーブランド、オハイオ）で作動させたバリジン差動圧力変換器（Validyne differential pressure transducer、モデル：DP-45161927、Validyne Engineering Corp.製、ノースリッジ、カリフォルニア）を用いて測定した。食道のバルーンを、該差動圧力変換器の片側に連結し、また、肺を通過する気流の圧力を記録できるように該気管内挿管用チューブの流出口を該圧力変換器の反対側に連結した。気流を積分し、継続的に肺に流入する量を求め、自動呼吸分析計（モデル：６、Buxco製、シャロン、CT）を用いて、総肺抵抗（ＲＴ）及び動的コンプライアンス（Cdyn）を、等容及び気流ゼロの時点で各々算出した。該動物を無作為抽出し、１日目に、エアゾール化したアデノシンに対するＰＣ５０での前処置の値を求めた。アンチセンス（HAdA1AS）または不適正対照（HAd A1MM）オリゴヌクレオチドを、5000μg（５mg）／1.0mlの濃度で、無菌生理食塩水に溶解した。引き続いて、該動物に、エアゾール化した該アンチセンスまたは不適正オリゴヌクレオチドを、該気管内チューブを通じて、１日２回で２日間投与した（約5000μg／1.0ml）。食塩水、アデノシン、アンチセンスまたは不適正オリゴヌクレオチドのいずれかのエアゾールを、超音波ネブライザー（DeVilbis s製、Somerset、PA）で生成させた。該エアゾールの８０％が、直径５μｍより小さい小滴であった。本実験の第１の構成では、無作為に選んだ４匹のアレルギーウサギに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与し、また４匹に不適正対照オリゴヌクレオチドを投与した。３日目の朝、ＰＣ₅₀値（気管気道の動的コンプライアンスを基線値（ベースライン値）から５０％低減させるために必要なエアゾール化アデノシン（mg/ml））の濃度）を求め、該オリゴヌクレオチドに曝す前に求めたＰＣ₅₀値と比較した。１週間の間隔を空けた後、先に不適正対照オリゴヌクレオチドを投与した動物にはアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与し、また先にアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置された動物には不適正対照オリゴヌクレオチドを投与して、該動物をクロスオーバーさせた。処置方法及び測定方法は、本実験の第１の構成で行った方法と同一の方法を用いた。アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した８匹の動物の内の６匹においては、アデノシン媒介性気管支収縮が、最大でアデノシンの溶解度の限界である２０mg/mlまで見られなかったことは注目すべき点である。算出のために、これらの動物のＰＣ₅₀値を２０mg/mlに設定した。従って、得られた値は、アンチセンスの効果の最低値を表すものである。実際の効果は、さらに高いものであった。本実験の結果を、図１及び表１に例示する。結果は、平均値（Ｎ＝８）±ＳＥＭで示す。有意差は、分散の繰返し測定分析（ANOVA）及びチュキー（Tukey）のｔ検定で求めた。**他の全ての群とＰ＜0.01 で有意に異なる。本実験の両構成ともに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを与えられた動物では、肺の動的コンプライアンスを５０％減少するのに必要なエアゾール化アデノシンの用量において、大きく増加したオーダーを示した。ＰＣ₅₀の下では、不適正対照オリゴヌクレオチドは全く効果を観察されなかった。アンチセンスまたは対照オリゴヌクレオチドを吸入させたいずれの動物においても毒性は観察されなかった。これらの結果は、肺が、肺疾患のアンチセンスに基づく治療的介入に対して、その標的として例外的に可能性を有するものであることを明白に示すものである。これらの結果は、さらに、ヒトの喘息に極めて類似したモデル系においては、アデノシンA₁受容体の抑制的制御により、喘息性気道におけるアデノシン媒介性気管支収縮を顕著に消失させることができることを示している。ヒトの喘息のモデルであるアレルギー罹患ウサギにおける気管支の過敏症は、アンチセンスによる介入のための優れた終点（エンドポイント）である。なぜならば、この反応に係わる組織は、エアゾール化オリゴヌクレオチドが接触するポイントの近くに存在し、また、該モデルがヒトの重要な疾患を擬態化しているものであるからである。実施例４ A₁ アデノシン受容体アンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性実施例３のクロスオーバー実験の結論に基づき、全てのウサギの気道の平滑筋におけるアデノシンA₁受容体の数を定量的に分析した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性を見るための対照として、何らの影響も受けていないアデノシンA₂受容体についても定量した。各々のウサギから取得した気道の平滑筋組織を細かく切断し、若干の修飾を加えた既報告に記載されている方法に従って膜画分を調製した（J.Kleinstein及び H．Glossmann，Naunyn-Schmiedeberg's Arch．Pharmacol.，305，191-200(1978) ）。粗製形質膜調製物は、アッセイに用いるまでは、−７０℃で保存した。蛋白含量を、ブラッドフォード（Bradford）の方法により測定した（M．Bradford，A nal．Biochem.，72，240-254(1976)）。凍結形質膜を、室温で融解し、0.2U/ml のアデノシンデアミナーゼとともに３７℃で３０分間インキュベートして内在性アデノシンを除去した。［³H］ＤＰＣＰＸ（A₁受容体特異的）または［³H］CGS- 21680（A₂受容体特異的）の結合を既報告に記載の方法に従って測定した（S．Al iら，J.Pharmacol．Exp.Ther.，268,1328-1334(1994)；及びS．Aliら，Am．J．P hysiol.，266，L271-277(1994)）。図２及び表２に例示されるように、A₁特異的拮抗剤であるＤＰＣＰＸを用いたアッセイにおいては、前記のクロスオーバー実験でアデノシンA₁アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置された動物では、対照に比べ、A₁受容体の数が７５％近く減少していた。A₂受容体特異的アゴニストである2-[p-(2-カルボキシエチル)- フェネチルアミノ]-5'-(N-エチルカルボキサミド)アデノシン（CGS-21680）を用いたアッセイにおいては、アデノシンA₂受容体の数は全く変化しなかった。結果は、平均値（Ｎ＝８）±ＳＥＭで示す。有意差は、分散の繰返し測定分析（ANOVA）及びチュキー（Tukey）のｔ検定で求めた。**他の全ての群とＰ＜0.01 で有意に異なる。上述の実施例は本発明の例示であるが、それらに限定されるものと解釈すべきではない。本発明は、以下の請求の範囲、並びに本明細書に包含される該請求の範囲の等価物により定義されるものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年２月５日【補正内容】２４．アンチセンスオリゴヌクレオチドの患者の細胞内での濃度が約0.1〜10 μMに達するよう、該アンチセンスオリゴヌクレオチドが十分な量で投与される、請求項13記載の方法。２５．アデノシン媒介性気管支収縮を低減させるために有効な量の、A₁アデノシン受容体及びA₃アデノシン受容体からなる群より選択されるアデノシン受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。２６．アデノシン受容体が、A₁アデノシン受容体である、請求項25記載の薬学的組成物。２７．アデノシン受容体が、A₃アデノシン受容体である、請求項25記載の薬学的組成物。２８．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、該ヌクレオチド中の少なくとも一つのフォスフォジエステル結合が、メチルフォスフォネート結合、フォスフォトリエステル結合、フォスフォロチオエート結合、フォスフォロジチオエート結合及びフォスフォラミデート結合からなる群より選択される結合により置換されているヌクレオチドを含む、請求項25記載の薬学的組成物。２９．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号:１に記載の配列を有する、請求項25記載の薬学的組成物。３０．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号:３に記載の配列を有する、請求項25記載の薬学的組成物。３１．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号:５に記載の配列を有する、請求項25記載の薬学的組成物。３２．担体が、固形担体及び液体担体からなる群より選択される担体である、請求項25記載の薬学的組成物。３３．アンチセンスオリゴヌクレオチドを有するリポソームをさらに含む、請求項25記載の薬学的組成物。３４．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、細胞内への取込みを可能にする分子と結合している、請求項25記載の薬学的組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．治療が必要な患者においてアデノシン媒介性気管支収縮を低減させる方法であって、A₁アデノシン受容体及びA₃アデノシン受容体からなる群より選択されるアデノシン受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、気管支収縮を低減させるために有効な量、該患者の肺に投与することを含む、方法。２．アデノシン受容体が、A₁アデノシン受容体である、請求項1記載の方法。３．アデノシン受容体が、A₃アデノシン受容体である、請求項1記載の方法。４．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、該ヌクレオチド中の少なくとも１つのフォスフォジエステル結合が、メチルフォスフォネート結合、フォスフォトリエステル結合、フォスフォロチオエート結合、フォスフォロジチオエート結合及びフォスフォラミデート結合からなる群より選択される結合により置換されているヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。５．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号:１に記載の配列を有する、請求項1記載の方法。６．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号:３に記載の配列を有する、請求項1記載の方法。７．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号:５に記載の配列を有する、請求項1記載の方法。８．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、該アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む呼吸に適した粒子のエアゾールを投与することにより患者の肺に輸送される、請求項1記載の方法。９．粒子が、固形粒子及び液体粒子からなる群より選択される粒子である、請求項8記載の方法。１０．エアゾールが、約0.5〜10ミクロンの範囲の粒子サイズを有する粒子で構成される、請求項9記載の方法。１１．粒子が、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリポソームである、請求項8記載の方法。１２．アンチセンスオリゴヌクレオチドの患者の細胞内での濃度が約0.1〜10 μMに達するよう、該アンチセンスオリゴヌクレオチドが十分な量で投与される、請求項8記載の方法。１３．治療が必要な患者において喘息を治療する方法であって、A₁アデノシン受容体及びA₃アデノシン受容体からなる群より選択されるアデノシン受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、喘息を治療するために有効な量、該患者に投与することを含む方法。１４．アデノシン受容体が、A₁アデノシン受容体である、請求項13記載の方法。１５．アデノシン受容体が、A₃アデノシン受容体である、請求項13記載の方法。１６．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、該ヌクレオチド中の少なくとも１つのフォスフォジエステル結合が、メチルフォスフォネート結合、フォスフォトリエステル結合、フォスフォロチオエート結合、フォスフォロジチオエート結合及びフォスフォラミデート結合からなる群より選択される結合により置換されているヌクレオチドを含む、請求項13記載の方法。１７．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号:１に記載の配列を有する、請求項13記載の方法。１８．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号:３に記載の配列を有する、請求項13記載の方法。１９．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号:５に記載の配列を有する、請求項13記載の方法。２０．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、該アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む呼吸に適した粒子のエアゾールを投与することにより患者の肺に輸送される、請求項13記載の方法。２１．粒子が、固形粒子及び液体粒子からなる群より選択される粒子である、請求項20記載の方法。２２．エアゾールが、約0.5〜10ミクロンの範囲の粒子サイズを有する粒子で構成される、請求項21記載の方法。２３．粒子が、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリポソームである、請求項20記載の方法。２４．アンチセンスオリゴヌクレオチドの患者の細胞内での濃度が約0.1〜10 μMに達するよう、該アンチセンスオリゴヌクレオチドが十分な量で投与される、請求項13記載の方法。２５．アデノシン媒介性気管支収縮を低減させるために有効な量の、A₁アデノシン受容体及びA₃アデノシン受容体からなる群より選択されるアデノシン受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。２６．アデノシン受容体が、A₁アデノシン受容体である、請求項25記載の方法。２７．アデノシン受容体が、A₃アデノシン受容体である、請求項25記載の方法。２８．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、該ヌクレオチド中の少なくとも１つのフォスフォジエステル結合が、メチルフォスフォネート結合、フォスフォトリエステル結合、フォスフォロチオエート結合、フォスフォロジチオエート結合及びフォスフォラミデート結合からなる群より選択される結合により置換されているヌクレオチドを含む、請求項25記載の方法。２９．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号:１に記載の配列を有する、請求項25記載の方法。３０．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号:３に記載の配列を有する、請求項25記載の方法。３１．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号:５に記載の配列を有する、請求項25記載の方法。３２．担体が、固形担体及び液体担体からなる群より選択される担体である、請求項25記載の薬学的組成物。３３．アンチセンスオリゴヌクレオチドを有するリポソームをさらに含む、請求項25記載の薬学的組成物。３４．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、細胞内への取込みを可能にする分子と結合している、請求項25記載の薬学的組成物。