JPH11501203A - Production of Neisseria gonorrhoeae pi protein and vaccine in E. coli and in Salmonella - Google Patents

Production of Neisseria gonorrhoeae pi protein and vaccine in E. coli and in Salmonella

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JPH11501203A JP50600295A JP50600295A JPH11501203A JP H11501203 A JPH11501203 A JP H11501203A JP 50600295 A JP50600295 A JP 50600295A JP 50600295 A JP50600295 A JP 50600295A JP H11501203 A JPH11501203 A JP H11501203A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は淋菌ポーリンタンパク又はその断片を発現するリコンビナントサルモネラ又は大腸菌細胞を提供する。 (57) Abstract: The present invention provides a recombinant Salmonella or E. coli cells expressing the Neisseria gonorrhoeae porin protein or fragment thereof. また本発明は当該リコンビナントサルモネラ細胞及び薬学的に許容される担体を含有するワクチン、さらに淋菌感染の予防及び治療方法を提供する。 The present invention vaccines containing the recombinant Salmonella cells and a pharmaceutically acceptable carrier, further provides a method for the prophylaxis and treatment of gonococcal infection.

Description

【発明の詳細な説明】 大腸菌およびサルモネラ菌中における淋菌PIタンパクおよびワクチンの製造発明の背景 本発明は、1993年7月30日出願の米国特許出願第08/100,588 号の一部継続出願であり、上記米国特許出願を本明細書の一部としてここに援用する。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION background the present invention of manufacturing the invention of gonococcal PI protein and vaccine in E. coli and in Salmonella is a continuation-in-part application of US patent application Ser. No. 08 / 100,588, filed July 30, 1993 There, incorporated herein above U.S. patent application as a part hereof. 淋菌即ちナイセリア淋菌(Neisseria gonorrhoeae)は、ヒトだけに感染し、 淋病を引き起こす。 Gonorrhoeae i.e. Neisseria gonorrhoeae (Neisseria gonorrhoeae) infects only humans, causing gonorrhea. 淋病は現在でも米国で最も頻繁に報告される感染性の疾病であり、先進国および開発途上国の双方における罹患率および不妊症の主要な原因となっている。 Gonorrhea is an infectious disease that is most frequently reported in the United States today, it has become a major cause of morbidity and infertility in both developed and developing countries. 現在の所、淋菌ワクチンは入手できない。 At present, Neisseria gonorrhoeae vaccine is not available. 淋菌ワクチンの幾つかの候補の内、 文献ではPIまたはPorと称される淋菌外膜ポーリンタンパクが主要な候補である(ゴッシュリッヒ(Gotschlich)、1984年;ブレイク(Blake)ら、1 989年;エルキンス(Elkins)およびスパーリング(Sparling)、1992年)。 Of several candidate gonococcal vaccine, the literature is gonococcal outer membrane porin protein primary candidate called PI or Por (Ghosh Eirich (Gotschlich), 1984 Jan; Blake (Blake) et al., 1 1989; Elkins (Elkins) and sparring (Sparling), 1992 years). PIは抗原的に安定な表面露出タンパクであり、PIに対する抗体は潜在的防御抗体である(ヘッケルス(Heckels)ら、1990年;ジョイナー(Joiner )ら、1985年;コール(Kohl)ら、1989年;バージ(Virji)ら、19 86年)。 PI is antigenically stable surface exposed protein, antibodies against PI are potentially protective antibody (Hekkerusu (Heckels) et al., 1990; Joyner (Joiner) et al., 1985; Call (Kohl) et al, 1989 ; barge (Virji) et al., 19 86 years). PIは、殆どのグラム陰性ポーリンと同じ構造的特徴を有し、非共有結合トリマー複合体として存在し、自然状態では大きなβシート構造を示す。 PI has the same structural features as most Gram-negative porins, present as non-covalently bound trimeric complex shows a large β sheet structure in nature. しかし、ドデシル硫酸ナトリウム溶液中での煮沸によって変性させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析すると、PIは、トリマー構造からモノマーへと解離し、32〜39kDaと見積もられる分子質量で移動する(ジョンストン(Johnsto n)ら、1976年;マクデード(McDade)とジョンストン(Johnston)ら、19 80年)。 However, denatured by boiling in sodium dodecyl sulfate solution, when analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis, PI dissociates from trimmer structure to monomer, moves molecules mass is estimated to be 32~39KDa (Johnston (Johnsto n) et al., 1976; Makudedo (McDade) and Johnston (Johnston), et al., 19 80 years). PIは、血清群PIAおよびPIBと呼ばれる2つの主要な免疫化学的クラスを有する(タム(Tam)ら、1982年;ナップ(Knapp)ら、1984年)。 PI has two major immunochemical class called serogroups PIA and PIB (Tam (Tam) et al., 1982; Knapp (Knapp) et al., 1984). PIAとPIBは同じ遺伝子の変異体/対立遺伝子の生成物である(カルボネッティ(Carbonetti)ら、1988年);カルボネッティ(Carbonetti)とスパーリング(Sparling)、1987年)。 PIA and PIB are products of the mutant / alleles of the same gene (Karubonetti (Carbonetti) et al., 1988); Karubonetti (Carbonetti) and sparring (Sparling), 1987 years). 全ての淋菌は何れか一方の血清群のPIを含んでいるが、両方は含んでおらず、PIマイナス突然変異株の存在は知られていない。 Although all gonococcal contains PI of one of serogroup, both does not include the presence of PI negative mutants is not known. PIは安定であり、相変異または抗原変異を起こさない(ジャッド(Ju dd)、1989年)。 PI is stable, does not cause the phase mutation or antigenic variation (Judd (Ju dd), 1989 years). PIAおよびPIB、並びにハイブリッドPIA/PIBおよびその断片のD NAとアミノ酸配列は知られている(カルボネッティ(Carbonetti)ら、国際出願第PCT/US92/02006、1992年3月13日出願;PCT/US 92/02090;PCT/US88/04225;カルボネッティ(Carbonet ti)とスパーリング(Sparling)、1987年;カルボネッティ(Carbonetti) ら、1988年;カルボネッティ(Carbonetti)ら、1990年)。 PIA and PIB, and hybrid PIA / PIB and D NA and the amino acid sequence of the fragment is known (Karubonetti (Carbonetti) et al., International Application No. PCT / US92 / 02006, March 13, 1992 filed; PCT / US 92/02090; PCT / US88 / 04225; Karubonetti (Carbonet ti) and sparring (Sparling), 1987 years; Karubonetti (Carbonetti) et al., 1988; Karubonetti (Carbonetti) et al., 1990). 淋菌による感染の圧倒的大多数のものは尿生殖器管の粘膜を含むため、効果的なワクチンは粘膜での免疫反応を指向するのが理想であろう。 For those overwhelming majority of infection with Neisseria gonorrhoeae, including mucosal urogenital tract, effective vaccines to direct an immune response in mucous membranes would be ideal. これまでの研究によると、局所的に産生される分泌型IgAイソタイプの抗体が、粘膜表面における最も重要な防御因子の一つである(マクギール(McGheel)ら、1992年) 。 According to previous studies, the antibodies of the secretory IgA isotype locally produced is one of the most important protective factor in the mucosal surface (Makugiru (McGheel) et al., 1992). 気管支関連リンパ組織および消化管関連リンパ組織(BALTおよびGALT )と呼ばれる特殊なリンパ組織が、粘膜応答の発生を誘導する部位である(検討のためにはホルムグレン(Holmgren)、1991年;ホルムグレン(Holmgren) ら、1992年;及びマクギール(McGheel)ら、1992年を参照)。 Bronchial-associated lymphoid tissue and gut-associated lymphoid tissue (BALT and GALT) and specialized lymphoid tissue called is a site for inducing the occurrence of mucosal responses (Holmgren is for consideration (Holmgren), 1991 years; Holmgren (Holmgren) et al., 1992; and Makugiru (McGheel) et al., see 1992). 粘膜表面での応答を誘発するために幾つかの抗原供給システムが開発された。 Some antigen delivery system in order to elicit a response at mucosal surfaces has been developed. 列えば、弱毒化されたサルモネラ菌株はGALTを定着(コロニー化)させ、サルモネラに対する一般化された防御免疫応答を刺激することができる。 In Retsue, Salmonella strains which are attenuated can be stimulated by fixing the GALT (colonization), the generalized protective immune response against Salmonella. あるシステムでは、生の弱毒化されたサルモネラチフィムリウム(Salmonella typhimuriu m)を採用してGALTに対しての外来性の抗原を発現して供給する(カーチスII I(Curtiss III)とケリー(Kelly)、1987年;ダウガン(Dougan)ら、1 988年;ダウガン(Dougan)ら、1987年;ダウガン(Dougan)ら、198 9年;モローナ(Morona)ら、1991年;ナカマヤ(Nakamaya)ら、1988年;ストラグネル(strugnell)ら、1990年;タルッカ(Tarkka)ら、1988年;ウォーカー(Walker)ら、1990年)。 In some systems, live attenuated Salmonella typhimurium (Salmonella typhimuriu m) adopted by the supplied expressing foreign antigens against GALT (Curtis II I (Curtiss III) and Kelly (Kelly ), 1987; Daugan (Dougan) et al., 1 988; Daugan (Dougan) et al., 1987; Daugan (Dougan) et al., 198, 1997; Morona (Morona) et al., 1991; Nakamaya (Nakamaya) et al., 1988 year; Sutoraguneru (strugnell) et al., 1990; Tarukka (Tarkka) et al., 1988; Walker (Walker), et al., 1990). 弱毒化されたマウスのサルモネラ菌株は、動物モデルにおいて発現された遺伝子の試験に有用であることが知られているが、これに加え、ヒトの臨床試験での使用の可能性を有するヒトのサルモネラ菌株(サルモネラ・チフィ)も試験されている(タケット(Tacket)ら、1992年)。 Salmonella strains of attenuated mice are known to be useful for testing gene expressed in animal models, in addition to this, the person with potential use in human clinical trials Salmonella strain (Salmonella typhi) have also been tested (Taketto (Tacket) et al., 1992). 弱毒化されたリコンビナントサルモネラによるGALTの刺激は、消化管中でのサルモネラ宿主株の少なくとも過渡的な成長を必要とし(ダウガン(Dougan) ら、1989年)、従って外来性のタンパクの発現は宿主に対して直ぐには致命的なものにならない。 Stimulation of GALT by attenuated recombinant Salmonella is at least transient requires growth of Salmonella host strain in the gastrointestinal tract (Daugan (Dougan) et al., 1989), therefore the expression of exogenous proteins in host not a fatal immediately for. 以前の報告(カルボネッティ(Carbonetti)とスパーリング(Sparling)、1987年;ゴッシュリッヒ(Gotschlich)ら、1987年; カルボネッティ(Carbonetti)ら、1988年)によれば、PIなどの幾つかの淋菌タンパクは大腸菌に対して致命的であったことを示した。 A previous report (Karubonetti (Carbonetti) and sparring (Sparling), 1987 years; Ghosh Eirich (Gotschlich) et al., 1987; Karubonetti (Carbonetti) et al., 1988) According to the, some of Neisseria gonorrhoeae, such as PI protein showed that it was lethal to E. coli. 大腸菌とサルモネラ・チフィムリウム(S.typhimurium)は類似しているため(ニードハート(Neid hardt)ら)、淋菌ポーリンタンパクもサルモネラ宿主に対して毒性を有することが予想される。 Since E. coli and Salmonella typhimurium (S.typhimurium) are similar (NEED Heart (NEID Hardt) et al), Neisseria gonorrhoeae porin proteins are also expected to have toxic to Salmonella host. サルモネラ中での淋菌ポーリンタンパクの発現および大腸菌中での無傷の淋菌ポーリンタンパクの発現は、本発明以前においては報告されていない。 Expression of intact Neisseria gonorrhoeae porin protein in Neisseria gonorrhoeae expression of porin protein and E. coli in a Salmonella, in the present invention not previously been reported. 従って、淋菌ポーリンタンパクを発現できるリコンビナントサルモネラまたは大腸菌細胞を構築することが望まれている。 Therefore, it is desirable to construct a recombinant Salmonella or E. coli cells capable of expressing a Neisseria gonorrhoeae porin protein. 特に、淋菌の感染を予防または治療するために、そのようなリコンビナントサルモネラまたは大腸菌細胞を使用したワクチン組成物を生産することが望まれる。 In particular, to prevent or treat infection of Neisseria gonorrhoeae, it is desirable to produce a vaccine composition using such recombinant Salmonella or E. coli cells. 発明の概要本発明は、淋菌ポーリンタンパクまたはその断片を発現するリコンビナントサルモネラ細胞を提供する。 The present invention provides a recombinant Salmonella cells expressing gonococci porin protein or a fragment thereof. また、本発明は、サルモネラ細胞中で淋菌ポーリンタンパクを発現可能なプラスミドを提供する。 Further, the present invention provides an expression plasmid capable gonococcal porin protein in Salmonella cells. このプラスミドは、上記タンパクをコードするDNA、およびサルモネラ細胞中において淋菌ポーリンタンパクが発現できるようにするためにプラスミド中に配置された適切な調節要素とを含有する。 This plasmid contains the appropriate regulatory elements located in the plasmid to gonococcal porin protein to be expressed in DNA, and Salmonella cells encoding the protein. さらに、本発明は、サルモネラまたは大腸菌において抗原を発現するプラスミドを提供する。 Furthermore, the present invention provides a plasmid expressing the antigen in a Salmonella or E. coli. このプラスミドは、上記抗原をコードするDNA、および宿主中において抗原が発現できるようにするためにプラスミド中に配置された、淋菌ポーリンプロモーターなどの好適な調節要素とを含有する。 This plasmid, DNA encoding an above antigens, and antigens in host located in the plasmid to allow expression, containing a suitable regulatory elements, such as Neisseria gonorrhoeae porin promoter. またさらに、本発明は、淋菌ポーリンタンパクを発現するためのプラスミドと、薬学的に許容されるキャリヤーとを含有するリコンビナントサルモネラ細胞を含むワクチン組成物、およびこのワクチン組成物を投与して淋菌の感染を治療または予防する方法を提供する。 Furthermore, the present invention provides a plasmid for expressing the Neisseria gonorrhoeae porin protein, a pharmaceutically acceptable vaccine composition comprising a recombinant Salmonella cells containing a carrier, and infection gonococcal by administration of the vaccine composition the provides a method of treating or preventing. 図面の説明図1は、淋菌株FA19からの完全なpor−1遺伝子の大腸菌への再構成を示す。 Figure legends Figure 1 illustrates the reconstruction of the E. coli complete por-1 gene from gonococcal strain FA19. pUNCH11のSmatからTaqIの720bpの断片は、完全なp or−1プロモーター(開始コドンから上流側の500bpの配列)を含み、そのタンパクの58個のアミノ酸についての配列をコードする。 Fragment of 720bp of the TaqI from Smat of pUNCH11 includes complete p or-1 promoter (sequence from the start codon of the upstream 500 bp), encoding the sequence for 58 amino acids of the protein. pUNCH15のTaqIからSau3AIの820bpの断片は、残りのコード化配列と12b pの下流側por−1配列を含む。 Fragment of 820bp of Sau3AI from TaqI of pUNCH15 includes downstream por-1 sequences of the remaining coding sequence and 12b p. これら2個の断片を、大腸菌宿主M16においてpGEM−2のHincIIおよびBamHI位置の間に連結し、pUNC H30を形成した。 These two fragments were ligated between the HincII and BamHI position of pGEM-2 in E. coli host M16, thereby forming a punc H30. 白抜きのバーは、隣接する非コード化DNA配列を示し、p の文字を添えた小さい白抜きの矢印はプロモーター領域を示し、斜線の入った矢印はporの位置と方向を示し、Ampは全ての図においてβ−ラクタマーゼ遺伝子の位置を示す。 The white bar indicates the non-coding DNA sequences flanking the arrow small white which accompanied the p letters indicate a promoter region, an arrow a slash indicates the location and direction of the por, Amp all indicating the position of the β- lactamase gene in figure. 括弧内の制限部位は構築の間に消失しなかった部位を示す。 Restriction sites in parentheses indicate the sites that did not disappear during the construction. 図2は、大腸菌中の天然のプロモーターからのリコンビナントPor−1 (A,F A19)およびPor−5 (A/B,FA6434)の構成的発現を示す。 Figure 2 shows the constitutive expression of recombinant Por-1 (A, F A19 ) and Por-5 (A / B, FA6434) from the natural promoter in E. coli. 淋菌(2.5ugのタンパク)または大腸菌(10ugのタンパク)の全細胞溶解産物を、PIA(パネルA)またはPIB(パネルB)エピトープに特異的なモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。 Whole cell lysates of Neisseria gonorrhoeae (2.5 ug protein) or E. coli (protein 10 ug), were subjected to Western blotting using a monoclonal antibody specific to PIA (Panel A) or PIB (Panel B) epitopes. レーン1〜3は、それぞれ淋菌株F A19(Por−1 (A) )、FA6434(Por−5 (A/B) )、およびMS11(Por−2 (B) )であり、レーン4〜6は、それぞれプラスミドp GEM−2(挿入なし)、pUNCH30(por−1)、およびpUNCH5 35(por−5)を含む大腸菌株M16を示し、レーン7〜9は、それぞれプラスミドpGEM−2(挿入なし)、pUNCH30(por−1)、およびp UNCH535(por−5)を含む大腸菌株DH5aMCRを示す。 Lanes 1-3, respectively gonococcal strain F A19 (Por-1 (A )), a FA6434 (Por-5 (A / B)), and MS11 (Por-2 (B) ), lane 4-6 (no insert) each plasmid p GEM-2, pUNCH30 (por-1), and pUNCH5 35 (por-5) shows the E. coli strain M16 containing, lanes 7-9 (no insert) each plasmid pGEM-2 , pUNCH30 (por-1), and p UNCH535 shows the E. coli strain DH5aMCR containing (por-5). パネルB の弱いバンドであるレーン5は、レーン6からの溢れを示し、他の類似のブロットでは見られなかった。 Lane 5 is a weak Panel B band indicates the overflow from lane 6, the blots other similar was observed. 図3は、淋菌株MS11からのpor−2遺伝子の大腸菌への再構成を示す。 Figure 3 shows the reconstruction of the E. coli por-2 gene from gonococcal strain the MS 11. (A) は完全なpor−2構造遺伝子の再構成を示す。 (A) shows the reconstruction of a complete por-2 structural gene. プラスミドpUNCH 23は、por−2プロモーター(開始コドンから上流側の157bpの配列) 全体と、por−2 (B,MS11)の最初の105個のアミノ酸をコードするDNA配列とを含む。 Plasmid PUNCH 23 includes a whole (sequences upstream 157bp from the initiation codon) por-2 promoter, and a DNA sequence encoding the first 105 amino acids of por-2 (B, MS11) . プラスミドpUNCH22は、por−2の配列をコードする残余の3'と1.0kbの下流側DNAとを含む。 Plasmid pUNCH22 includes a downstream DNA of 1.0kb and 3 'of the remaining coding sequence of the por-2. バー及び矢印中の格子模様はpo r−2を示す。 Lattice pattern of the bars and in the arrows indicate the po r-2. クローニングは、KpnIとEcoRIを用いてpUNCH22 とpUNCH23を二重消化し、関連する各断片をゲル精製し、それらを結合することで行った。 Cloning was double digested pUNCH22 and pUNCH23 with KpnI and EcoRI, associated with each fragment was gel purified and was carried out by combining them. 完全なpor−2遺伝子の再構成を繰り返し試行したが、極僅かの形質転換しか得られず、血清群PIBエピトープを発現したものが無いか、 好適な大きさのプラスミドが含まれておらず、成功に至らなかった。 Was repeated attempt to reconstruct the full por-2 gene, but obtained only very little transformation, or nothing that expressed serogroup PIB epitope, does not contain a suitable size of the plasmid, It did not lead to success. 上記の結合反応において適切な結合産物が存在したことを確認するために、0.1ulのリゲーション混合物を、por−2から上流側および下流側をアニールするプライマーを用いてPCRを行った。 To confirm that the correct ligation product was present in the above coupling reaction, the ligation mixture 0.1Ul, PCR was performed using primers that annealed upstream and downstream from por-2. 5'オリゴヌクレオチド(5'−GGCGAAT TCCGGCCTGCTTAAATTTCTTA−3')は、加工されたEco RIクローニング部位を含み、発表されているpor−2配列の44〜63bp の配列をアニールする。 5 'oligonucleotide (5'-GGCGAAT TCCGGCCTGCTTAAATTTCTTA-3') includes a processed Eco RI cloning site, annealing sequence of 44~63bp of por-2 sequences have been published. 3'オリゴヌクレオチド(5'−GCGAAGCTTA TTAGAATTTGTGGCGCAGA−3')は、加工されたHindII I部位を含み、por−2配列の1992〜2011bpの配列をアニールする。 3 'oligonucleotide (5'-GCGAAGCTTA TTAGAATTTGTGGCGCAGA-3') includes a processed HindII I site, annealing sequence of 1992~2011bp of por-2 sequence. したがって、PCR生成物は、−10および−35プロモーター領域配列を示すMS11 DNA配列については−10プロモーター領域を含むが、−35プロモーター領域は欠損している(カルボネッティ(Carbonetti) (1988年))。 Thus, PCR products, including -10 promoter region for the MS 11 DNA sequence which shows -10 and -35 promoter region sequences, -35 promoter region is defective (Karubonetti (Carbonetti) (1988 years)) . MS11染色体DNAもポジティブコントロールとして同様に増幅した。 MS11 chromosomal DNA was also amplified in the same manner as a positive control. 増幅条件は、94℃で1分の変性、42℃で30秒のアニール、7 2℃で2分間、合計28サイクルの伸長、および72℃で5分間、最終サイクルの伸長というものであった。 The amplification conditions were one minute denaturation at 94 ° C., 30 sec at 42 ° C. annealing, 7 2 ° C. for 2 minutes, a total of 28 cycles elongation, and 72 ° C. for 5 minutes, was that the last cycle extension. (B)は、PCR生成物を1%アガロースゲル電気泳動によって解析した結果を示す。 (B) shows the results of analyzing the PCR products by 1% agarose gel electrophoresis. レーン1は1kbのはしご型分子量標準(B RL)を示し、レーン2はT4DNAリガーゼを含むpor−2連結反応のPC R増幅を示し、レーン3はT4 DNAリガーゼを含まない模擬的なpor連結反応のPCR増幅を示し、レーン4はMS11染色体のPCR増幅を示し、レーン5はテンプレートDNAを欠いている模擬的なPCR反応を示す。 Lane 1 indicates the 1kb ladder molecular weight standard (B RL), lane 2 represents the PC R amplification of por-2 ligation reaction containing T4DNA ligase, lane 3 does not contain a T4 DNA ligase simulated por ligation shows the PCR amplification, and lane 4 shows the PCR amplification of MS11 chromosome, lane 5 shows a simulated PCR reactions lacking template DNA. パネル(B )のレーン1及び3の増幅された生成物をEcoRIおよびHindIIIを用いて制限酵素処理し、同様に切断・ゲル精製したpGEM3Zf(−)ベクターに連結した。 Lanes 1 and amplified products of third panel (B) was digested with EcoRI and HindIII, and then cut and gel-purified as pGEM3Zf (-) was ligated into the vector. 大腸菌株BL21 DE3〔pLysS〕を形質転換し、1000 を越える数のアンピシリン耐性コロニーを得た。 E. coli strain BL21 DE3 and [pLysS] was transformed to obtain a number of ampicillin resistant colonies of over 1000. モノクローナル抗体(Mab) と、大部分発現した血清群PIBエピトープとを使用したコロニーリフトにより、IPTGを誘導することなくPor生成物について抗アンピシリンコロニーをスクリーニングした。 A monoclonal antibody (Mab), by colony lifts using the most expressed serogroup PIB epitopes were screened anti ampicillin colonies on without Por product to induce IPTG. (C)は、大腸菌形質転換株によるリコンビナントPor −2の発現を示す。 (C) shows the expression of recombinant Por -2 by E. coli transformants. 抗PIBモノクローナル抗体をコロニーリフト中で結合した淋菌(2.5ugのタンパク)または大腸菌(10ugのタンパク)の全細胞溶解産物を、0.1%SDS−12%ポリアクリルアミドのゲル上で電気泳動処理し、PIB特異性のモノクローナル抗体(mAb)を使用してウエスタンブロッティングを行った。 Whole cell lysates of anti PIB monoclonal antibody bound in the colony lift gonococcal (2.5 ug protein) or E. coli (protein 10 ug), electrophoresed on a 0.1% SDS-12% polyacrylamide gels and it was subjected to Western blotting using the PIB specificity of monoclonal antibodies (mAb). レーン1と2は、それぞれ淋菌株MS11(Por−2 (B) Lanes 1 and 2, respectively gonococcal strain MS11 (Por-2 (B) )とFA19(Por−1 (A) )であり、レーン3〜5は、それぞれpUNCH 540(por−2連結から増幅)、pUNCH541(MS11染色体から増幅)、およびpGEM3Zf(−)ベクターコントロールを含むBL21(DE 3)〔pLysS〕大腸菌を示す。 ) And a FA19 (Por-1 (A) ), lane 3-5, respectively PUNCH 540 (amplified from por-2 connection), amplified from pUNCH541 (MS11 chromosomes), and pGEM3Zf (-) BL21 containing the vector control (DE 3) shows the [pLysS] E. coli. 培養はIPTGでは誘導されなかった。 Culture was not induced in IPTG. 図4は、無傷のpor−1プロモーターの後ろにハイブリッドpor遺伝子( 株F6434からのpor−5)を含むプラスミドの構築を示す。 Figure 4 shows the construction of plasmids containing (por-5 from strain F6434) hybrid por gene behind intact por-1 promoter. NcoIおよびSstIIを用いてプラスミドpUNCH30(図1)、およびpUNCH 50を制限酵素処理した。 Plasmid pUNCH30 with NcoI and SstII (Figure 1), and the PUNCH 50 was treated with restriction enzymes. pUNCH30の大きな断片をゲル精製し、ゲル精製したpUNCH50の小断片と連結した。 The large fragment of pUNCH30 was gel purified and ligated with the small fragment of pUNCH50 gel purified. 得られたプラスミドをpUNCH53 5と命名した。 The resulting plasmid was named pUNCH53 5. 斜線の領域はpor−1をコードする配列を示し、格子模様の領域はpor−2をコードする配列を示す。 Shaded areas indicate the sequence encoding the por-1, regions of the lattice pattern represents the sequence encoding the por-2. 図5は、染色体組み込みベクターpDEL−1を使用したFA19 por− 1のサルモネラ染色体への組み込みを示す。 Figure 5 shows the incorporation into FA19 por- 1 of Salmonella chromosome using chromosomal integration vector pDEL-1. プラスミドpDEL−1は、aro Cの殆どが除去された4.1kbのS. Plasmid pDEL-1 is a 4.1kb most aro C was removed S. typhimuriumaroCフランキングDNA(斑点の付けられた箱によって示す)を含む。 typhimuriumaroC flanking DNA (indicated by a box attached speckled). なおここで野性型および欠失aroC配列を網状線によって示す。 Note here indicates a wild type and deletion aroC sequence by cross-hatch. por−1のpDEL−1へのクローニングは、pUNCH30(プロモーターとpor−1の完全なコード化配列とを含む)のHincIIからEcoRIまでのゲル精製した断片を、ベクターpDEL−1のSmaIからEcoRIのゲル精製した大きな断片に連結し、 大腸菌M16とDH5aMCRへ両方に形質転換することによって行った。 Cloning into pDEL-1 of por-1 is, PUNCH30 fragments were gel purified to EcoRI from HincII (including the complete coding sequence of the promoter and por-1), the EcoRI from the vector pDEL-1 of SmaI ligated to a large fragment was gel purified, was carried out by transforming both into E. coli M16 and DH5aMCR. 同様の形質転換株を双方の株から得(制限分析による)たところ、各々がPorに対するエピトープを発現した(図6)。 Where was the same from both strains transformed strain (by restriction analysis), each expressed epitope for Por (Figure 6). 代表としてM16大腸菌形質転換株を選択し、そのプラスミドをpUNCH527と命名した。 Select M16 E. coli transformant strain as a representative, he was named the plasmid PUNCH527. DNA(図示略)をメチル化するためにプラスミドpUNCH527DNAを、S. Plasmid pUNCH527DNA to methylate the DNA (not shown), S. typhimuriu mBRD835(r -+ )に形質転換した。 typhimuriu mBRD835 - was transformed into (r m +). そして、メチル化したプラスミドp UNCH527DNAを、アンピシリンについての選択を行ってS. Then, the plasmid p UNCH527DNA were methylated by performing a selection for ampicillin S. typhi murium polA株BRD207に形質転換した。 It was transformed into typhi murium polA strain BRD207. pUNCH527やp DEL−1のようなColE1レプリコンは、polA突然変異株に複製できないため、アンピシリンの存在下でプラスミドマーカーを染色体に組み込む細菌だけが成長できる(図5の一番下の図を参照)。 ColE1 replicon, such as pUNCH527 and p DEL-1, because you can not replicate in the polA mutant, plasmid markers only bacteria incorporated into the chromosome can be grown in the presence of ampicillin (see the bottom drawing of FIG. 5) . 得られた4つのコロニーの内の一つであるFX501と命名したものは、Por−1 (A.FA19)を弱く発現したのに対し、pDEL−1を用いた形質転換により得た対照形質転換株FX502はP or−1 (A,FA19)を発現しない(図6)。 The resulting four those named is one FX501 of the colonies, whereas the weakly expressed Por-1 a (A.FA19), control transformant obtained by transformation with a pDEL-1 strain FX502 do not express P or-1 (a, FA19 ) ( Fig. 6). 図6は、S. 6, S. typhimuriumにおけるPorの染色体およびプラスミド発現の比較を示す。 It shows a comparison of chromosomal and plasmid expression Por in typhimurium. 0.1%SDS−12%ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動の後、淋菌(2.5ugタンパク)、大腸菌M16(10ugタンパク) 、 またはS. After electrophoresis on 0.1% SDS-12% polyacrylamide gel, Neisseria gonorrhoeae (2.5 ug protein), E. coli M16 (10 ug protein), or S. typhimurium(10ugタンパク)の全細胞溶解産物を、 PIAエピトープに特異的なモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。 Whole cell lysates of typhimurium (10 ug protein) were subjected to Western blotting using a monoclonal antibody specific to PIA epitope. レーン1は淋菌株FA19(Por−1 (A) )を示し、レーン2 はMS11(por−2 (B) )を示し、レーン3と4はそれぞれpDEL−1またはpUNCH527を有する大腸菌M16を示し、レーン5と6はそれぞれp DEL−1またはpUNCH527を有するS. Lane 1 represents a gonococcal strain FA19 (Por-1 (A) ), lane 2 represents the MS11 (por-2 (B) ), lane 3 and 4 show an E. coli M16 having pDEL-1 or pUNCH527 respectively, S., each having a p DEL-1 or pUNCH527 lanes 5 and 6 typhimuriumBRD 835を示し、レーン7はS. Shows the typhimuriumBRD 835, Lane 7 S. typhimuriumFX501(BRD20 7のpUNCH527形質転換株)とFX502(BRD207のpDEL−1 形質転換株)を示す。 typhimuriumFX501 and (BRD20 7 pUNCH527 transformants in) FX502 shows a (pDEL-1 transformant of BRD207). 図7は、asd突然変異株S. 7, asd mutant S. typhimuriumワクチン宿主での使用に適したプラスミドの構築を示す。 It shows the construction of a suitable plasmid for use in typhimurium vaccine host. サルモネラasd遺伝子を含む1.75kb のBglII断片をpYA292から回収し、末端をKlenowを用いて平滑化し、ScaIによって制限酵素処理したプラスミドpUNCH30(por− 1)、pUNCH535(por−5)およびpGEM−2(無挿入)と連結した。 The BglII fragment of 1.75kb including Salmonella asd gene was recovered from pYA292, the ends were blunted with Klenow, the plasmid pUNCH30 (por- 1) which was digested by ScaI, pUNCH535 (por-5) and pGEM-2 It was coupled with (non-insertion). 各結合物を大腸菌X6212asdに形質転換した。 Each conjugate was transformed into E. coli X6212asd. 形質転換株をそれぞれpUNCH537、pUNCH536およびpUNCH539と命名した。 Transformants were named respectively pUNCH537, pUNCH536 and PUNCH539. これらのプラスミドをまずS. These plasmids First S. typhimuriumX3730(r -+ )に移し、次いでマウスワクチン株X4072に移した。 typhimuriumX3730 (r - m +) to transfer, and then transferred to mice vaccine strain X4072. 斜線の領域はpor−1コード配列、格子模様の領域はpor−2コード配列、斑点のバーはasd配列を示す。 Shaded regions por-1 coding sequence, regions of the grating pattern is por-2 coding sequence, spots bars indicate asd sequence. 図8は、asd大腸菌およびS. 8, asd E. coli and S. typhimurium宿主からのporのプラスミド発現を示す。 It shows the plasmid expression por from typhimurium host. 淋菌(2.4ugタンパク)、大腸菌(10ugタンパク)、またはS. Neisseria gonorrhoeae (2.4ug protein), E. coli (10ug protein), or S. typhimurium(10ugタンパク)の全細胞溶解産物を、PIA(A)またはPIB(B)エピトープに特異的なモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。 Whole cell lysates of typhimurium (10 ug protein) were subjected to Western blotting using a monoclonal antibody specific to PIA (A) or PIB (B) epitopes. レーン1〜3はそれぞれ淋菌株FA19(Por−1 (A) )、FA6434(Por−5 (A/B) )およびMS11 (por−2 (B) )を示し、レーン4〜6は大腸菌X6212を示し、レーン7 〜9はS. Lanes 1-3 N. gonorrhoeae strain FA19 (Por-1 (A) ), indicate the FA6434 (Por-5 (A / B)) and MS11 (por-2 (B) ), the lanes 4-6 E. coli X6212 shows, lanes 7-9 is S. typhimuriumX3730を示し、レーン10〜12は、それぞれプラスミドpUNCH539(対照プラスミド、por無し)、 pUNCH537(por−1)およびpUNCH536(por−5)を含む大腸菌およびS. Indicates TyphimuriumX3730, lanes 10 to 12, respectively plasmid PUNCH539 (control plasmid, no por), pUNCH537 (por-1) and E. coli containing pUNCH536 (por-5) and S. typhimuriumの株を示す。 Show the strain of typhimurium. 図9は、断片1〜6に対応する抗原配列を示す。 Figure 9 shows the antigen sequence corresponding to the fragment 1-6. 各断片はN−末端システイン残基を任意的に含有する。 Each fragment contains the N- terminal cysteine ​​residue optionally. アミノ酸の数は、N. The number of amino acids, N. gonorrhoeae菌株F A19(断片1〜4)からのPor−1 (A)のアミノ酸残基、またはN. amino acid residues of Por-1 (A) from gonorrhoeae strain F A19 (fragment 1-4) or N., gon orrhoeae菌株MS11(断片5と6)からのPor−2 (B)のアミノ酸残基に対応している。 gon Orrhoeae strain the MS 11 (fragment 5 and 6) corresponds to the Por-2 amino acid residues (B) from. 図10は、Por−5の表面構造を示す。 Figure 10 shows the surface structure of the Por-5. この図はファン・デル・レイ(ファン・デル・レイ(van der Ley)ら、1991年)によって提案された淋菌ポーリンのモデルに基づくものである。 This figure fan del Rey (Juan del Rey (van der Ley), et al., 1991) is based on the proposed Neisseria gonorrhoeae Pauline model by. 推定の表面露出領域が上部点線の上側に描かれており、膜スパンニング領域が上部点線と下部点線との間に描かれており、周縁質露出領域が下部点線の下側に描かれている。 Surface exposed region of the estimation is depicted on the upper side of the upper dotted line, membrane spanning region is depicted between the upper dotted line and the lower dotted line, periplasmic exposed region is depicted below the lower dotted line . 表面に露出した各ループはローマ数字で番号が付けられている。 Each loop exposed on the surface are numbered with Roman numerals. ボールドの活字は淋菌株FA6434の構築の間に相同的組換え(二重交叉)が生じた領域を示す。 Bold print indicate a region where homologous recombination (double crossover) has occurred during the construction of gonococcal strains FA6434. Por−5を含むpUNC H50のDNA配列決定からPor−5の構造を推定した。 It was estimated structure of por-5 from DNA sequencing of punc H50 containing Por-5. 細菌性のモノクローナル抗体であるSM101、4G5(PIA モノクローナル抗体)、SM24 および15A4A(PIB モノクローナル抗体)はPor−5と結合する。 A bacterial monoclonal antibody SM101,4G5 (PIA monoclonal antibodies), SM24 and 15A4A (PIB monoclonal antibody) binds to Por-5. 図11は、rPor−5に対する免疫応答を示す。 Figure 11 shows the immune response against rPor-5. rPor−5を用いて免疫処置した個々のウサギ(アジュバント群当たり5羽)についてのELISA価を示す。 It shows the ELISA titers for individual rabbits immunized (5 birds per adjuvant group) using rPor-5. 被覆抗原はrPor−1またはrPor−2であった(100ng/ウエル)。 Coating antigen was rPor-1 or rPor-2 (100ng / well). 2次抗体は、ホースラディッシュ・パーオキシダーゼに接合したヤギ抗ウサギであり、1:10,000の希釈率で使用した。 Secondary antibodies are goat anti-rabbit conjugated to horseradish peroxidase, 1: was used at a dilution of 10,000. 免疫前血清は示されておらず、この希釈率におけるそれらのODは0.05未満であった。 Pre-immune sera is not shown, those of OD in the dilution was less than 0.05. 図12は、Porの表面露出エピトープに対する免疫応答のドット・ブロット分析を示す。 Figure 12 shows a dot blot analysis of the immune response to a surface exposed epitope of the Por. 淋菌株FA19(Por−1)、FA6434(Por−5)またはMS11(Por−2)をニトロセルロース(二重カラム)上に固定化し、P or−5血清の1:50希釈液を用いて1時間プローブした。 Gonococcal strain FA19 (Por-1), FA6434 (Por-5) or MS11 and (Por-2) was immobilized onto nitrocellulose (double column), using a 1:50 dilution of P or-5 serum 1 It was time probe. 結合した抗体を検出するためにプロテインAアルカリフォスファターゼ(1:2000)を使用した。 Protein A alkaline phosphatase to detect bound antibody (1: 2000) was used. ドットの左側と右側の番号は各ウサギ(41〜45はアジュバント無し、 46〜50はBCG、51〜55はCFA)を示す。 Each rabbit left and right of the number of dots (41 to 45 adjuvant without, 46-50 is BCG, 51 to 55 is CFA) shows a. 各ウサギの上側の6個のドットは免疫前血清の反応を示し、下側の6個のドットは免疫後の反応を示す。 Six dots above each rabbit shows the reaction of pre-immune sera, the six dots of the lower shows the response following immunization. モノクローナル抗体コントロールは4G5(抗PIA、N末端)と5.51(抗P IB、中央領域)である。 Monoclonal antibody control is 4G5 (anti-PIA, N-terminal) and 5.51 (anti-P IB, the central region). ウサギのデータの一部だけを説明の目的で示す。 Only part of the rabbit of the data shown for purposes of illustration. 元のドット・ブロットでは、陽性反応と陰性反応との間の差がこの再生物に比べてより明確であった。 In the original dot blot, the difference between the positive reaction and negative reaction was more clear than in the recyclate. 元の結果を表1にまとめた。 The original results are summarized in Table 1. 図13は、抗Por−5血清のウエスタンブロッティングを示す。 Figure 13 shows Western blotting of anti-Por-5 serum. 淋菌または大腸菌の全細胞溶解産物(約2×10 7 CFU)を、ドット・ブロット中で三種の(Por−1、Por−2およびPor−5を発現する)淋菌全てと結合する2つの選択された抗血清を用いてウエスタンブロッティングを行った。 Whole cell lysates of Neisseria gonorrhoeae or E. coli (approximately 2 × 10 7 CFU), (expressing Por-1, Por-2 and Por-5) of the three types in the dot blot are two selected that bind to all N. gonorrhoeae Western blotting was performed using anti-serum. レーン1 はFA19を示し、レーン2はFA19 Drmpを示し、レーン3はMS11 を示し、レーン4はMS11 Drmpを示し、レーン5はFA6434を示し、レーン6は大腸菌MC4 100(親、ompAについての野性種)を示し、 レーン7はBre2413 DompAを示し、Preは免疫前を示し、Pos tは免疫後を示す。 Lane 1 shows the FA19, lane 2 represents the FA19 Drmp, lane 3 represents a the MS 11, lane 4 represents the the MS 11 Drmp, lane 5 represents the FA6434, lane 6 E. coli MC4 100 (parent, wild about ompA shows the seeds), lane 7 shows the Bre2413 DompA, pre denotes preimmune, Pos t denotes the post-immunization. ウサギの抗血清を1:1000で希釈し、第二の試薬はプロテインAアルカリフォスファターゼである。 The rabbit antisera diluted 1: 1000, the second reagent is Protein A alkaline phosphatase. パネルAにおいては、追加のアジュバントを用いることなく界面活性剤DBM内で図示のウサギをrPor−5で免疫処理した。 In panel A, it was immunized with rPor-5 rabbits shown in surfactant DBM without using additional adjuvants. パネルBにおいては、KLHをアジュバントとして使用してウサギを免疫処理した。 In Panel B, it was immunized rabbits using KLH as an adjuvant. 図14は、pUNCH50からのpor−5DNA配列を示す。 Figure 14 shows a por-5 DNA sequence from PUNCH50. 発明の開示本発明は、淋菌ポーリンタンパク(Por)を発現するDNAを含有するリコンビナントサルモネラ又は大腸菌細胞を提供する。 Disclosure of the Invention The invention provides a recombinant Salmonella or E. coli cells containing the DNA expressing gonococcal porin protein (Por). PorDNAは、サルモネラ又は大腸菌細胞染色体中、あるいはサルモネラや大腸菌細胞中に挿入された適切なクローニング/発現ベクター中に組み込まれる。 PorDNA is incorporated into Salmonella or E. coli cell chromosome or Salmonella or E. coli appropriate cloning / expression vector inserted into the cell. 本発明の好ましい態様に於いては、この細胞は、淋菌ポーリンタンパクを産生するDNAを有するベクター、 好ましくはプラスミドを含有する。 In a preferred embodiment of the present invention, the cells, the vector comprising a DNA producing gonococcal porin protein, preferably containing plasmid. 好ましくは、このタンパクはサルモネラ又は大腸菌細胞の表面で発現されるが、これらの細胞は抗体産生を刺激することが好ましい。 Preferably, this protein is expressed on the surface of Salmonella or E. coli cells, these cells are preferably to stimulate antibody production. 好ましくは、このタンパクの発現は、高くはなく中程度である。 Preferably, the expression of this protein is moderate rather than high. 他の好ましい態様においては、細胞によって発現されるポーリンタンパクは、哺乳類( 好ましくはヒト)における淋菌感染を防ぐ抗体を生産するために用いられる。 In another preferred embodiment, porin protein expressed by the cell is used to produce antibodies to prevent gonococcal infection in a mammal (preferably a human). 淋菌ポーリンタンパクはPor−1、Por−2、Por−1/Por−2ハイブリッドタンパクの何れでもよい。 Neisseria gonorrhoeae porin protein may be any of Por-1, Por-2, Por-1 / Por-2 hybrid protein. 淋菌ポーリンタンパクは、por−1、p or−2、あるいはpor−5遺伝子によって産生されるタンパクまたはその断片であることが好ましい。 Neisseria gonorrhoeae porin protein, preferably a protein or fragment thereof produced by por-1, p or-2 or por-5 gene. 本明細書では、por−1はN. In the present specification, por-1 is N. gonorrhoe ae株FA19(血清群PIA)から組み立てられるpor遺伝子である。 A por gene assembled from Gonorrhoe ae strain FA19 (serogroup PIA). po r−2はここではN. po r-2 is N. is here gonorrhoeae株MS11(血清群PIB)から組み立てられるpor遺伝子である。 A por gene, which is assembled from gonorrhoeae strain MS11 (serogroup PIB). また、por−5はN. In addition, por-5 is N. gonorrho eae株FA6434から組み立てられるpor遺伝子である(表1と図10参照)。 A por gene assembled from Gonorrho eae strain FA6434 (see Table 1 and Figure 10). por−5は、血清群PIAとPIBからのエピトープを有するクラス9 (カルボネッティ(Carbonetti)ら、1988年)として単離されるハイブリッドPorを発現する。 por-5, the class 9 having an epitope from serogroup PIA and PIB (Karubonetti (Carbonetti) et al., 1988) expresses a hybrid Por that isolated as. por−1、por−2、およびpor−5遺伝子によって産生されるPorタンパクをそれぞれ、Por−1 (A) 、por−2 (B) 、po r−5 (A/B)で示す。 por-1, por-2, and por-5 gene Por protein produced by each, shown in Por-1 (A), por -2 (B), po r-5 (A / B). これらのPorタンパクのフェノタイプは、本明細書では、血清群名と株名を下添字によって、それぞれPor−1 (A,FA19) 、Por−2 (B,MS11) 、Por−5 (A/B,FA6434)のように記す。 Phenotype of these Por proteins, as used herein, the subscript a serogroup name and name of the strain, respectively Por-1 (A, FA19) , Por-2 (B, MS11), Por-5 (A / B, FA6434) referred to as. 血清群PIAやPIB、またはキメラPIA/PIBポーリンタンパクからのN. N. from serogroup PIA and PIB or chimeric PIA / PIB porin protein, gonorrhoeaeポーリンは、リコンビナントサルモネラまたは大腸菌細胞によって発現されうる。 gonorrhoeae porin may be expressed by the recombinant Salmonella or E. coli cells. ポーリンタンパクおよび遺伝子の例は1988年11月23日に出願された国際出願PCT/US88/04225に記載されており、この内容を本明細書の一部として引用する。 Examples of porin proteins and genes are described in International Application PCT / US88 / 04225, filed November 23, 1988, to cite this content as a part hereof.また、ハイブリッドポーリンタンパクは1992年3月13日に出願されたPCT/US92/02090( 完全長ポーリンタンパクおよび遺伝子の断片が好適である)に記載されており、 この内容もまたここに本明細書の一部として引用する。 GOL−1−Tハイブリッド断片。 断片抗原配列を含有する断片であるPor−1 (A) 、Por−2 (B) 、およびPor −5 (A/B)は、潜在的抗原性および/または露出についての一般に受容されている基準に基づいて選択することができる。そのような基準としては、Por−1 (A)およびPor−2 (B)タンパクの表面露出分析によって決定される親水性および相対抗原性指数が挙げられる。抗原性と免疫原性に関し、確実な候補を調製し試験する。図9に示す断片1〜6は好適な抗原配列である。断片1〜4は淋菌株FA19 のPor−1 (A)に見いだされるアミノ酸配列を有する。断片5と6は淋菌株M S11のPor−2 (B)中に見いだされるアミノ酸配列を有する。 por遺伝子を含有するリコンビナントサルモネラまたは大腸菌細胞の調製ポーリンタンパクを発現するリコンビナントサルモネラまたは大腸菌細胞は公知の方法によって生産する事ができる。例えば、ポーリン遺伝子を当該遺伝子の複製ユニットとして機能するプラスミドクローニングベクター中に挿入する。リコンビナントベクターは、適合する宿主細胞、即ちサルモネラまたは大腸菌細胞に挿入し、これによって遺伝子産物が発現される。本明細書に記載するリコンビナントプラスミドによれば、Porタンパクの宿主細胞に対し毒性を有さず、この宿主細胞中での安定した発現が可能である。本発明によれば、Porタンパクは、Por−1 (A)若しくはPor−2 (B)タンパク又はそのハイブリッドのクローニングされた配列を、プラスミド等の適切なクローニング/発現ベクター中に挿入し、大腸菌やサルモネラ菌に挿入することによって生産される。あるいは、前記遺伝子を公知方法によってサルモネラまたは大腸菌染色体に導入することもできる(ストラグネル(Strugnell)ら、Gene、88:57−6 3(1990年)等を参照)。プラスミドや染色体に挿入された挿入遺伝子の転写と翻訳を行うには、遺伝子は、選択された宿主細胞から得た(あるいは選択された宿主細胞との適合性を有する)調節要素の制御下に置かなければならない、好ましくは、この調節要素はポーリンタンパクの天然プロモーターなど、一以上の天然淋菌ポーリンタンパク調節要素を有する。本発明の他の態様に於いては、淋菌ポーリンプロモーターは、大腸菌、サルモネラ菌、あるいはN. gonorrhoeae中で通常発現されないポーリンタンパク以外に、大腸菌、サルモネラ菌、またはN. gonorrhoeae抗原中で発現させるために用いることもできる。希望の抗原を大腸菌やサルモネラ菌において構成的に発現するためには、抗原DNAを淋菌ポーリンプロモーターに融合し、好適なクローニング/発現ベクター(例えばプラスミド)に挿入してさらに大腸菌やサルモネラ菌に挿入する。大腸菌、サルモネラ菌、またはN. go norrhoeae中で淋菌ポーリンプロモーターと融合して発現させる抗原の例としては、例えばBトランスフェリン、ラクトフェリン、ヘム結合タンパク、 およびその他のワクチン候補などの淋菌トランスフェリン結合タンパク、並びに髄膜炎菌タンパクであるFrpA、FrpB、FrpCが挙げられる。インビトロでDNAをベクター中に挿入する方法は多数存在する。 DNAリガーゼは、二重DNA鎖において隣接するヌクレオチド間の一本鎖のニックをシールする酵素である。よってこの酵素は、或る制限酵素によって生産されたアニール付着末端と共有結合的な結合を達成するために用いることができる。あるいは、DNAリガーゼを使用して平滑末端化断片間においてフォスフォジエステル結合の形成を触媒することもできる。最後に、酵素である末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを利用してホモポリマー性の3'−一本鎖テールを断片の末端に形成することもできる;オリゴ(dA)配列を一つのポピュレーションの3'末端に加え、オリゴ(dT)ブロックを第二のポピュレーションの3'末端に加えることにより、二つのタイプの分子はアニールしてダイマー環が形成できる。これらの方法のいずれか、あるいは他の公知の方法を用いて遺伝子セグメントプロモーターと他の調節要素をベクター中の特定の部位に連結することができる。このようにして、Porタンパクをコードする遺伝子は、配列が正しいリーディングフレームにあるようにベクタープロモーターとコントロール要素とに対し特定の関係を保持しながら、選択されたベクター中に連結される。使用されるベクターは、典型的にはアンピシリン耐性やテトラサイクリン耐性などのマーカー機能を有し、これによって形質転換細胞が同定される。使用されるベクターは公知のクローニング若しくは発現ベクターまたはそれらの誘導体であることができる;最もよく用いられるプラスミドベクターとしては、pBR322、pAC 105、pVA5、pACYC177、PKH47、pACYC184、pUB 110、pmB9、pBR325、CoIEI、pSC101、pBR313、 pML21、RSF2124、pCR1、RP4、そして好ましいものとしてp GEMシリーズ(プロメガ社)が挙げられる(好ましいベクターの例は表1参照)。異種タンパクを好ましくは表面に発現するどのようなリコンビナントサルモネラまたは大腸菌も、ポーリンタンパクに対する抗体のインビボでの産生を刺激するために用いることができる。大腸菌やサルモネラ菌は、異種ポーリンタンパクを効果的に発現し、淋菌感染に対し効果的に免疫応答を刺激することが好ましい。好ましい細菌株とプラスミドを下記表1に示す。 ワクチンここにワクチン組成物を調製する各種方法を記載する。 The vaccine described various methods for preparing here in the vaccine composition. 好ましい態様においては、ワクチン組成物はPor−1 (A) 、Por−2 (B) 、ハイブリッドPor (A/B )タンパク、およびこれらの断片など、サルモネラや大腸菌が産生するPorタンパクを含有する。 In a preferred embodiment, the vaccine composition Por-1 (A), Por -2 (B), the hybrid Por (A / B) proteins, and the like of these fragments, Salmonella and E. coli containing Por proteins produced. ワクチンの調製淋菌感染の予防及び処置のためのワクチン組成物の調製には、por遺伝子を好ましくはプラスミド中に含むサルモネラまたは大腸菌細胞が有用である。 The preparation of a vaccine composition for the prevention and treatment of Preparation gonorrhea vaccine, preferably a por gene is useful Salmonella or E. coli cells containing the plasmid. 好ましい微生物宿主は、S.typhimuriumである。 Preferred microbial hosts are S.typhimurium. ワクチンは、水、生理食塩水、エタノール、ポリオール(グリセリンやプロピレングリコール等)、植物油等の通常薬学的に許容される担体、並びに本技術分野で公知のワクチンアジュバンドであるムラミルペプチド、リンフォカイン(インターフェロン、インターロイキン−1、インターロイキン−6等)、あるいは細菌性アジュバンド等と併用する事ができる。 Vaccines, water, saline, ethanol, polyol (glycerol, propylene glycol, etc.), muramyl peptide is usually a pharmaceutically acceptable carrier, as well as known vaccines adjuvant in the art of vegetable oil, lymphokines ( interferons, interleukin-1, interleukin-6, etc.), or can be used in combination with bacterial adjuvant and the like. ここでいう「薬学的に許容される担体」は各種溶剤、分散媒体、コーティング剤、抗菌・抗カビ剤;等張剤、吸収遅延剤等のいずれのものも包含する。 The term "pharmaceutically acceptable carrier" is various solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, including isotonic agents, others any such absorption delaying agents. これらの剤を薬理活性を有する物質に対して使用することは本技術分野で公知である。 It is known in the art that the use of these agents against substances having a pharmacological activity. 従来の媒体が活性成分と適合しない場合を除き、それを治療的組成物中に用いることは本発明の範囲である。 Unless conventional medium is incompatible with the active ingredient, it is the scope of the present invention using the same in therapeutic compositions. 追加の活性成分も使用できる。 Additional active ingredients can also be used. 本発明の特に有用な態様は、活性免疫原がハイブリッドPor−1 (A) /Po r−2 (B)タンパクであるワクチンである。 Particularly useful embodiments of the present invention, the active immunogen is a vaccine which is a hybrid Por-1 (A) / Po r-2 (B) proteins. そのようなワクチンの構成は198 8年11月23日に出願された国際出願PCT/US88/04225中に記載されている。 Such a vaccine of configuration are described in International Application PCT / US88 / 04225, filed in 198 8 November 23. あるいはまた活性免疫原がハイブリッドPor−1 (A) /Por− 2 (B)タンパクの断片であるワクチンも本発明の特に有用な態様であって、そのようなワクチンの構成は1992年3月13日に出願された国際出願PCT/U S92/02090中に記載されている。 Alternatively the vaccine active immunogen is a fragment of a hybrid Por-1 (A) / Por- 2 (B) protein even particularly useful embodiment of the present invention, the configuration of such vaccines March 1992 13 It is described in International application PCT / U S92 / 02090, filed on the date. さらに、このハイブリッドタンパクは、いずれのハイブリッド遺伝子構造(クラス1〜9)のものでもよい(カルボネッティ(Carbonetti)ら、1988年)。 Moreover, the hybrid protein may be any of a hybrid gene structures (classes 1-9) (Karubonetti (Carbonetti) et al., 1988). ハイブリッドPor−1 (A) /Por −2 (B)は、プラスミドpUNCH50、pUNCH535、 pUNCH536に含まれているものであってよい。 Hybrid Por-1 (A) / Por -2 (B) may be those contained in the plasmid pUNCH50, pUNCH535, pUNCH536. ワクチンは、本技術分野で公知の方法によって哺乳類に投与することができる。 The vaccine can be administered to a mammal by methods known in the art. そのような方法としては、例えば、経口投与、静脈投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与が挙げられる。 Such methods include, for example, oral administration, intravenous administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration, and intramuscular administration. 好ましくは経口投与である。 Preferably it is oral. ワクチンは、予防のためには淋菌感染に先立っての投与、治療のためには淋菌感染の期間中の投与とすることができる。 Vaccine for the prevention administration of prior to gonococcal infection, for the treatment may be with the administration of the duration of gonococcal infection. PORポリペプチドまたは抗体を用いたプローブ Porポリペプチドプローブ本発明のリコンビナントサルモネラまたは大腸菌細胞によって好ましくはその表面に発現されたPorポリペプチドを用いて、試料中のポーリンタンパクに特異的な抗体の存在を検出することができる。 Preferably the recombinant Salmonella or E. coli cells probe Por polypeptide probes present invention using the POR polypeptide or antibody using Por polypeptide expressed on the surface, the presence of antibodies specific for porin protein in the sample it is possible to detect. この方法は、ポーリンタンパクに実質的に相同なアミノ酸配列を有するセグメントを含有するポリペプチドを調製することを含む。 The method comprises preparing a polypeptide containing a segment having an amino acid sequence substantially homologous to porin protein. なおこのポリペプチドは本技術分野で公知の方法によって調製することができるが、ポリペプチドはポーリンタンパク中に存在するアミノ酸配列を有するセグメントを包含することが好ましい。 Although the polypeptide can be prepared by methods known in the art, polypeptide is preferably to include a segment having an amino acid sequence present in porin protein. 試料は例えばN. The sample, for example, N. gonorrhoeaeに感染したことが疑われる患者から得ることができる。 It can be obtained from a patient suspected to be infected with gonorrhoeae. 適切なアッセイは本技術分野で公知であり、例えばR. Suitable assays are known in the art, for example, R. H. H. Kennethが“ポリビニルクロライドプレートに付着した細胞を用いるエンザイムリンクト抗体アッセイ”(Kennethら、「モノクローナル抗体」、 プレナム出版、ニューヨーク、376ページ(1981年))に記載している標準ELISAプロトコール等が挙げられる。 "Enzyme Linked antibody assay using adhering to polyvinylchloride plates cells" Kenneth standard ELISA protocol such as that described in (Kenneth et al, "Monoclonal Antibodies", Plenum Press, New York, 376 pages (1981)) can be mentioned It is. 即ち、検出可能な量の抗体に結合するのに十分な濃度の抗原ポリペプチドでプレートをコーティングする。 That is, coating the plates with a sufficient concentration of the antigen polypeptide to bind detectable amounts of the antibody. プレートをポリペプチドでインキュベートした後、 プレートを10%正常ヤギ血清などの適切な阻止剤でブロックする。 The plates were incubated with a polypeptide to block the plate with a suitable blocking agent, such as 10% normal goat serum. 患者血清などの試料を添加しエンドポイントを決定するために滴定する。 Titrated to determine the endpoint by adding a sample such as patient sera. 陽性と陰性のコントロールを同時に加え、未知の試料中に存在する関連抗体の量を定量する。 It added positive and negative controls simultaneously to quantitate the amount of relevant antibody present in the unknown sample. インキュベートに続き、試料を適切な酵素に接合したヤギ抗ヒトIgで探索する。 Following incubation, searching with goat anti-human Ig conjugated samples to the appropriate enzyme. 試料中の抗ポリペプチド抗体の存在は酵素の存在によって示される。 The presence of anti-polypeptide antibodies in the sample is indicated by the presence of the enzyme. Por抗体プローブ本発明のリコンビナントサルモネラまたは大腸菌細胞によって好ましくはその表面に発現されたポーリンタンパクを用いて、試料中にポーリンタンパクが存在するか否かを検出するためのプローブとして用い得る抗体を生産することができる。 Using recombinant Salmonella or preferably porin protein expressed on the surface by E. coli cells Por antibody probes present invention, the production of antibodies that can be used as probes to detect whether there is porin protein in the sample be able to. この抗体はポリクローナルでも、あるいはモノクローナルでもよい。 This antibody be polyclonal, or may be monoclonal. 試料は、N. The samples, N. gonorrhoeaeに感染していることが疑われる、ヒトを含む哺乳類の体液などであることができる。 Suspected of being infected with gonorrhoeae, it can be located in such a mammal body fluids, including humans. 抗体によってポリペプチドを検出する方法は公知である。 Method for detecting the polypeptide by antibodies are known. 例えば、ポリペプチドを固相支持体に固定化する。 For example, to immobilize the polypeptide to a solid phase support. ポリペプチドの固定化は、このポリペプチドに特異的な第一の抗体を固定化することによって達成することができる。 Immobilization of polypeptides can be achieved by immobilizing a first antibody specific for the polypeptide. 固定化された第一の抗体を、前記ポリペプチドを含有していることが疑われる試料と共にインキュベートする。 The first antibody which is immobilized is incubated with a sample suspected of containing the polypeptide. もしポリペプチドが存在するならば、これは第一の抗体に結合する。 If If the polypeptide is present, it binds to the first antibody. 第二抗体もポリペプチドに特異的であり、固定化されたポリペプチドに結合する。 Second antibody also specific for the polypeptide, binds to the immobilized polypeptide. この第二抗体は本技術分野で公知の方法によって標識することができる。 The second antibody can be labeled by methods known in the art. 固定化されなかった物質を洗い流すと、固定化された標識の存在によってがポリペプチドの存在が示される。 When washing out was not immobilized material, the presence of immobilized label is the presence of the polypeptide is shown. この方法およびその他の免疫アッセイについては、D avidらによって記載され、カリフォルニア州ラ・ホーラのハイブリテック, インク. This method and other immunoassays are described by D avid et al, CA La hauler Hybritech of ink. に譲渡された米国特許第4376110号を参照されたい。 See US Patent No. 4376110, which is assigned to. 上述のプローブは本技術分野で公知の方法によって標識される。 The probes described above are labeled by methods known in the art. 抗体を標識する方法は、例えばHunterとGreenwoodによってNature、1 44、945(1962年)およびDavidらによってBiochemist ry、13、1014−1021(1974年)に記載されている。 Methods for labeling antibodies, for example, by Hunter and Greenwood Nature, 1 44,945 (1962 years) and David et al by Biochemist ry, are described in 13,1014-1021 (1974). 抗体を標識するその他の方法は米国特許第3940475号、米国特許第3645090号に記載されている。 Other methods for labeling antibodies have been described in U.S. Patent No. 3940475, U.S. Patent No. 3,645,090. オリゴヌクレオチドプローブを標識する方法は、例えばLe aryら、Natl. Methods for labeling oligonucleotide probes, for example, Le ary et, Natl. Acad. Acad. Sci. Sci. USA(1983年)80:4045 :RenzとKurz、Nucl. USA (1983 years) 80: 4045: Renz and Kurz, Nucl. Acids. Acids. Res. Res. (1984年)12: 3435;RichardsonとGumport、Nucl. (1984) 12: 3435; Richardson and Gumport, Nucl. Acids Res. Acids Res. (1983年)11:616 7;Smithら、Nucl. (1983) 11: 616 7; Smith et al., Nucl. Acids Res. Acids Res. (1985年)13:23 99;および、MeinkothとWahl、Anal. (1985) 13:23 99; and, Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem. Biochem. (1 984年)138:267に記載されている。 It described in 267 (1 984 years) 138. 標識は放射性であり得る。 The label may be radioactive. 有用な放射性標識の例としては、 32 P、 125 I、 131 Examples of useful radioactive labels, 32 P, 125 I, 131 I、 3 Hが挙げられる。 I, 3 H and the like. 放射性標識の使用については、英国特許第203432 3号、米国特許第4358535号、および米国特許第4302204号に記載されている。 The use of radioactive labels is described in British Patent No. 203,432 3, U.S. Patent No. 4,358,535, and U.S. Patent No. 4,302,204. 非放射性の標識の例としては、酵素、発色団、電子顕微鏡で検出可能な原子や分子、さらに自己の磁性によって検出され得る金属イオンが挙げられる。 Examples of non-radioactive labels, enzymes, chromophores, detectable atoms and molecules by electron microscopy, and metal ions which can be detected by further self-magnetic. 有用な酵素標識は、基質に検出可能な変化をもたらすことが出来るものである。 Useful enzyme labels are those that can result in a detectable change in a substrate. 有用な酵素と基質の例としては、西洋ワサビペロキシダーゼ(ピロガロールとo−フェニレンジアミン)、β−ガラクトシダーゼ(フルオレセインβ−ガラクトピラノシド)およびアルカリフォスファターゼ(5−ブロモ−4−クロロ−3 −インドリルフォスフェート/ニトロブルーテトラゾリウム)が挙げられる。 Examples of useful enzymes and substrates, horseradish Perot Kishida over peptidase (pyrogallol and o- phenylenediamine), beta-galactosidase (fluorescein beta-galactopyranoside) and alkaline phosphatase (5-bromo-4-chloro-3 - Inn drill phosphate / nitroblue tetrazolium) can be mentioned. 酵素標識の利用については、英国特許第2019404号、ヨーロッパ特許第63 879号、さらにRotman、Proc. The use of an enzymatic label, British Patent No. 2019404, European Patent No. 63 879 No., further Rotman, Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. Sci. 、4 7、1981−1991(1961年)に記載されている。 , It has been described in 4 7,1981-1991 (1961). 有用な発色団としては例えば、蛍光物質、化学発光物質、および生物発光物質の各分子、並びに染料が挙げられる。 Useful chromophores for example, fluorescent substance, chemiluminescent substance, and each molecule of bioluminescent materials, as well as dyes. 本発明において特に有用な発色団としてはフルオレセイン、ローダミン、テキサス・レッド、フィコエリトリン、ウンベリフェロン、ルミノールが挙げられる。 Particularly useful chromophore in the present invention fluorescein, rhodamine, Texas red, phycoerythrin, umbelliferone, luminol. 標識は、本技術分野で公知の方法によって抗体あるいはヌクレオチドプローブに接合することができる。 The labels may be conjugated to an antibody or nucleotide probe by methods known in the art. 標識はプローブ上の官能基によって直接的に付着させることができる。 The label can be directly attached by a functional group on the probe. プローブはそのような官能基を含有するものであるか、あるいは含有するように誘導することができる。 The probe can be induced to do those containing such functional groups, or contain. 好適な官能基の例としては、例えばアミノ、カルボキシル、スルホヒドリ、マレイミド、イソシアネート、イソチオシアネートが挙げられる、 標識は、上記の方法によってプローブに付着せしめたリガンドと、標識に付着した当リガンドに対するレセプターによってもまたプローブに接合することができる。 Examples of suitable functional groups, such as amino, carboxyl, Suruhohidori, maleimide, isocyanate, isothiocyanate and the like, the label is a ligand by adhering to the probe by the above method, the receptor for those ligand attached to the label It can also be bonded to the probe. 公知のリガンド−レセプターの組合せはいずれも好適である。 Known ligand - combinations of receptors is suitable both. ビオチン− アビジンの組合せが好ましい。 Biotin - avidin combination is preferred. 実施例以下の実施例は本発明の理解を容易にするために記載するものであって、本発明がこれによって如何なる様にも限定されると解釈されてはならない。 The following examples examples are those described for easy understanding of the present invention, it should not be construed as the present invention is hereby limited to any manner. 以下の実施例には、ベクターおよびプラスミドの構築、ポリペプチドをコードする遺伝子をそのようなベクターやプラスミドに挿入すること、またプラスミドを宿主に導入するために用いられる従来の方法の詳細な記述は含まれていない。 The following examples, the construction of vectors and plasmids, inserts the gene encoding the polypeptide into such vectors and plasmids, also detailed descriptions of conventional methods used to introduce the plasmid into the host not included. そのような方法は本技術分野における当業者の熟知するところであり、Sambrook, J、Fritsch,E. Such methods are about to familiar of those skilled in the art, Sambrook, J, Fritsch, E. F、およびManiatis,T(1989年)による“分子クローニング:実験室手引き”(第2版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版)をはじめとする数多くの出版物に記載されている。 F, and Maniatis, T (1989 years) According to "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press) are described in numerous publications, including. 以下の実施例は、大腸菌とS. The following examples are E. coli and S. typhimurium中で、ある無傷のpo r遺伝子(por−1、por−5)がプラスミド上に存在する場合それらのプロモーターから、あるいはサルモネラ染色体(por−1のみ)から、これらの遺伝子を安定に発現させたものである。 In typhimurium, from one intact po r gene (por-1, por-5) from their promoters when present on a plasmid, or Salmonella chromosome (por-1 only), were stably express these genes those were. さらに、無傷のプロモーターからの高いレベルの発現が致死的であるのは当然であるが、por−2の完全なプロモーター領域なしでクローニングした時に、毒性なく大腸菌中でpor−2を発現させた。 Furthermore, although the high level of expression from the intact promoter is lethal is natural, when cloned without complete promoter region of the por-2, was expressed por-2 toxicity without E. coli. 大腸菌において試験したpor遺伝子の全形態がその高レベル発現で大腸菌にとって致死的であった(E.coli BL21(DE3)[pLysS]で分解したPorの高レベル導入)。 All forms of por genes tested in E. coli was lethal to E. coli at that high level expression (E.coli BL21 (DE3) high level introduction of decomposed Por in [pLysS]). porの大腸菌中におけるクローニングとプラスミド発現 Por−1 (A) 、Por−2 (B) 、およびハイブリッドPor−1 (A/B)形態のPorを再構成し、大腸菌中で発現させた。 Cloning and plasmid expression Por-1 (A) in E. coli in a por, Por-2 (B) , and reconfigure the hybrid Por-1 (A / B) forms of Por, was expressed in E. coli. 淋菌por−1(Por−1 (A) ) プロモーターを用いてPor−1 (A)とハイブリッドPor−1 (A/B)の各Porタンパクを発現させた。 Gonococcal por-1 was (Por-1 (A)) to express Por-1 (A) and the Por proteins Hybrid Por-1 (A / B) using a promoter. Por−1 (A) 淋菌株FA19(Por−1 (A) )(株とプラスミドのリストは表1参照)からのpor−1遺伝子を再構成し(pUNCH30、図1)M16(図2のレーン5)において自身のプロモーターから安定に発現させた。 Por-1 (A) gonococcal strain FA19 (Por-1 (A) ) ( list of strains and plasmids Table 1) to reconfigure the por-1 gene from (pUNCH30, Figure 1) M16 (of FIG. 2 lanes 5) was stably expressed from its own promoter in. さらに研究を重ねることにより、E. By further overlapping research, E. coli DH5aMCR(図2のレーン8)、DH5aF' およびHB101がpUNCH30で形質転換され、明白な毒性なしにPor− 1 (A,FA19)を発現しうることが判明した。 coli DH5aMCR (lane 8 of FIG. 2), DH5aF 'and HB101 were transformed with PUNCH30, it has been found capable of expressing the without apparent toxicity Por- 1 (A, FA19). Por−2 (B) Por-2 (B) por−2プロモーター領域全体(即ち、淋菌−35領域を欠失するが淋菌− 10領域を含有する領域)を用い、大腸菌中において、比較的弱いが安定なPo r−2 (B,MS11)の発現が達成された。 por-2 promoter region the overall (ie, lacking the gonococcal -35 region gonorrhoeae - a region containing 10 regions) using, in E. coli, relatively weak stable Po r-2 of the (B, the MS 11) expression has been achieved. プロモーター配列(淋菌ポーリンプロモーターの−35および−10領域)は、カルボネッティ(Carbonetti)ら(198 8年)の文献中に、MS11のPIB遺伝子のDNAおよびアミノ酸配列に示されている。 Promoter sequences (-35 and -10 regions of the Neisseria gonorrhoeae Porin promoter) is in the literature of Karubonetti (Carbonetti) et (198 1996), is shown in DNA and amino acid sequences of the PIB gene the MS 11. por−2遺伝子をMS11(Por2 (B) )株からその無傷のプロモーターによって再構成するための試みの幾つかは、形質転換においてE. Several attempts for a por-2 gene reconfigured by MS11 (Por2 (B)) that the intact promoter from strain, E. in transformed coli M 16とDH5aMCRおよびS. coli M 16 and DH5aMCR and S. typhimuriumX3730をレシピエントとして使用したにも関わらず、これまで成功しなかった(カルボネッティ( Carbonetti)ら、1988年)。 typhimuriumX3730 Despite the was used as a recipient, it was not successful up to now (Karubonetti (Carbonetti) et al., 1988). トライされたpor−2の連結物が組み立てられたpor−2遺伝子を含有するか否かをテストするために、pUNCH22の4.7kb EcoRI〜KpnI断片とpUNCH23の469bpEcoR I〜KpnI断片とを含むpor−2連結反応を、組み立てられた遺伝子からの1kbの産物を生じると予測されたプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応( PCR)によって行った(図3A)。 To test whether containing por-2 gene conjugate is assembled tri been por-2, por comprising a 469bpEcoR I~KpnI fragment 4.7 kb EcoRI~KpnI fragment pUNCH23 of pUNCH22 -2 ligation reaction was carried out by polymerase chain reaction using the predicted primers to result in a product of 1kb from the assembled gene (PCR) (FIG. 3A). この反応をアガロースゲルで分析すると、 連結物からPCRの主要産物として1kbのバンドを再現可能に生じ、またコントロールPCR増幅はMS11染色体から生じた(それぞれ図3Bのレーン2と4)。 Analysis of this reaction by agarose gel, occur reproducibly band 1kb as the major product of PCR from the ligation, also the control PCR amplification resulted from MS11 chromosome (lane 2, respectively, in FIG 3B 4). 連結反応(図3Bのレーン2)から、およびMS11染色体(図3Bのレーン4)からの増幅されたPCR断片をクローニングし、両クローン( pUNCH540と541)は大腸菌中で完全長のPor−2 (B,MS11)を発現した(それぞれ図3Cのレーン3と4)。 Ligation from (lane 2 in FIG. 3B), and MS11 chromosome cloning the amplified PCR fragments from (lane 4 in Fig. 3B), both clones (PUNCH540 and 541) is Por-2 full-length in E. coli ( B, the MS 11) expressed (lanes 3 and 4, respectively, of FIG 3C). pUNCH540と541は両方とも淋菌−35プロモーター配列を欠くが−10プロモーター配列は含有するため、大腸菌中での発現は−35配列を要求しないか、あるいは誘導がない場合にはベクターの上流T7プロモーターから始まる転写が存在した。 pUNCH540 and 541 for both lacking gonococcal -35 promoter sequence is -10 promoter sequence contains either expression in E. coli are not required to -35 sequence, or if induction is not from an upstream T7 promoter of the vector begin the transfer was present. これらのデータはpo r−2の全プロモーター(−35と−10)領域を含む構築物によりPor−2 (B,MS11) −発現形質転換体が得られなかったことは、遺伝子の適切な再構成以外の問題によるものであることを示唆している。 These data all promoters po r-2 (-35 and -10) Por-2 by the constructs containing regions (B, the MS 11) - the expression transformant is not obtained, suitable gene rearrangement suggesting that is due to other problems. さらに、得られた結果は、Por −2 (B,MS11)が大腸菌中で弱くはあるが安定に発現されることを示した。 Furthermore, results obtained, Por -2 (B, MS11) but is weak is in E. coli showed that it is expressed stably. Por−5 (A/B)クラス9ハイブリッド Por−1 (A)モノクローナル抗体、Por−1 (B)モノクローナル抗体の両者に対するエピトープを有するインタータイプのハイブリッドポーリン(クラス9 ハイブリッドと記す)を発現する淋菌を構築した(カルボネッティ(Carbonetti )ら)。 Por-5 (A / B) Class 9 N. gonorrhoeae expressing hybrid por-1 (A) monoclonal antibody, Por-1 (B) inter-type hybrid porins having epitopes for both monoclonal antibodies (referred to as class 9 hybrid) was constructed (Karubonetti (Carbonetti) et al.). 上記クラス9ハイブリッドポーリンはPor−1 (A,FA19)のNおよびC末端ドメインとPor−2 (B,MS11)の中央ドメインを有する(カルボネッティ(Carbon etti)ら、1988年)。 The class 9 hybrid porin has a central domain of Por-1 (A, FA19) of N and C-terminal domain and Por-2 (B, MS11) ( Karubonetti (Carbon etti) et al., 1988). pGEM−2中で淋菌株FA6434からそれ自身のプロモーターなしでハイブリッドポーリン(Por−5 (A/B,FA6434) )に対し遺伝子(por−5)をクローニングしてプラスミドpUNCH50を得た(表1 )。 pGEM-2 hybrid porin without its own promoter from Neisseria gonorrhoeae strain FA6434 in (Por-5 (A / B , FA6434)) to obtain a plasmid pUNCH50 by cloning the gene (por-5) (Table 1) . 大半のクラス9タンパクは(中央のPor−2 (B.MS11)表面−露出領域を除けば)、Por−1 (A,FA19)であったので、毒性無く大腸菌中でpor−5を構成的に発現させることができた。 Most Class 9 protein (middle Por-2 (B.MS11) surface - with the exception of exposed area), since a Por-1 (A, FA19), constitutive of the por-5 toxic without E. coli It could be expressed in. 無傷por−プロモーターの後方のpor−5 のクローニングは成功し、pUNCH535(図4)が得られた。 The cloning of the por-5 behind the intact por- promoter successful, pUNCH535 (Figure 4) was obtained. これはPor −1 (A,FA19)およびPor−2 (B,MS11)に対するエピトープを発現した(図2) 。 It expressed the epitope for Por -1 (A, FA19) and Por-2 (B, MS11) ( Figure 2). このようにして完全長のPor−1 (A,FA19) 、Por−2 (B.MS11) 、並びにP or−5 (A/B,FA6434)ハイブリッドの再構成と発現を達成した。 In this way, the full-length Por-1 (A, FA19) , Por-2 (B.MS11), as well as to achieve a P or-5 (A / B , FA6434) reconstruction and expression of the hybrid. ただし、Por −2 (B.MS11)の発現においては、毒性の問題を避けるためにプロモーター領域を変更する必要があった。 However, in the expression of Por -2 (B.MS11), it was necessary to change the promoter regions in order to avoid toxicity problems. porのサルモネラ中におけるクローニングと発現 a)染色体発現 クローニングされた淋菌por−1遺伝子のS. Cloning and Expression a) S. chromosomal expression cloned gonococcal por-1 gene in Salmonella in por typhimurium株B RD207染色体に対する組み込みの結果、株FX501を得た(図5)。 typhimurium strain B RD207 result of incorporation for chromosome to obtain a strain FX501 (Figure 5). po r−1とaroCに対するプローブを用いてサザンブロッティング分析でFX5 01とFX502(ベクタpDEL−1が染色体に組み込まれたコントロールサルモネラ株)を分析すると、プラスミドpUNCH527およびpDEL−1のどちらも一回の交叉でaroCからみて上流に組み込まれたことを示した。 When Southern blotting analysis FX5 01 and FX502 analyzing (vector pDEL-1 controls Salmonella strains integrated into the chromosome) using probes for po r-1 and aroC, both plasmids pUNCH527 and pDEL-1 once showed that the incorporated upstream as viewed aroC in crossover. po r−1のシングルコピーがサルモネラ染色体に存在する場合、マルチコピー発現プラスミドからの発現に比較してPor−1 (A,FA19)の発現は普通程度であった(図6)。 If single copy of po r-1 is present in the Salmonella chromosome, the expression as compared to expression from a multicopy expression plasmid Por-1 (A, FA19) it was usually about (Figure 6). b)プラスミド発現 Curtissと彼の同僚によって開発された安定な発現系(Galanら、 1990年、ナカヤマら、1988年)を用いてPorをサルモネラのプラスミド発現系に導入した。 b) plasmid expression Curtiss and his stable expression system which has been developed by co-workers (Galan et al., 1990, Nakayama et al., Por using the 1988) was introduced into the plasmid expression system of Salmonella. この系は、欠損アスパルテートB−セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ(asd)染色体遺伝子をプラスミドでコードされたasd遺伝子で補足するという考えに立つものである(ナカヤマら、1988年;Galan ら、1990年)。 This system is deficient in aspartate B- semialdehyde dehydrogenase (asd) chromosomal gene intended to stand on the idea of ​​supplemented by asd genes encoded by plasmids (Nakayama et al., 1988; Galan et al., 1990). Asdは、哺乳類細胞には存在しないにも関わらず細菌においてはその細胞壁の必須成分であるジアミノピメリン酸(DAP)の合成に関与している酵素である。 Asd is the enzyme in the bacteria despite not present in mammalian cells involved in the synthesis of an essential component of diaminopimelic acid in the cell wall (DAP). 染色体の遺伝子座asdで突然変異を起こしプラスミドを喪失した細菌はDAPを合成することができず、野性型のasd遺伝子がトランスで与えられないかぎりインビボでは成長できない(Galanら、1990年、ナカヤマら、1988年)。 Bacteria that have lost the plasmid mutated in chromosomal locus asd can not synthesize DAP, asd genes of wild type can not be grown in vivo unless given in trans (Galan et al., 1990, Nakayama et al. , 1988). このように、asdプラスミドはasd宿主中の抗生物質的圧力がない場合にはインビトロおよびインビボで安定なままである( 表1)。 Thus, asd plasmid remains stable in vitro and in vivo in the absence antibiotic pressure in asd host (Table 1). pYA292から得たasd遺伝子を含むBglII断片をクレノー断片で十分平滑末端化してpUNCH30とpUNCH535のScaI部位にクローニングしてそれぞれpUNCH537とpUNCH536を形成した。 The BglII fragment containing the asd gene was obtained from pYA292 sufficiently blunted with Klenow fragment to form a respective pUNCH537 and pUNCH536 and cloned into ScaI site of pUNCH30 and pUNCH535 with. por −1遺伝子とpor−5遺伝子のサブクローニングの詳細を図7に示す。 The por -1 gene and por-5 gene Subcloning details shown in FIG. またa sd宿主中でのPorの発現を図8に示す。 Also shown in FIG. 8 expression Por in a sd host. 上記の系においてPor−1 (A,FA19)およびPor−5 (A/B,FA6434)双方が多量に作成され、Porの量は淋菌が典型的に作る量の1/5と見積もられる。 Created in the system Por-1 (A, FA19) and Por-5 (A / B, FA6434) both in a large amount, the amount of Por is estimated to be 1/5 of the amount of Neisseria gonorrhoeae make typically. 淋菌は一細胞あたり100,000〜300,000コピーのPorを含有していると信じられているので(Joinerら、1985年)、本発明のリコンビナントサルモネラは一細胞当たり20,000〜60,000コピーのPorを生じる。 Because N. gonorrhoeae is believed to contain Por of 100,000 to 300,000 per cell copy (Joiner et al., 1985), recombinant Salmonella of the present invention per cell 20,000-60,000 produce a copy of the Por. Porタンパクはサルモネラ菌中において、検出可能なタンパク分解を起こさず安定であると観察された(図8)。 Por proteins during Salmonella was observed to be stable without causing detectable proteolysis (Figure 8). 抗Porモノクローナル抗体を用いて全細胞をドット分析に付した結果、Porは、S. Results Whole cell with an anti-Por monoclonal antibodies were subjected to dot analysis, Por is, S. typhimuriumのX 4072株を除き、Porプラスミドを含有する全試験サルモネラおよび大腸菌において細胞表面に露出していた。 Except X 4072 strain typhimurium, it was exposed on the cell surface in all test Salmonella and E. coli containing Por plasmid. この株においてPorタンパクが存在するにも関わらずこのタンパクが検出されない理由は、この株に存在するが他には存在しないスムーズLPSによってPorがシールドされるためと考えられる。 The reason why the protein despite Por proteins are present is not detected in this strain is present in this strain is considered to be because Por is shielded by the smooth LPS which is not present in the other. 毒性試験 S. Toxicity test S. typhimuriumのX4072株(pUNCH537、536、5 39を含有)において、Luria−Bertaniブロス中で成長曲線を得る試験を行い、Por−1 (A,FA19)とPor−5 (A/B,FA6434)の毒性を試験した。 In X4072 strain typhimurium (containing pUNCH537,536,5 39), were tested to obtain a growth curve in Luria-Bertani broth, Por-1 (A, FA19 ) and Por-5 of (A / B, FA6434) It was tested for toxicity. ベクターのみを含有するコントロールと比較して、Porを発現する両株間で成長率に明確な差は無かった。 Compared to controls containing the vector alone, a clear difference in growth rates in both strains expressing Por did. pUNCH30を配列決定を行い、宿主大腸菌およびサルモネラ菌に対する予期しなかった毒性欠如は突然変異によるものであるか否かを調べた。 It was sequenced to PUNCH30, toxicity lack of unexpected to host E. coli and Salmonella was examined whether or not due to mutations. 当初報告された(カルボネッティ(Carbonetti)とスパーリング(Sparling)、1987年;エルキンス(Elkins)らによって1992年に修正)por−1配列と本発明におけるpor−1配列の間には差異は認められなかった。 Was initially reported; observed differences between the por-1 sequences in (Karubonetti (Carbonetti) and sparring (Sparling), 1987 year modified in 1992 by Elkins (Elkins) et al) por-1 sequence and the present invention It is did not. 淋菌ハイブリッドポーリンでの免疫による、淋菌の両血清群に対する抗体の導入以下の実施例によって、rPor−5でウサギを免疫した時の、PIAとPI Bに対して免疫応答を引き起こす能力を種々のアジュバンドについて説明する。 By immunization with gonococcal hybrid Pauline, introduced by the following examples of antibodies to both serogroups gonococcal, when immunized rabbits with rPor-5, PIA and PI various adjuvant ability to elicit an immune response against B the band will be described. 実験手続リコンビナントPor−5を比較的非変性的な条件下で精製した。 It was purified in a relatively non-denaturing conditions the experimental procedures recombinant Por-5. ニュージーランド白色ウサギを、次のアジュバンドと混合した精製Por−5(100ug )で隔週ごとに4回免疫した:アジュバンドなし、完全フロインド/不完全フロインド、キーホールリンペットヘモシアニン、Ribi、Bacille Ca lmet−Guerin、水酸化アルミニウム。 New Zealand White rabbits were immunized four times every other week with the following adjuvant mixed with purified Por-5 (100ug): No adjuvant, complete Freund's / incomplete Freund's, keyhole limpet hemocyanin, Ribi, Bacille Ca lmet -Guerin, aluminum hydroxide. 血清は、免疫前と4回目の免疫後一週間経過時に採取した。 Sera were collected at one week elapsed after the pre-immune and fourth immunization. 免疫学的検定はHarlowとLane(Harl owとLane、1988年)の記載に従って実施した。 Immunological assays were performed as described in Harlow and Lane (Harl ow and Lane, 1988 years). 結果 ELISAの力価は、rPor−1またはrPor−2を被覆抗原として使用した1:5000希釈(図11)条件下において、全てのウサギが検出可能な抗Por活性を有することを示した。 Results ELISA titers, RPor-1 or rPor-2 was used as coating antigen 1: In 5000 dilution (Fig. 11) conditions showed that all rabbits have detectable anti-Por activity. Por−5ハイブリッドからのPor−1ドメインは、Por−5ハイブリッドのPor−2(中央)ドメインよりも常に免疫原性が高かった。 Por-1 domain from Por-5 hybrid, was always higher immunogenic than Por-5 hybrid of Por-2 (middle) domain. 全淋菌上の表面露出エピトープに対する結合の度合いを評価するために、固定化した淋菌を用いてドットブロッティングを行った。 To assess the degree of binding to the surface-exposed epitopes on all gonococcal were dot blotting using immobilized Neisseria gonorrhoeae. 図12に示すように全ての免疫後血清は淋菌FA19(Por−1)株に結合したが多くはMS11(Por−2)には結合しなかった。 All post-immune sera as shown in FIG. 12 is a lot has been bound to gonococcal FA19 (Por-1) strain did not bind to MS11 (Por-2). しかしながら、ドット・ブロッティングによるMS11に対する免疫応答を各アジュバンド群それぞれの間で比較すると、アジュバンドなしの群は他の5群のアジュバンド有りの群より良く応答した。 However, when the immune response to MS11 by dot blotting compared between each of adjuvant group, the group without adjuvant responded better than the group of there adjuvant other five groups. アジュバンドなしの5羽のウサギ中4羽においてMS11ウェルの全細胞に対する結合が見られた。 Binding was observed for whole cells of MS11 well in 5 birds 4 birds in rabbits without adjuvant. ドット・ブロッティングにおいて、全淋菌に対する免疫応答がPorに特異的であったことを確認するために、アジュバンド無投与群から選択されたウサギの血清について改変ウェスタン・ブロッティングを行った(図13)。 In dot blotting, immune response against all Neisseria gonorrhoeae in order to confirm that was specific to Por, were serum for the modified Western blotting of rabbit selected from adjuvant untreated group (Figure 13). 全ての免疫後血清がPor−1、Por−2、およびPor5を認識したが、いくつかの免疫前および/または免役後の血清はPor以外の淋菌抗原を認識した。 While all immune after sera recognized the Por-1, Por-2, and Por5, some preimmune and / or serum after immunized recognized the gonococcal antigens other than Por. 例えば、 ウェスタン・ブロッティングの結果、幾つかのウサギ血清において大腸菌Omp Aとの反応性が観察された(図13)。 For example, Western blotting results were observed reactivity with E. coli Omp A in some rabbit serum (Figure 13). OmpAは淋菌Rmp(PIII)に部分的に相同であることが示されており(Goschlichら、1987年)、 またOmpA様のタンパクはグラム陰性菌において普通に見られるものである。 OmpA is shown to be partially homologous to gonococcal Rmp (PIII) (Goschlich et al, 1987), also OmpA-like protein are those commonly found in Gram-negative bacteria. これら二つのタンパクの間の相同領域はC末端ドメインに存在し、このドメインは大腸菌では表面露出していないと信じられているので、この類推により淋菌でも表面露出していないと考えられる。 These homologous regions between the two proteins are present in the C-terminal domain, this domain is believed to not surface exposed in E. coli, it is considered not exposed surfaces in gonococcal this analogy. Rmpは免疫原性で、抗por抗体やその他の抗体によって淋菌が細菌的に殺傷死滅させられるのをブロックする抗体を包含することができる(Riceら、1986年;VirjiとHeckels、 1988年)。 Rmp immunogenic, it is possible to include antibodies Neisseria gonorrhoeae by anti por antibodies or other antibodies to block from being allowed to bacterial kills killed (Rice et al., 1986; Virji and Heckels, 1988 years). 免疫前および免疫後の両血清において、強いE. In both serum after the pre-immune and immune, strong E. coli Om pAとの反応が見られたが、ウェスタン・ブロッティング(図13)や放射免疫沈降法によってはRmpに対する反応はほとんど無いかあるいは全く無かった。 coli The reaction with Om pA was observed, the reaction or were totally not or hardly for Rmp by Western blotting (Fig. 13) and radioimmunoprecipitation. このことはOmpAの非保存領域が保存領域に比べてより免疫原性が高いことを示唆している。 This suggests a higher more immunogenic than non-conserved regions conserved region of OmpA. この実施例のPor−5ハイブリッドタンパク中で見いだされたPor−1およびPor−2配列のうち、Por−1(N−およびC−末端配列)は、用いたアジュバンドや評価方法(ELISAまたはドット・ブロッティング)とは無関係に、Por−2(中央領域配列)よりもより免疫性が高かった。 Of Por-5 hybrid protein Por-1 and Por-2 sequence were found in this embodiment, Por-1 (N-and C- terminal sequences), adjuvant and evaluation methods used (ELISA or Dot blotting) and independently, more immunity is higher than Por-2 (central region sequences). しかしながら、アジュバンドなしでPor−5を投与された群は、他の全てのアジュバンド群と比較してPor−2表面露出配列に比較的よく応答した。 However, the group administered Por-5 without adjuvant responded relatively well to Por-2 surface exposure sequence was compared to all other adjuvants group. 追補的実施可能性添付特許請求の範囲に記載の本発明は、本明細書の記載に従い、容易に入手できる記載の参考文献と出発物質を用いて実施できるものである。 The present invention described in the scope of Supplement feasibility appended claims in accordance with the description herein, those that can be carried out using the reference and the starting materials according readily available. さりながら、本発明における製造、使用をより容易なものとするために、以下に記す細胞株がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(メリーランド州、ロックヴィル)から入手可能であることをここに記す。 Tumbled while, manufactured according to the present invention, in order to make easier the use referred here to available cell lines described below are the American Type Culture Collection (Maryland, Rockville) from . また、下のリストに掲載されたプラスミドを担持する次の大腸菌株がアグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクション(NRRL)(イリノイ州、 プレトリア)あるいはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATC C)(メリーランド州、ロックヴィル)に寄託済であり、次のように受託番号を割り当てられている。 In addition, the following E. coli strains carrying the listed plasmids in the list below the Agricultural Research Culture Collection (NRRL) (Illinois, Pretoria) or the American Type Culture Collection (ATC C) (Maryland state, is already deposited in Rockville), it has been assigned the accession number in the following manner. 各寄託株は、本発明の一例を単に例証する目的で掲げたものであって、機能的に等価であるいかなる細胞株も本発明の範囲内に入るものである。 Each deposited strain, be those listed for the purpose of merely illustrative examples of the present invention, any cell lines that are functionally equivalent are also intended to fall within the scope of the present invention. 上記寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約およびこれに基づく規定(ブダペスト条約)によってなされたものである。 The deposit has been made by the provision under the Budapest Treaty and which on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure (Budapest Treaty). これは寄託の日から30年間生存培養の維持を確保するものである。 This is intended to ensure the maintenance from the date of deposit of the 30-year survival culture. 有機体はブダペスト条約の定める期間、ATCCにおいて入手可能とされ、また出願人とATC Cとの間の合意を条件として、関連米国特許の発行時より無制限に入手の可能性が確保される。 Organisms period specified by the Budapest Treaty, is made available in the ATCC, and as condition the agreement between Applicants and ATC C, the possibility of unlimited available from the time of issuance of the related US patents is ensured. 寄託株の入手可能性は、いずれかの国の政府の関係官庁がその自国法に従って認める権利に違背して本発明を実施する許諾を与えるものと解釈してはならない。 Availability of the deposited strain is not to be construed as providing a license to the authorities concerned of the government of any country is to practice the invention in violation to the right to admit in accordance with its domestic law.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 6識別記号 FI C12R 1:36) (C12N 1/21 C12R 1:42) (C12N 1/21 C12R 1:19) (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M C,NL,PT,SE),AU,CA,FI,JP,K R,NO ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (51) Int.Cl. 6 identification symbol FI C12R 1:36) (C12N 1/21 C12R 1:42) (C12N 1/21 C12R 1:19) (81) designated States EP ( AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), AU, CA, FI, JP, K R, NO

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1. [Claims] 1. 淋菌ポーリンタンパクまたはその断片を発現するリコンビナントサルモネラ細胞。 Neisseria gonorrhoeae porin protein or recombinant Salmonella cells expressing fragment thereof. 2. 2. 前記細胞が淋菌ポーリンタンパクを発現するベクターを有するものである、請求項1に記載のリコンビナントサルモネラ細胞。 Wherein said cell is one having a vector expressing a Neisseria gonorrhoeae porin protein, recombinant Salmonella cell according to claim 1. 3. 3. 前記ベクターがプラスミドである、請求項2に記載の細胞。 Wherein said vector is a plasmid, cell of claim 2. 4. 4. 前記ポーリンタンパクが完全長である、請求項1に記載のリコンビナントサルモネラ細胞。 The porin protein is full-length, recombinant Salmonella cell according to claim 1. 5. 5. 前記リコンビナントポーリンタンパクがPor−1 (A)である、請求項4 に記載のサルモネラ細胞。 The recombinant porin protein is Por-1 (A), Salmonella cell according to claim 4. 6. 6. 前記リコンビナントポーリンタンパクがPor−1 (B)である、請求項4 に記載のサルモネラ細胞。 The recombinant porin protein is Por-1 (B), Salmonella cell according to claim 4. 7. 7. 前記リコンビナントポーリンタンパクがPor−5 (A/B)ハイブリッドである、請求項4に記載のサルモネラ細胞。 The recombinant porin proteins are Por-5 (A / B) hybrid, Salmonella cell according to claim 4. 8. 8. 前記Por−5 (A/B)ハイブリッドがプラスミドpUNCH50である、 請求項7に記載のサルモネラ細胞。 The Por-5 (A / B) hybrid is a plasmid PUNCH50, Salmonella cell according to claim 7. 9. 9. 前記ポーリンタンパクが断片である、請求項1に記載のリコンビナントサルモネラ細胞。 The porin protein is a fragment, recombinant Salmonella cell according to claim 1. 10. 10. 前記断片がPor−1 (A)の断片である、請求項9に記載のリコンビナントサルモネラ細胞。 Said fragment is a fragment of the Por-1 (A), recombinant Salmonella cell according to claim 9. 11. 11. 前記Por−1 (A)断片が図9のPor−1 (A)配列から選択されるDNA 配列のいずれかを包含するものである、請求項10に記載のリコンビナントサルモネラ細胞。 The Por-1 (A) fragment is intended to include any DNA sequence which is selected from the Por-1 (A) sequence of Figure 9, recombinant Salmonella cell according to claim 10. 12. 12. 前記断片がPor−1 (B)の断片である、請求項9に記載のリコンビナントサルモネラ細胞。 Said fragment is a fragment of the Por-1 (B), recombinant Salmonella cell according to claim 9. 13. 13. 前記Por−2 (B)断片が図9のPor−2 (B)配列から選択されるDNA 配列のいずれかを包含するものである、請求項10に記載のリコンビナントサルモネラ細胞。 The Por-2 (B) fragment is intended to include any DNA sequence which is selected from the Por-2 (B) sequence of Figure 9, recombinant Salmonella cell according to claim 10. 14. 14. 前記断片がPor−5 (A/B)ハイブリッドの断片である、請求項9に記載のサルモネラ細胞。 Said fragment is a fragment of the Por-5 (A / B) hybrid, Salmonella cell according to claim 9. 15. 15. 前記サルモネラ細胞がサルモネラ・チフィムリウムである、請求項1に記載のサルモネラ細胞。 The Salmonella cell is a Salmonella typhimurium, Salmonella cell according to claim 1. 16. 16. 淋菌ポーリンタンパクをコードするDNAと、サルモネラ細胞中で当該タンパクを発現させる様に調節する、プラスミド内に配置された適切な調節要素とを包含するサルモネラ細胞中で淋菌ポーリンタンパクを発現可能なプラスミド。 A DNA encoding the N. gonorrhoeae porin protein, is adjusted so that the expression of the protein in Salmonella cells, gonococcal porin protein capable of expressing plasmid and a suitable regulatory element disposed within the plasmid include Salmonella cells. 17. 17. サルモネラ細胞中で淋菌ポーリンタンパクを発現させる方法であって、請求項16に記載のプラスミドをタンパク発現に好適な条件下でサルモネラ細胞中に挿入し、これによってタンパクを発現するものである、サルモネラ細胞中で淋菌ポーリンタンパクを発現させる方法。 A method of expressing a Neisseria gonorrhoeae porin protein in Salmonella cells are those inserted in Salmonella cells under conditions suitable for protein expression plasmid according to claim 16, thereby expressing the protein, Salmonella cells method of expressing the Neisseria gonorrhoeae porin protein in the medium. 18. 18. 前記プラスミドがpUNCH50である、請求項17に記載の方法。 The plasmid is PUNCH50, The method of claim 17. 19. 19. サルモネラ、大腸菌、またはN. Salmonella, E. coli or N., gonorrhoeae宿主細胞中で抗原を発現するプラスミドであって、当該抗原をコードするDNAと好適な調節要素とを包含し、当該調節要素は淋菌ポーリンプロモーターを有し、宿主細胞中で当該抗原を発現させる様に調節し、かつプラスミド内に配置されたものである、 プラスミド。 A plasmid expressing the antigen in gonorrhoeae host cell, includes a DNA and a suitable regulatory element encoding the antigen, the regulatory element comprises a Neisseria gonorrhoeae porin promoter, to express the antigens in a host cell It was adjusted so, and those disposed in the plasmid, plasmid. 20. 20. 請求項19に記載のプラスミドを含有するリコンビナントサルモネラまたは大腸菌。 Recombinant Salmonella or E. coli containing the plasmid of claim 19. 21. 21. 請求項1に記載のサルモネラ細胞と薬学的に許容される担体とを含有するワクチン組成物。 Vaccine compositions containing the carriers Salmonella cells and a pharmaceutically acceptable according to claim 1. 22. 22. 前記組成物が薬学的に許容されるアジュバンドをも含有する、請求項21 に記載のワクチン組成物。 Wherein the composition also contains adjuvants which are pharmaceutically acceptable, a vaccine composition of claim 21. 23. 23. 請求項1に記載のリコンビナントサルモネラ細胞および薬学的に許容されるアジュバンド。 Recombinant Salmonella cells and a pharmaceutically acceptable adjuvant is as defined in claim 1. 24. 24. 請求項21または22に記載のワクチン組成物を投与することによって淋菌感染を予防する方法。 Method for preventing gonorrhea by administering the vaccine composition of claim 21 or 22. 25. 25. 請求項21または22に記載のワクチン組成物を投与することによって淋菌感染を治療する方法。 Methods of treating gonococcal infections by administering the vaccine composition of claim 21 or 22.
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